CN1198922C - 截短的血小板激活因子乙酰水解酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供编码人血浆血小板激活因子乙酰水解酶的纯化和分离的多核苷酸序列。也提供重组产生预期可用于调节病理性炎症事件的血小板激活因子乙酰水解酶产物的材料和方法。

Description

截短的血小板激活因子乙酰水解酶

                       发明领域

本发明总的涉及血小板激活因子乙酰水解酶，更具体地涉及新的编码人血浆血小板激活因子乙酰水解酶的纯化的和分离的多核苷酸、涉及由所述多核苷酸编码的血小板激活因子乙酰水解酶产物、涉及血小板激活因子乙酰水解酶产物的重组生产的材料和方法、涉及对血小板激活因子乙酰水解酶特异性的抗体物质。

                       发明背景

血小板激活因子(PAF)是由各种细胞类型合成的生物学活性磷脂。体内和在10^-10至10^-9M的正常浓度范围时，PAF通过与特异性G蛋白偶联细胞表面受体结合，激活诸如血小板和嗜中性粒细胞的靶细胞[Venable等，J.Lipid Res.，34：691-701(1993)]。PAF具有1-O-烷基-2-乙酰基- sn-甘油基-3-磷酸胆碱结构。为达到最佳生物学活性，PAF甘油主链的 sn-1位必须是与脂肪族醇的醚键， sn-3位必须具有磷酸胆碱首基。

PAF在正常生理过程中起作用(例如，炎症、止血和分娩)，并且与病理炎症反应(例如，哮喘、过敏性反应、败血症性休克和关节炎)[Venable等，见上述，和Lindsberg等，Ann.Neurol.，30：117-129(1991)]有关。PAF涉及病理反应的可能性已促使尝试调节PAF的活性，这些尝试的主要焦点是开发PAF活性的拮抗剂，所述拮抗剂干扰PAF与细胞表面受体的结合。参见，例如，Heuer等，Clin.Exp.Allergy，22：980-983(1992)。

PAF的合成和分泌及其降解和清除看来受严格控制。PAF调节机制失灵产生的过度产生、不适当地产生或缺乏降解，导致PAF的病理炎症作用，在这方面来讲，调节PAF活性的替代方法将涉及模拟或增大炎症消退发生的自然过程。已报道巨噬细胞[Stafforini等，J.Biol.Chem.，265(17)：9682-9687(1990)]、肝细胞和人肝细胞瘤细胞系HepG2[Satoh等，J.Clin.Invest.，87：476-481(1991)和Tarbet等，J.Biol.Chem.，266(25)：16667-16673(1991)]释放钝化PAF的PAF乙酰水解酶(PAF-AH)酶活性。除了钝化PAF，PAF-AH亦钝化氧化片段化的磷脂，诸如介导炎症的花生四烯酸级联的产物。参见，Stremler等，J.Biol.Chem.，266(17)：11095-11103(1991)。PAF-AH对PAF的钝化主要通过水解PAF的 sn-2乙酰基而发生，PAF-AH通过除去 sn-2酰基代谢氧化片段化磷脂。已鉴别二种类型的PAF-AH：在各种细胞类型和组织中(诸如内皮细胞和红细胞中)发现的细胞质形式和在血浆和血清中发现的细胞外形式。血浆PAF-AH不水解完整的磷脂，除了PAF，这种底物特异性允许该酶以完全活性状态在体内循环而无不利影响。血浆PAF-AH看来对活体外人血中所有PAF的降解负责[Stafforini等，J.Biol.Chem.，262(9)：4223-4230(1987)]。

虽然PAF-AH的细胞质形式和血浆形式看来具有相同的底物特异性，但血浆PAF-AH具有使其区别于细胞质PAF-AH和其它已表征的脂酶的生物化学特征。具体而言，血浆PAF-AH与脂蛋白颗粒相关联，被二异丙基氟磷酸抑制，不受钙离子影响，对蛋白酶水解相对不敏感，表现分子量为43,000道尔顿。参见，Stafforini等(1987)，见上述。Stafforini等的同一篇文章描述了从人血浆部分纯化PAF-AH的程序以及利用该程序得到的血浆材料的氨基酸组成。Stafforini等，J.Biol.Chem.，268(6)3857-3865(1993)报道已从红细胞纯化细胞质PAF-AH，在该文章中亦描述了细胞质PAF-AH的10个氨基末端残基。Hattori等，J.Biol.Chem.，268(25)：18748-18753(1993)描述了从牛脑纯化细胞质PAF-AH。其母申请提交后，Hattori等，J.Biol.Chem.，269(237)：23150-23155(1994)发表了牛脑细胞质PAF-AH的核苷酸序列。1995年1月5日，在其母申请提交后的三个月时，Smithkline Beecham PLC专利合作条约(PCT)国际公布号WO 95/00649中发表了脂蛋白相关磷脂酶A₂(Lp-PLA₂)的核苷酸序列。与本发明的PAF-AH的核苷酸序列相比，Lp-PLA₂的核苷酸序列在一个位置上有差异。该核苷酸差异(对应于SEQ ID NO：7的位置1297)导致由所述多核苷酸编码的酶之间的氨基酸差异。位于SEQ ID NO：8的位置379的氨基酸是缬氨酸，而Lp-PLA₂对应位置的氨基酸是丙氨酸。另外，本发明的PAF-AH的核苷酸序列包括在所述Lp-PLA₂序列中不存在的5’端的124个碱基和3’端的20个碱基。三个月后，1995年4月10日，一个Lp-PLA₂序列以登记号U24577贮存于GenBank，该序列与本发明的PAF-AH的核苷酸序列相比在11个位置上有区别。所述的核苷酸差异(对应于SEQ ID NO：7的位置79、81、84、85、86、121、122、904、905、911、983和1327)导致由所述多核苷酸编码的酶之间的四个氨基酸差异。SEQ ID NO：8的位置249、250、274和389的氨基酸分别是赖氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸，而所述GenBank序列中对应位置的氨基酸分别是异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。

PAF-AH的重组生产将使得可以使用外源PAF-AH模仿或增大体内炎症消退的正常过程。给予PAF-AH提供优于给予PAF受体拮抗剂的生理学优势，因为PAF-AH是在血浆中正常发现的产物。另外，因为与PAF结构相关的PAF受体拮抗剂抑制天然PAF-AH活性，由此阻止了所需要的PAF代谢和氧化片段化磷脂的代谢。因此，PAF受体拮抗剂抑制PAF-AH的活性对抗了所述拮抗剂对PAF受体的竞争性阻塞。参见，Stremler等，见上述。另外，在急性炎症部位，例如，氧化剂的释放导致天然PAF-AH酶的钝化，进而导致PAF和PAF样化合物局部水平升高，所述化合物将与任何外源给予的PAF受体拮抗剂竞争与PAF受体的结合。与之相反，用重组PAF-AH治疗将增大内源PAF-AH活性并补偿任何钝化的内源酶。

因此在本领域内需要鉴别和分离编码人血浆PAF-AH的多核苷酸序列、需要开发可用于PAF-AH重组生产的材料和方法，需要制备检测血浆中PAF-AH的试剂。

                       发明概要

本发明提供编码人血浆PAF-AH或其酶活性片段的新的纯化的和分离的多核苷酸(即，有义链和反义链DNA和RNA)。本发明的优选DNA序列包括基因组序列和cDNA序列以及全部或部分化学合成的DNA序列。本发明考虑了陈述于SEQ ID NO：7的编码PAF-AH的DNA序列和在标准严格条件下与其非编码链杂交的DNA序列或如果不是由于遗传密码的丰余性将与其杂交的DNA序列。本发明亦考虑了本发明DNA序列的生物复制物(即，体内或体外产生的分离DNA序列的拷贝)。亦提供了诸如加入PAF-AH序列的质粒和病毒DNA载体、尤其是其中编码PAF-AH的DNA可操作地连接至内源或外源表达控制DNA序列和转录终止子的载体的自主复制重组构建物。

按照本发明的另一方面，以使需要的PAF-AH在其中表达的方式，用本发明的DNA序列稳定地转化原核或真核宿主细胞。表达PAF-AH产物的宿主细胞可以为各种有用目的服务。这种细胞为开发特异性地与PAF-AH免疫反应的抗体物质组成了有价值的免疫原源。本发明的宿主细胞在大规模生产PAF-AH的方法中显著地有用，其中所述细胞生长于合适的培养基中，通过例如免疫亲和纯化从所述细胞或所述细胞生长的培养基中分离需要的多肽产物。

本发明考虑的用于从血浆纯化PAF-AH的非免疫学方法包括以下步骤：(a)分离低密度脂蛋白颗粒；(b)将所述低密度脂蛋白颗粒溶解于包含10mM CHAPS的缓冲液中，以产生第一个PAF-AH酶溶液；(c)将所述第一个PAF-AH酶溶液上DEAE阴离子交换柱；(d)使用包含1mMCHAPS的约pH7.5缓冲液洗涤所述DEAE阴离子交换柱；(e)使用包含0-0.5M NaCl梯度的约pH7.5缓冲液从所述DEAE阴离子交换柱分部洗脱PAF-AH酶；(f)将从所述DEAE阴离子交换柱洗脱的具有PAF-AH酶活性的分部收集液合并；(g)调节从所述DEAE阴离子交换柱得到的合并活性分部收集液至10mM CHAPS，以产生第二个PAF-AH酶溶液；(h)将所述第二个PAF-AH酶溶液上样至蓝染料配体亲和柱；(i)使用包含10mM CHAPS和离液盐的缓冲液从所述蓝染料配体亲和柱洗脱PAF-AH酶；(j)将所述蓝染料配体亲和柱的洗脱液上样至Cu配体亲和柱；(k)使用包含10mM CHAPS和咪唑的缓冲液从所述Cu配体亲和柱洗脱PAF-AH酶；(l)将所述Cu配体亲和柱的洗脱液进行SDS-PAGE；和(m)从所述SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离约44kDa PAF-AH酶。优选地，步骤(b)的缓冲液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS，pH7.5；步骤(d)的缓冲液是25mM Tris-HCl、1mM CHAPS；步骤(h)的柱是Blue SepharoseFast Flow柱；步骤(i)的缓冲液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、0.5MKSCN，pH7.5；步骤(j)的柱是Cu螯合Sepharose柱；而步骤(k)的缓冲液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、0.5M NaCl、50mM咪唑，pH范围为约7.5-8.0。

本发明考虑的用于从产生PAF-AH的大肠杆菌纯化酶活性PAF-AH的方法包括以下步骤：(a)从产生PAF-AH酶的大肠杆菌的溶菌产物制备离心上清液；(b)将所述离心上清液上样至蓝染料配体亲和柱；(c)使用包含10mM CHAPS和离液盐的缓冲液从所述蓝染料配体亲和柱洗脱PAF-AH酶；(d)将所述蓝染料配体亲和柱的所述洗脱液上样至Cu配体亲和柱；(e)使用包含10mM CHAPS和咪唑的缓冲液从所述Cu配体亲和柱洗脱PAF-AH酶。优选地，步骤(b)的柱是Blue Sepharose Fast Flow柱；步骤(c)的缓冲液是25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、0.5M KSCN，pH7.5；步骤(d)的柱是Cu螯合Sepharose柱；步骤(e)的缓冲液是25mMTris-HCl、10mM CHAPS、0.5M NaCl、100mM咪唑，pH7.5。

本发明考虑的用于从产生PAF-AH的大肠杆菌纯化酶活性PAF-AH的另一方法包括以下步骤：(a)从产生PAF-AH酶的大肠杆菌的溶菌产物制备离心上清液；(b)在包含10mM CHAPS的低pH缓冲液中稀释所述离心上清液；(c)将所述稀释的离心上清液上样至于约pH7.5平衡的阳离子交换柱；(d)使用1M盐从所述阳离子交换柱洗脱PAF-AH酶；提高所述阳离子交换柱的所述洗脱液的pH，将所述洗脱液的盐浓度调节至约0.5M盐；(f)将所述阳离子交换柱的所述调节洗脱液上样至蓝染料配体亲和柱；(g)使用包含约2M至约3M盐的缓冲液从所述蓝染料配体亲和柱洗脱PAF-AH酶；和(h)使用包含约0.1％吐温的缓冲液透析所述蓝染料配体亲和柱的所述洗脱液。优选地，步骤(b)的缓冲液是25mMMES、10mM CHAPS、1mM EDTA、pH4.9；步骤(c)的柱是在25mMMES、10mM CHAPS、1mM EDTA、50mM NaCl、pH5.5中平衡的Ssepharose柱；步骤(d)中使用1mM NaCl洗脱PAF-AH；步骤(e)中洗脱液的pH用2M Tris碱调节至pH7.5；步骤(f)中的柱是sepharose柱；步骤(g)的缓冲液是25mM Tris、10mM CHAPS、3M NaCl、1mm EDTA、pH7.5；步骤(h)中的缓冲液是25mM Tris、0.5M NaCl、0.1％吐温80、pH7.5。

