CN1203092C - 产生含有人粒细胞集落刺激因子的乳的转基因山羊制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转基因山羊，其是从一种山羊受精卵发育而来，其包含一种核酸构建体，该核酸构建体含有山羊β-酪蛋白启动子的核苷酸序列和编码hG-CSF的核苷酸序列，该转基因山羊产生含有高浓度生物活性hG-CSF的乳。

Description

产生含有人粒细胞集落刺激因子的乳的转基因山羊制备方法

发明领域

本发明涉及一种山羊受精卵，其包含一种核酸构建体，该构建体以乳腺组织特异性方式表达人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)基因；本发明还涉及一种产生含有hG-CSF的乳的转基因山羊。

发明背景

hG-CSF是一种生物活性糖蛋白，其表达是由内部刺激触发的，例如细菌感染或癌症治疗，以刺激造血干细胞例如粒细胞和巨噬细胞的生长和分化，而当宿主是健康的时候，其在宿主血液中的浓度是极微量的。

由于从人体中获得hG-CSF还不是切实可行的，已经尝试使用大肠杆菌或动物细胞制备hG-CSF。用大肠杆菌生产的hG-CSF在体内的活性不稳定，及安全性未核实。另外，使用大肠杆菌生产hG-CSF的方法是不经济的，因为需要昂贵的设备和复杂的纯化程序，使用动物细胞生产hG-CSF的方法也具有同样问题。

因此，需要开发一种经济地生产生物活性hG-CSF的方法。近年来，已经报道了关于使用转基因牛，山羊或猪作为生物反应器，生产生物活性蛋白，乳蛋白和胶原蛋白的成功尝试(美国专利No.5633076，5849992和5895833)。通过这种方法产生的蛋白质与在人体内产生的相应的野生型相同，而这种生产成本比使用大肠杆菌或动物细胞的方法低1000-2000倍。WO 97/19589揭示了一种产生转基因矮小山羊的方法，但实际生产生物活性蛋白的方法未得以证实。

本发明人尝试开发一种通过使用本发明人在韩国专利申请No.97-9601(韩国专利申请公开No.98-73991)中所揭示的乳腺组织特异性表达***用转基因山羊生产hG-CSF的方法。

发明概述

因此，本发明的一个目的提供了一种山羊受精卵，其包含一种核酸构建体，所述构建体以乳腺组织特异性方式表达hG-CSF基因。

本发明的其它目的包括：

一种制备所述山羊受精卵的方法；

一种从导入所述核酸构建体的山羊中提取完整受精卵的方法；

一种产生含有hG-CSF的乳的转基因山羊；

一种从山羊受精卵中制备转基因山羊的方法；

一种使用转基因山羊生产hG-CSF的方法；

一种从转基因山羊中生产的含有hG-CSF的乳组合物；和

一种包含所述这样产生的hG-CSF的药物组合物。

根据本发明的一方面，提供了一种山羊受精卵，其包含一种核酸构建体，所述构建体含有山羊β-酪蛋白启动子的核苷酸序列和编码hG-CSF的核酸序列。

本发明的其它方面涵盖了：

一种制备山羊受精卵的方法，包括将核酸构建体微注射入完整的山羊受精卵中；

一种制备完整山羊受精卵的方法，包括同步化一种雌性山羊，使其超***，将超***的雌性山羊与雄性山羊交配，从交配的雌性山羊中回收受精卵，特征在于进行同步化步骤是将诺甲醋孕酮和***给予雌性山羊，在雌性山羊中***一种含有诺甲醋孕酮的植入物，以及除去此植入物；进行超***步骤是以预定的时间间隔相继给予雌性山羊以组合剂量的孕马血清***(PMSG)和卵泡刺激激素(FSH)，分剂量的FSH，和组合剂量的FSH和人绒毛膜***(hCG)；

