CN1222938A - 经修饰具有改变了的钙离子吉合性质的α－淀粉酶 - Google Patents

Abstract

公开了新型α－淀粉酶,其中一种新的钙离子结合位点通过化学或遗传性改造与钙离子结合位点相关的残基加以修饰。此新型α－淀粉酶具有改变了的性能特征,如低pH下的淀粉水解能力、稳定性和活性曲线。

Description

经修饰具有改变了的钙离子结合 性质的α-淀粉酶

本发明涉及具有改变了的钙离子结合性质的α-淀粉酶。特别地，本发明涉及带有如点突变的修饰的新型α-淀粉酶，其中的修饰意在改变分子中一先前未知的钙离子结合位点处的钙离子结合。通过改变此附加位点的钙离子结合性质，可以增加修饰过的α-淀粉酶的稳定性。

α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1)在淀粉中主要以随机方式水解内部α-1,4-糖苷键以产生小分子量的麦芽糖糊精。α-淀粉酶具有可观的商业价值，应用于淀粉加工的初始阶段(液化)；酒精生产；洗涤基质中的清洗剂以及纺织工业中的淀粉脱浆。α-淀粉酶由许多不同的微生物包括芽孢杆菌(Bacillus)和曲霉(Asper gillus)产生，其中最有商业价值的淀粉酶产自如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliq uefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的细菌来源。近年来，优选的用于商业的酶是那些来自地衣芽孢杆菌的酶，因为它们的热稳定性和至少在中性和温和碱性pH下的性能。

在美国专利No.5,322,778中通过将一种如亚硫酸氢盐、抗坏血酸或其盐、erythorbic酸的抗氧化剂或是如丁基化羟苯甲醚、丁基化羟甲苯或α-维生素E的酚类抗氧化剂加入到液化浆液中在pH4.0和6.0之间实现液化。根据此专利，亚硫酸氢钠必须以高于5mM的浓度加入。

在美国专利No.5,180,669中，通过将超过缓冲溶液所需的量的碳酸根离子加入到磨碎的淀粉浆液中在pH5.0到6.0之间实现液化。因为碳酸根离子的加入引起pH值的增加，一般通过加入一种氢离子，例如：象盐酸或硫酸的一种无机酸中和浆液。

在PCT申请No.WO95/10603中，公开了具有改进的洗衣或洗碟性能的包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中不是在M197位点的单一突变的一种突变的α-淀粉酶变体。

在PCT申请No.WO94/02597中，描述了一种具有改进的氧化稳定性的突变α-淀粉酶，其中的一个或多个甲硫氨酸用除了半脱氨酸或甲硫氨酸之外的任意氨基酸替换。

在PCT申请No.WO94/18314中，描述了一种具有改进的氧化稳定性的突变α-淀粉酶，其中的一个或多个甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸残基用一种不能氧化的氨基酸取代。

在PCT申请No.WO91/00353中，野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中与液化相关的性能特点和问题均通过基因工程处理该α-淀粉酶来解决，其中包括特异性替换Ala-111-Thr,His-133-Tyr和/或Thr-149-Ile。

已有许多不同的研究人员利用重组DNA技术进行了探查哪个残基对于淀粉酶的催化活力是重要的和/或探查修饰不同淀粉酶和糖基化酶中的活性位点的特定氨基酸的效果的研究(Vihinen等人，生物化学杂志(J.Biochem.)vol.107,267-272(1990))；Holm等人，蛋白质工程(ProteinEngineering),Vol.3,181-191(1990)；Takase等人，生物化学及生物物理学通报(Biochemica et Biophysica Acta)Vol.1120,281-288(1992)；Matsui等人，Febs.Letters,Vol.310,216-218(1992)；Matsui等人，生物化学(Biochemistry)Vol.33,451-458(1992)；Sogaard，等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)vol.268,22480-22484(1993)；Sogaard等人，碳水化合物(Carbohydrate Polymers)Vol.21,137-146(1993)；Svensson，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)Vol.25,141-157(1994)；Svensson等人，生物技术杂志(J.Biotech.)Vol 29,1-37(1993))。研究人员也已研究了哪个残基对于热稳定性重要(Suzuki，等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)Vol.264,18933-18938(1989)；Watannabe等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)vol.226,277-283(1994))；并且已有一研究组使用这种方法在地衣芽孢杆菌淀粉酶中在不同的组氨酸残基处引入突变，其基本原理是已知与其它相似的芽孢杆菌淀粉酶相比具有相对热稳定性的地衣芽孢杆菌淀粉酶含有的组氨酸较多，因此提示组氨酸的取代可能影响此酶的热稳定性。这一工作导致了在133位组氨酸残基和209位丙氨酸残基的稳定化突变的确认(Declerck等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)vol.265,15481-15488(1990)；FR2,665,178-A1；Joyet等人，生化技术(Bio/Technology),vol10,1579-1583(1992))。

来自不同生物的α-淀粉酶除了一级结构上可观的差异之外均有相似的三维结构。图1显示地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的结构。虽然在不同的α-淀粉酶之间会有一些种类内部的变化，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的主要结构部件一般认为是α-淀粉酶结构的代表(见Brayer等人，蛋白质科学(Protein Sci.)Vol.4,1730-1742(1995)；Larson等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)Vol.235,1560-1584(1994)；Qian等人，分子生物学杂志，Vol.231,785-799(1993))。例如，定点突变已确认对催化有重要作用(Svensson，植物分子生物学，vol.25,141(1984))的三个不变的羧酸和两个不变的组氨酸(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的D231、E261、D328和H104和H327)，且已提出了一种普遍性机理(Mazur等人，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)vol.204,297(1994))。已表征了认为参与钙和氯结合的残基且发现在不同的酶中这些残基高度保守(见如：Kadziola等人，分子生物学杂志，vol.239,104(1994)；Qian等人，出处同前，Larson等人，出处同前；Brayer等人，出处同前；Machius等人，分子生物学，vol.246,545-559(1995)和Boel等人，生物化学，vol.29,6244(1990))。

