CN1206527C - 隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片，包括基片和盖片；在基片上设缓冲液池、至少两样品池、至少两试剂池、废液池和反应检测池；其中两样品池由进样通道连通，缓冲液池经进样通道与样品池的进样通道相交后与分离通道相连；所述的分离通道、试剂池和废液池均与反应检测池相连；另在盖片上与基片上的样品池、缓冲液池、试剂池及废液池的对应位置处设置孔，然后将基片和盖片固定成芯片；本发明有较长的分离通道和巧妙的反应检测池，因而具有灵敏度和分离效果高、干扰小、试剂即时更新、多组分测定以及设备简单等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用化学发光检测的玻璃或者透明性高聚物微流控芯片，具体而言是一种适合微量荧光性有机化合物、金属离子等能够进行化学发光反应的物质的分离和检测用的微流控芯片。
背景技术
科学技术的发展要求分析科学用更低的成本、更简便的方法、更直接的途径、更快捷的方式提供所关心对象的信息。九十年代初出现的微型全分析***是分析化学的一次革命，它将传统分析化学实验室的样品预处理、反应、分离、检测等单元操作集成于微芯片上，一次性完成全部操作。所用加工技术来源于半导体微加工技术，即在玻璃或石英片上采用光刻蚀技术制作出一些微通道、微反应池等满足不同需要的微型结构，来完成化学分析任务，称为“芯片上的实验室”。由于微型全分析***的应用节约了大量的试剂和样品，加快了分析速度，提高了工作效率，简化了分析程序，避免了中间环节可能引起的污染和误差。目前应用于分离分析的微流控芯片的报道很多，检测方法为紫外检测、激光诱导荧光检测、电化学检测、质谱检测等。激光诱导荧光检测和质谱检测具有很高的灵敏度，但由于仪器体积较大，难于集成，不利于***微型化。紫外检测的灵敏度太低。电化学检测虽然具有很高灵敏度，但是由于分离强电场的影响使其应用受到限制。化学发光检测法具有灵敏度高、易于集成、制造成本低等优点，是理想的微型全分析***的检测手段。
目前公开的以化学发光作为检测手段的微流控芯片有以下几种：
(1)三维微通道生物芯片化学发光进行杂化测定：用标准光刻法制作芯片，对芯片微通道表面硅烷化，然后将探测试剂固定于微通道内表面，即可用于杂化测定。对64个点的测定标准偏差是8.1％，检测限达250amol，线形范围为3个数量级(B.J.Cheek，A.B.Steel，M.P.Torres，Y.-Y Yu，H.Yang，Chemiluminescence detection for hybridization assays on theflow-thru chip，a three-dimensional microchannel biochip，Anal.Chem.，2001，73，5777-5783.)。
(2)化学发光检测微流控芯片用于过渡金属离子的测定：X.-J.Huang等人用蠕动泵连续进样，在芯片平台上进行毛细管电泳分离，样品分离后进入发光试剂池进行化学发光反应，这并不是严格意义上的微流控芯片，而是毛细管电泳-化学发光检测。Tsukagoshi等人使用最经典的十字形微流控电泳芯片，较短的通道用于进样，而另一微通道就是分离通道，分离通道末端的液池注入发光试剂，当金属离子经分离通道进入该液池时，发生化学发光反应。Co(II)的测定表明，具有好的重现性，测定6次，迁移时间和峰高的标准偏差不超过5％，检测限0.4fmol，在1.0×10-5-1.0×10-3M范围内具有良好的相关性。但是，由于发光试剂储存于液池中，测定过程中无法进行即时更新，且反应废液积于液池中，不能即时排出，对后续金属离子的测定产生干扰。(X.-J.Huang，Q.-S.Pu，Z.-L.Fang，Capillary electro-phoresis system with flow injection sampleintroduction and chemi-luminescence detection on a chip platform，Analyst，2001，126，281-284.K.Tsukagoshi，M.Hashimoto，R.Nakajima，A.Arai，Application of microchip capillaryelectrophoresis with chemiluminescence detection to analysis fortransition-metal ions.Anal.Sci.，2000，16，1111-1112)。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种适用于有机荧光性化合物、过渡金属离子等电泳分离化学发光检测的微流控芯片；该芯片有较长的分离通道和巧妙的反应检测池，因而具有较高的灵敏度和分离效率、干扰小、试剂即时更新、多组分测定以及设备简单等特点；该微流控芯片制造成本低、易于批量生产。
本发明的目的可通过如下措施来实现：