一种由山羊受精卵产生的转基因山羊，其产生含有hG-CSF的乳；

一种制备转基因山羊的方法，包括将山羊的受精卵移至一个雌性山羊体内，并使山羊受精卵发育直至生产；

一种生产hG-CSF的方法，包括从转基因山羊中产生乳，并从乳中回收hG-CSF；

一种包含hG-CSF的乳组合物，是从转基因山羊中产生的；

从转基因山羊中产生的hG-CSF；和

一种药物组合物，其包含hG-CSF和一种药物适当的载体。

附图简述

本发明的上述目的和特点通过以下阐述的优选实施方案并结合附图将是显而易见的，其中：

图1是产生同步和超***山羊的图式；

图2是示出在转基因山羊基因组DNA中导入表达盒的聚合酶链反应(PCR)结果；

图3是示出在转基因山羊的基因组DNA中导入表达盒的Southern印迹分析结果；

图4是示出hG-CSF在转基因山羊乳清中表达的Western印迹结果；

图5是示出由转基因山羊乳清诱导的HL-60细胞增殖图式。

发明详述

用于制备本发明转基因山羊受精卵的核酸构建体含有山羊β-酪蛋白启动子的核苷酸序列和编码hG-CSF基因的核苷酸序列。hG-CSF的表达是由在乳腺组织中特异激活的山羊β-酪蛋白启动子控制的。hG-CSF基因和山羊β-酪蛋白启动子在GenBank中有公开，登记号分别为X03656和M90559，并可以分别得自人体和山羊组织，或使用常规DNA合成方法合成(Sambrook，J.等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约(1989))。除了山羊β-酪蛋白启动子和hG-CSF基因之外，核酸构建体还可以包含一个转录终止区。核酸构建体例如是一个表达盒pGbc-hGCSF(SEQ IDNO：1)，其中山羊β-酪蛋白启动子的核苷酸序列是从山羊β-酪蛋白启动子至山羊β-酪蛋白基因的外显子I的翻译起始密码子之前的核苷酸，而且其控制位于其下游的hG-CSF基因的表达。

本发明的转基因山羊可以通过将核酸构建体微注射入山羊的完整的单细胞阶段受精卵中而制备。微注射可以根据常规方法在倒置显微镜下用显微操作器进行(操作小鼠胚胎实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约(1994))。本发明的受精卵例如是Caprahircus aegagrus胚胎/pGbc-bGCSF，其产生自一种韩国本地种Caprahircus aegagrus，并包含表达盒pGbc-bGCSF。根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，这种转基因受精卵于1999年12月28日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：韩国生物科学和生物技术研究中心(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，韩国)，保藏号KCTC0718BP。然而，受精卵不限于本发明的转基因山羊受精卵。

用于微注射步骤中的单细胞阶段受精卵，是通过同步化一雌性山羊，使其超***，将此超***的雌性山羊与雄性山羊交配，并从交配的雌性山羊中回收受精卵而制备的。

优选地，同步化和超***步骤可以根据图1所示进行：进行同步化步骤是肌注适当数量的诺甲醋孕酮和***，以及将一个含有适量诺甲醋孕酮的植入物***耳中，并在***后的第13或14天除去此植入物；进行超***步骤是在除去植入物之前60小时开始，每12小时注射1次PMSG，FSH和hCG，共8次。注射时间表包括第一次给予PMSG和FSH；在第二次至第七次给予FSH；第八次给予FSH和hCG。在第八次与FSH一起注射hCG，可以有效地使超***增强以及调节***时间。这种方法特别适用于制备Capra hircusaegagrus的完整受精卵。

交配和回收步骤可以通过常规方法进行。在将超***的雌性山羊与雄性山羊交配后，回收受精卵可以如下进行：在除去植入物后72-76小时，通过注射麻醉剂如甲苯噻嗪或利多卡因将交配的雌性山羊麻醉，交配的山羊在注射之前禁食24小时；将其背部朝下；局部麻醉腹部中线；从腹部中线作切口，取出卵巢，输卵管和子宫；在输卵管漏斗中***一个导管；将含有胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)导入导管中，以从子宫流至输卵管；获得完整的受精卵。

可以根据常规方法，将本发明的转基因山羊受精卵移植入一个雌性山羊(受体)中，并使其发育直至生产。移植可以如下进行：将受体山羊禁食24小时；在受体山羊腹中线作切口取出卵巢，输卵管和子宫；将现代转基因受精卵的导管***输卵管漏斗中，如此可以将受精卵移至输卵管中。可以用于本发明的受体山羊选自那些处于自发的或激素如PMSG诱导的发情期动物。优选同步发情期模式中的受体。可以移植的转基因受精卵的数目是2-4个/受体山羊。受体山羊的妊娠可以在移植后大约40天，通过超声诊断设备识别。移植的受精卵发育至生产以获得转基因山羊，其体细胞和生殖细胞包含所述核酸构建体，然后繁殖转基因山羊。

本发明的核酸构建体在转基因山羊中的存在情况可以通过常规方法鉴别，例如聚合酶链反应(PCR)或Southern印迹分析。另外，hG-CSF在转基因山羊中的表达，可以通过常规方法鉴别，例如使用其乳蛋白进行Western印迹分析或酶联免疫吸附测定(ELISA)。

在交配后，转基因山羊在乳腺组织中特异地产生hG-CSF并在乳中释放hG-CSF。这样产生的hG-CSF在体内呈现保持良好的生物活性，并刺激粒细胞和巨噬细胞的生长和分化。本领域熟知hG-CSF在预防和治疗一些疾病方面是有效的，例如由骨髓移植所致白细胞减少症，恶性淋巴瘤，急性白血病，肺癌，卵巢癌，睾丸癌，脊髓发育不良，营养不良性贫血和先天性中性粒细胞减少症。

