CN1216768A

CN1216768A - 生物抗菌肽及其制备方法

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Publication number: CN1216768A
Application number: CN98123799A
Authority: CN
Inventors: 李青山; 苟小军; 滕利荣; 王彦忠; 李向晖; 黄程芳
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 1999-05-19
Anticipated expiration: 2018-10-29
Also published as: CN1064050C

Abstract

本发明涉及一种生物抗菌肽及其制备方法,本发明的抗菌肽以林蛙蛙皮为原料,经除脂除肌肉前处理、溶胀、匀浆、抽提、离心、沉淀、透析除盐、浓缩、洗脱、收集活力峰等步骤,最后制得。本抗菌肽具有制备工艺简单、产率高、抗菌谱广、杀菌效力高等优点,可广泛地应用于食品、水果及蔬菜保鲜及护肤品等领域。

Description

生物抗菌肽及其制备方法

本发明涉及一种生物抗菌肽及其制备方法，特别是涉及一种从林蛙蛙皮提取的抗菌肽及其制备方法。

七十年代末期，瑞典科学家Boman首先从惜古比天蚕(HyalopHoracecropia)蛹中经诱导分离纯化了天蚕素(cecropins)，引起了人们的广泛重视，特别是80年代后期以来对抗菌肽的筛选、纯化、结构测定、机理研究、基因克隆和应用研究等方面都取得了显著的进展。1989年Lee等人从猪小肠中发现并纯化了抗菌肽，又有人从牛气管和两栖类中发现并纯化了抗菌肽，说明抗菌肽类化合物是广泛存在的。目前已确定一级结构的抗菌肽有二十几种，可分为有二硫键抗菌肽和不含二硫键的抗菌肽，这些抗菌肽的残基数一般在20-40之间，具有广谱抗细菌、抗病毒和抗癌等重要功能，具有重要的应用价值。

本发明的目的是提供一种制备工艺简单、原料来源广泛、成本低廉、抗菌谱广的生物抗菌肽及其制备方法。

本发明所涉及的生物抗菌肽以林蛙蛙皮为原料，其制备工艺路线如下：

1、取林蛙干皮或鲜皮，进行除脂，除肌肉的前处理；

2、加少量(1～2ml/g干皮)的缓冲液(0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的酸性或中性缓冲溶液)，于4℃～80℃溶胀1～24小时；(鲜皮材料无需此步操作)

3、鲜皮或溶胀后干皮于组织匀浆器中匀浆；

4、加上述缓冲液(10～100ml/g蛙皮)4℃～80℃抽提2～72小时；

5、3000～10000r.p.m,5～30min离心，收集上清，对沉淀物可重复操作4,5步骤2～3次；

6、合并上清液，加(NH₄)₂SO₄沉淀，(NH₄)₂SO₄终浓度为20～80％；或沸水浴5～10min；

7、4000～20000r.p.m,10～30min离心，收集上清液；

8、对上清液透析24～72小时除盐；

9、透析后上清液超滤浓缩(超滤膜分子量截留值为1000Da)或冻干浓缩；

10、浓缩液上CM-纤维素柱，平衡液为pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液，洗脱液为pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc～HAc缓冲液，进行梯度洗脱，收集活力峰；

11、活力峰超滤浓缩(超滤膜分子量截留值为1000Da)或冻干浓缩；

12、浓缩液上Sephadex G-25/G-50柱，洗脱条件为pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸缓冲液，收集活力峰；