此外，在几乎所有目前已测序的内切淀粉酶(范围包括植物、哺乳动物和细菌)之间已发现同源物(Nakajima等人，应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.),vol 23,355-360(1986)；Rogers,生物化学和生物物理学研究通讯，vol.128,470-476(1985)；Janecek，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),vol 224,519-524(19941))。在某些芽孢杆菌淀粉酶中有4个区域有特别高的同源性，如图5所示，其中下划线的区域称为高度同源区。也已采用序列对比以标明芽孢杆菌内切淀粉酶之间的关系(Feng等人，分子进化杂志(J.Molec.Evol.)vol.35,351-360(1987))。嗜热脂肪芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌淀粉酶之间相关序列同源性约为66％，地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌淀粉酶之间约为81％，如Holm等人，蛋白质工程，vol.3,No.3,181-191(1990)所测定。虽然序列同源性重要，一般认为结构同源性在比较淀粉酶或其它酶时也很重要。

来源于不同生物的不同α-淀粉酶(及相关淀粉分解酶如环糊精糖基转移酶和α-葡糖苷酶)之间的三维结构相似(除了它们一级结构的差异之外)，发现其共同存在一种α/β-桶形成的中央部分(结构域A)、作为分离的结构域C的希腊纹样排列(Greek key motif)和至少一个附加的结构域，即结构域B(Machius等人，出处同前)。认为底物的结合点位于α/β-桶和结构域B之间，包含依种类不同而具有不同长度的β-链(Machius，出处同前)。也同样共有的是对钙的需求，认为它维持结构的完整性。Machius公开了一个钙离子结合位点，它涉及对应于由源自地衣芽孢杆菌的耗尽了钙的α-淀粉酶的晶体结构中的N104、D200和H235的残基。除了地衣芽孢杆菌的结构之外，已测定了黑曲霉(Aspergillus niger)(Brady等人，Acta.Crystailog.B,vol47,527(1991))、猪胰腺(Qian等人，分子生物学杂志，vol231,758(1993)；Larson等人，分子生物学杂志，vol235,1560(1994))和人胰腺(Brayer等人，Prot.Sci.vol.4,1730(1995))中的淀粉酶的结构。

除了先有技术取得的进展之外，还需要具有改变了的性能(包括活性和稳定性)的以便在淀粉液化、洗衣用和洗碟用洗涤剂、焙烤、纺织品脱浆和其它的淀粉酶标准用途中使用的α-淀粉酶。因为在许多条件下由于稳定性和/或活性的问题商业性可得的淀粉酶不可使用，因而在这些条件下需要一种具有改变了的优选的为增加了的性能曲线的淀粉酶。例如：与洗涤剂相关联的高碱性和氧化(漂白)性水平或是在淀粉液化过程中存在的极端条件均可造成α-淀粉酶的不稳定及失活。因此，期望获得诸如热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性或钙离子稳定性的改变了的性能特征的，同时与野生型或前体酶相比也有改变了的、维持原状的或增加了的酶活性的淀粉酶。类似地，已知许多α-淀粉酶需要钙离子的添加以维持稳定。在一些应用中由于这会增加加工成本因而是不期望的。

本发明的目的在于提供一种具有改变了的性能特点如：改变了的pH稳定性、碱性稳定性、氧化稳定性、热稳定性或酶活性的α-淀粉酶。

本发明的另一个目的在于提供一种具有改变了的钙离子结合性质(例如：维持活性所需加入的钙减少)的α-淀粉酶。

本发明的又一目的在于提供一种由于增加了低pH稳定性或活性而具有改善的性能的(特别是在淀粉液化的过程中)α-淀粉酶。

本发明还有一个目的在于提供一种在高温或高pH环境中或是在氧化剂或漂白剂存在时具有改善的性能的α-淀粉酶。

本发明还有一个目的在于提供一种由于其改变了的稳定性或活性而在纺织品脱浆或烘烤中具有改善的性能的α-淀粉酶。

根据本发明，提供了一种包含一个结构域A，一个结构域C和一个钙离子结合位点的α-淀粉酶，其中的钙离子结合位点与结构域A和结构域C相关且包含位于结构域A和/或C中的配体残基，其中α-淀粉酶经过修饰以改变钙离子结合位点的特性，从而改变了该α-淀粉酶的性能。

在一优选的实施方案中，修饰包括一种基因工程修饰，其导致在等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶氨基酸残基290-309,339-347,402-411,426-436或472-477中的一个或多个残基处的替换、删除或添加。在一特别优选的实施方案中，基因工程修饰包括在等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶G301,M304,H405,H406和/或K436中的一个或多个残基处的替换、删除或添加。

在一产品实施方案中，本发明包含一种编码本发明的α-淀粉酶的DNA。在另一组合物实施方案中，本发明包含一种整合有编码根据本发明的α-淀粉酶的DNA的表达载体，以及已用这种DNA和/或表达载体转化的宿主细胞。在一个方法实施方案中，包含在一宿主细胞中表达一种编码本发明的α-淀粉酶的DNA或是一种整合有这种DNA的表达载体。