药物配方可以根据任何常规方法制备。在制备配方中，活性配料优选与载体混合或用其稀释，或装入载体中，可以是胶囊，小袋或其它容器形式。当载体作为稀释剂时，其可以是固体，半固体或液体材料，作为活性配料的运载体，赋形剂或介质。因此，配方可以是片剂，药丸，粉末，小袋，酏剂，悬浮液，乳液，乳液，糖浆，气雾剂，软或硬质凝胶胶囊，无菌可注射乳液，无菌包装的粉末等。

适当的载体，赋形剂和稀释剂例如是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，***树胶，海藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羟苯甲酸酯，丙基羟苯甲酸酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。配方另外可包括充填剂，抗粘合剂，润滑剂，湿润剂，香料，乳化剂，防腐剂等。本发明的组合物可以这样配制，以在将其以本领域熟知的任何方法给予哺乳动物后，能迅速，持续或延迟释放活性配料。

本发明的药物组合物可以通过各种途径给予，包括通过口服，经皮，皮下，静脉内及肌内给予。在人体情况下，hG-CSF的典型日剂量为大约75-600mg/kg体重，优选100-400mg/kg体重，并可以单剂或分剂量给予。

然而，应意识到实际给予的活性配料的数量应当根据各种相关因素加以确定，包括各个患者的治疗状态，选择的给药途径，年龄，性别和体重，及患者症状的程度；因此上述剂量不应以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例进一步例证了本发明而无限制之意。

实施例1：构建载体pGbc-hGCSF

质粒pGbc-S含有产生自韩国本地产山羊(Capra hircusaegagrus)的β-酪蛋白基因的一部分，这部分是从启动子至外显子I(韩国专利申请公开No.99-73991)，将该质粒用HindIII裂解，并将所得混合物用1∶1(v/v)苯酚和氯仿的混合物提取，在95％乙醇中沉淀，并溶解于蒸馏水中，获得含有山羊β-酪蛋白基因从启动子至外显子I部分的DNA片段。将此DNA片段用DraI裂解，并将所得混合物在1％琼脂糖凝胶上电泳。从琼脂糖凝胶中切下1239bp的条带，并用Geneclean II试剂盒纯化(Bio101，美国)，获得DNA片段1。

将山羊(Capra hircus aegagrus)的基因组DNA进行PCR，使用引物CAS-F1(SEQ ID NO：2)和CAS-R1(SEQ ID NO：3)，并将PCR产物用DraI和HindIII裂解并经电子提取，获得DNA片段2。

将DNA片段1和2与开环的pBluescript II(Stratagene，美国)连接，所述开环是用SalI，HindIII和小牛碱性磷酸酶处理获得的。在所得质粒的HindIII和EcoRI位点中，***DNA片段pRC/RSV，其含有hG-CSF基因，后接牛生长激素(Invitrogen，荷兰)的转录终止区，如此获得载体pGbc-hGCSF。

将载体pGbc-hGCSF用BssHII和KpnI裂解，并将所得混合物在琼脂糖凝胶上电泳，相继用Geneclean II试剂盒(BIO101)和Elutip-d(Schleicher和Schuell，德国)纯化，用透析溶液(10mM Tris-Cl(Ph7.2)和0.1M EDTA)透析，然后用0.22um滤膜(Nalgene，美国)过滤，获得表达盒pGbc-hGCSF。将这样获得的表达盒用透析溶液稀释为终浓度为4μg/ml。

实施例2：回收山羊受精卵

根据图1所示进度表，将由Konju Sabisung育种场提供的3年龄雌性韩国本地产山羊(Capra hircus aegagrus)，经肌内注射2ml含有3.0mg诺甲醋孕酮和5.0mg***的芝麻油。在除去耳毛及将耳部消毒后，使用Synchromate-B枪将植入物Synchromate-B(SanofiAnimal Health，美国)***消毒的耳部，然后在***后第13或14天经手术除去，以同步发情。

将5.6mg FSH(Ovagen，免疫化学制品，新西兰)分成8剂，并如图1所示从60小时开始每12小时肌内注射至山羊：第一次注射0.7mg FSH和0.7mg PMSG(Pregnecol，Horizon Technology，澳大利亚)，第二次至第七次注射0.7mg FSH，在第八次注射0.7mg FSH和100IU hCG。使***的雌性山羊与雄性山羊(Capra hircusaegagrus)交配12小时。