13、活力峰超滤浓缩(超滤膜分子量截留值为1000Da)或冻干浓缩；

14、浓缩液上制备型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，或梯度洗脱，收集活力峰；

15、活力峰冻干，于零下20℃保存，得本发明所说的从林蛙蛙皮制备的抗菌肽。

本抗菌肽具有如下性能：

(一)生化特性：

1、热稳定性

林蛙皮抗菌肽80℃ 5小时不失活，100℃ 10min仍有活力；

2、pH值稳定性

在pH2～13范围内活力稳定，最适pH值为pH6.4；

3、非极性体系稳定性

抗菌肽在15％六氟异丙醇中呈稳定的α-螺旋构象，在磷脂脂质体中也呈稳定α-螺旋构象；

4、等电点

采用pH值调节测吸光度法测定蛙皮抗菌肽的pI值：

pI值为8.0～10.5的碱性多肽；

5、分子量

采用凝胶过滤层析法、聚丙烯酰氨垂直板电泳法及激光解吸电离飞行时间质谱法，测得本抗菌肽的分子量为4～6KD；

6、氨基酸组成：

用6N HCl于100～120℃下在真空安瓿瓶内水解10～24小时，水解后除去过量盐酸，于HITACHI 835-50氨基酸自动分析仪上测定抗菌肽含有氨基酸种类为：天门冬氨酸(Aspartic acid)；苏氨酸(Threonine)；丝氨酸(Serine)；谷氨酸(Glutamic acid)；甘氨酸(Glycine)；丙氨酸(Alanine)；半胱氨酸(Cystine)；缬氨酸(Valine)；甲硫氨酸(Methionine)；异亮氨酸(Isoleucine)；亮氨酸(Leucine)；酪氨酸(Tyrosine)；苯丙氨酸(Phenylalanine)；赖氨酸(Lysine)；组氨酸(Histidine)；精氨酸(Arginine)；脯氨酸(Proline)。

(二)生理活性

采用两种方法测定抗菌肽的生理活性

1、液体比浊法

将处于对数生长期的菌液预冷后，3000r.p.m离心10分钟得菌体，用pH7.0、0.2M磷酸缓冲液洗去残余培养基后，将菌体悬浮于pH7.0、0.2M磷酸缓冲液中，使OD值为0.3～0.4，按2ml/管加入菌液，并加入适量的待测样，设立阳性、阴性对照，混匀后，37℃摇床培养45分钟，冰浴10分钟。

λ600nm处测OD值

根据μ²=(A₀-A)/A计算抑菌活力

μ：活力单位；A₀：阴性对照OD值；A：样品管OD值。

2、抑菌圈法

用相同大小滤纸片分别加入不等量抗菌肽，晾干后，置于涂菌液的培养皿内，24小时后观察结果，以抑菌圈大小来测定抑菌活力。

3、实验结果

经测定，林蛙皮抗菌肽可广泛抑制多种革兰氏阳性、阴性细菌及真菌，下表给出了几种细菌的最低抑菌浓度。

最小抑菌浓度(μg/ml)

菌种	抗菌肽
菌种	抗菌肽	铜绿假单孢菌 G^-Organism 27853	5
大肠杆菌 G^-Escherichia coli ATCC25922	10	铜绿假单孢菌 G^-Organism 27853	5
大肠杆菌 G^-Escherichia coli ATCC25922	10	粪链球菌 G⁺S.faccalis ATCC29212	10
枯草杆菌 G⁺Bacillus sublilis 63501	10	粪链球菌 G⁺S.faccalis ATCC29212	10
枯草杆菌 G⁺Bacillus sublilis 63501	10	普通变形杆菌 G⁺Proteus vulgaris 49027	30

(三)水果保鲜试验

A组：选取草莓6枚，水洗后室温放置(标记为A1～A6)；

B组：选取草莓4枚，水洗后喷抗菌肽蛙皮初提液(相当于步骤5得到的抗菌肽)

(标记为B1～B4)；

C组：选取草莓4枚，水洗后喷步骤15后得到的抗菌肽

(标记为C1～C4)。

试验结果如下(单位：小时)：

时间

A组

B组

C组

24	A1软化，有液体流出	正常	正常
24	A1软化，有液体流出	正常	正常	33	A1有霉菌出现，A2开始软化	正常	正常
48	A1、A2大量霉菌且有孢子生成；A3开始腐烂；A4、A5有斑点状软化区	B1有软化点	正常	33	A1有霉菌出现，A2开始软化	正常	正常
48	A1、A2大量霉菌且有孢子生成；A3开始腐烂；A4、A5有斑点状软化区	B1有软化点	正常	57	A1、A2、A3出水干缩，长出黑曲霉等真菌；A4、A5、A6出现软化区	B1出现软化区	C1出现软化区
72	A1、A2、A3完全腐烂；A4、A5、A6霉烂	B1、B2、B3出现霉烂	C2、C3、C4干缩	57	A1、A2、A3出水干缩，长出黑曲霉等真菌；A4、A5、A6出现软化区	B1出现软化区	C1出现软化区
72	A1、A2、A3完全腐烂；A4、A5、A6霉烂	B1、B2、B3出现霉烂	C2、C3、C4干缩	96	A1～A6完全腐烂	B4干缩	C2、C3、C4干缩
130	A1～A6完全腐烂	B4干缩	C2、C3、C4干缩	96	A1～A6完全腐烂	B4干缩	C2、C3、C4干缩