一种隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片，包括基片和盖片；在基片上设缓冲液池D、至少两样品池A、B、至少两试剂池E、F、废液池G和反应检测池H；其中两样品池A、B由进样通道连通，缓冲液池D经进样通道与样品池A、B的进样通道相交后与分离通道相连；所述的分离通道、试剂池E、F和废液池G均与反应检测池H相连；另在盖片上与基片上的样品池A、B，缓冲液池D，试剂池E、F及废液池G的对应位置处设置孔，然后将基片和盖片固定成芯片。
当在所述的样品池A、B两端通电时，样品沿进样通道移动进入到进样通道与分离通道的交叉口C后，即在所述的缓冲液池D、试剂池E、F与废液池G之间通电；同时将样品池A、B两端浮起或加同等电位。样品在分离通道中在电场作用下，沿分离通道移动并进行分离，当到达反应检测池H时，与在电场作用下从试剂池E、F输送过来的试剂混合并发生发光反应，光信号通过置于反应检测池H下的接受器接收，而反应后产生的废液在电场作用下进入废液池G。
上述的分离通道为螺旋槽、直线槽、曲线槽、折线槽、直线与曲线和/或折线相连的槽、曲线与曲线相连的槽、曲线与折线相连的槽及曲线与直线和折线相连的槽中的一种。
上述的基片和盖片的材料选自玻璃及聚甲基丙稀酸甲脂(PMMA)、聚二甲基硅氧烷透明性高聚物(PDMS)、聚苯乙烯、聚氯乙烯、酚醛树脂、环氧树脂、聚氨酯、聚几内酰胺或他们之间的任意共聚物。
上述的盖片上的液池孔为通孔。
本发明比现有技术具有如下优点：
本发明将化学发光检测与微流控电泳芯片结合在一起，与公知的化学发光检测微流控芯片相比，有较长的分离通道和巧妙的反应检测池，因而具有较高的灵敏度和分离效率、干扰小、试剂即时更新、多组分测定以及设备简单等特点。该微流控芯片制造成本低、易于批量生产。对于海水以及环境污染水中荧光性有机化合物、过渡金属离子等物质的测定具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明的结构示意图
基片1 缓冲液池D 交叉口C 样品池A、B
进样通道5 分离通道6 试剂池E、F
反应检测池H 废液池G 盖片10 孔11
图2是本发明基片的结构示意图
图3是本发明盖片的结构示意图
图4是本发明分解示意图
具体实施方式
实施例1：
(1)基片的制作：玻璃板首先在煮沸的H2SO4∶H2O2体积比4∶1中清洗，再依次用丙酮、酒精、高纯水各进行超声波清洗10分钟。然后进行真空镀膜，镀上150nm的铬膜，再进行感光胶涂敷即PMER正性胶，600转/分钟，2分钟，厚度1微米左右，在95℃下预烘半小时，冷却，将带有设计图的掩膜胶片置于光刻胶上，紫外光波长为365nm曝光90秒，显影2分钟，然后再在100℃下烘半小时。在室温下用铬膜刻蚀液，刻蚀注解的配比为硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升，腐蚀铬膜，然后用水冲洗干净。用0.4M HF/0.4M NH4F腐蚀硼硅玻璃，腐蚀速度为6微米/小时。刻蚀十个小时后，水洗，丙酮洗，用铬膜刻蚀液除去铬膜。即为基片。废液池至检测池通道及进样通道宽度上底220微米，下底100微米，深度60微米，分离通道和试剂通道的上底宽170微米，下底宽50微米，深度60微米，分离通道长为21厘米。
(2)盖片的制作，在与基片同样材料同样尺寸的玻璃片上，选定与基片液池相对应的位置，用微型台钻打孔，孔的直径取决于钻头的直径，钻头为1毫米的金刚钻头时，孔的直径即为液池直径1毫米。
(3)键合：将基片与盖片在H2SO4∶H2O2体积比4∶1、H2O∶H2O2∶NH4OH体积比50∶10∶1、H2O∶H2O2∶HCl体积比5∶1∶1中超声波清洗10分钟，用氮气吹干，将水玻璃(含二氧化硅35-38％，氧化纳17-19％，少量氧化钙)用甩胶机均匀涂敷于盖片表面(转速约2000转/分钟，涂敷20秒)，然后将两片合拢，在氮气环境下加热至80℃并保持1小时左右。得到微结构参数等于上述盖片和基片的微流控玻璃芯片。
实施例2：
(1)玻璃阳模板制作：玻璃板首先在煮沸的H2SO4∶H2O2体积比4∶1中清洗，再依次用丙酮、酒精、高纯水各进行超声波清洗10分钟。然后进行真空镀膜，镀上150nm的铬膜，再进行感光胶涂敷(PMER正性胶，600转/分钟，2分钟，厚度1微米左右)，在95℃下预烘30分钟，冷却，将带有设计图的掩膜胶片(与玻璃芯片所用掩膜反色)置于光刻胶上，紫外光波长为365nm曝光90秒，显影2分钟，然后再在100℃下烘半小时。在室温下用铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蚀铬膜，然后用水冲洗干净。用0.2M HF/0.2M NH4F腐蚀硼硅玻璃，腐蚀速度为4微米/小时。刻蚀十五个小时后，水洗，丙酮洗，用铬膜刻蚀液除去铬膜。即为带有凸形微通道图形的基片阳模。废液池至检测池通道及进样通道宽度上底80微米，下底200微米，高度60微米，分离通道和试剂通道的上底宽30微米，下底宽150微米，高度60微米，分离通道长为21厘米。
