CN1220995A - 总rna提取试剂及其制造方法以及提取总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核糖核酸(RNA)技术领域,涉及一种总RNA提取试剂及其制造方法以及提取总RNA的方法。该提取试剂以异硫氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料,以十二烷基肌胺酸钠、十二烷基硫酸钠两种去垢剂,柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸提供盐分和调节pH值,以消毒双蒸水和苯酚作为溶剂来制取。用本发明的总RNA提取试剂提取RNA操作过程简单、操作时间短、提取的RNA质量略优于进口的TRIzol试剂,生产成本低。
Description
本发明属于核糖核酸(RNA)技术领域,涉及一种总RNA提取试剂及其制造方法以及提取总RNA的方法。
核糖核酸即RNA是细胞内基因表达的产物,细胞RNA的提取是目前分子生物学研究方法之一。由于自然界和实验室都存在大量的RNA酶,因此RNA的提取产物极易降解,给实验带来较大困难。因此如何快速提取RNA并防止RNA的降解而使之储存较长的时间,一直是分子生物学研究人员要解决一个难题。现有的提取RNA的技术有:1、氯化铯硫氰酸胍法:该方法操作复杂,要求超速离心24小时(十万转/分钟),且时间太长,现已淘汰不用。2、氯化锂硫氰酸胍法:该方法操作时间长达24小时,时间太长,也已淘汰不用。3、酸性硫氰酸胍法(一步法):该方法操作简化,时间缩短到4小时,在时间上大大缩短了,但对于提取多个样本,时间还太长,故现大部分已被TRI zol RNA试剂法取代。4、TRIzol RNA试剂法:这是美国生命技术公司在酸性硫氰酸胍法(一步法)基础上开发的产品,以苯酚硫氰酸胍混合而成的一种提取试剂。采用该试剂提取时间由4小时缩短到1小时左右。但采用该方法还存在以下不足:RNA的提取产量偏低,有时RNA部分降解,操作时间仍然偏长。《国外医学·遗传学分册》杂志在95年第18期上登载一篇文章“TRI zol:一种适于一步分离RNA的新试剂”,对TRI zol试剂和使用情况作了介绍。
本发明的目的是要提供一种能使提取总RNA(同时含rRNA、tRNA、mRNA)的时间更短、制作简单、提取效率更高的总RNA提取试剂及其制造方法以及操作更简单快速的提取总RNA的方法。
本发明的目的是用以下方式来实现的。本发明的总RNA提取试剂含有RNA酶的高效抑制剂、去垢剂、PH调节剂、溶剂,高效抑制有异硫氰酸胍、溶剂为双蒸水和苯酚,还有盐酸胍作为高效抑制剂,所含原料的比例(重量百分比)为:异硫氰酸胍15-45%、盐酸胍1-20%、去垢剂0.2-0.7%、双蒸水10-35%、苯酚12-46%、PH调节剂0.005-0.02%。去垢剂可采用十二烷基肌胺酸钠和十二烷硫酸钠,其用量分别为十二烷基肌胺酸钠0.12-0.35%、十二烷基硫酸钠0.1-0.31%。PH调节剂为柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸,其用量为柠檬酸三钠0.001-0.005%、醋酸钠0.005-0.01%、适量冰醋酸。另外,本提取试剂中,还含有巯基乙醇作为抗氧化剂。
本发明用于总RNA提取试剂的制造方法,是以异硫氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料,辅以十二烷基肌胺酸钠、十二烷基硫酸钠两种去垢剂,柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸提供盐分和调节PH值,以巯基乙醇作为抗氧化剂,以消毒双蒸水(经焦碳酸二乙酯预处理)为溶剂之一,先按以下比例(重量百分比):异硫氰酸胍15-45%、盐酸胍1-20%、去垢剂0.2-0.7%、十二烷基胺酸钠0.12-0.35%、十二烷基硫酸钠0.1-0.31%、柠檬酸三钠0.001-0.005%、醋酸钠0.005-0.01%、消毒双蒸水10-35%,在45℃温度下混合溶解平衡0.1-2小时,再加入12-46%(或以上原料体积的0.5-1.5倍)的重蒸苯酚,室温冷却至2℃-30℃,用适量冰醋酸调至PH3.5-6.5,此即为总RNA提取试剂成品,储存于-70℃-+25℃,有效期长达1-3年。下面为用本发明制造总RNA提取试剂的非限定实施例:
实施例1:取异硫氰酸胍45份、盐酸胍20份、十二烷基肌胺酸钠0.35份、十二烷基硫酸钠0.31份、柠檬酸三钠0.005份、醋酸钠0.01份、消毒双蒸水10份(都为重量份),在70℃温度下溶解平衡2小时,加入1.5倍体积的重蒸苯酚,室温冷却至30℃,用冰醋酸调至PH6.5。此即为总RNA提取试剂成品。储存于+25℃中,有效期可长达1年。
实施例2:取硫氰酸胍15份、盐酸胍1份、十二烷基肌胺酸钠0.12份、十二烷基硫酸钠0.1份、柠檬酸三钠0.001份、醋酸钠0.005份、消毒双蒸水35份(都为重量份),在45℃温度下混合溶解平衡0.1小时,加入0.5倍体积的重蒸苯酚,室温冷却至2℃,用冰醋酸调至PH3.5。此即得到总RNA提取试剂成品。储存于-70中,有效期可长达三年。