在另一产品实施方案中，本发明包含一种掺入根据本发明的α-淀粉酶的洗衣或洗碟用洗涤组合物。在另一产品实施方案中，本发明包含一种掺入根据本发明的α-淀粉酶的纺织品脱浆组合物。在又一产品实施方案中，本发明包含一种掺入根据本发明的α-淀粉酶的淀粉液化组合物。在又一个产品实施方案中，本发明包含了一种含有根据本发明的α-淀粉酶的烘烤助料。

在一本发明的方法实施方案中，提供了一种使用掺入根据本发明的α-淀粉酶的洗碟洗涤剂组合物洗涤衣物或清洗碟子的方法。在另一本发明的方法实施方案中，提供了使用一种掺入根据本发明的α-淀粉酶的组合物使纺织品脱浆的方法。在另一本发明的方法实施方案中，提供了一种使用掺入根据本发明的α-淀粉酶的淀粉液化组合物液化淀粉的方法。在另一本发明的方法实施方案中，提供了一种烘烤方法，其包含加入一种掺入根据本发明的α-淀粉酶的组合物。

根据本发明的修饰过的α-淀粉酶将具有一些与现有α-淀粉酶相比重要的优点。例如：已在一些变体中发现在常用淀粉液化方法中典型的低pH和高温条件下具有增加的活性的优点。在一些具有增加的高pH和氧化稳定性的变体中发现有便于其在洗涤剂中使用的另一优点。通过在无或低钙离子浓度中具有改善的稳定性的变体提供了另一优点。本发明的目的和伴随的优点将通过下面详细的描述和实施例进一步阐明。

图1显示地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的结构，标明了主链折叠与结构域A和结构域B相关联的钙离子结合位点(CalA)的位置以及与结构域A和结构域C相关联的另一钙离子结合位点(CalB)的位置。

图2显示最终2fo-fc差异图的立体视图以及在与来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的结构域A和结构域C相关的钙离子结合位点的Sm异常傅里叶差异。

图3A-C显示来自地衣芽孢杆菌(NCIB8061)的α-淀粉酶的基因的DNA序列以及如Gray等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)vol166,635-643(1986)中所述的翻译产物的推测的氨基酸序列。

图4显示了来自地衣芽孢杆菌的成熟的α-淀粉酶的氨基酸序列。

图5A-B显示三种芽孢杆菌α-淀粉酶的一级结构的一个片段。地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Am-Lich)如Gray等人，细菌学杂志，vol.166,635-643,(1986)所述；解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(Am-Amylo)如Takkinen等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)vol.258,1007-1013(1983)所述；嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(Am-Stearo)如Ihara等人生物化学杂志(J.Biochem.)vol.98,95-103(1985)所述。

“α-淀粉酶”指一种切割或水解如在淀粉、支链淀粉或直链淀粉聚合物中的α-(1-4)糖苷键的酶活性。此处所用的α-淀粉酶包括天然产生的α-淀粉酶以及重组α-淀粉酶。根据本发明的α-淀粉酶可以衍生自一种前体淀粉酶。该前体淀粉酶可以通过任何能够产生α-淀粉酶的来源生产。α-淀粉酶的合适来源是原核或真核生物，包括真菌、细菌、植物或动物。优选地，前体α-淀粉酶由芽孢杆菌或真菌产生，如衍生自曲霉的真菌(即：米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉)。更优选地，前体由地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌产生；更优选地，前体α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌。

一种“修饰过的”α-淀粉酶是一种经遗传或化学性修饰以改变其生物化学、结构或物理化学性质的α-淀粉酶。α-淀粉酶中的“遗传性修饰”指编码天然产生的或前体α-淀粉酶的DNA序列经过修饰以产生一种突变的DNA序列，此序列编码与天然产生的α-淀粉酶或前体α-淀粉酶相比的α-淀粉酶序列中一个或多个氨基酸的替换、***或删除。

“表达载体”指包含一种能影响该DNA在合适的宿主中表达的DNA序列的DNA构建体，此DNA序列一般被可操纵地与合适的控制序列连接。这样的控制序列可以包括一种影响转录的启动子，一种控制这种转录的选择性操纵子序列、一种编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。一种优选的启动子是枯草芽孢杆菌aprE启动子。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或意在影响基因组***(即整合)的DNA。一旦转化入合适的宿主，此载体可不依赖宿主基因组的复制并发挥功能，或在有些情况下可以整合到基因组之中。质粒和载体有时候互相换用，因为质粒是目前最为常用的载体的形式。然而，本发明意在包括其它形式的有等效功能的表达载体，这些载体为本领域已知或逐渐为本领域知晓，特别包括噬菌体显示。

“宿主菌”或“宿主细胞”指一种对如含有编码根据本发明的α-淀粉酶的DNA的表达载体合适的宿主。用于本发明的宿主细胞一般地为原核或真核宿主，包括在其中能实现根据本发明的α-淀粉酶的表达的任何可转化的微生物。特别地，与产生α-淀粉酶的种属相同的种或属的宿主菌株如芽孢杆菌菌株是适宜的。优选地，使用一种α-淀粉酶阴性芽孢杆菌菌株(基因缺失)和/或一种α-淀粉酶和蛋白酶缺失的芽孢杆菌(如：ΔamyE,Δapr,Δnpr)。使用由重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这种转化的宿主细胞或是能复制编码α-淀粉酶和其变体(突变体)的载体，或是能表达期望的α-淀粉酶。