(2)本体聚合合成PMMA芯片基片：将提纯后的甲基丙烯甲酯(MMA)与引发剂(一般为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁氰)按体积比1000∶5混合后，在85-90℃预聚合50分钟左右，迅速冷却至室温，真空脱气30分钟，然后浇铸到步骤(1)的阳模上，在45℃聚合12小时，然后升温至95℃聚合2小时，缓慢冷却至40℃左右后脱模，得PMMA微流控芯片基片，通道尺寸对应于阳模板。
(3)盖片制作：将直径为3毫米，高度为2.5毫米的不锈钢柱置于光洁玻璃特定位置，制成模具，采用与本题聚合PMMA基片相同的方法合成盖片，脱模后，取出小钢柱即成盖片。
(4)键合：将基片与盖片对齐合拢，在110℃键合2小时，即成PMMA微流控芯片，废液池至检测池通道及进样通道宽度上底200微米，下底80微米，高度60微米，分离通道和试剂通道的上底宽150微米，下底宽30微米，高度60微米，分离通道长为21厘米。
实施例3：
(1)玻璃阳模板制作：玻璃板首先在煮沸的H2SO4∶H2O2(4∶1)中清洗，再依次用丙酮、酒精、高纯水各进行超声波清洗10分钟。然后进行真空镀膜，镀上150nm的铬膜，再进行感光胶涂敷(PMER正性胶，600转/分钟，2分钟，厚度1微米左右)，在95℃下预烘半小时，冷却，将带有设计图的掩膜胶片(与玻璃芯片所用掩膜反色)置于光刻胶上，紫外曝光90秒(波长365nm)，显影2分钟，然后再在100℃下烘半小时。在室温下用铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蚀铬膜，然后用水冲洗干净。用0.2MHF/0.2MNH4F腐蚀硼硅玻璃，腐蚀速度为4微米/小时。刻蚀十五个小时后，水洗，丙酮洗，用铬膜刻蚀液除去铬膜。即为带有凸形微通道图形的基片阳模。废液池至检测池通道及进样通道宽度上底80微米，下底200微米，高度60微米，分离通道和试剂通道的上底宽30微米，下底宽150微米，高度60微米，分离通道长为21厘米。
(2)本体聚合合成PDMS芯片基片：将PDMS单体与引发剂(Sylgard 184，Dow Corning，Midland，MI)按重量比10∶1混合，浇注于步骤(1)的阳模板上，在65℃聚合1小时左右，冷却，剥离模板即得PDMS基片；
(3)盖片制作：将直径为3毫米，高度为2.5毫米的不锈钢柱置于光洁玻璃特定位置，制成模具，采用与本题聚合PDMS基片相同的方法合成盖片，脱模后，取出小钢柱即成盖片。
(4)键合：基片与盖片用乙醇洗干净，用氩气吹干，放于空气等离子器中氧化1分钟后，立即将两片合拢，盖片与基片即牢固的结合在一起，制成PDMS微流控芯片，或利用PDMS材料的粘性室温下加一定压力进行可逆键合，废液池至检测池通道及进样通道宽度上底200微米，下底80微米，高度60微米，分离通道和试剂通道的上底宽150微米，下底宽30微米，高度60微米，分离通道长为21厘米。
Claims (5)
1、一种隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片，包括基片(1)和盖片(10)；其特征在于在基片(1)上设缓冲液池(D)、至少两样品池(A，B)、至少两试剂池(E，F)、废液池(G)和反应检测池(H)；其中两样品池(A，B)由进样通道(5)连通，缓冲液池(D)经进样通道(5)与样品池(A，B)的进样通道(5)相交后与分离通道(6)相连；所述的分离通道(6)、试剂池(E，F)和废液池(G)均与反应检测池(H)相连；另在盖片(10)上与基片(1)上的样品池(A，B)、缓冲液池(D)、试剂池(E，F)及废液池(G)的对应位置处设置孔(11)，然后将基片(1)和盖片(10)固定成芯片。
2、按权利要求1所述的隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片，其特征在于所述的分离通道(6)为螺旋槽、直线槽、曲线槽、折线槽、直线与曲线和/或折线相连的槽、曲线与曲线相连的槽、曲线与折线相连的槽及曲线与直线和折线相连的槽中的一种。
3、按权利要求1所述的隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片，其特征在于所述的基片(1)和盖片(10)的材料选自玻璃及聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷透明性高聚物、聚苯乙烯、聚氯乙稀、酚醛树脂、环氧树脂、聚氨酯、聚几内酰胺或它们之间的任意共聚物。
4、按权利要求1所述的隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片，其特征在于所述盖片(10)上的孔(11)为通孔。
5、按权利要求1所述的隧道毛细管电泳化学发光检测微流控芯片，其特征在于当在所述的样品池(A，B)两端通电时，样品沿进样通道(5)移动进入到进样通道(5)与分离通道(6)的交叉口(C)后，即在所述的缓冲液池(D)、试剂池(E，F)与废液池(G)之间通电；同时将样品池(A，B)两端浮起或加同等电位。
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