在除去植入物后72-76小时，将2％甲苯噻嗪溶液(Rompun，Bayer，韩国)肌内注射至雌性山羊，此山羊在注射前已经禁食24小时，并将此雌性山羊背部朝下定位。将10ml 2％的利多卡因注射至腹中线，以局部麻醉，并在腹中线作一个长度为4-6cm的切口，以取出卵巢，输卵管和子宫。将一个内径为1.0mm的聚乙烯导管***输卵管漏斗部并固定，将含有胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过导管导入，以反向从子宫流入输卵管，以回收完整受精卵。将此完整的受精卵贮存于改良的合成输卵管液中(mSOF：Takahashi Y.等，兽类学37：963-978(1991))，直至进行以下微注射步骤。

测试实施例1：FSH和hCG对***和受精卵回收时间的作用

(1)FSH与hCG的组合对***的影响

为测试hCG与FSH组合对韩国本地产山羊***的影响，重复实施例2的步骤，并进行对照组实验，这组是在第8次只使用0.7mgFSH而没有hCG，其余相同。在除去植入物后70-76小时，确定***率(***的山羊与全部山羊的数目比)，***点(每个***山羊的***卵泡的平均数目)，回收率(回收的***与***卵泡的数目比)和受精率(具有原核的受精卵与回收的***的数目比)。

结果示于表1。

表1：hCG与FSH组合对***的影响

	总山羊数	***的山羊(***率)	***点(***点)	回收的***	受精卵(受精率)
						FSH组	44	16(36.4％)a	127(7.9)	70(55.1)	31(44.3)
FSH+hCG组	36	36(100％)b	309(8.6)	267(86.4)	126(47.2)

^a，b是有统计学显著意义的(P＜0.05)

从表1可以看出，FSH+hCG组的***率(100％)高于FSH组(36.4％)，提示FSH和hCG组合在诱导***中是有效的。另一方面，在FSH+hCG组和FSH组中观测的受精率相似，提示hCG对受精无伤害。因此，hCG可以用于增强***率而不阻止受精。

与只用FSH可以有效诱导其它种属山羊***的报道(Selgrath J.P.等，兽类学34，1195-1205(1990)；Ebert，K.M.等，生物/技术12，699-702(1994)；和Gootwine，E.等，兽类学48，485-499)相反，FSH诱导的韩国本地产山羊的***率仅为36.4％。通过hCG和FSH组合在韩国本地产山羊中观测的***率，可以归因于韩国本地产山羊的固有生理特性所致。

(2)当组合给予hCG和FSH时，确定回收受精卵的最佳时间

为确定适于微注射的具有原核的单细胞阶段受精卵的最佳回收时间，重复实施例2的步骤，除了受精卵的回收时间是在除去植入物后62-68，70-76和78-84小时。在解剖显微镜下观测受精卵的发育阶段。

结果示于表2。

表2：当组合给予FSH和hCG时，在各种回收时间内受精卵的发育阶段

回收时间c(小时)	回收的***	受精卵(受精率)	受精卵的发育阶段(％)
							单细胞阶段	2细胞阶段	4细胞阶段	≥8细胞阶段
			62-68	10	3(30.0)	3(100)					-	-	-
70-76	183	126(68.9)					106(84.1)	17(13.5)	3(2.4)	-
			78-84	17	14(82.4)	8(57.1)					(28.6)	2(14.3)	-

^c在除去植入物后经过的时间

从表2中可以看出，在62-68小时回收的受精卵处于单细胞阶段，受精率为30％。在70-76小时回收的受精卵中，受精率高得多(70％)，虽然形成了一些2细胞和4细胞阶段的受精卵。在78-84小时回收的受精卵的单细胞阶段受精卵含量更低。

因此，为获得适于微注射的单细胞阶段受精卵，需要在除去植入物后70-76小时回收受精卵。

实施例3：将表达盒微注射入山羊受精卵中

将在实施例2中获得的受精卵在12000rpm离心7分钟，以观测每个单细胞阶段受精卵的原核。在装备微操作器(Leitz，德国)的DIC倒置显微镜下(Leitz，德国)，将1-2pl含有4μg/ml实施例1中获得表达盒pGbc-hGCSF的DNA溶液，微注射入单细胞阶段受精卵的雄性原核中。为使微注射期间pH的变化最小，使用TL-HEPES培养基(Hagen，D.R.，J.Anim.Sci.，69，1147-1150(1991))。将微注射的受精卵在mSOF培养基中，在37℃在5％CO₂下培养直至移植。选择经过上述处理存活的单细胞阶段受精卵。

这个受精卵称为Capra hircus aegagrus胚胎/pGbc-bGCSF，于1999年12月28日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：韩国生物科学和生物技术研究中心(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，韩国)，保藏号KCTC 0718BP。