本发明考虑的用于从大肠杆菌纯化酶活性PAF-AH的再一方法包括以下步骤：(a)制备在含有CHAPS的缓冲液中溶菌后产生溶解的PAF-AH上清液的大肠杆菌提取液；(b)稀释所述上清液，上样至于约pH8.0平衡的阴离子交换柱；(c)从所述阴离子交换柱洗脱PAF-AH酶；(d)将所述阴离子交换柱的所述调节洗脱液上样至蓝染料配体亲和柱；(e)使用包含3.0M盐的缓冲液洗脱所述蓝染料配体亲和柱；(f)将所述蓝染料洗脱液稀释入用于进行羟基磷灰石(hydroxylapatite)层析的合适缓冲液；(g)进行羟基磷灰石层析，其中使用缓冲液(含或不含CHAPS)完成洗涤和洗脱；(h)将所述羟基磷灰石洗脱液稀释至适当盐浓度以进行阳离子交换层析；(i)将所述稀释的羟基磷灰石洗脱液上样至pH范围约6.0-7.0的阳离子交换柱；(j)使用合适的配制缓冲液从所述阳离子交换柱洗脱PAF-AH；(k)在低温进行阳离子交换层析；和(l)在缺少CHAPS的情况下以液体或冷冻形式配制PAF-AH。

优选地，上述步骤(a)中的溶菌缓冲液是25mM Tris、100mMNaCl、1mM EDTA、20mM CHAPS、pH8.0；在步骤(b)中，将用于阴离子交换层析的上清液在25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0中稀释3-4倍，所述柱是在25mM Tris、1mM EDTA、50mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0中平衡的Q-Sepharose柱；步骤(c)中使用25mMTris、1mM EDTA、350mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0洗脱所述阴离子交换柱；步骤(d)中直接将步骤(c)的洗脱液上样至蓝染料亲和柱；步骤(e)中用3M NaCl、10mM CHAPS、25mM Tris、pH8.0缓冲液洗脱所述柱；步骤(f)中通过在10mM磷酸钠、100mM NaCl、10mMCHAPS、pH6.2中稀释，完成用于羟基磷灰石层析的所述蓝染料洗脱液的稀释；步骤(g)中使用以10mM磷酸钠、100mM NaCl、10mM CHAPS平衡的羟基磷灰石柱完成羟基磷灰石层析，使用50mM磷酸钠、100mMNaCl(含或不含)10mM CHAPS、pH7.5完成洗脱；步骤(h)中通过在pH范围约6.0-7.0、包含磷酸钠(含或不含CHAPS)的缓冲液中稀释，完成用于阳离子交换层析的所述羟基磷灰石洗脱液的稀释；步骤(i)中用50mM磷酸钠、(含或不含)10mM CHAPS、pH6.8平衡S Sepharose柱；步骤(j)中用诸如含有0.01％吐温80的50mM磷酸钾、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl、pH7.5的配制缓冲液完成洗脱；步骤(k)中于2-8℃完成阳离子交换层析。用于步骤(l)中稳定PAF-AH的合适的配制缓冲液的实例包括50mM磷酸钾、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl pH7.4(大约值，含或不含吐温80和或Pluronic F68)或25mM磷酸钾缓冲液，含有(至少)125mM NaCl、25mM精氨酸和0.01％吐温80(含或不含约0.1和0.5％的Pluronic F68)。

本发明考虑的用于从大肠杆菌纯化酶活性rPAF-AH产物的又一方法包括以下步骤：(a)制备在含有Triton X-100的缓冲液中溶菌后产生溶解的rPAF-AH产物上清液的大肠杆菌提取液；(b)稀释所述上清液，上样至于约pH8.0平衡的固定化金属亲和交换柱；(c)用包含咪唑的缓冲液从所述固定化金属亲和交换柱洗脱rPAF-AH产物；(d)调节盐浓度，将所述固定化金属亲和交换柱的所述洗脱液上样至疏水性相互作用柱(HIC#1)；(e)通过降低盐浓度和/或增加去污剂浓度洗脱所述HIC#1；(f)将所述HIC#1洗脱液滴定至约pH6.4；(g)将所述调节的HIC#1洗脱液上样至于约pH6.4平衡的阳离子交换柱(CEX#1)；(h)用浓度？的氯化钠洗脱所述CEX#1；(i)用氯化钠将所述CEX#1洗脱液至约2.0M浓度；(j)将所述调节的CEX#1洗脱液上样至于约pH8.0和约2.0M氯化钠平衡的疏水性相互作用柱(HIC#2)；(k)通过降低盐浓度和/或增加去污剂浓度洗脱所述HIC#2；(l)稀释所述HIC#2洗脱液并调节至约pH6.0；(m)将所述调节的HIC#2洗脱液上样至于约pH6.0平衡的阳离子交换柱(CEX#2)；(n)用合适的配制缓冲液从所述CEX#2洗脱所述rPAF-AH产物。

优选地，上述步骤(a)中的溶菌缓冲液是90mM TRIS、0.125％TritonX-100、0.6M NaCl、pH8.0，在高压匀浆器中进行溶菌；步骤(b)中将所述上清液在平衡缓冲液(20mM TRIS、0.5M NaCl、0.1％Triton X-100、pH8.0)中稀释.，将锌螯合柱(Chelating Sepharose Fast Flow，Pharmacia，Uppsala，Sweden)装柱、用平衡缓冲液平衡、用所述稀释的上清液上样、用20mM TRIS、0.5M NaCl、4M尿素、0.1％Triton X-100、pH8.0洗涤，接着用20mM TRIS、0.5M NaCl、0.02％Triton X-100、pH8.0洗涤；步骤(c)中使用20mM Tris、50mM咪唑、0.02％Triton X-100、pH8.0完成洗脱；步骤(d)中将洗脱液调节至1mM EDTA和2M NaCl，将Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Pharmacia)用平衡缓冲液(2.0M NaCl，25mM Tris，0.02％Triton X-100，pH8.0)平衡、于室温用步骤(c)的调节的洗脱液上样，用平衡缓冲液洗涤、以30cm/小时的流速用25mMNaPO₄、0.02％Triton X-100、pH6.5洗涤；步骤(e)中用25mM NaPO₄、3％Triton X-100、pH6.5完成洗脱；步骤(g)中将Macro-Prep High S柱(Bio-Rad Labs，Richmond，CA)用平衡缓冲液(20mM NaPO₄、0.02％Triton X-100、pH6.4)平衡、用步骤(f)的调节的洗脱液上样、用平衡缓冲液洗涤、用25mM Tris、0.02％Triton X-100、pH8.0洗涤；步骤(h)中用25mM Tris、0.02％Triton X-100、1.3M NaCl、pH8.0完成洗脱；步骤(j)中将Bakerbond Wide Pore Hi-Propyl C₃(Baker，Phillipsburg，NJ)用平衡缓冲液(2.0M NaCl、25mM Tris、0.02％Triton X-100、pH8.0)平衡、用步骤(i)的调节洗脱液于室温上样、用平衡缓冲液洗涤、以30cm/小时用25mM Tris、0.02％Triton X-100、pH8.0洗涤；步骤(k)中用10mMTris、3.0％Triton X-100、pH8.0完成洗脱；步骤(l)中在平衡缓冲液(20mM琥珀酸盐、0.1％PLURONIC F68、pH6.0)中稀释；步骤(m)中将SP Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱用步骤(l)的平衡缓冲液平衡、用步骤(l)的洗脱液上样、用平衡缓冲液洗涤；步骤(n)中用50mM NaPO₄、0.7M NaCl、0.1％PLURONIC F68、0.02％吐温80、pH7.5。

PAF-AH产物可以做为天然细胞来源的分离物得到或可以化学合成，但优选通过涉及本发明的原核或真核宿主细胞的重组程序产生。考虑了具有陈述于SEQ ID NO：8中的氨基酸序列的一部分或全部的PAF-AH产物。特别考虑了缺少陈述于SEQ ID NO：8的成熟人PAF-AH氨基酸序列的最多达前12个N末端氨基酸的片段，特别是那些具有SEQID NO：8的Met₄₆、Ala₄₇或Ala₄₈做为起始N末端氨基酸的片段。亦考虑了其缺少最多达SEQ ID NO：8的氨基酸序列的30个C末端氨基酸的片段，特别是那些具有Ile₄₂₉和Leu₄₃₁做为C末端残基的片段。再考虑了PAF-AH的变异体或PAF-AH或在SEQ ID NO：8的序列中具有选自以下的氨基酸置换的：S108A、S273A、D286A、D286N、D296A、D304A、D338A、H351A、H395A、H399A、C67S、C229S、C291S、C334S、C407S、D286A、D286N和D304A。如上所述，本发明提供了编码这类片段或变异体片段的多核苷酸(包括DNA)，以及通过使包含这种DNA的宿主细胞生长而重组产生这类片段或变异体的方法。本文推荐的PAF-AH产物包括编码SEQ ID NO：8的氨基酸残基Met₄₆至Asn₄₄₁的DNA的原核多肽表达产物(命名为rPH.2)和编码SEQID NO：8的氨基酸残基Met₄₆至Ile₄₂₉的DNA的原核多肽表达产物(命名为rPH.9)。例如，与位于翻译起始密码子之后的编码PAF-AH全长成熟序列的DNA的对应原核表达产物相比，rPH.2和rPH.9产物均显示较小的氨基末端异质性。另外，rPH.9显示较高的羧基末端同质性(一致性)。预期使用哺乳动物宿主细胞提供可能需要赋予本发明的重组表达产物的最佳生物学活性的翻译后修饰(例如，豆蔻酰化(myristolation)、糖基化、截短、脂化(lipidation)和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)。本发明的PAF-AH产物可以是全长多肽、片段或变异体。变异体可以包含PAF-AH类似物，其中一个或多个规定的(即，天然编码的)氨基酸缺失或被置换，或其中添加了一个或多个非规定氨基酸：(1)不丧失一种或多种PAF-AH特有的酶活性或免疫学特性；或(2)特异性地使PAF-AH的特定生物学活性丧失。可以使用与PAF-AH结合的蛋白或其它分子以调节其活性。

本发明亦考虑对PAF-AH特异性的抗体物质(例如，单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR-移植的抗体等等)和其它结合蛋白。本发明的具体描述的结合蛋白是用杂交瘤90G11D和90F2D产生的单克隆抗体，所述杂交瘤分别以保藏号HB 11724和HB 11725于1994年9月30日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852。本发明也描述的结合蛋白是用杂交瘤143A产生的单克隆抗体，该杂交瘤于1995年6月1日保藏于ATCC，保藏号是HB 11900。使用从血浆分离的PAF-AH、重组PAF-AH、PAF-AH变异体或表达这种产物的细胞，可以鉴别特异性地与PAF-AH结合的蛋白或其它分子(例如，脂类或小分子)。结合蛋白反过来可以用于免疫组合物以及用于纯化PAF-AH，并可以通过已知免疫学程序用于检测或定量体液或组织样本中的PAF-AH。亦考虑了对PAF-AH特异性抗体特异性的抗独特型抗体。

在本发明的DNA和氨基酸序列公开内容中贡献的信息的科学价值是明显的。做为实例的一个系列，PAF-AH的cDNA序列的知识使得可以通过DNA/DNA杂交分离编码PAF-AH和特化(specifying)诸如启动子、操纵基因等等的PAF-AH表达控制调节序列的基因组DNA序列。在本领域严格标准条件下使用本发明的DNA序列进行的DNA/DNA杂交程序，有可能预期使得能够分离编码PAF-AH等位变异体、共享PAF-AH的一种或多种生物化学和/或免疫学性质的其它结构相关蛋白质和与PAF-AH同源的非人类物种蛋白质的DNA。本发明提供的DNA序列信息使得可以通过同源重组或“剔除”策略[参见，例如，Kapecchi，Science，244：1288-1292(1989)]，发展不能表达功能性PAF-AH酶或表达变异PAF-AH酶的啮齿类动物。本发明的多核苷酸当适当标记时，可以用于检测细胞合成PAF-AH的能力的杂交测定中。本发明的多核苷酸亦可以是用于鉴别PAF-AH基因座中构成一种或多种疾病状态的基础的遗传改变的诊断方法的基础。本发明亦使得可以得到与调节正常表达PAF-AH的那些细胞的PAF-AH表达相关的反义多核苷酸。