“液化作用”或“液化”指一种将淀粉转变成短链和低粘度糊精的过程。一般地，此过程包括淀粉凝胶化的同时或之后加入α-淀粉酶。

“钙离子结合位点”指α-淀粉酶中适于且在游离钙离子存在时对结合钙离子有作用的一个区域。一般认为在许多条件下钙离子对维持α-淀粉酶的结构完整性是必需，且已证实在不同的酶中参与钙离子结合的氨基酸残基是高度保守的(Machius等人，分子生物学杂志，vol246,545-559(1995))。根据本发明，与野生型或前体α-淀粉酶相比改变了钙离子结合位点的特性从而改变了α-淀粉酶的性能。钙离子结合位点的改变可以包括降低或增加该位点与钙离子结合的亲和力。通过改变其性能意在指该酶在不同应用中的稳定性(如氧化或热稳定性)或是活性(如α-淀粉酶水解淀粉底物的速度或效率)。

“配体残基”或“钙离子配体”指在α-淀粉酶中的一个或多个氨基酸残基，其在钙离子结合位点之中形成一个与钙离子结合的配体。就由本申请人，发现的α-淀粉酶之中的钙离子结合位点而言，已确认了认为起钙离子配体作用的5个氨基酸配体。钙离子配体残基包含与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中G300,Y302,H406,D407和D430等效的氨基酸残基。特别地，就这些确定的钙离子配体而言，认为G300,Y302和H406的羰基氧以及D407和D430侧链参与了钙离子结合。

根据本发明，提供了包含结构域A，结构域C和一个钙离子结合位点的一种α-淀粉酶，其中的钙离子结合位点与结构域A和结构域C相关且包含结构域A和/或结构域C中的配体残基，其中的α-淀粉酶经修饰以改变钙离子结合位点的特性从而改变该α-淀粉酶的性能。

本发明也提供了编码含有本发明提供的α-淀粉酶的至少一部分的氨基酸序列的一种核酸分子(DNA)，整合有这种DNA包括载体和噬菌体的表达体系，用这种DNA转化的宿主细胞以及与编码该氨基酸序列的DNA分子相对应的DNA的反义链。类似地，本发明包括一种通过表达在已转化入宿主细胞中的整合到一种表达体系上的DNA来生产一种α-淀粉酶的方法。

可以通过将其与合适的表达载体中的表达控制序列相连且按照周知的技术用此表达载体转化一合适的宿主以表达该DNA序列。大量不同的宿主表面体系的组合均可用于表达本发明的DNA序列。有用的表达载全体，例如，包括染色体、非染色体的片段和合成的DNA序列，如不同的已知用于此目的的质粒和噬菌体。此外，大量不同的表达控制序列中的任一种一般地均可用于这些载体。例如，申请人已发现用于芽孢杆菌转化子的优选的表达控制序列是衍生自枯草芽孢杆菌的aprE信号肽。此外，噬菌体显示***也适用于本发明。

许多宿主细胞也可用于表达本发明的DNA序列且也在此加以考虑。这些宿主可以包括周知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单孢菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces)、不同的如木霉属(Trichoderma)或曲霉属的真菌的菌株，酵母和动物细胞。优选地，宿主将本发明的α-淀粉酶表达到胞外以利于纯化和下游加工。本发明突变的α-淀粉酶的表达和纯化可以通过本领域已知的进行此类操作的方法进行。

根据本发明的α-淀粉酶包含一种衍生自一种前体α-淀粉酶的氨基酸序列的氨基酸序列。此前体α-淀粉酶包括天然产生的α-淀粉酶和重组α-淀粉酶。α-淀粉酶突变体的氨基酸序列通过前体氨基酸序列的一种或多种氨基酸的替换、删除或***而衍生自前体α-淀粉酶氨基酸序列。这种修饰一般地是对编码前体α-淀粉酶的氨基酸序列的前体DNA序列而不是对前α-淀粉酶本身的操作。修饰α-淀粉酶基因(即：通过定点寡核苷酸突变)和转化、表达和分泌遵照突变的基因所产生的酶产物的方法已由先有技术所述，包括PCT公开文本No.WO95/10603(NovoNordisk),PCT公开文本No.WO94/02597(Novo Nordisk),PCT公开文本No.WO94/18314(Genencor International，公司)和PCT公开文本No.WO91/00353(Gist Brocades)，此处引入这些公开作为参考。另外适合于前体DNA序列操作的方法包括此处公开的以及共同拥有的美国专利No.4,760,025和5,185,258，此处引用作为参考。

主要的结构元件，包括此处公开的新发现的CalB位点和为了改变α-淀粉酶的性能而进行的改变在下面以适用于大多数α-淀粉酶的一般性词语进行描述。如图1所示，明确了三个主要的结构域：结构域A、B和C以及两个钙离子结合位点CalA和CalB。结构域A包含此分子的中央部分且已确认为一个α/β或TIM桶形。此α/β桶由一系列平行的以α-螺旋内部相连的β-链构成。在酶的羧基端，结构域A的一侧为一个由反平行β-桶(称为“希腊纹样”)组成的区域(参见如：Richardson等人，高等蛋白质化学(Advan.Protein Chem.),vol.34,167-339(1981)；Braden等人，蛋白质结构导论(Introduction to Protein Structure),Garland出版公司，纽约(1991))。此结构域已确认为结构域C。在结构域A与结构域C相对的一侧(N-端)是一个附加的结构域，其包含一些随种类不同而长度不同的β-链，称为结构域B。已发现结构域B在不同种类的α-淀粉酶之间高度可变且经常包含延伸的环。认为底物结合位点位于结构域A和结构域B之间的裂隙中，且活性位点也与此区域的分子有关。CalA结合位点位于分隔结构域A和结构域B的裂隙中，认为其可稳定此区域。此处公开的CalB结合位点位于结构域A和结构域C交界的区域。