实施例4：将微注射的受精卵经手术移植至受体山羊中

将自发发情期的1-3年龄的受体山羊(Capra hircus aegagrus)禁食24小时，然后将每个受体山羊的腹中线局麻，并切开以取出卵巢，输卵管和子宫。将在实施例3中获得的单细胞-4细胞阶段的受精卵，使用无菌导管经输卵管漏斗移植，所述导管是内径为0.5mm，外径为0.8mm，长度为20cm的聚乙烯管。每个受体接受的受精卵数目为2-4个。在移植后30天，受体山羊的妊娠情况用超声诊断设备(Sonorex，Medison，韩国)在移植后30天识别。使受精卵发育至生产以获得25个子代山羊。

测试实施例2：对比自发发情的受体和激素诱导发情的受体的妊娠 率和子代产生率

将在实施例3中获得的微注射的受精卵，通过重复实施例4的步骤，分别移植至自发发情的和激素诱导发情的受体山羊中。激素应答发情的受体山羊是通过重复实施例2的同步化步骤，随后根据在除去植入物后48小时山羊对激素的应答程度，肌内注射400-600IU的PMSF而制备的。检测其妊娠率和子代产生率。结果示于表3。

表3：微注射的受精卵在移植后的妊娠率和子代产生率

	受体	平均***点	平均移植的受精卵	妊娠受体(妊娠率)	子代
						激素诱导的发情组	35	5.3	2.7	9(25.7)	10
自发发情组	36	1.8	2.6	14(38.9)	15

从表3中可以看出，自发发情组的***点低于激素处理组，而自发发情组的妊娠率高于激素处理组。

实施例5：鉴别转基因山羊

(1)分离基因组DNA

从实施例4中获得的10-30天龄的山羊中，切下每个山羊的一部分耳部组织，大小为0.5cm，然后移至一个15ml试管中，加入4ml裂解溶液(10mM Tris-Cl(pH8.0)，0.1mM EDTA和0.5％SDS)。将所得混合物在55℃保持16小时以裂解组织。

将裂解的组织细胞经苯酚提取和乙醇沉淀，根据Sambrook等所述方法进行(分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约(1989))，以获得纯化的基因组DNA。将纯化的DNA溶解于蒸馏水中至终浓度为0.5μg/ml。

(2)PCR

将在(1)中获得的1ul每个子代的基因组DNA进行PCR，使用引物GB2(SEQ ID NO：4)和GCSF2(SEQ ID NO：5)或引物GB2(SEQID NO：4)和GCSF3(SEQ ID NO：6)。PCR是在94℃温育4分钟，以变性DNA；并重复30次热循环，每次循环包括94℃1分钟，55℃1分钟，及72℃1分钟。将这样获得的PCR产物在6％聚丙烯酰胺测序凝胶进行电泳，随后放射自显影。引物GB2(SEQ ID NO：4)具有β-酪蛋白基因有义链的5’部分(从1621-1640位核苷酸)的核苷酸序列，引物GCSF2(SEQ ID NO：5)和GSF3(SEQ ID NO：6)具有互补于hG-CSF有义链的3’部分的核苷酸序列(分别从第511-530位核苷酸，和第681-698位核苷酸)。

将PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，结果示于图2，其中泳道1-7是代表性子代山羊的PCR产物；泳道(-)，亲代野生型山羊；泳道(+)，亲代野生型山羊基因组DNA和质粒pGbc-hGCSF的混合物。在图2的第6泳道上，可以观测到一条480bp的条带，这是使用引物GB2(SEQ ID NO：4)和GCSF2(SEQ ID NO：5)经PCR获得的，和一条540bp的条带，这是使用引物GB2(SEQ ID NO：4)和GCSF3(SEQ ID NO：6)经PCR获得的。这证实了泳道6的子代是导入表达盒pGbc-hGCSF的转基因山羊。

(3)Southern印迹分析

将在(1)中获得的10μg子代基因组DNA用HindIII裂解，并将所得片段在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，并移至一个尼龙膜上，根据Sambrook等所述方法(如前)。将吸附DNA的尼龙膜用预杂交溶液(6×SSC，5×Denhardt’s试剂和0.5％SDS)，在68℃预杂交2小时，然后用³²P标记的hG-CSF探针杂交，所述探针是使用〔α-³²P〕dCTP通过随机引发hG-CSF基因的HindIII/NeaI片段而制备的。

在完成反应后，将尼龙膜相继用2×SSC/0.1％SDS溶液在室温冲洗，用等体积的溶液在65℃冲洗10分钟，及用1×SSC/0.1％SDS溶液在65℃冲洗10分钟。将一个X光胶片置于尼龙膜上，并在-70℃曝光3天，然后显影。

结果示于图3，其中泳道1-7代表子代山羊的基因组DNA；泳道(-)，亲代野生型山羊的基因组DNA；泳道(+)，亲代野生型山羊基因组DNA和质粒pGbc-hGCSF的混合物。图3的结果提示泳道6的子代是导入表达盒pGbc-hGCSF的转基因山羊。