考虑了将本发明的PAF-AH制剂给予哺乳动物受治疗者特别是人类以减轻病理炎症病症。基于PAF涉及病理炎症病症，给予PAF-AH适于例如治疗哮喘[Miwa等，J.Clin.Invest.，82：1983-1991(1988)；Hsieh等，J.Allergy Clin.Immunol.，91：650-657(1993)；和Yamashita等，Allergy，49：60-63(1994)]、过敏性反应[Venable等，见上述]、休克[Venable等，见上述]、再灌注损伤和中枢神经***局部缺血[Lindsberg等(1991)，见上述]、抗原诱导的关节炎[Zarco等，Clin.Exp.Immunol.，88：318-323(1992)]、动脉粥样化形成[Handley等，Drug Dev.Res.，7：361-375(1986)]、局限性回肠炎[Denizot等，Digestive Diseases and Sciences，37(3)：432-437(1992)]、局部缺血性肠坏死/坏死性小肠结肠炎[Denizot等，见上述和Caplan等，Acta Paediatr.，Suppl.396：11-17(1994)]、溃疡性结肠炎(Denizot等，见上述)、局部缺血性中风[Satoh等，Stroke，23：1090-1092(1992)]、局部缺血性脑损伤[Lindsberg等，Stroke，21：1452-1457(1990)和Lindsberg等(1991)，见上述]、***性红斑狼疮[Matsuzaki等，Clinica Chimica Acta，210：139-144(1992)]、急性胰腺炎[Kald等，Pancreas，8(4)：440-442(1993)]、败血症(Kald等，见上述)、急性感染后链球菌性肾小球肾炎[Mezzano等，J.Am.Soc.Nephrol.，4：235-242(1993)]、由IL-2治疗法引起的肺水肿[Rabinovici等，J.Clin.Invest.，89：1669-1673(1992)]、变应性炎症[Watanabe等，Br.J.Pharmacol.，111：123-130(1994)]、局部缺血性肾衰竭[Grino等，Annals of InternalMedicine，121(5)：345-347(1994)；早产[Hoffman等，Am.J.Obstet.Gynecol.，162(2)：525-528(1 990)和Maki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：728-732(1988)]；成人呼吸窘迫综合症[Rabinovici等，J.Appl.Physiol.，74(4)：1791-1802(1993)；Matsumoto等，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，19：509-515(1992)；和Rodriguez-Roisin等，J.Clin.Invest.，93：188-194(1994)]。亦考虑了使用PAF-AH制备物治疗中枢神经***的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。本文使用的“治疗”包括预防性和治疗性治疗。

本领域中已描述了许多前述病理病症的动物模型。例如，本文的实施例16中描述了哮喘和鼻炎的小鼠模型；在Zarco等，见上述中描述了关节炎的兔子模型；在Furukawa等，Ped.Res.，34，(2)：237-241(1993)和Caplan等，见上述中描述了局部缺血性肠坏死/坏死性小肠结肠炎的兔子模型；在Lindsberg等，(1990)，见上述描述了中风的兔子模型；在Matsuzaki等，见上述中描述了狼疮的小鼠模型；在Kald等，见上述中描述了急性胰腺炎的大鼠模型；在Rabinovici等，见上述中描述了由IL-2治疗法引起的肺水肿的大鼠模型；在Watanabe等，见上述)中描述了变应性炎症的大鼠模型；在Watson等，Transplantation，56(4)：1047-1049(1993)中描述了肾同种移植的犬模型；分别在Rabinovici等，见上述和Lellouch-Tubiana，Am.Rev.Respir.Dis.，137：948-954(1988)中描述了成人呼吸窘迫综合症的大鼠和豚鼠模型。

本发明特别考虑了用于治疗对PAF-AH介导的病理病症易感或患有此病症的哺乳动物的方法中的PAF-AH组合物，包含以足以补充内源PAF-AH活性和钝化所述哺乳动物中病理量PAF的量将PAF-AH给予所述哺乳动物。

本发明考虑的治疗/药学组合物包括PAF-AH产物和生理可接受的稀释剂或载体，亦可以包括具有抗炎症效应的其它药物。标明的剂量将足以补充内源PAF-AH活性和钝化病理量的PAF。关于一般剂量考虑，参见Remmington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing Co.，Easton，PA(1990)。剂量将在约0.1-约1000μg PAF-AH/kg体重之间变化。本发明的治疗组合物可以通过不同途径给予，取决于欲治疗的病理病症。例如，可以通过静脉内、皮下、口服、栓剂和/或肺途径给予。

对于肺脏的病理病症，特别标明了通过肺途径给予PAF-AH。考虑用于肺给予的是种类繁多的传递装置，包括，例如喷雾器、计量给药吸入器和粉末吸入器，均是本领域标准的。在以下描述了通过吸入气溶胶制剂将各种蛋白传递至肺脏和循环***，Adjei等，Pharm.Res，7(6)：565-569(1990)(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等，J.Cardio.Pharm.，13(Supp.5)：s.143-146(1989)(内皮缩血管肽-1)；Hubbard等，Annals ofInternal Medicine，III(3)，206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，J.Clin.Invest.，84：1145-1146(1989)(α-1-蛋白酶抑制剂)；Debs等，J.Immunol.，140：3482-3488(1933)(重组γ干扰素和肿瘤坏死因子α)；于1994年9月15日公开的专利合作条约(PCT)国际公布号WO 94/20069(重组聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子)。

                          附图简要说明

在考虑以下详细描述以及参考其中附图时，本发明的无数其它方面和优点将是显而易见的：

图1是含有从人血浆纯化的PAF-AH的PVDF膜的照片；

图2是显示重组人血浆PAF-AH酶活性的图表。

图3是描绘重组PAF-AH片段及其催化活性的图解图示。

图4描绘重组PAF-AH产物rPH.2的质谱结果。

图5描绘重组PAF-AH产物rPH.9的质谱结果。

图6是描绘通过局部给予本发明的重组PAF-AH阻断PAF诱导的大鼠足水肿的直方图。

图7是描绘通过静脉内给予PAF-AH阻断PAF诱导的大鼠足水肿的直方图。

图8是显示PAF-AH阻断PAF诱导的水肿而不阻断酵母聚糖A诱导的水肿的直方图。

图9A和9B展示大鼠足水肿中PAF-AH的抗炎活性的剂量反应结果。

图10A和10B展示的结果表明随时间进程的单剂量PAF-AH的体内效力。

图11是代表PAF-AH在大鼠循环中的药物动力学的曲线图；

图12是显示大鼠足水肿中PAF-AH的抗炎效果与效果较差的PAF拮抗剂的比较的直方图。

图13展示的结果表明，PAF-AH中和来自HIV-1感染和激活的单核细胞的条件培养基的凋亡效应。

                         发明详述

以下实施例描绘了本发明。实施例1展示了从人血浆纯化PAF-AH的新方法。实施例2描述了纯化的人血浆PAF-AH的氨基酸微序列。在实施例3中描述了编码人血浆PAF-AH的全长cDNA的克隆。在实施例4中描述了鉴别人血浆PAF-AH基因的推测剪接变异体。在实施例5中描述了编码人血浆PAF-AH的基因组序列的克隆。实施例6描述了与人血浆PAF-AH cDNA同源的犬、鼠、牛、鸡、啮齿类动物和猕猴cDNA的克隆。实施例7展示了检测的结果，该结果证明在COS7细胞中瞬时表达的重组PAF-AH的酶活性。实施例8描述了在大肠杆菌、啤酒酵母(S.cerevisiae)和哺乳动物细胞中表达全长、截短和嵌合的人PAF-AHDNA。实施例9展示了从大肠杆菌纯化重组PAF-AH的方案和确认其酶活性的测定。实施例10描述了各种重组PAF-AH产物，包括氨基酸置换类似物和氨基和羧基截短产物，并且描述了证明从血浆分离的天然PAF-AH是糖基化的实验。在实施例11中展示了用于人血浆PAF-AHRNA在各种组织和细胞系中表达的RNA印迹测定的结果，在实施例12中展示了原位杂交的结果。实施例13描述了开发对人血浆PAF-AH特异性的单克隆和多克隆抗体。实施例14、15、16、17、18和19分别描述了给予本发明的重组PAF-AH产物对动物模型中的急性炎症、胸膜炎、哮喘、坏死性小肠结肠炎、成人呼吸窘迫综合症和胰腺炎的体内治疗效果。实施例20描述了重组PAF-AH产物对与HIV感染相关的神经毒性的体外影响。实施例21展示了表现出缺乏PAF-AH活性的人类患者血清免疫测定的结果，描述了鉴别明显地对所述缺乏负责的患者中的基因损伤。

                         实施例1

为提供氨基酸测序的材料，从人血浆纯化PAF-AH。

A. 优化纯化条件

起初，使用磷钨酸盐从血浆沉淀低密度脂蛋白(LDL)颗粒，溶解于0.1％吐温20中，按照Stafforini等(1987)，见上述的方法在DEAE柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上进行层析，但是所述DEAE柱PAF-AH活性的不一致的洗脱，需要再评价溶解和后续纯化条件。

通过离心和凝胶过滤层析，评价吐温20、CHAPS(Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL)辛基葡糖苷溶解LDL颗粒的能力。CHAPS比吐温20多提供了25％溶解活性的回收，比辛基葡糖苷多提供了300％的回收。然后将用10mM CHAPS溶解的LDL沉淀使用含有1mM CHAPS的缓冲液在DEAE Sepharose Fast Flow柱(阴离子交换柱；Pharmacia)上进行分级分离，以提供部分纯化的PAF-AH的大合并液(“DEAE合并液”)以评价其它的柱。

将DEAE合并液做为原材料以测试用于进一步纯化PAF-AH活性的各种层析柱。测试的柱包括：Blue Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，染料配体亲和柱；S-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，阳离子交换柱；铜螯合Sepharose(Pharmacia)，金属配体亲和柱；Fractogel S(EMSeparations，Gibbstown，NJ)，阳离子交换柱；和Sephacryl-200(Pharmacia)，凝胶过滤柱。当在1mM CHAPS中操作时，这些层析程序产生了低、不能令人满意的纯化水平。后续在1mM CHAPS中的Sephacryl S-200凝胶过滤层析产生了在很宽大小范围、而不是预期的44kDa大致大小洗脱的酶活性分部收集液。综合考虑，这些结果表明LDL蛋白质在溶液中凝聚。

因此通过分析型凝胶过滤层析，评价不同的LDL样品的PAF-AF活性的凝聚。在用含有1mM CHAPS的缓冲液平衡的Superose 12(Pharmacia)上分析源自DEAE合并液和新鲜溶解的LDL沉淀的样品。这二种样品均在非常宽阔的分子量范围内洗脱，洗脱的绝大多数活性超过150kDa。当在用10mM CHAPS平衡的Superose 12上分析所述样品时，大量的活性在接近44kDa洗脱，与对PAF-AH活性预期的一样。但是，所述样品含有一些高分子量区的PAF-AH活性，对应于凝聚物。

其它样品当接着通过凝胶过滤检测时仅仅在约44kDa范围洗脱PAF-AH活性。这些样品是在存在0.5M NaCl下溶解于10mM CHAPS中的LDL沉淀和在从DEAE柱洗脱后调整至10mM CHAPS的新鲜DEAE合并液。这些数据表明，至少需要10mM CHAPS以保持非凝聚的PAF-AH。在DEAE上层析后但在后续层析步骤之前，将CHAPS浓度从1mM增加至10mM导致纯化的显著差异。例如，PAF-AH在S-SepharoseFast Flow上的纯化程度从2倍增加至10倍。在1mM CHAPS中PAF-AH活性与Blue Sepharose Fast Flow柱不可逆地结合，但是该柱在10mMCHAPS中提供了最高纯化水平。预先加入10mM CHAPS未改善DEAE层析。

在Blue Sepharose Fast Flow柱之后在铜螯合Sepharose上的层析将PAF-AH活性浓缩15倍。亦确定了可以从还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶回收PAF-AH活性，只要不将样品煮沸。从铜螯合Sepharose柱洗脱的材料的活性当进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，与该凝胶银染时的主蛋白带一致。