由申请者发现的芽孢杆菌α-淀粉酶中的CalB结合位点使得申请者可开发一种具有改变了的性能的突变α-淀粉酶，且具有特别改变了的稳定性。例如：可将用于稳定蛋白质结构的一般原则应用于CalB位点周围的区域。此外，特别为提高在CalB位点的钙离子结合设计的方案也可以采用以增加该酶的稳定性。优选地，这种修饰在结合到CalB结合位点的钙离子中央的15A之内，更优选地在结合到CalB位点的钙离子中央的10之内。

此处还确定了用于删除或替换的α-淀粉酶中的残基。因此，此处讨论的特别的残基是指参照示于图4中分配给成熟地衣芽孢杆菌α-淀粉酶序列的号码的一种氨基酸的位置号码。然而，本发明不局限于特定的成熟地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的突变，而可延伸到非地衣芽孢杆菌前体α-淀粉酶，这些酶中含有与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的特定残基等价位置的氨基酸。一种前体α-淀粉酶的残基等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基，只要其与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中特定的残基或部分同源(即：相应于或是初级或是四级结构的位置)或类似(即：有相同或相似的结合、反应或者化学性或功能性相互作用的功能)。

为了构建一级结构的同源物，直接将前体α-淀粉酶的氨基酸序列与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶一级序列特别是与在所有α-淀粉酶中恒定的一系列残基(其序列已知)相比较(见如图7)。也可以通过已报道的猪胰腺α-淀粉酶(Buisson等人，EMBO J.vol6,3909-3916(1987)；Qian等人，生物化学(Biochemistry),vol.33,6284-6294(1994)；Larson等人，分子生物学杂志，vol335,1560-1584(1994))；来源于米曲霉的Taka-淀粉酶A(Matsuura等人，生物化学(J.Biochem)(东京)，vol95,697-702(1984))和来自黑曲霉的带有前两个结构相似的一种酸性α-淀粉酶(Boel等人，生物化学(Biochemistry),vol,29,6244-6249(1990))以及大麦α-淀粉酶(Vallee等人，分子生物学杂志，vol.236,368-371(1994)；Kadziola，分子生物学杂志，vol.239,104-121(1994))的晶体结构的四级结构分析确定等价残基。虽然有一些初步的研究已公开(Suzuki等人，生物化学杂志(J.Biochem.),vol.108,379-381(1990)；Lee等人，生物化学和生物物理学文献(Arch.Biochem.Biophys.)vol291,255-257(1991)；Chang等人，分子生物学,vol229,235-238(1993)；Mizuno等人，分子生物学，vol.234,1282-1283(1993))，但仅有关于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的公开的结构(Machius等人，分子生物学，vol.246,545-549(1995))。然而，一些研究人员已预测了在葡聚糖酶(MacGregor等人，生物化学杂志(Biochem.J.)vol.259,145-152(1989))和α-淀粉酶内部以及其他淀粉代谢酶(Jaspersen，蛋白质化学杂志(J.Prot.Chem.)vol.12,791-805(1993)；MacGregor,Starke,vol.45,232-237(1993))之间共同的超二级结构；以及与α-淀粉酶有相似的超二级结构的酶之间的序列相似性(Janecek,FEBS Letters,vol.316,23-26(1993)；Janecek等人，蛋白质化学杂志，vol.12,509-514,(1993))。一种嗜热脂肪芽孢杆菌酶的结构已按Taka-淀粉酶A制成模型(Holm等人，蛋白质工程，Vol.3,181-191(1990))。图7中所示的4个高度保守区域包含许多认为属于活性位点的残基(Matsuura，等人，生物化学杂志(J.Biochem.)(东京)，vol.95,697-702(1984)；Buisson等人，EMBO J.,vol.6,3909-3916(1987)；Vihinen等人，生物化学杂志(J.Biochem.)vol.107,267-272(1990))，其包括按地衣芽孢杆菌编号体系中的His105；Arg+229；ASP+231；His+235；Glu+261和Asp+328。

含有CalB结合位点的α-淀粉酶多肽链片段包括残基290-309,339-347,402-411,426-436和472-477。这些多肽片段含有CalB结合位点。相应地，可以预期在这些区域中的区域特异性随机突变将产生通过在这些位点钙离子亲合力的调整而调整α-淀粉酶稳定性的变体。

下面提供了另外的更特别的方案：

(1)增加未折叠主链的熵可以增加酶的稳定性。例如，将脯氨酸残基在α-螺旋和环状结构的N-端转角的2位上引入可以通过增加未折叠链的熵而明显稳定此蛋白质(见如：Watanabe等人，欧洲生物化学杂志，vol.226,277-283(1994))。类似地，甘氨酸残基没有β-碳原子，因而比其它残基具有明显较大的骨架构象自由度。这可造成导致弱稳定性的高柔性。在等价于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中G299,G410,G433,G474,G475的一个或多个甘氨酸残基的替换，优选地用丙氨酸，可以降低柔性而增加稳定性。此外，通过缩短延伸环也可以增加稳定性。已观察到高温嗜热产生的蛋白质与其中温对应物相比延伸环较短(见如：Russel等人，生物技术现代观点(Current Opinions in Biotechnolog)vol.6,370-374(1995))。二硫键的引入对稳定彼此间独特的四级结构也有效。在G301处的修饰通过限制或增加甘氨酸的构象变化将改变290-309片段的稳定性。特别地，考虑在此残基天冬氨酸或脯氨酸的替换。在G474的修饰通过用其它残基替换可以因引入一个Cβ而增加稳定性，因此降低其构象自由度。