本发明使用以上制造出的总RNA提取试剂来提取总RNA的方法,其提取步骤如下:
1、按1ml总RNA提取试剂加入到用于提取总RNA的组织如50-100mg组织块(冰上匀浆)或10cm2的贴壁培养细胞或105-107的悬浮细胞中的比例混合,然后转入Eppendorf管,
2、加0.1ml氯仿、异戊醇的混合液〔氯仿∶异戊醇=(24-49)∶1〕振荡10秒种,进行翠取,
3、10000g离心,10分钟,在4℃温度。
4、取上层水相转入新的Eppendorf管(注意不要吸取界面),
5、加等体积的-20--80℃预冷的异丙醇颠摇10秒钟,
6、10000g离心、10分钟、在4℃温度,
7、去上清液,得白色沉淀即总RNA,
8、加1ml75%酒精冲洗RNA沉淀,
9、弃酒精,气干或真空干燥5分钟,
10、加适量RNA保护剂溶解RNA,低温储藏备用。
下面为本发明使用总RNA提取试剂提取总RNA的非限定实施例:
实施例3:取本发明的总RNA提取试剂成品0.1毫升,加入10毫克组织或105个细胞中,破碎组织细胞,保护RNA,以氯仿、异戊醇按24∶1比例进行翠取分离RNA、以-70℃预先冷却的异丙醇沉淀RNA。加1ml75%酒精冲洗RNA沉淀(去掉盐分和残留的异丙醇)弃酒精,气干(自然干燥),加适量RNA保护剂溶解RNA,低温储藏备用。
实施例4:取本发明的总RNA提取试剂成品1.5毫升,加入1克组织或107个细胞中,破碎组织细胞,保护RNA,以氯仿、异戊醇按49∶1比例进行翠取分离RNA。以-20℃预先冷却的异丙醇沉淀RNA。加0.5ml75%酒精冲洗RNA沉淀,弃酒精,真空干燥5分钟,加适量RNA保护剂溶解RNA,低温储藏备用。
用本发明的总RNA提取试剂来提取总RNA操作过程简单,操作时间短(约30-40分钟),提取的RNA质量略优于进口的TRI zol试剂,生产成本低。
Claims (6)
1、一种总RNA提取试剂,含有RNA酶的高效抑制剂、去垢剂、抗氧化剂、PH调节剂、溶剂,高效抑制剂有异硫氰酸胍、溶剂为双蒸水和苯酚,其特征在于还有盐酸胍作为高效抑制剂,所含原料的比例(重量百分比)为:异硫氰酸胍15-45%、盐酸胍1-20%、去垢剂0.2-0.7%、消毒双蒸水10-35%、苯酚12%-46%、PH调节剂0.005-0.02%。
2、根据权利要求1所述的总RNA提取试剂,其特征在于去垢剂为十二烷基肌胺酸钠和十二烷硫酸钠,其用量分别为十二烷基肌胺酸钠0.12-0.35%、十二烷基硫酸钠0.1-0.31%。
3、根据权利要求1或2所述的总RNA提取试剂,其特征在于PH调节剂为柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸,其用量为柠檬酸三钠0.001-0.005%、醋酸钠0.005-0.01%,适量冰醋酸。
4、根据权利要求3所述的总RNA提取试剂,其特征在于用巯基乙醇作为抗氧化剂,用量为0.2-0.5%。
5、一种用于权利要求1所述的总RNA提取试剂的制造方法,是以异硫氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料,辅以十二烷基肌胺酸钠、十二烷基硫酸钠两种去垢剂,柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸提供盐分和调节PH值,以巯基乙醇作为抗氧化剂,以消毒双蒸水(经焦碳酸二乙酯预处理)为溶剂之一,先按以下比例(重量百分比):异硫氰酸胍15-45%、盐酸胍1-20%、去垢剂0.2-0.7%、十二烷基胺酸钠0.12-0.35%、十二烷基硫酸钠0.1-0.31%、柠檬酸三钠0.001-0.005%、醋酸钠0.005-0.01%、消毒双蒸水10-35%,在45℃温度下混合溶解平衡0.1-2小时,再加入12-46%(或以上原料体积的0.5-1.5倍)的重蒸苯酚,室温冷却至2℃-30℃,用适量冰醋酸调至PH3.5-6.5,此即为总RNA提取试剂成品,储存于-70℃-+25℃。
6、一种使用权利要求1所述的总RNA提取试剂来提取总RNA的方法,其提取步骤如下:
①、按1ml总RNA提取试剂加入到用于提取总RNA的组织如50-100mg组织块(冰上匀浆)或10cm2的贴壁培养细胞或105-107的悬浮细胞中的比例混合,然后转入Eppendorf管,
②、加0.1ml氯仿、异戊醇的混合液〔氯仿∶异戊醇=(24-49)∶1〕振荡10秒种,进行翠取,
③、10000g离心,10分钟,在4℃温度,
④、取上层水相转入新的Eppendorf管(注意不要吸取界面),
⑤、加等体积的-20--80℃预冷的异丙醇颠摇10秒钟,
⑥、10000g离心、10分钟、在4℃温度,
⑦、去上清液,得白色沉淀即总RNA,
⑧、加1ml75%酒精冲法RNA沉淀,
⑨、弃酒精,气干或真空干燥5分钟。
⑩、加适量RNA保护剂溶解RNA,低温储藏备用。
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