B. PAF-AH纯化程序

用于纯化PAF-AH以进行氨基酸测序的新方法因此包括以下在4C进行的步骤。将人血浆分成在Nalgene瓶中的900ml等分样品，调整至pH8.6。然后通过加入90ml3.85％磷钨酸钠，然后加入23ml 2MMgCl₂沉淀LDL颗粒。然后于3600g将血浆离心15分钟。将沉淀再悬浮于800ml 0.2％柠檬酸钠中。通过加入10g NaCl和24ml 2M MgCl₂再次沉淀LDL。通过于3600g离心15分钟沉淀LDL颗粒。重复这种洗涤二次。然后将沉淀冷冻于-20℃。将源自5升血浆的LDL颗粒再悬浮于5升缓冲液A(25mM Tris-HCl，10mM CHAPS，pH7.5)中并搅拌过夜。将溶解的LDL颗粒于3600g离心1.5小时。合并上清液，用Whatman113滤纸过滤除去任何残留的固体。将溶解的LDL上清液上样至用缓冲液B(25mM Tris-HCl，1mM CHAPS，pH7.5)平衡的DEAE Sepharose FastFlow柱(11cm×10cm；1升树脂体积；80ml/分钟)。用缓冲液B洗涤该柱直至吸收回至基线。用8升0-0.5M NaCl梯度洗脱蛋白，收集480ml分部收集液。该步骤对于得到与以下的Blue Sepharose Fast Flow柱的结合是必需的。基本上通过实施例4中描述的方法检测分部收集液的乙酰水解酶活性。

合并活性分部收集液，加入足量的CHAPS使合并液为约10mMCHAPS。以4ml/分钟将该DEAE合并液过夜上样至用含有0.5M NaCl的缓冲液A平衡的Blue Sepharose Fast Flow柱(5cm×10cm；200ml床体积)。用平衡缓冲液以16ml/分钟洗涤该柱，直至吸收回至基线。用含有0.5M KSCN(离液盐)的缓冲液A以16ml/分钟台阶洗脱(step elute)PAF-AH活性，收集于50ml分部收集液。该步骤产生了超过1000倍的纯化。合并活性分部收集液，使用1M Tris-HCl pH8.0将合并液调整至pH8.0。将Blue Sepharose Fast Flow层析的活性合并液上样至在缓冲液C[25mM Tris-HCl，10mM CHAPS，0.5M NaCl，pH8.0(pH7.5亦可以)]中平衡的铜螯合Sepharose柱(2.5cm×2cm；10ml床体积；4ml/分钟)，用50ml缓冲液C洗涤该柱。用100ml缓冲液C中的50mM咪唑洗脱PAF-AH活性，收集于10ml分部收集液中。合并含有PAF-AH活性的分部收集液，对缓冲液A透析。除了提供15倍PAF-AH活性浓缩之外，铜螯合Sepharose柱纯化效果很小。于37℃在50mM DTT中将铜螯合Sepharose合并液还原15分钟，上样至0.75mm、7.5％聚丙烯酰胺凝胶。每隔0.5cm切割胶条，将胶条置于含有200μl 25mM Tris-HCl、10mM CHAPS、150mM NaCl的一次性微量离心管中。将胶条磨碎，于4℃温育过夜。然后检测每个胶条的上清液的PA-AH活性，以确定SDS-PAGE上的哪个蛋白条带具有PAF-AH活性。在约44kDa条带中发现PAF-AH活性。将另一重复凝胶上的蛋白电转移至PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)，用考马斯蓝染色。PVDF膜的照片展示于图1中。

如以下表1中所展示的，从5升人血浆纯化2×10⁶倍产生约200μgPAF-AH。与之对照，Stafforini等(1987)，见上述描述了PAF-AH活性纯化了3×10⁴倍。

                                       表1

样品    体积    活性    总       蛋白      比活     活性回收％       纯化倍数

        (ml)    (cpm×      活性     浓度      (cpm×

                 10 ⁶ )(cmp×         (mg/ ml)  10 ⁶ )

                        10 ⁹ )                      台阶   累计    台阶   累计

血浆    5000    23      116      62        0.37     100     100      1       1

LDL     4500    22      97       1.76      12       84      84       33      33

DEAE    4200    49      207      1.08      46       212     178      3.7     124

蓝      165     881     14       0.02      54200    70      126      1190    1.5×10⁵

铜      12      12700   152      0.15      82200    104     131      1.5     2.2×10⁵

SDS-    ---     ---     ---      ---       ---      ---     ---      ～10    2.2×10⁶

PAGE

总之，以下步骤对用于微量测序的血浆PAF-AH的成功纯化是独特和关键的：(1)在10mM CHAPS中溶解和层析，(2)在诸如BlueSepharose Fast Flow的蓝配体亲和柱上层析；(3)在诸如铜螯合Sepharose的铜配体亲和柱上层析，和(4)从SDS-PAGE洗脱PAF-AH。

                           实施例2

对于氨基酸测序，从实施例1中描述的含有PAF-AH的PVDF膜上切下约44kDa蛋白条带，使用Applied Biosystems 473A蛋白测序仪测序。对应于PAF-AH活性的约44kDa蛋白条带的N末端序列分析表明，该条带含有二个主序列和二个次序列。二个主序列的比例是1∶1，因此难以解释测序数据。

为区分已在SDS凝胶上分离的二个主蛋白的序列，将另一重复的含有约44kDa条带的PVDF膜切为二半，分别将膜的上半部分和下半部分进行测序。

膜的下半部分得到的N末端序列是：

SEQ ID NO：1

F K D L G E E N F K A L V L I A F

对蛋白数据库的检索揭示该序列是人血清白蛋白的片段。亦对同一PVDF膜的上半部分进行了测序，确定的N末端氨基酸序列是：

SEQ ID NO：2

I Q V L M A A A S F G Q T K I P

该序列与检索的数据库中的任何蛋白都不相同，并且不同于以下N末端氨基酸序列：

SEQ ID NO：3

M K P L V V F V L G G

该序列是在Stafforini等(1993)，见上述中报道的红细胞细胞质PAF-AH的序列。如以下实施例3中所述，利用该新序列(SEQ ID NO：2)进行人血浆PAF-AH的cDNA克隆。

                        实施例3

从巨噬细胞cDNA文库分离编码人血浆PAF-AH的全长克隆。

A. 构建巨噬细胞cDNA文库

从外周血单核细胞源的巨噬细胞收获Poly A⁺RNA。使用InvitrogenCopy试剂盒(San Diego，CA)产生双链、平端cDNA，在***哺乳动物表达载体pRc/CMV(Invitrogen)之前将BstXI接头连接至该cDNA。通过电穿孔将产生的质粒导入大肠杆菌菌株XL-1蓝。以约3000菌落/琼脂糖平板的密度将转化的细菌在总共978个平板上铺平板。将独立从每个平板分离的质粒DNA保持于单独的库中，亦将它们合并为代表300,000克隆的较大的库。

B. 通过PCR筛选文库

通过聚合酶链式反应，利用基于在实施例2中描述的新N末端氨基酸序列的简并反义寡核苷酸PRC引物，筛选巨噬细胞文库。该引物的序列以IUPAC命名陈述于下，其中“I”是肌苷。

SEQ ID NO：4

5’ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA 3’

使用Wada等，Nuc.Acids Res.，19S：1981-1986(1991)的密码子选择表，选择位于该引物每个密码子的第三个位置的核苷酸。将此引物与对位于pRc/CMV克隆位点侧翼的或者SP6或者T7启动子序列特异性的引物联合使用，以筛选300,000个克隆的巨噬细胞文库库。所有的PCR反应均含有100ng模板cDNA、每种引物各1μg、每种dNTP各0.125mM、10mM Tris-HCl pH8.4、50mM MgCl₂和2.5单位Taq聚合酶。起始变性步骤为94℃4分钟，接着进行30个周期的扩增：94℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟。将产生的PCR产物克隆入pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)，通过双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。该PCR产物具有由新肽链预测的序列，对应于SEQ ID NO：7的核苷酸1-331。

然后为鉴别全长克隆，设计陈述于以下的对上述克隆的PCR片段特异性的PCR引物。

有义引物(SEQ ID NO：5)

5’TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3’

反义引物(SEQ ID NO：6)

5’CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3’

如上述进行利用所述引物的PCR反应，以首先筛选300,000个克隆的cDNA库，然后筛选约3000个克隆的较小库的适当亚组。然后使用产生预期大小PCR产物的三个3000个克隆的库转化细菌。

C. 通过杂交筛选文库

使用原始克隆的PCR片段做为探针，通过杂交接着筛选转化的细菌的DNA。将菌落印迹至硝酸纤维素上，在50％甲酰胺、0.75M氯化钠、0.075M柠檬酸钠、0.05M磷酸钠pH6.5、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％Ficoll、1％牛血清白蛋白和50ng/ml超声处理鲑精DNA中进行预杂交和杂交。通过随机六聚物引发标记杂交探针。于42℃杂交过夜后，于42℃在0.03M氯化钠、3mM柠檬酸钠、0.1％SDS中彻底洗涤印迹。测定10个杂交克隆的核苷酸序列。其中一个克隆sAH 406-3具有由从人血浆纯化的PAF-AH活性的原始肽序列预测的序列。人血浆PAF-AH的DNA序列和推导的氨基酸序列分别陈述于SEQ ID NO：7和8。

克隆sAH 406-3含有具有编码预测的441个氨基酸的蛋白的可读框的1.52kb***片段。在氨基末端，通过蛋白微测序鉴别了在N末端氨基酸(SEQ ID NO：8的位置42的异亮氨酸)之前的41个残基的相对疏水性区段。因此该被编码的蛋白或者具有长信号序列或信号序列加上被酶切产生成热功能性酶的另一个肽。存在信号肽是分泌蛋白的一个特征。另外，由克隆sAH 406-3编码的蛋白质包括共有GxSxG基元(SEQ IDNO：8的氨基酸271-275)，据信该基元含有所有已知的哺乳动物脂酶、微生物脂酶和丝氨酸蛋白酶的活性位点丝氨酸。参见Chapus等，Biochimie，70：1223-1224(1988)和Brenner，Nature，334：528-530(1988)。

以下表2是从SEQ ID NO：8推测的本发明的人血浆PAF-AH氨基酸组成与Stafforini等(1987)，见上述号称纯化的材料的氨基酸组成的比较。

                            表2

                  克隆sAH 406-3               Stafforini等

Ala               26                           24

Asp和Asn          48                           37

Cys               5                            14

Glu和Gln          36                           42

Phe               22                           12

Gly               29                           58

His               13                           24

Ile               31                           17

Lys               26                           50

Leu               40                           26

Met               10                           7

Pro               15                           11

Arg               18                           16

Ser               27                           36

Thr               20                           15

Val               13                           14

Trp               7                            未确定

Tyr               14                           13

本发明的人血浆PAF-AH成熟形式的氨基酸组成与号称为人血浆PAF-AH的先前纯化的材料的氨基酸组成区别明显。

当尝试将Hattori等(见上述)的牛脑细胞质PAF-AH的核苷酸和推导的氨基酸序列与本发明的人血浆PAF-AH的核苷酸和氨基酸序列对比时，未观察到序列中有显著的结构类似性。

                         实施例4

当使用与PAF-AH cDNA的5’非翻译区(SEQ ID NO：7的核苷酸31-52)和跨越位于PAF-AH cDNA的3’端的翻译终止密码子的区(SEQID NO：7的核苷酸1465-1487)杂交的引物、对巨噬细胞和受刺激的PBMC的cDNA进行PCR时，检测到人PAF-AH基因的推测剪接变异体。所述PCR反应在凝胶上产生了二个条带，一个条带对应于实施例3的PAF-AH cDNA的预期大小，另一条带则短约100bp。对这二个条带的测序揭示，较大的条带是实施例3的PAF-AH cDNA，而较短的条带缺少编码血浆PAF-AH推测信号和原肽序列的PAF-AH序列的外显子2(下述实施例5)。在较短的克隆中存在预期的催化三联体和所有的半胱氨酸，因此由该克隆编码的蛋白质的生化活性有可能与血浆酶的生化活性相当。

为开始评价预期编码细胞质活性酶的PAF-AH剪接变异体的生物学相关性，通过RNA酶保护检测这二种形式在血液单核细胞源巨噬细胞中的相对丰度。在新鲜分离的单核细胞中这二种信息均不存在，但在单核细胞体外分化成为巨噬细胞的第2天发现这二种信息，在培养的6天持续存在。在分化期中这二种信息的数量大致相同。与之相反，神经组织的类似分析揭示，仅表达预期编码全长胞外形式PAF-AH的全长信息。