(2)通过增加侧链疏水性减少内部的空腔可以改变一种酶的稳定性。减少内部空腔的数量和体积可通过最大化疏水相互作用和降低填充缺陷从而增加酶的稳定性(见如：Mattews,Ann.Rew.biochem.vol.62,139-160(1993)；Burley等人，科学，vol.229,23-29(1985)；Zuber,Biophys.Chem.,vol29,171-179(1988)；Kellis等人，自然，vol.333,784-786(1988))。已知来自嗜热性蛋白的多亚基蛋白经常比其嗜温性对应物中有较大表面互补性的疏水性亚单位界面(Russel.等人，出处同前)。申请者认为此原则可应用到单亚基蛋白质的结构域表面。特异性替换可以通过增加疏水性以增加稳定性，包括赖氨酸换成精氨酸、丝氨酸换成丙氨酸以及苏氨酸换成丙氨酸(Russel，等人，出处同前)。通过替换成丙氨酸或脯氨酸在G301处的修饰可以增加侧链的尺寸，从而导致空腔减少，填充性更好且增加疏水性。此外，在CalB结合区域中结构域A和结构域C之间的交界处的空腔是以Y302,M304,L307,F343,L427和I428为边界的。减少空腔尺寸、增加疏水性和提高结构域A-结构域C交界处的互补性的替换可以提高酶的稳定性。特别地，用选自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中的不同的残基对在这些位点的特异性残基加以修饰可以改善性能。可能有用的另外的替换是在V409和F403，优选地替换在V409包含异亮氨酸或亮氨酸，以及在F403包含酪氨酸或色氨酸。

(3)平衡刚性二级结构(即：α-螺旋和β-转角)中的电荷可以提高稳定性。例如，用天冬氨酸上的负电荷中和螺旋N-端的部分正电荷可以稳定此结构(见如，Eriksson等人，科学，vol.255,178-183(1992))。相似地，用正电荷中和螺旋C-端上的负电荷可以增加稳定性。移去与β-转角中肽的N-端相互作用的正电荷可以有效赋予四级结构稳定性。用非正电荷的残基替换H405可从与405-408转角中的D407酰胺氮相互作用中除去不利的正电荷。

(4)引入盐桥和氢键以稳定四级结构是有效的。例如，离子对相互作用，如：天冬氨酸或谷氨酸与赖氨酸、精氨酸或组氨酸之间，可以引起强稳定效果且可以用于贴附不同的四级结构元件从而导致热稳定性的提高。此外，荷电残基/非荷电残基氢键的数目以及氢键数目的增加一般地可提高热稳定性(见如：Tanner等人，生物化学(Biochemistry),vol.35,2597-2609)。用天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺替换H405可以引入与骨架酰胺D407之间的氢键，因而稳定了405-408转角。用精氨酸替换K436可以改善与D404的盐桥且引入一种H键到I408的骨架羰基。

(5)避免不耐热的残基一般可以增加热稳定性。例如，高温下天冬酰胺和谷氨酰胺易于脱酰胺而半胱氨酸易于被氧化。在敏感位置减少这些残基的数目可以导致热稳定性提高(Russel等人，出处同前)。由除了谷氨酰胺或半胱氨酸之外的任一氨基酸替换或删除Q291,Q298,N309,Q340或N473可以通过避免了不耐热的残基而增加稳定性。

(6)从蛋白质上引入第六个配基到钙离子可以提高结合的钙离子的稳定性，因而稳定此酶。用天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺替换H406可以增加钙离子的亲和力。

(7)CalB中现有的钙离子配基的稳定也可以增加结合的钙离子的稳定性，因而稳定此酶。例如，M304可以用苯丙氨酸或酪氨酸替换以引入芳香侧链/天冬氨酸侧链稳定性，其中羧化的氧可以与苄基环相关的部分正电荷有利的相互作用，从而增加D407和D430的稳定性。用苯丙氨酸或酪氨酸替换H405在D407附近引入一个疏水基因，可以通过D407侧链的C-b和C-g原子的有利的范德华相互作用的形成而增加D407的稳定性。用苯丙氨酸在G300的替换可以除去与Q291的侧链H键。

(8)增加任何一个钙离子配体的负电性可以增强钙离子结合。例如，用苯丙氨酸或酪氨酸替换M304可以通过改善对溶剂的屏蔽而增加D407和D430的负电性，从而改善钙离子结合。

(9)从钙离子附近除去可以干扰钙离子结合的正电荷可以类似地改善钙离子结合位点的稳定性。例如，替换紧邻结合的钙离子的H405或H406，这些残基可带有可能与带正电的钙离子产生不利的电荷-电荷相互作用的正电荷且可以与带负电荷的钙离子配体有竞争性电荷-电荷相互作用。因此，使用一个合适的非正电荷残基的替换可以增加钙离子亲和力和蛋白质稳定性。

(10)通过在其附近引入负电荷的残基的CalB结合位点的稳定也可以改进在此位点的钙离子的结合(见例如，Pantoliano等人，生物化学(Biochemisry)vol.27,8311-8317(1988)；Bryan,《蛋白质药物的稳定性B部：体外降解途径和蛋白质稳定的策略》(Stability of Protein Pharmaceuticals Part B:In vitro Pathwaysfor Degradation and Strategies for Protein Stabilization)(Ahern和Manning编)，147-181(1992)；Fagain,Biochim.Biophys.Acta,vol.1252,1-14(1995))。例如，用带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸替换Q291,Q298,N309,Q304,H405,H406,N473和/或G474可以增加钙离子区的净负电荷且可增加钙离子的亲和力，从而增加酶的稳定性。