生理活性试验及水果保鲜试验表明：本发明的生物抗菌肽可广泛地用于食品、水果保鲜，护肤品等领域。

本抗菌肽来源于生物，是一种小肽分子，属天然物质，且水溶性极好，用于水果保鲜，抗菌肽会形成一层无色保护膜，隔绝空气的接触并能杀死水果表面的细菌，从而达到水果保鲜保水的目的，对水果的色香味影响不明显。

抗菌肽对于皮肤上存在的各种细菌具有高效杀伤作用，如铜绿假单孢菌，其活性比溶菌酶还高，抗菌肽制剂应用于皮肤消毒，具有对皮肤无损害，杀菌效果好的优点。应用于护肤品中，由于其特有的杀菌性及高稳定性，可以在护肤同时得到杀菌的效果，对于常见的皮肤病如青春痘、粉刺等有一定的疗效。

可以看出，本发明的生物抗菌肽具有制备工艺简单，抗菌谱广，抗菌效果好，稳定性高等优点。

下面举例说明本发明生物抗菌肽的制备：

实施例1：

1、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉；

2、加2ml 0.01mol/L、pH2.5柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，于4℃溶胀24小时；

3、溶胀蛙皮匀浆；

4、加10ml步骤2所述的缓冲液，进行抽提，于4℃抽提72小时；

5、3000r.p.m,30min离心，收集上清；沉淀重抽提两次；

6、上清液加(NH₄)₂SO₄沉淀，至终浓度为20％；

7、4000r.p.m,30min离心，收集上清液；

8、上清液透析24小时；

9、上清液超滤浓缩；

10、浓缩液上CM-纤维素柱，pH4.0、0.01mol/L NaAc-HAc缓冲液平衡，以pH5.0、0.1～0.5mol/L NaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；

11、活力峰冻干浓缩；

12、浓缩液上Sephadex G25柱，pH6.0、0.01mol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液洗脱，收集活力峰；

13、活力峰冻干浓缩；

14、浓缩液上半制备型HPLC(Sepherisorb C₁₈ 10μ),10％乙腈(0.01％TFA)洗脱，收集活力峰；

15、活力峰冻干于零下20℃保存。

产率：2.7mg/g干皮。

实施例2：

取林蛙干皮1g，前处理后加入2ml、0.5mol/L、pH7.0 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，80℃溶胀1小时，匀浆后加入100ml上面所述的缓冲液进行抽提，于80℃抽提2小时，10000r.p.m、10min离心，收集上清液，上清液加入(NH₄)₂SO₄沉淀，(NH₄)₂SO₄终浓度为80％，20000r.p.m、离心10min，收集上清液，透析72小时除盐，上清液冻干浓缩；浓缩液上CM-纤维素柱，以pH5.0、0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液平衡，以pH5.5、0.1～0.5mol/L NaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰，活力峰冻干浓缩；浓缩液上Sephadex G50柱，洗脱条件为pH7.0、0.1mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，收集活力峰冻干浓缩；浓缩液上半制备HPLC(Sepherisorb C₁₈ 10μ)，80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，收集活力峰；冻干于零下20℃保存。

产率：1.9mg/g干皮。

实施例3：

1、取林蛙干皮1g，除脂除肌肉前处理；

2、加2ml、0.2mol/L、pH5.0 NaAc-HAc缓冲液，于40℃溶胀4小时；

3、匀浆；

4、加50ml步骤2所述的缓冲液进行抽提，70℃抽提4小时；

5、6000r.p.m,15min离心，沉淀反复抽提两次；

6、沸水浴10min；

7、18000r.p.m,15min离心，收集上清液；

8、上清液透析36小时除盐；

9、上清液超滤浓缩；

10、浓缩液上CM-纤维素柱，平衡液为pH4.0、0.05mol/LNaAc-HAc缓冲液，以pH5.1、0.2～0.5mol/L NaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；