                          实施例5

亦分离了基因组人血浆PAF-AH序列。通过在严格条件下由DNA杂交分离含有人基因组DNA的λ和P1噬菌体克隆，测定了该PAF-AH基因的结构。使用设计在cDNA克隆sAH 406-3中以规则间隔退火的引物，亚克隆噬菌体克隆的片段并测序。另外，使用设计退火至外显子侧翼的内含子的新测序引物，对跨越外显子-内含子边界倒退测序以确认所述序列。外显子/内含子边界定义为基因组和cDNA序列分岐的点。这些分析揭示，人PAF-AH由12个外显子组成。

从在λFIX(Stratagene)中构建的男性胎儿胎盘文库分离外显子1、2、3、4、5、6以及外显示7的一部分。将噬斑印迹至硝酸纤维素上，在50％甲酰胺、0.75M氯化钠、75mM柠檬酸钠、50mM磷酸钠(pH6.5)、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％Ficoll、1％牛血清白蛋白和50ng/ml超声处理鲑精DNA中进行预杂交和杂交。用于鉴别含有外显子2-6和7的一部分的噬菌体克隆的杂交探针由整个cDNA克隆sAH 406-3组成。使用源自所述cDNA克隆的5’端片段(SEQ ID NO：7的核苷酸1-312)鉴别含有外显子1的克隆。这二种探针均用32P通过六聚物随机引发标记。于42℃杂交过夜后，在30mM氯化钠、3mM柠檬酸钠、0.1％SDS中于42℃彻底洗涤印迹。外显子1、2、3、4、5和6的DNA序列以及部分周围内含子序列分别陈述于SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14中。

从人P1基因组文库分离的P1克隆，亚克隆外显子7的剩余部分以及外显子8、9、10、11和12。将P1噬斑印迹至硝酸纤维素上，在0.75M氯化钠、50mM磷酸钠(pH7.4)、5mMEDTA、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％Ficoll、1％牛血清白蛋白、0.5％SDS和0.1mg/ml总人DNA中进行预杂交和杂交。用32P通过六聚物随机引发标记的杂交探针，由源自上述分离的λ克隆的3’端的基因组DNA的2.6kb EcoRI片段组成。该片段含有存在于所述噬菌体克隆上的外显子6和的外显子7的一部分。于65℃杂交过夜后，如上述洗涤印迹。外显子7、8、9、10、11和12的DNA序列以及部分周围内含子序列分别陈述于SEQ ID NO：15、16、17、18、19和20中。

                          实施例6

从小鼠、犬、牛和鸡脾脏cDNA文库分离全长血浆PAF-AH cDNA克隆，从大鼠胸腺cDNA文库分离一个部分啮齿类克隆。通过与人cDNA低严格性杂交鉴别所述克隆(杂交条件与上述实施例5中对外显子1-6描述的相同，除了使用了20％甲酰胺而不是50％甲酰胺)。使用人PAF-AH sAH 406-3 cDNA克隆的1kb HindIII片段(SEQ ID NO：7的核苷酸309-1322)做为探针。另外，使用基于SEQ ID NO：7的核苷酸285-303和851-867的引物，通过PCR从猕猴脑cDNA分离一个部分猴克隆。小鼠、犬、牛、鸡、大鼠和猕猴cDNA克隆的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别陈述于SEQ ID NO：21、22、23、24、25和26。

所述cDNA克隆的推导的氨基酸序列与人cDNA克隆的比较产生了氨基酸相同性百分比，陈述于以下表3中。

                               表3

                 人       狗        小鼠       牛        鸡

狗               80        100        64          82         50

小鼠             66        64         100         64         47

猴               92        82         69          80         52

大鼠             74        69         82          69         55

牛               82        82         64          100        50

鸡               50        50         47          50         100

在所有的序列中约38％的残基是完全保守的。差异最大的区域位于氨基末端(含有信号序列)和在实施例10中显示为对酶活性不关键的羧基末端。在神经脂酶和其它酯酶中发现的Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly基元(SEQ ID NO：27)在牛、犬、小鼠、大鼠和鸡PAF-AH中是保守的。该基元中心的丝氨酸做为这些酶的活性位点亲核体起作用。活性位点(实施例10A)的推测的天冬氨酸和组氨酸组分亦是保守的。本发明的人血浆PAF-AH因此看起来利用了催化三联体，可能采取了神经脂酶的α/β水解酶构象，尽管它不表现与所述脂酶的其它序列同源性。

另外，预期人血浆PAF-AH具有一个介导其与血浆的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒特异性相互作用的区。与这些颗粒的相互作用可以由所述分子的N末端一半介导，这一半具有一大段种间高度保守的氨基酸，但不具有所述酶的催化三联体。

                         实施例7

为确定人血浆PAF-AH cDNA克隆sAH 406-3(实施例3)是否编码具有PAF-AH活性的蛋白质，在COS7细胞中瞬时表达pRc/CMV表达构建物。通过DEAE葡聚糖方法转染3天后，检测COS细胞培养基的PAF-AH活性。

以每60mm组织培养平皿300,000细胞的密度接种细胞。次日，将所述细胞在含有0.5mg/ml DEAE葡聚糖、0.1mM氯喹和5-10μg质粒DNA的DMEM中培养2小时。然后将细胞用磷酸缓冲盐水中的10％DMSO处理1分钟，用培养基洗涤，在含有10％胎牛血清的DMEM中培养，所述胎牛血清预先用二异丙基氟磷酸(DFP)处理以钝化内源牛血清PAF-AH。培养3天后，检测转染细胞的培养基的PAF-AH活性。在存在或不存在或者10mM EDTA或者1mM DFP的情况下进行检测，以确定所述重组酶是否是钙依赖性的、是否被Stafforini等(1987)(见上述)对血浆PAF-AH先前描述的丝氨酸酯酶抑制剂DFP抑制。阴性对照包括用或者缺少***片段或者具有反向的sAH 406-3***片段的pRc/CMV转染的细胞。

采用以下改良，通过Stafforini等(1990)(见上述)的方法测定转染上清液中的PAF-AH活性。简言之，通过测定³H-乙酸从[乙酰-³H]PAF(NewEngland Nuclear，Boston，MA)的水解测定PAF-AH的活性。通过在十八烷基硅胶柱体(Baker Research Products，Phillipsburg，PA)上的反相柱层析，从标记的底物分离水溶性游离的³H-乙酸。使用10μl 0.1M Hepes缓冲液中的转染上清液、pH7.2，在50μl的反应体积内进行检测。每次反应使用总共50皮摩尔的底物，比例为1∶5标记：非标记PAF。于37C使反应物温育30分钟，通过加入40μl10M乙酸终止反应。然后通过所述十八烷基硅胶柱洗涤该溶液，该柱然后用0.1M乙酸钠清洗。然后收集每个样品的水性洗脱液，在液闪计数器中计数1分钟。以计数/分钟表示酶活性。

如图2中所示，用sAH 406-3转染的细胞的培养基具有比本底高4倍的PAF-AH活性。该活性不受存在EDTA的影响，但被1mM DFP消除。这些观察证实克隆sAH 406-3编码与人血浆酶PAF-AH一致的活性。

                            实施例8

通过重组方法，在大肠杆菌和酵母中表达并在哺乳动物细胞中稳定地表达全长和各种截短的人血浆PAF-AH DNA和嵌合小鼠-人PAF-AH DNA。

A. 在大肠杆菌中表达

使用PCR从克隆sAH 406-3产生人血浆PAF-AH cDNA的蛋白质编码片段，其易于亚克隆入大肠杆菌表达载体。该亚克隆的区段开始于所述人基因的5’端编码Ile₄₂的密码子(SEQ ID NO：8)，该残基是从人血浆纯化的酶的N末端残基。在该构建物中包括了该基因直至天然终止密码子的剩余部分。使用的5’有义PCR引物是：

SEQ ID NO：28

5’

TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3’，具有一个XbaI克隆位点和一个翻译起始密码子(下划线)。使用的3’反义引物是：

SEQ ID NO：29

5’ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG 3’并且包含sAH 406-3的终止密码子，具有一个EcoRV克隆位点。基本上如实施例3中所述进行PCR反应。用XbaI和EcoRV消化产生的PCR产物，亚克隆入在紧靠克隆位点上游具有Trp启动子的pBR322载体[deBoer等，PNAS，80：21-25(1983)]。用该表达构建物转化大肠杆菌菌株XL-1蓝，在含有100μg/ml羧苄青霉素的L培养液中培养。沉淀过夜培养的转化体，再悬浮于含有50mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl、10mM CHAPS、1mMEDTA、100μg/ml溶菌酶和0.05胰蛋白酶抑制单位(TIU)/ml的抑酶肽的溶菌缓冲液中。在冰上温育1小时和超声处理2分钟后，通过实施例4中描述的方法检测溶菌液的PAF-AH活性。用该表达构建物(命名为trpAH)转化的大肠杆菌产生了具有PAF-AH活性的产物。参见实施例9中的表6。

亦使用了包括其它三种启动子即tacII启动子(deBoer，见上述)、源自鼠伤寒沙门氏菌的***糖(ara)B启动子[Horwitz等，Gene，14：309-319(1981)]、噬菌体T7启动子的构建物，驱动人PAF-AH序列在大肠杆菌中表达。在质粒pUC19(New England Biolabs，MA)中组装包含Trp启动子(pUC trp AH)、tacII启动子(pUC tac AH)和araB启动子(pUCara AH)的构建物，在质粒pET15B(Novagen，Madison，WI)中组装包含T7启动子(pET AH)的构建物。亦在pET15B中组装由融合至T7启动子区核糖体结合位点的araB启动子组成的含有杂种启动子的构建物pHAB/PH。所有的大肠杆菌构建物均产生了在20-50U/ml/OD₆₀₀范围内的PAF-AH活性。这种活性对应于≥1％总细胞蛋白的总重组蛋白量。

亦评价了产生具有延伸的氨基末端的PAF-AH的几种大肠杆菌表达构建物。通过氨基酸测序，天然血浆PAF-AH的N末端鉴别为Ile₄₂(实施例2)。但是，Ile₄₂上游紧接的序列与在信号序列切割位点发现的氨基酸不符合[即未遵循“-3-1-原则”，因为在位置-1未发现赖氨酸；参见yon Heijne，Nuc.Acids Res.，14：4683-4690(1986)]。推定由细胞分泌***识别一个更加经典的信号序列(M_1-A₁₇或M_1-P₂₁)，然后进行内切蛋白酶切割。改造起始于起始甲硫氨酸的整个PAF-AH编码序列(SEQ IDNO：7的核苷酸162-1487)，以使用trp启动子在大肠杆菌中表达。如表4中所示，该构建物产生活性PAF-AH，但是表达仅为起始于Ile₄₂的原始构建物水平的约1/50。另一起始于Val₁₈的表达构建物(SEQ ID NO：7的核苷酸213-1487)产生了原始构建物水平的1/3的活性PAF-AH。这些结果暗示，氨基末端延伸对大肠杆菌中产生的重组PAF-AH活性不是关键的或必需的。

                              表4

                               PAF-AH活性(U/ml/OD₆₀₀)

构建物                         溶菌液                培养基

pUC trp AH(Ile₄₂N末端)          177.7                0.030

pUC trp AH Met₁                 3.1                  0.003

pUC tp AH Val₁₈                 54.6                 0.033

使用低拷贝数质粒和可以通过将***糖加入培养基诱导的启动子，亦在大肠杆菌中产生了截短的重组人PAF-AH产物。一种这种N末端截短的PAF-AH产物是编码由全长PAF-AH cDNA编码的多肽的氨基酸残基Met₄₆-Asn₄₄₁的DNA的重组表达产物，命名为rPH.2。用于在细菌细胞中生产rPH.2的质粒是pBAR2/PH.2，是基于pBR322的质粒，携带(1)编码起始于位置46的甲硫氨酸密码子的人PAF-AH的SEQ IDNO：7的核苷酸297-1487，(2)源自鼠伤寒沙门氏菌的***糖操纵子的araB-C启动子和araC基因，(3)源自噬菌体T7的转录终止序列，和(4)源自噬菌体f1的复制起点。

具体地说，pBAR2/PH.2包括以下DNA区段：(1)从位置1994的破坏的AatII位点至位于核苷酸6274的EcoRI位点，含有复制起点和源自细菌质粒pBR322编码或者氨苄青霉素或四环素抗性的基因的载体序列；(2)从位于位置6274的EcoRI位点至位于位置131的XbaI位点，源自鼠伤寒沙门氏菌***糖操纵子(Genbank保藏号M11045，M11046，M11047，J01797)的DNA；(3)从位于位置131的XbaI位点至位于位置170的NcoI位点，含有源自pET-21b(Novagen，Madison，WI)的核糖体结合位点的DNA；(4)从位于位置170的NcoI位点至位于位置1363的XhoI位点，人PAF-AH cDNA序列；和(5)从位于位置1363的XhoI位点至位于位置1993的破坏的AatII位点，源自pET-21b(Novagen)、含有源自噬菌体T7的转录终止序列和源自噬菌体f1的复制起点的DNA片段。