根据本发明的α-淀粉酶可以呈现改变了的性能，只要这些期望的和出乎意料的效果在通常使用α-淀粉酶的不同应用中是有用的。例如，根据本发明的α-淀粉酶呈现出在低pH下改变了的性能特点，包括改善了的热稳定性、pH稳定性和/或氧化稳定性，它就可用于低pH的淀粉液化。增强的热稳定性可用于延长掺入此酶的产品的保质期。增强的氧化稳定性或改善了的性能在清洁产品中特别需要，且可用于延长含有漂白剂、过硼酸盐、过碳酸盐或用于这些清洁产品的过酸的α-淀粉酶的保质期。相反，低热稳定性或氧化稳定性可以用于需要淀粉水解活性迅速高效失活的工业过程中。此外，对钙离子的低需要或强亲和力在洗涤剂中通常可见的多价螯合组分存在时有利，如：增加清洁作用的物质(助洗剂)。

本发明的α-淀粉酶特别用于淀粉加工和特别是淀粉液化中。在商业化期望的液化过程的特征性条件包括：低pH，高温和可能的氧化条件，这就要求α-淀粉酶呈现改善的低pH性能、改善的热稳定性和改善的氧化稳定性。相应地，根据本发明的在液化过程中特别有用的α-淀粉酶在低于约pH6，优选地低于约pH5.5，更优选地在约pH5.0和5.5之间呈现改善的性能，此外，根据本发明的在温度约80-120℃之间，优选地在约100-110℃之间呈现增加的热稳定性以及在有氧化剂存在下增加的稳定性的α-淀粉酶特别有用。优选地，根据本发明的用于液化的α-淀粉酶还包含在M15,V128,H133,W138,N188,A209和/或M197的一个或多个位置的缺失或替换。

在另一本发明的实施方案中，提供了包含根据本发明的α-淀粉酶的液体、凝胶或颗粒形式的洗涤剂组合物。这些洗涤剂组合物将会从根据本发明的一种α-淀粉酶的添加中受益，这些α-淀粉酶具有增加的热稳定性可延长保质期或增加氧化稳定性，因而此α-淀粉酶对洗涤剂中常常存在的漂白剂或过酸化合物有增强的抗性。因此，根据本发明的α-淀粉酶可以被有利的制成具有pH约6.5到12.0之间的粉末、液体或凝胶型洗涤剂。本发明的一个优选的实施方案还包括在M15,V128,H133,W138,N188,A209和/或M197的一个或多个位置的缺失或替换。含有根据本发明的α-淀粉酶的洗涤剂组合物可以进一步包含如内切糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶的其它酶，例如，为本领域周知的源自嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶。

本发明的实施方案包括根据本发明的α-淀粉酶与蛋白酶的结合物，优选地包括氧化稳定的蛋白酶，如在US.Re34,606中描述过的酶(此处引用作为参考)以及商业性可得的酶如：DURAZYM(NovoNordisk),MAXAPEM(Gist brocades)和PURAFECT^OxP(Genencor International公司)。制造这些蛋白酶突变体(氧化稳定性蛋白酶)特别是具有在等价于解淀粉地衣芽孢杆菌中M222位置的甲硫氨酸替换的突变体的方法见U.S,Re34,606中所述。

以下以实施例方式给出且不构成对权利要求范围的限制。此处所用的缩写，特别是关于氨基酸的三字母或单字母概念如Dale,J.W.细菌分子遗传学(Molecular Genetics of Bacteria)John Wiley&Sons(1989)附录B中所述。实验部分