通过重复上述步骤，在全部25个子代山羊中鉴别两个转基因山羊。

实施例6：对转基因山羊乳中含有的hG-CSF进行Western印迹分析

在将实施例5中获得的转基因山羊产生后代之后，在第2天(初乳)和第5天收集乳。在乳中加入等体积的1×PBS，并将所得混合物在4℃保持1小时，然后在13000rpm离心15分钟，获得上清(乳清)。将2ul上清进行15％SDS-PAGE。分别使用商购的衍生自大肠杆菌的rHuG-CSF(Kirin，日本)和衍生自CHO细胞的rHuG-CSF(Jugai，日本)作为对照组，及亲代野生型山羊的乳清，重复进行上述步骤。将在凝胶上分离的蛋白质移至硝基纤维素膜上(Amersham pharmacia biotech，美国)是根据本领域熟知的方法进行(蛋白质方法，Daniel Mbollag和Stuart J.Edelstein，Wiley-Liss，1991)。将此膜用封闭溶液(含有3％脱脂奶的1×PBS)在摇床中处理1小时。将此膜用一种溶液处理1小时，所述溶液是在摇床中通过用10ml封闭溶液将抗hG-CSF小鼠IgG(R&D***，美国)稀释1000倍，并用300ml的1×PBS进一步稀释3倍而制备的。将此膜用10ml溶液处理1小时，所述溶液是用封闭溶液将辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG抗体稀释1000倍而制备的。将此膜用1×PBS处理5分钟，共3次，并使用ECL试剂盒显影(Amersham pharmaciabiotech，美国)。

结果示于图4，其中泳道1是50ng的rHuG-CSF；泳道2是100ng的大肠杆菌rHuG-CSF；泳道3是50ng CHO rHuG-CSF；泳道4是100ng的CHO rHuG-CSF；泳道5是转基因山羊第2天的1μl乳清；泳道6是转基因山羊第5天的1μl乳清；泳道S是蛋白质分子量标记；泳道(-)是亲代野生型山羊的乳清。从图4中可以看出在转基因山羊的乳中存在一条大约18kDa蛋白质的条带，这与商购的hG-CSF相同。另外，在第5天的乳清中该条带密度比第2天乳清的强。这提示乳清中hG-CSF浓度为50-100ug/ml。因此，转基因山羊在乳中释放大量hG-CSF。

实施例7：转基因山羊乳中hG-CSF浓度

为确定转基因山羊乳中hG-CSF浓度，将在实施例6中获得的转基因山羊乳用缓冲溶液(20mM Trizma base pH7.4和1mM EDTA稀释4倍，并在4℃以27000xg离心20分钟，共进行3次，以除去脂质和糖。上清(乳清)中hG-CSF浓度使用商购的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)ELISA(Cat#DCS50，R&D***，美国)确定。

实施例8：转基因山羊乳中包含的hG-CSF的活件

将源自人体骨髓的HL-60细胞(ATCC CCL-240)在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃在5％CO₂的条件下培养。将细胞数目调节为2.2×10⁵个细胞/ml，并加入DMSO至终浓度为1.25％(v/v)。在低蒸发的96孔平板(NUNC，Denmark)的每个孔中加入90μl细胞培养物(大约2×10⁴个细胞)，并在37℃在5％CO₂的条件下培养48小时。

将实施例6获得的转基因山羊的乳清，亲代野生型山羊的乳清和商购的hG-CSF(Choongwae Pharm公司)，均用RPMI1640培养基稀释至hG-CSF终浓度为500ng/ml，并用RPMI1640培养基进行相继2倍稀释。

将2μg商购的hG-CSF(Choongwae Pharm公司)加入10ml亲代野生型山羊的乳清中，获得一种混合物，并将10μl的此混合物加入含有HL-60细胞的孔中，并在37℃培养48小时。

为检测培养物中细胞的增殖度，将每个培养物均用CellTiter96^TM处理(Cat#G4100，Promega，美国)，并在670nm波长测定其光密度。

结果示于图5，其中●代表商购的hG-CSF；

代表商购的hG-CSF和亲代野生型山羊乳清的混合物；▲代表转基因山羊乳清；代表转基因山羊乳清。从图5中可以看出，转基因山羊乳清的细胞增殖活性与商购的hG-CSF相同，而亲代野生型山羊的乳清对细胞增殖活性没有影响。另外，HL-60细胞的增殖通过转基因山羊的乳清中含有的hG-CSF诱导，其与已知的hG-CSF相同。

本发明参考优选的实施方案已经进行了阐述和例证，本领域技术人员应知道在不偏离所附权利要求中限定的本发明精神和范围的情况下，可以对本发明加以改变和修改。

                             序列表

<110>韩美药品株式会社等

<120>产生含有人粒细胞集落刺激因子的乳的转基因山羊

<130>PCA10106/HMY

<150>KR2000-3187

<151>2000-01-24

<160>6

<170>Kopatentln 1.71

<210>1

<211>3686

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>表达盒pGbc-hGCSF

<220>启动子

<221>

<222>(7)..(1763)