另一命名为rPH.9的PAF-AH产物是编码由全长PAF-AH cDNA(SEQ ID NO：8)编码的多肽的氨基酸残基Met₄₆至Ile₄₂₉的DNA的表达产物。将编码rPH.9的DNA***用于在细菌细胞中生产rPH.2的同一载体。该质粒命名为pBAR2/PH.9，具体地包括以下DNA区段：(1)从载体序列的位于位置1958的破坏的AatII位点至位于核苷酸6239的EcoRI位点，含有复制起点和源自细菌质粒pBR322编码或者氨苄青霉素或四环素抗性的基因；(2)从位于位置6239的EcoRI位点至位于位置131的XbaI位点，源自鼠伤寒沙门氏菌***糖操纵子(Genbank保藏号M11045，M11046，M11047，J01797)的DNA；(3)从位于位置131的XbaI位点至位于位置170的NcoI位点，含有源自pET-21b(Novagen，Madison，WI)的核糖体结合位点的DNA；(4)从位于位置170的NcoI位点至位于位置1328的XhoI位点，人PAF-AH cDNA序列；(5)从位于位置1328的XhoI位点至位于位置1958的破坏的AatII位点，源自pET-21b(Novagen，Madison，WI)、含有源自噬菌体T7的转录终止序列和源自噬菌体f1的复制起点的DNA片段。

pBAR2/PH.2和pBAR2/PH.9中PAF-AH产物的表达在araB启动子的控制之下，该启动子在存在葡萄糖和缺乏***糖时被严格阻抑，但当将L-***糖加入已消耗完葡萄糖的培养基中时做为强启动子起作用。通过向培养基加入或者氨苄青霉素(或相关抗生素)或者四环素可以完成含有该质粒的细胞的筛选。可以使用各种大肠杆菌菌株做为重组表达PAF-AH产物的宿主，包括但不限于对***糖代谢原养型的菌株诸如W3110、DH5α、BL21、C600、JM101和其衍生物，具有降低蛋白水解的突变的菌株例如CAG629、KY1429和降解***糖能力缺陷的菌株诸如SB7219和MC1061。使用不能分解***糖的菌株的优点是在诱导期间产生PAF-AH的诱导物(***糖)不从培养基中排除，与使用可以代谢***糖的菌株得到的相比产生较高水平的PAF-AH。可以使用任何合适的培养基和培养条件在各种大肠杆菌菌株中表达活性PAF-AH产物。允许大量产生rPAF-AH产物的例如或者是诸如LB、EDM295(基于M9的补充了酵母膏和酸水解酪蛋白的极限培养基)的丰富培养基配方或者是“已知成分的”培养基诸如A675，一种基于A的极限培养基、pH6.75，使用甘油做为碳源并补充了微量元素和维生素。培养基中包括四环素以保持筛选所述质粒。

将质粒pBAR2/PH.2转化入大肠杆菌菌株MC1061(ATCC53338)，该菌株携带***糖操纵子的缺失，因此不能代谢***糖。MC1061亦是亮氨酸营养缺陷型，通过分批流加法(batch-fed process)使用含有补充所述亮氨酸突变的酪蛋白氨基酸的已知成分培养基培养。

用pBAR2/PH.2转化的大肠杆菌M1061细胞于30℃在含有2gm/L葡萄糖的分批培养基中生长。葡萄糖起着细胞生长的碳源和***糖启动子阻抑物的双重作用。当批料葡萄糖水平耗尽后(＜50mg/L)，开始营养流加(含有300gm/L葡萄糖)。以限制酸副产物(bi-product)形成的速率线性增加16小时。此时，将营养流加转换为含有甘油而不是葡萄糖的培养基。同时，加入500gm/L L-***糖使最终浓度为5gm/L。以恒定的流加速率保持甘油流加22小时。使用中空纤维过滤收获细胞，浓缩悬浮液约10倍。将细胞浆储存于-70℃。得到了最终细胞量约80gm/L(OD₆₀₀＝50-60)，具有代表约总细胞蛋白10％的65-70U/OD/ml的PAF-AH活性。约75升的最终培养体积含有50-60gm PAF-AH。

当由菌株SB7219或MC1061表达pBAR2/PH.2或PH.9时，可以达到高水平生产rPAF-AH产物。***糖降解缺陷的其它菌株适于高细胞密度生产。优选地，在以下条件下培养所述细胞。将指数生长的SB7219；pBAR2/PH.2和SB7219；pBAR2/PH.9菌株接种入装有含有2g/L葡萄糖的分批培养基的发酵罐。一旦葡萄糖被消耗完，则使用含有微量元素、维生素、镁盐和铵盐的甘油溶液对罐进行流加，以保持健康的指数生长。将罐保持于30℃、提供空气以供应氧气并搅拌，以保持溶氧水平超过约15％饱和度。当培养物的细胞密度超过110g/L(细胞湿重)时，实行恒定流加速率，将L-***糖的大剂量添加剂加入培养物(最终约0.5％)。观察产物形成16-22小时。培养物通常达到40-50g/L(细胞干重)。通过离心收获细胞，储存于-70℃，纯化rPAF-AH产物进行分析。通常得到超过150单位/ml/OD₆₀₀的比生产率。

B. 在酵母细胞中表达

亦在啤酒酵母中表达重组人PAF-AH。使用酵母ADH2启动子驱动rPAF-AH表达，产生7U/ml/OD₆₀₀(见下表5)。

                            表5

构建物            启动子            菌株               酶活性

                                                         (U/ml/OD)

pUC tac AH         tac                大肠杆菌W3110       30

pUC trp AH         trp                大肠杆菌W3110       40

pUC ara AH         arab               大肠杆菌W3110       20

pET AH             T7                 大肠杆菌BL21(DE3)   50

                                      (Novagen)

pHAB/PH            araB/T7            大肠杆菌XL-1        34

pBAR2/PH.2         araB               MC1061              90

pYep ADH2 AH       ADH2               酵母BJ2.28          7

C. 在哺乳动物细胞中表达PAF-AH

1. 表达人PAF-AH cDNA构建物

除了pSFN/PAFAH.1，构建以表达PAF-AH的质粒使用了细胞肥大病毒的强病毒启动子、牛生长激素基因的多聚腺苷酸化位点和SV40的复制起点，以使得所述质粒在COS细胞中高拷贝数复制。将质粒电穿孔进入细胞。

构建第一套质粒，其中用已知在哺乳动物细胞中以高水平表达的其它基因的侧翼序列取代人PAF-AH cDNA的5’侧翼序列(pDC1/PAFAH.1)或同时取代5’或3’侧翼序列(PDC1/PAFAH.2)。将这些质粒转染入COS、CHO或293细胞，导致产生PAF-AH，其水平与实施例7中提出的瞬时转染COS细胞后克隆sAH 406-3的水平基本相同(0.01单位/ml或超出本底2-4倍)。构建另一质粒，其包括取代了细胞肥大病毒启动子的Friend脾转化灶形成病毒启动子。将人PAF-AH cDNA***在Friend脾转化灶形成病毒启动子控制之下的质粒pmH-neo[Hahn等，Gene，127：267(1993)]。用命名为pSFN/PAFAH.1的质粒转染骨髓瘤细胞系NS0，筛选几百个克隆，导致分离二个产生0.15-0.5单位/ml PAF-AH活性的转染体(4B11和1C11)。假设比活为5000单位/毫克，这二个NS0转染体的生产率对应于约0.1mg/升。

2. 表达小鼠-人嵌合PAF-AH基因构建物

具有在哺乳动物表达载体pRc/CMV中的编码小鼠PAF-AH的cDNA的构建物(pRc/MS9)在转染进入COS细胞后，导致产生水平为5-10单位/ml(高于本底1000倍)的分泌的PAF-AH。假设小鼠PAF-AH的比活大约与人的酶相同，因此小鼠cDNA的表达水平比人PAF-AH cDNA高500-1000倍。

为检查人和小鼠PAF-AH在COS细胞中表达水平之间的差异，构建二个小鼠-人嵌合基因并在COS细胞测试表达。这些构建物的第一个，pRc/PH.MHC1含有融合至表达载体pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)中的人PAF-AH的C末端343个氨基酸的小鼠PAF-AH多肽(SEQ IDNO：21)的N末端的97个氨基酸的编码序列。在质粒pRc/PH.MHC2中的第二个嵌合基因，含有融合至pRc/CMV中的人PAF-AH的C末端400个残基的小鼠PAF-AH多肽的N末端40个氨基酸的编码序列。用pRc/PH.MHC1转染COS细胞导致在培养基中积累1-2单位/ml的PAF-AH活性。发现源自用pRc/PH.MHC2转染的细胞的条件培养基仅含有0.01单位/ml的PAF-AH活性。从这些实验看来，小鼠与人PAF-AH基因之间表达水平的差异至少部分归因于残基40和97之间的多肽区段、或对应的编码PAF-AH蛋白的该区的RNA或DNA区段。

3. 重编码PAF-AH编码序列的首290bp

在转染的哺乳动物细胞中人PAF-AH合成的低水平的一个假说是天然基因使用的密码子对于有效表达是次优的。但是，好象密码子使用不可能对小鼠和人基因之间表达水平的500-1000倍的差异负责，因为优化密码子一般对表达最多仅有10倍的影响。第二个解释小鼠和人PAF-AH表达水平差异的假说是5’编码区中的人PAF-AH mRNA形成了导致或者所述mRNA相对快速降解或者引起无效翻译起始或延长的二级结构。

为检验这些假说，构建了编码从氨基末端至残基96的真正人PAF-AH蛋白的合成片段，但其中大多数的密码子用不同序列的、但编码同一氨基酸的密码子置换(“重编码”)。第二个密码子从GTG变为GTA导致产生Asp718位点，其位于所述合成片段的一端并存在于小鼠cDNA中。该片段的另一端具有通常在人基因的密码子97发现的BamHI位点。约290bp Asp718/BamHI片段源自PCR片段，该PCR片段用描述于Sandhu等，Biotechniques，12：14-16(1992)中的用于构建合成基因的双不对称PCR方法产生。将该合成的Asp718/BamHI片段与编码人PAF-AH分子的剩余部分、起始于SEQ ID NO：7的核苷酸453的DNA片段连接，使得编码真正的人PAF-AH酶的序列***哺乳动物表达载体pRc/CMV(Invitrogen，San Diego)，产生质粒pRc/HRH.4。所述重编码的基因的完整序列陈述于SEQ ID NO：30。与pRc/HPH.4中的人PAF-AH编码序列邻近的5’侧翼序列源自在pRc/MS9中的编码PAF-AH的小鼠cDNA的侧翼序列(SEQ ID NO：21的核苷酸1-116)。

为检验pRc/HPH.4的人PAF-AH的表达，用pRc/HPH.4(重编码人基因)、pRc/MS9(小鼠PAF-AH)或pRc/PH.MHC1(小鼠-人杂种1)瞬时转染COS细胞。检测所述转染细胞的条件培养基的PAF-AH活性，发现含有5.7单位/ml(小鼠基因)、0.9单位/ml(小鼠-人杂种)或2.6单位/ml(重编码人基因)。因此，重编码人PAF-AH的首290bp编码序列的策略在瞬时COS细胞转染中成功地将人PAF-AH表达水平从几个纳克/ml提高至约0.5微克/ml。将pRc/HPH.4的重编码PAF-AH基因***含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的哺乳动物表达载体，将用该载体转染DHFR-阴性中国仓鼠卵巢细胞。对转染的细胞将进行甲氨蝶呤筛选，以得到由于基因扩增产生高水平人PAF-AH的克隆。