实施例

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶晶体的制备

晶体生长在10μl的悬滴中进行，其中含有1.6-1.8M Li₂SO₄,1mMCaCl₂,50mM NaCl,用200mM bistrispropane缓冲在pH6.5。晶体在7-14天生长成长条棱柱状，最大线度约1.5mm，其空间群为P2₁2₁2₁,晶胞参数为：a=118.3,b=119.0,c=84.9。假定不对称单位中含2个分子,则Matthews值(见Matthews，分子生物学，vol.33,409(1968))为3.01，处于正常范围之内。数据收集使用RAXISⅡ成象板***，固定于RU-200B转靶X光源产生的石墨单色化的CuKα辐射。使用Molecular Structures公司(The Woodlands,Texas)为此***配备的软件进行数据处理并还原为振幅。相角信息的确定采用多对同晶置换法(MIR)辅以反常散射数据(MIRAS)，及随后的密度修正方法。重原子衍生物用传统浸泡法制备，SmCl₃衍生物除外，它是用共晶法制备的。采用差值帕特森法(Pattersons)和交差相位差值付里叶法确定重原子位置。SmCl₃衍生物提供了极好的反常散射数据，被用来确定正确的手性，以及给所有重原子确定共同的原点。使用Xheavy程序(Zhang等人，Acta Crystallog.A,vol.46,377(1990))修正重原子位置并计算了MIRAS相角。相角进一步采用溶剂过滤法进行改善，使用的程序为SQUASH(McRee,J.,Mol.Graph.,vol.10,44(1992))，由此获得了3分辨率的电子密度图，其上两个分子的大部分二级结构元素都能被识别。用Xfit程序(Zhang，出处同前)进行了模型建造、实空间修正和对称性平均。两个分子中，α/β桶形结构域中的β折叠和α螺旋的Cα位置，和所有β结构域的C末端的Cα位置都被识别出。将曲霉属α-淀粉酶(PDB代号6TAA)(Swift等人，Acta Crystallog.B,vol.47,535(1991))中的TIM桶模型近似地覆盖于不对称单位中两个分子的Cα轨迹上，然后用整个未修改的结构域的实空间修正来精确定位。这样就可以精确测定局部对称性算符，后者被用于电子密度图的非晶体学对称性平均。由此得到了显著改善的电子密谋图，但结构域B仍不好。此时，仅有一个分子被建造于经对称性平均的图中，另一个分子用局部对称算符产生出来。Cα位置被识别出，主链用迭合五聚体的方法构建出，五聚体取自一个经很好修正的结构的数据库(Zhang，出处同前；Jones等人，EMBO,vol.5,819(1986))。在结构域B，电子密度图的大部分都不可解释，仅残基105-116和133-169能被建造出。对那些没有明显侧链密度的残基，以丙氨酸模型代替。使用Xplor程序(Brunger等人，ActaCrystallog.A,vol.45,50(1989))对这一初始模型用模拟退火慢降温过程(初始温度=3000K)，随后用传统最小二乘法进行修正，使用15-3.0之间的数据(F＞=3σF)，施加非晶体学对称性约束。模型收敛于R因子0.28。用sigmaA法(Read,Acta Crystallog.A,Vol.42,140(1986))结合MIRAS和模型的相角，计算了2.2的电子密度图。缺失的残基被建造出来，同时对结构的其余部分进行了相当大的手工调整，然后用模拟退火(初始温度=1000K)进行修正，使用8.0-2.2A之间的数据(F＞=3σF)。模型收敛于R因子0.245。随后进行的限制性各向同性B因子修正给出R因子0.225。采用计算的相角计算了sigmaA加权的2fo-fc和fo-fc电子密度图，并被用于鉴别错误，以及定位钙离子。获得1.9的母体数据后，fo-fc和2fo-fc差值电子密度图被用于定位残留的错误和识别有序水分子，继之以Powell能量最小化和立体化学约束的B因子修正。

目前模型的R因子为0.19(15-1.9,F＞=3σF)，包含7914个非氢原子且包括630个水氧原子和3个钙原子。它的几何学质量很好，与理想键长键角的r.m.s偏差分别为0.012和1.35°。φ和ψ角的Ramachandron图显示残基150是唯一的显著偏离允许区的非甘氨酸残基。

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶包含483个残基。在目前的模型中N端的头3个残基和C端的残基缺失，缺失的残基还有：分子1的残基181-195，分子2的残基181-193。这一例子导出的数据列于表1。

表1

数据集	分辨率	Rmerge	R-deriv	位点数	Phasing power	反常散射
							母体SmCl3PtI6PtCl4Hg(Ac)2IrCl6HgI3Me3PbI	50-1.850-2.250-3.050-3.050-3.050-3.050-2.250-2.2	0.09	-0.0730.2590.2490.1240.2260.1330.186	-455441212	-1.451.221.291.331.011.481.29	-YNNNNYY

Claims (14)

1．一种包含结构域A，结构域C和钙离子结合位点的α-淀粉酶，其中该钙离子结合位点与所述结构域A和所述结构域C相关，其包含位于所述结构域A和/或结构域C中的配体残基，其中所述的α-淀粉酶被修饰以改变该钙离子结合位点的特性从而改变所述α-淀粉酶的性质。

2．根据权利要求1的α-淀粉酶，其中所述的对该α-淀粉酶的修饰包括在该α-淀粉酶中替换、添加或删除一种或多种氨基酸残基的基因工程修饰。

3．根据权利要求2的α-淀粉酶，其中所述的α-淀粉酶由芽孢杆菌或其衍生菌产生。

4．根据权利要求3的α-淀粉酶，其中所述的α-淀粉酶由地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌或其衍生菌产生。

5．根据权利要求2的α-淀粉酶，其中所述的基因工程修饰包括在等价于地衣芽孢杆菌中290-309,339-347,402-411,426-436和/或472-477的位置上替换、添加或删除一种氨基酸残基。

6．根据权利要求5的α-淀粉酶，其中所述的基因工程修饰包括在地衣芽孢杆菌中Q291,Q298,G299,G301,Y302,M304,L307,N309,Q340,F343,F403,H405,H406,D407,V409,G410、L427,I428,D430,G433,K436,N473,G474和G475中的一处或多处替换。

7．一种含有根据权利要求1的α-淀粉酶的洗涤剂。

8．一种含有根据权利要求1的α-淀粉酶的淀粉液化组合物。

9．根据权利要求1的α-淀粉酶，其中所述的α-淀粉酶还包含在等价于地衣芽孢杆菌中M15,V128,H133,W138,N188,A209和/或M197的一个或多个残基的替换或删除。

10．一种液化淀粉的方法，其包括以下步骤：将根据权利要求1的一种α-淀粉酶加入到淀粉的水溶液中，在合适的条件下孵育合适的时间以液化该淀粉水溶液。

11．一种编码根据权利要求1的α-淀粉酶的DNA。

12．一种表达载体，其中权利要求11的DNA被可操纵地连接到可以用于表达该DNA的表达控制序列上。

13．一种用权利要求12的表达载体转化的宿主细胞。

14．一种在宿主细胞中表达和/或分泌权利要求11的DNA的方法。

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