<223>山羊β-酪蛋白启动子的核苷酸序列

<220>

<221>终止子

<222>(3391)..(3679)

<223>牛生长激素转录终止区

<220>

<221>基因

<222>(1788)..(3390)

<223>hG-CSF基因

<400>1

gagctcttta gtatattgtt aaggatttct tgatcaagat tttacctact tttctggtcc     60

aattggtgag agacagtcat aaggaaatgc tgtgtttatt gcacaatatg taaagcatct    120

tcctgagaaa ataaaaggga aatgttgaat gggaaggata tgctttcttt tgtattcctt    180

ttctgagaaa tcagactttt tcacctgtgg ccttggcaca aaagctaaca aataaaggca    240

tatgaagtag ccaaggcctt ttctagtata tctatgacac tgagttcatt tcatcattta    300

ttttcctgac ttcctcctgg gtccatatga gcagtcttag aatgaatatt agctgaataa    360

tccaaataca tagtagatgt tgatttgggt tttctaagca atccaagact tgtatgacag    420

taagatgtat taccatccaa caacacacat ctcagcatga tataaatgca aggtatattg    480

tgaagaaaaa tttttaatta tgtcaaagtg cttactttag aaggtcatct atctgtccca    540

aagctgtgaa tatatatatt gaaggtaatg aatagatgaa gctaaccttg taaaaatgag    600

tagtgtgaat acaactacaa ttatgaacat ctgtcactaa agaggcaaag aaacttgaag    660

attgcttttg caaatgggct cctattaata aaaagtactt ttgaggtctg gctcagactc    720

tattgtagta cttagggtaa taccctcctc ctgtatgggc tttcattttc tttcttgctt    780

ccctcatttg cccttccatg aatgactagc tgataaagca ttgactataa aagatatgag    840

gccaaacttg agctgtccca ttttaataaa tctgtataat aatattgttc tacaaaagta     900

ttatctaaat aaatgttact ttctgtctta aaatccctca acaaatcccc actatctaga     960

ggatccgatt gacattccct ggaatcacag catgctttgt ctgccattat ctgacccctt    1020

tctctttctc tcttctcacc tccatctact cctttttcct tgcaattcat gacccagatt    1080

cactgtttga tttggcttgc atgtgtgtgt gctgagttgc gtctgactgt tatcaacccc    1140

atgaatgata gtccaccagg ctctactgtc catgaaattt tccagtcaag aatactggag    1200

tggattgcat ttcctactcc atttgattaa tttagtgact tttaaatttc tttttccata    1260

ttcgggagcc tattcttcct ttttagtcta tactctcttc actcttcagg tctaaggtat    1320

catcgtgtgc ttgttagctt gttactttct ccattatagc ttaagcacta acaactgttc    1380

aggttggcat gaaattgtgt tctttgtgtg gcctgtatat ttctgttgtg tattagaatt    1440

taccccaaga tctcaaagac ccactgaata ctaaagagac ctcattgtgg ttacaataat    1500

ttggggactg ggccaaaact tccgtgcatc ccagccaaga tctgtagcta ctggacaatt    1560

tcatttcctt tatcagattg tgagttattc ctgttaaaat gctccccaga atttctgggg    1620

acagaaaaat aggaagaatt catttcctaa tcatgcagat ttctaggaat tcaaatccac    1680

tgttggtttt atttcaaacc acaaaattag catgccatta aatactatat ataaacagcc    1740

actaaatcag atcattatcc attaagcttg atatcgaatt cctgcagccc agccccaccc    1800

agacccatgg ctggacctgc cacccagagc cccatgaagc tgatgggtga gtgtcttggc    1860

ccaggatggg agagccgcct gccctggcat gggagggagg ctggtgtgac agaggggctg    1920

gggatccccg ttctgggaat ggggattaaa ggcacccagt gtccccgaga gggcctcagg    1980

tggtagggaa cagcatgtct cctgagcccg ctctgtcccc agccctgcag ctgctgctgt    2040

ggcacagtgc actctggaca gtgcaggaag ccacccccct gggccctgcc agctccctgc    2100

cccagagctt cctgctcaag tgcttagagc aagtgaggaa gatccagggc gatggcgcag    2160

cgctccagga gaagctggtg agtgaggtgg gtgagagggc tgtggaggga agcccggtgg    2220

ggagagctaa gggggatgga actgcagggc caacatcctc tggaagggac atgggagaat    2280

attaggagca gtggagctgg ggaaggctgg gaagggactt ggggaggagg accttggtgg    2340

ggacagtgct cgggagggct ggctgggatg ggagtggagg catcacattc aggagaaagg    2400