                         实施例9

通过各种方法将大肠杆菌中表达的重组人血浆PAF-AH(起始于Ile₄₂)纯化为单一的考马斯染色SDS-PAGE条带，检测天然PAF-AH酶表现的活性。

A. 纯化重组PAF-AH

使用的第一个纯化程序与实施例1中对天然PAF-AH描述的类似。在4℃进行以下步骤。将50ml产生PAF-AH的大肠杆菌(用表达构建物trp AH转化)的沉淀如实施例8中所述进行溶菌。通过于10,000g离心20分钟除去固体。以0.8ml/分钟将上清液上样至在缓冲液D(25mMTris-HCl，10mM CHAPS，0.5M NaCl，pH7.5)中平衡的Blue SepharoseFast Flow柱(2.5cm×4cm；20ml床体积)。用100ml缓冲液D洗涤该柱，用含有0.5M KSCN的缓冲液A以3.2ml/分钟洗脱。将15ml的活性分部收集液上样至在缓冲液D中平衡的1ml铜螯合Sepharose柱。用5ml缓冲液D洗涤该柱，接着用含有100mM咪唑的5ml缓冲液D以重力流速洗脱。通过SDS-PAGE分析含有PAF-AH活性的分部收集液。

纯化的结果示于表6，其中一个单位等于μmol PAF水解/小时。于4℃得到的纯化产物在SDS-PAGE上表现为低于43kDa标记的单个深条带，在其上下有一些扩散染色。与实施例1中所述的血浆PAF-AH制备物相比，重组材料显著地更纯并表现出较高的比活。

                                         表6

样品      体积     活性    总活性     蛋白     比活     活性回收％      纯化倍数

          ( ml)  (单位   (单位×           浓度     (单位

                   / ml)  10 ³ )    (mg/ ml) /mg)     台阶  累计    台阶  累计

溶菌液    4.5      989     4451       15.6      63       100    100      1      1

蓝        15       64      960        0.07      914      22     22       14.4   14.4

铜        1        2128    2128       0.55      3869     220    48       4.2    61

当在室温进行同样的纯化程序时，除了低于43kDa标记的条带之外，一组低于29kDa标记的条带与检测的凝胶条的PAF-AH活性相关。这些较低分子量条带可能是保留酶活性的PAF-AH的蛋白水解片段。

亦在室温进行不同的纯化程序。将产生PAF-AH的大肠杆菌(用表达构建物pUC trp AH转化)的沉淀(100g)再悬浮于200ml溶菌缓冲液(25mM Tris，20mM CHAPS，50mM NaCl，1mM EDTA，50μg/ml苄脒，pH7.5)，通过于15,000psi三次通过显微流态仪(microfluidizer)溶菌。通过于14,300xg离心1小时除去固体。将上清液在稀释缓冲液[25mM MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)，10mM CHAPS，1mM EDTA，pH4.9]中稀释10倍，以25ml/分钟上样至在缓冲液E(25mM MES，10mM CHAPS，1mMEDTA，50mM NaCl，pH5.5)中平衡的S Sepharose Fast Flow柱(200ml)(阳离子交换柱)。用1升缓冲液E洗涤该柱，用1M NaCl洗脱，将洗脱液以50ml分部收集液收集，用0.5ml2M Tris碱调节至pH7.5。合并含有PAF-AH活性的分部收集液，调节至0.5M NaCl。将S合并液以1ml/分钟上样至在缓冲液F(25mM Tris，10mM CHAPS，0.5M NaCl，1mMEDTA，pH7.5)中平衡的Blue Sepharose Fast Flow柱(2.5cm×4cm；20ml)。以4ml/分钟用100ml缓冲液F洗涤该柱，用100ml含有3M NaCl的缓冲液F洗脱。重复进行Blue Sepharose Fast Flow层析步骤以降低样品中的内毒素水平。合并含有PAF-AH活性的分部收集液，对缓冲液G(25mM Tris pH7.5，0.5M NaCl，0.1％吐温80，1mM EDTA)透析。

纯化的结果示于表7，其中一个单位等于μmol PAF水解/小时。

                                         表7

样品      体积      活性      总活性     蛋白      比活    活性回收％    纯化倍数

          ( ml)    (单位     (单位      浓度      (单位

                    / ml)    × 10 ³ )  (mg/ml)  /mg)   台阶  累计  台阶  累计

溶菌液    200       5640      1128        57.46     98     100    100    1      1

S         111       5742      637         3.69      1557   57     56     16     16

蓝        100       3944      394         0.84      4676   35     62     3      48

得到的纯化产物在SDS-PAGE上表现为低于43kDa标记的单个深条带，在其上下有一些扩散染色。与实施例1中所述的血浆PAF-AH制备物相比，重组材料显著地更纯并表现出较高的比活。

本发明考虑的再一纯化程序涉及以下细胞裂解、澄清和第一柱步骤。在溶菌缓冲液(25mM Tris pH7.5，150mM NaCl，1％吐温80，2mMEDTA)中将细胞1∶1稀释。在冷却的显微流态仪中以15,000-20,000psi将材料通过三次以产生＞99％细胞破碎进行溶菌。在稀释缓冲液(25mMTris pH8.5，1mM EDTA)中将溶菌液稀释1∶20，上样至用Q-SepharoseBig Bead层析介质(Pharmacia)装柱并在25mM Tris pH8.5，1mM EDTA，0.015％吐温80中平衡的柱。将洗脱液在25mM MES pH5.5、1.2M硫酸铵、1mM EDTA中稀释1∶10，上样至在同样缓冲液中平衡的丁基Sepharose层析介质(Pharmacia)。在25mM MES pH5.5、0.1％吐温80、1mM EDTA中洗脱PAF-AH活性。

本发明考虑的用于从大肠杆菌纯化酶活性PAF-AH的再一方法包括以下步骤：(a)制备在含有CHAPS的缓冲液中溶菌后产生溶解的PAF-AH上清液的大肠杆菌提取液；(b)稀释所述上清液，上样至于约pH8.0平衡的阴离子交换柱；(c)从所述阴离子交换柱洗脱PAF-AH酶；(d)将所述阴离子交换柱的所述调节洗脱液上样至蓝染料配体亲和柱；(e)使用包含3.0M盐的缓冲液洗脱所述蓝染料配体亲和柱；(f)将所述蓝染料洗脱液在用于羟基磷灰石层析的合适缓冲液中稀释；(g)进行羟基磷灰石层析，其中使用缓冲液(含或不含CHAPS)完成洗涤和洗脱；(h)将所述羟基磷灰石洗脱液稀释至适当盐浓度以进行阳离子交换层析；(i)将所述稀释的羟基磷灰石洗脱液上样至pH范围约6.0-7.0的阳离子交换柱；(j)使用合适的配制缓冲液从所述阳离子交换柱洗脱PAF-AH；(k)在低温进行阳离子交换层析；和(l)在缺少CHAPS的情况下以液体或冷冻形式配制PAF-AH。

优选地，上述步骤(a)中的溶菌缓冲液是25mM Tris、100mMNaCl、1mM EDTA、20mM CHAPS、pH8.0；步骤(b)中为进行阴离子交换层析，将所述上清液在25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0中稀释3-4倍，该柱是在25mM Tris、1mM EDTA、50mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0中平衡的Q-Sepharose柱；步骤(c)中使用25mMTris、1mM EDTA、350mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0洗脱所述阴离子交换柱；步骤(d)中直接将步骤(c)的洗脱液上样至蓝染料亲和柱；步骤(e)中用3M NaCl、10mM CHAPS、25mM Tris、pH8.0缓冲液洗脱所述柱；步骤(f)中通过在10mM磷酸钠、100mM NaCl、10mMCHAPS、pH6.2中稀释，完成稀释所述蓝染料洗脱液以进行羟基磷灰石层析；步骤(g)中使用用10mM磷酸钠、100mM NaCl、10mM CHAPS平衡的羟基磷灰石柱完成羟基磷灰石层析，使用50mM磷酸钠、100mMNaCl(含或不含)10mM CHAPS、pH7.5完成洗脱；步骤(h)中通过在pH范围约6.0-7.0、包含磷酸钠(含或不含CHAPS)的缓冲液中稀释，完成用于阳离子交换层析的所述羟基磷灰石洗脱液的稀释；步骤(i)中用50mM磷酸钠、(含或不含)10mM CHAPS、pH6.8平衡S Sepharose；步骤(j)中用诸如含有0.01％吐温80的50mM磷酸钾、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl、pH7.5的合适配制缓冲液完成洗脱；步骤(k)中于2-8℃完成阳离子交换层析。用于步骤(l)中稳定PAF-AH的合适的配制缓冲液的实例包括50mM磷酸钾、12.5mM天冬氨酸、125mM NaCl pH7.4(大约值，加入或不加入吐温80和或Pluronic F68)或25mM磷酸钾缓冲液，含有(至少)125mM NaCl、25mM精氨酸和0.01％吐温80(含或不含约0.1和0.5％的Pluronic F68)。

B. 重组PAF-AH的活性

PAF乙酰水解酶的最显著的特性是它对在底物的sn-2位置具有短残基的底物的显著的特异性。该严格的特异性将PAF乙酰水解酶与PLA₂的其它形式区别开来。因此，为确定重组PAF-AH是否降解在sn-2位置有长链脂肪酸的磷脂，检测1-棕榈酰-2-花生四烯酰(arachidonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(花生四烯酰PC(arachidonyolPC))的水解，因为这是PLA₂的良好特征鉴定形式的优选底物。与用天然PAF-AH进行的先前研究的预测一样，当与重组PAF-AH温育时该磷脂不降解。在其它实验中，以0-125μM的浓度范围将arachidonoylPC包括于标准PAF水解检测中，以确定它是否抑制重组PAF-AH对PAF的水解。甚至在最高浓度的PAF-AH时都没有抑制PAF水解，该浓度超过PAF浓度5倍。因此，重组PAF-AH表现出与天然酶一样的底物选择性；不识别长链底物。另外，重组PAF-AH酶快速地降解已进行了sn-2脂肪酸氧化裂解的氧化磷脂(戊二酰PC)。天然血浆PAF-AH具有使其与其它磷脂酶区分的几种其它特性，包括钙依赖性、对修饰巯基或破坏二硫化物的化合物的抗性。

天然和重组PAF-AH酶都对DFP敏感，表明丝氨酸构成它们活性位点的一部分。天然血浆PAF乙酰水解酶的不寻常的特征是它与循环中的脂蛋白紧密联系，其催化效率受脂蛋白环境影响。当本发明的重组PAF-AH与人血浆(预先用DFP处理以消除内源酶活性)保温时，它以与天然活性相同的方式与低密度和高密度脂蛋白相结合。这个结果是有意义的，因为有大量的证据表明，低密度脂蛋白的修饰对在动脉粥样化中观察到的胆固醇沉积是必需的、脂类的氧化是该过程中的起始因子。PAF-AH在体外保护低密度脂蛋白在氧化条件下免受修饰，可能在体内有这种作用。因此给予PAF-AH适于抑制动脉粥样硬化斑中脂蛋白的氧化以及可以消除炎症。

这些结果都确认cDNA克隆sAH406-3编码具有人血浆乙酰水解酶活性的蛋白。

                         实施例10

在大肠杆菌中表达各种重组PAF-AH产物。产物包括具有单氨基酸突变的PAF-AH类似物和PAF-AH片段。

A. PAF-AH氨基酸置换产物

PAF-AH是脂酶，因为它水解磷脂PAF。虽然在PAF-AH与其它已鉴定的脂酶之间没有明显的总类似性，但在结构表征的脂酶的比较中发现了保守残基。一个丝氨酸已被鉴别为活性位点的成员。该丝氨酸与天冬氨酸残基和组氨酸残基一起形成了代表该脂酶的活性位点的催化三联体。这三个残基在蛋白一级结构中不相邻，但是结构研究已证实这三个残基在三维结构中是相邻的。哺乳动物脂酶结构比较提示，该天冬氨酸残基一般距离活性位点丝氨酸C末端24个氨基酸。另外，该组氨酸一般距离活性位点丝氨酸C末端109-111个氨基酸。

通过定点诱变和PCR，修饰人PAF-AH编码序列的单个密码子，以编码丙氨酸残基并在大肠杆菌中表达。如以下表8中所示，例如缩写“S108A”’表明位于位置108的丝氨酸残基被改为丙氨酸，Ser₂₇₃、Asp₂₉₆或His₃₅₁的点突变完全破坏了PAF-AH活性。活性位点残基之间的距离对PAF-AH(Ser至Asp，23个氨基酸；Ser至His，78个氨基酸)和其它脂酶是类似的。这些实验证明Ser₂₇₃、Asp₂₉₆和His₃₅₁是对活性关键的残基，因此可能是催化三联体残基的候选者。半胱氨酸对于蛋白质的功能完整性通常是关键的，因为它们具有形成二硫键的能力。血浆PAF-AH具有5个半胱氨酸。为确定这5个中的哪一个对酶活性是关键的，将每个半胱氨酸单独地突变为丝氨酸，在大肠杆菌中表达产生的突变体。使用这些重组产生的突变体的部分纯化制备物的初步活性结果示于以下表8的第2栏，使用更加纯化的制备物的结果示于表8的第3栏。数据显示，所有的半胱氨酸突变体具有大致相同的活性，所以所有这些半胱氨酸对PAF-AH活性都不是必需的。其它点突变亦对PAF-AH催化活性几乎没有或没有影响。在表8中，“++++”代表约40-60U/ml/OD₆₀₀的野生型PAF-AH活性，“+++”代表约20-40U/ml/OD₆₀₀活性，“++”代表约10-20U/ml/OD₆₀₀活性，“+”代表1-10U/ml/OD₆₀₀活性，“-”表明＜1U/ml/OD₆₀₀活性。