11、活力峰超滤浓缩；

12、浓缩液上Sephadex G25柱，pH6.4、0.05mol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液洗脱，收集活力峰；

13、活力峰超滤浓缩；

14、浓缩液上半制备型HPLC(Sepherisorb C₁₈ 10μ),20～80％乙腈(0.01％TFA)梯度洗脱，收集活力峰；

15、冻干于零下20℃保存。

产率：3.5mg/g干皮

Claims

1、一种用林蛙蛙皮制备生物抗菌肽的方法，其步骤如下：

(1)取林蛙干皮或鲜皮，进行除脂，除肌肉的前处理；

(2)加少量的缓冲液，于4℃～80℃溶胀1～24小时；

(3)鲜皮或溶胀后干皮于组织匀浆器中匀浆；

(4)加缓冲液，10～100ml/g蛙皮，于4℃～80℃抽提2～72小时；

(5)3000～10000r.p.m,5～30min离心，收集上清，沉淀。可重复操作4,5步骤2～3次；

(6)上清液加(NH₄)₂SO₄沉淀，(NH₄)₂SO₄终浓度为20～80％；或沸水浴5～10min；

(7)4000～20000r.p.m,10～30min离心，收集上清液；

(8)合并上清透析24～72小时除盐；

(9)透析后上清液超滤浓缩，超滤膜分子量截留值为1000Da，或冻干浓缩；

(10)浓缩液上CM-纤维柱，平衡液为pH4.0～5.0,0.01～0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液，洗脱液为pH5.0～5.5,0.1～0.5mol/LNaAc-HAc缓冲液梯度洗脱，收集活力峰；

(11)活力峰超滤浓缩，超滤膜分子量截留值为1000Da，或冻干浓缩；

(12)浓缩液上Sephadex G-25/G-50柱，洗脱条件为pH6.0～7.0,0.01～0.1mol/L磷酸缓冲液，收集活力峰；

(13)活力峰超滤浓缩，超滤膜分子量截留值为1000Da，或冻干浓缩；

(14)浓缩液上制备型HPLC,10～80％乙腈(0.01％TFA)洗脱，或梯度洗脱，收集活力峰；

(15)活力峰冻干，于零下20℃保存，得从林蛙蛙皮制备的抗菌肽。

2、如权利要求1所述的制备生物抗菌肽的方法，其特征在于：所说的缓冲液为0.01～0.5mol/L,pH2.5～7.0的溶液。

3、权利要求1所述方法制备的生物抗菌肽，其具有如下特征：

(1)热稳定性

本抗菌肽80℃5小时不失活，100℃10min仍有活力；

(2)pH值稳定性

在pH2～13范围内活力稳定，最适pH值为pH6.4；

(3)非极性体系稳定性

本抗菌肽在15％六氟异丙醇中呈稳定的α-螺旋构象，在磷脂脂质体中也呈稳定α-螺旋构象；

(4)等电点

采用pH值调节测吸光度法测定蛙皮抗菌肽pI值；

pI值为8.0～10.5的碱性多肽；

(5)分子量

(6)氨基酸组成：

本抗菌肽含有氨基酸种类为：天门冬氨酸(Aspartic acid)苏氨酸(Threonine)；丝氨酸(Serine)谷氨酸(Glutamicacid)；甘氨酸(Glycine)；丙氨酸(Alanine)；半胱氨酸(Cystine)；缬氨酸(Valine)；甲硫氨酸(Methionine)；

异亮氨酸(Isoleucine)；亮氨酸(Leucine)；酪氨酸(Tyrosine)；苯丙氨酸(Phenylalanine)；赖氨酸(Lysine)；

组氨酸(Histidine)；精氨酸(Arginine)；脯氨酸(Proline)。

4、如权利要求3所述的生物抗菌肽，可用作食品、水果及蔬菜保鲜剂使用。

5、如权利要求3所述的生物抗菌肽，可用作护肤品及皮肤外用药使用。