gcaagggccc ctgtgagatc agagagtggg ggtgcagggc agagaggaac tgaacagcct    2460

ggcaggacat ggagggaggg gaaagaccag agagtcgggg aggacccggg aaggagcggc    2520

gacccggcca cggcgagtct cactcagcat ccttccatcc ccagtgtgcc acctacaagc    2580

tgtgccaccc cgaggagctg gtgctgctcg gacactctct gggcatcccc tgggctcccc    2640

tgagcagctg ccccagccag gccctgcagc tggtgagtgt caggaaagga taaggctaat    2700

gaggaggggg aaggagagga ggaacaccca tgggctcccc catgtctcca ggttccaagc    2760

tgggggcctg acgtatctca ggcagcaccc cctaactctt ccgctctgtc tcacaggcag    2820

gctgcttgag ccaactccat agcggccttt tcctctacca ggggctcctg caggccctgg    2880

aagggatctc ccccgagttg ggtcccacct tggacacact gcagctggac gtcgccgact    2940

ttgccaccac catctggcag caggtgagcc ttgttgggca gggtggccaa ggtcgtgctg    3000

gcattctggg caccacagcc gggcctgtgt atgggccctg tccatgctgt cagcccccag    3060

catttcctca tttgtaataa cgcccactca gaagggccca accactgatc acagctttcc    3120

cccacagatg gaagaactgg gaatggcccc tgccctgcag cccacccagg gtgccatgcc    3180

ggccttcgcc tctgctttcc agcgccgggc aggaggggtc ctggttgcct cccatctgca    3240

gagcttcctg gaggtgtcgt accgcgttct acgccacctt gcccagccct gagccaagcc    3300

ctccccatcc catgtattta tctctattta atatttatgt ctatttaagc ctcatattta    3360

aagacaggga agagcagaac ggagtctaga gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct    3420

agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc    3480

actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt    3540

cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat    3600

agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg    3660

ggctcgaggg gggatccccg ggtacc                                         3686

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物CAS-F1

<400>2

tgatcgcgag tccaccaggc tctactgtc                    29

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物CAS-R1

<400>3

gagaagctta atggataatg atctga                       26

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物GB2

<400>4

tggggacaga aaaataggaa                              20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物GCSF2

<400>5

atcttcctca cttgctttaa                               20

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物GCSF3

<400>6

ctctcaccca cctcactc                                 18

Claims (10)

1.一种山羊受精卵，其包含一种核酸构建体，所述核酸构建体含有一个山羊β-酪蛋白启动子的核苷酸序列和一个编码人粒细胞集落刺激因子hG-CSF的核苷酸序列。

2.权利要求1的山羊受精卵，其中山羊是Capra hircus aegagrus。

3.权利要求1的山羊受精卵，其中核酸构建体是表达载体pGb-hGCSF，其序列是SEQ ID NO：1。

4.权利要求3的山羊受精卵，其是保藏号为KCTC 0718BP的Caprahircus aegagrus胚胎/pGbc-bGCSF。

5.一种制备权利要求1的山羊受精卵的方法，包括将含有山羊β-酪蛋白启动子的核苷酸序列和编码hG-CSF的核苷酸序列的一种核酸构建体微注射至完整的山羊受精卵中。

6.权利要求5的方法，其中所述完整的山羊受精卵通过如下步骤制备：同步化一个雌性山羊，使其超***，将超***的雌性山羊与雄性山羊交配，并从交配的雌性山羊中回收受精卵，特征在于同步化步骤是通过将诺甲醋孕酮和***给予雌性山羊，将含有诺甲醋孕酮的植入物***雌性山羊中以及除去植入物而进行；所述超***步骤通过以预定的时间间隔相继给予雌性山羊以组合剂量的孕马血清***PMSG和***FSH，分剂量的FSH和组合剂量的FSH和人绒毛膜***hCG而进行。

7.权利要求6的方法，其中山羊是Capra hircus aegagrus；而且在同步化步骤中，给予PMSG和FSH是在除去植入物之前60小时进行的，FSH是在给予PMSG和FSH之后每12小时给予一次，共6次，而FSH和hCG是在此之后12小时给予的。

8.一种制备产生含有hG-CSF的乳的转基因山羊的方法，包括将权利要求1-4任一项的山羊受精卵移至一个雌性山羊中，并使受精卵发育直至生产。

9.一种生产hG-CSF的方法，包括从自权利要求1的山羊受精卵发育来的转基因山羊中产生乳，并从乳中回收hG-CSF。

10.一种含有hG-CSF的山羊乳，其产自权利要求1的山羊受精卵发育而来的转基因山羊。

Images