                                 表8

突变                         PAF-AH活性                  纯化的制备物的PAF-

                                                              AH比活

野生型                        ++++                         6.9mmol/mg/小时

S108A                         ++++

S273A                         -

D286A                         -

D286N                         ++

D296A                         -

D304A                         ++++

D338A                         ++++

H351A                         -

H395A，H399A                  ++++

C67S                          +++                          5.7mmol/mg/小时

C229S                         +                            6.5mmol/mg/小时

C291S                         +                            5.9mmol/mg/小时

C334S                         ++++                         6.8mmol/mg/小时

C407S                         +++                          6.4mmol/mg/小时

C67S，C334S，C407S                                         6.8mmol/mg/小时

B. PAF-AH片段产物

通过用外切核酸酶III消化PAF-AH编码序列的3’端不同的时间，然后将缩短的编码序列连接至在所有三个读框中编码终止密码子的质粒DNA来制备C末端缺失。通过DNA序列分析、蛋白表达和PAF-AH活性特征鉴定了10个不同的缺失构建物。除去21个至30个C末端氨基酸显著降低了催化活性，除去52个残基完全破坏了活性。参见图3。

在PAF-AH的氨基末端产生了类似的缺失。制备了PAF-AH与大肠杆菌硫氧还蛋白于N末端的融合物，以促进一致性的高水平表达PAF-AH活性[LaVallie等，Bio/technology，11：187-193(1993)]。除去天然加工的N末端(Ile₄₂)的19个氨基酸降低活性99％，而除去26个氨基酸完全破坏了融合蛋白中的酶活性。参见图3。缺失12个氨基酸看来增强酶活性约4倍。

在以后通过与实施例1中描述的类似的方法从新鲜人血浆纯化PAF-AH(使用Amicon的Microcon 30滤器浓缩Blue sepharose洗脱液而不是铜柱)，鉴别了除Ile₄₂之外的二个N末端，Ser₃₅和Lys₅₅。这种异质性可能是血浆中酶的天然状态，或可能在纯化中发生。

将上述纯化的材料进行糖基化分析。将纯化的天然PAF-AH在存在或不存在N-聚糖酶的情况下温育，该酶从糖蛋白除去N连接的碳水化合物。将处理的PAF-AH样品通过12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后使用兔多克隆抗血清通过蛋白印迹显现。未用N-聚糖酶处理的蛋白质以45-50kDa的扩散条带迁移，而用聚糖酶处理的蛋白质以约44kDa的紧密条带迁移，证实天然PAF-AH是糖基化的。

亦在重组PAF-AH(Ile₄₂N末端)的纯化制备物中观察到N末端异质性。这些制备物是N末端起始于Ala₄₇、Ile₄₂或与Ile₄₂邻接的人工起始Met_-1的多肽的混合物。

1. PAF-AH片段与PAF-AH的初步比较

鉴于观察到的重组产生的PAF-AH的异质性，制备其它重组产物并在重组表达和纯化后检测均质性。在细胞发酵生产期的不同时间点分析在大肠杆菌菌株MC1061中pBAR2/PH.2和pBAR2/PH.9的重组表达产物的组成。通过矩阵辅助激光吸收电离质谱仪(MALDIMS)分析诱导蛋白表达后5-22小时之间的多个时间点收集的细胞的重组PH.2和PH.9的部分纯化的样品。

当使用PH.2表达载体时，在部分纯化的蛋白质谱中预期为rPAF-AH蛋白的质量值处观察到2个峰。在所有的时间点都观察到2个峰，在由培养基中的乙酸积累和/或氧消耗完表明的发酵逆境时的时间点，观察到较大的异质性。在此质量范围内MALDI-MS的精度是约±0.3％，大约是一个氨基酸的质量。观察到的较高的质量峰与预期的PH.2载体的全长翻译产物减去预期翻译后除去的翻译起始甲硫氨酸的存在一致。较低的质量峰约少1200原子质量单位。

当使用PH.9表达载体时，在部分纯化的蛋白质谱中预期为rPAF-AH蛋白的质量值处观察到占优势的单峰。在所有的时间点都观察到该单峰，在不同的时间点未观察到异质性增加。观察到的该蛋白的质量与预期减去起始甲硫氨酸的PH.9载体的全长翻译产物的存在一致。

2. 纯化PAF-AH片段

为与纯化的rPAF-AH(编码Ile₄₂-Asn₄₄₁的DNA的表达产物)进一步比较，纯化重组表达的rPH.2(编码Met₄₆-Asn₄₄₁的DNA的表达产物)和rPH.9(编码Met₄₆-Ile₄₂₉的DNA的表达产物)制备物。rPH.9由大肠杆菌菌株SB7219产生，一般按照上述锌螯合纯化程序纯化，而rPH.2由大肠杆菌菌株MC1061产生并如下述纯化。通过用溶菌缓冲液(100mM琥珀酸盐，100mM NaCl，20mM CHAPS，pH6.0)稀释细胞沉淀(cell paste)将转化的细胞溶菌。混合该浆液并通过高压破碎溶菌。将溶菌的细胞离心，保留含有rPH.2的上清液。将澄清的上清液在含有1mM EDTA10mMCHAPS、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液中稀释5倍。然后将稀释的上清液上样至Q Sepharose柱。该柱先用三倍柱体积的含有1mM EDTA、50mM NaCl、10mM CHAPS、pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液洗涤(洗涤1)，然后用10倍柱体积的含有1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0的25mM Tris缓冲液洗涤(洗涤2)，用10倍柱体积的含有1mM EDTA、100mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0的25mM Tris缓冲液洗涤(洗涤3)。用含有1mM EDTA、350mM NaCl、10mM CHAPS、pH8.0的25mM Tris缓冲液完成洗脱。将Q Sepharose洗脱液在25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0中稀释3倍，然后上样至Blue Sepharose柱。该柱首先用10倍柱体积的25mM Tris、1mM EDTA、10mM CHAPS、pH8.0洗涤。然后用3倍柱体积的25mM Tris、0.5M NaCl、10mM CHAPS、pH8.0洗涤。用25mM Tris、3.0M NaCl、10mM CHAPS、pH8.0完成洗脱。将Blue Sepharose洗脱液在10mM磷酸钠、10mM CHAPS、pH6.2中稀释5倍，然后上样至层析柱。该柱用10倍柱体积的10mM磷酸钠、100mMNaCl、0.1％Pluronic F68、pH6.2洗涤。rPH.2用120mM磷酸钠、100mMNaCl、0.1％Pluronic F68、pH7.5洗脱。羟基磷灰石洗脱液用10mM磷酸钠、0.1％Pluronic F68、pH6.8稀释6倍。使用0.5N琥珀酸将稀释的羟基磷灰石洗脱液调节至pH6.8，然后上样至SP Sepharose柱。然后用10倍柱体积的50mM磷酸钠、0.1％Pluronic F68、pH6.8洗涤，用50mM磷酸钠、125mM NaCl、0.1％Pluronic F68、pH7.5洗脱。通过稀释成50mM磷酸钠、125mM NaCl、0.15％Pluronic F68、pH7.5中的最终浓度为4mg/ml配制洗脱的rPH.2，加入吐温80至最终浓度为0.02％吐温80。然后将配制的产物通过0.2μ膜过滤，在使用之前贮存。

3. 通过测序比较PAF-AH片段和PAF-AH

通过使用Applied Biosystems 473A型蛋白测序仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行N末端测序，使用Hewlett-PackardG1009A型C末端蛋白测序仪进行C末端测序，比较纯化的rPH.2和rPH.9制备物与纯化的rPAF-AH制备物。与rPAF-AH相比，rPH.2制备物的N末端异质性较低。rPH.9制备物的N末端分析与rPH.2的类似，但是观察到rPH.9制备物的C末端异质性比rPH.2相对低一些。

纯化的rPH.2制备物含有具有N末端Ala47的主序列(约86-89％)和具有N末端Ala₄₈的次序列(约11-14％)，在不同发酵条件下这二种N末端的比例相当一致。纯化的rPH.9制备物亦含有具有N末端Ala₄₇的主序列(约83-90％)和具有N末端Ala₄₈的次序列(约10-17％)。与之相反，试图在细菌中产生起始于Ile₄₂的多肽(rPAF-AH)导致具有起始于Ala₄₇(20-53％)、Ile₄₂(8-10％)或与Ile₄₂邻接的人工起始Met₁甲硫氨酸(37-72％)的多肽的各种混合物。对于rPH.2和rPH.9，细菌合成该多肽之后通过氨基末端肽酶有效地除去了起始甲硫氨酸，使得位于位置47的丙氨酸(或位于位置48的丙氨酸)做为N末端残基。

对一批rPH.2进行C末端测序，观察到其具有HOOC-Asn-Tyr的C末端做为主序列(约80％)，与翻译产物预期的HOOC-Asn₄₄₁-Tyr₄₄₀C末端一致，而约20％是HOOC-Leu。在rPH.2制备物通过SDS-PAGE分级分离之后，主要条带和次要条带的再测序产生了较低的次要条带的HOOC-Leu-Met的C末端(AH_L，在以下B.5.节中描述)，这与比全长翻译产物短10个氨基酸的产物一致，还产生了低水平的HOOC-His。进一步的肽作图已显示在一些批的PH.2蛋白中存在其它的C末端。通过直接测序的rPH.9的C末端主要是HOOC-Ile-His(约78-91％，取决于各批)，与翻译产物预期的HOOC-Ile₄₂₉-His₄₂₈C末端一致。在该技术中看来有一些本底(“噪音”)，所以不能排除如此低水平的其它序列。

4. 通过MALDI-MS比较PAF-AH片段与PAF-AH

对纯化的rPH.2和rPH.9制备物进行MALDI-MS。rPH.2质谱中在预期为rPAF-AH蛋白的质量值处展现出2个峰(参见图4)，与在上述B.1.节中用部分纯化的蛋白质观察到的型式类似。次要的较低分子量峰通常以总量的约20-30％存在。rPH.9的质谱显示与预期减去翻译起始甲硫氨酸的PH.9载体的全长翻译产物一致的占优势的峰(参见图5)。亦观察到rPH.9的代表总量约5％的小的分子量稍低的肩峰。

5. 通过SDS-PAGE比较PAF-AH片段与PAF-AH

对纯化的rPAF-AH、rPH.2和rPH.9制备物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)。在基于蛋白分子量标准预期为rPAF-AH产物的电泳迁移范围周围，观察到rPH.2的复杂条带型式。在一个或一些凝胶中观察到二个占优势的条带，在主带上下容易地观察到次要条带。将这些上部次要条带、中部主要条带和较低的次要条带分别命名为AH_U、AH_M和AH_L。所有这些条带均在蛋白印迹上与抗-rPAF-AH单克隆抗体反应，因此被鉴别为rPAF-AH相关产物。上部次要条带AH_U的深度随蛋白储存时间加深，推测代表rPAF-AH产物的修饰形式。rPAF-AH制备物的SDS-PAGE与rPH.2的类似。迁移在rPAF-AH预期分子量附近的有二个主带，在主带上面有次要条带，主带下有阴影。与之相反，rPH.9在SDS-PAGE上展示单一占优势条带，没有明显***。亦观察到在分子量稍低的位置和预期的二***置的浅带。未观察到AH_U样的条带。

亦在2D凝胶(在尿素中等电聚焦，接着第二向进行SDS-PAGE)中分析纯化的rPH.2和rPH.9制备物的组成。对于rPH.9，2D凝胶显示在IEF方向上分离的5个主要斑点。在rPH.9的各批之间出现的电荷异质性是一致的。与之相反，rPH.2的2D凝胶型式更加复杂，因为它有在IEF和SDS-PAGE方向上分离的约15个斑点。

6. 比较PAF-AH片段与PAF-AH的活性

纯化的rPH.2和rPH.9具有与从血清纯化的内源PAF-AH不可区分的酶活性，rPH.2和rPH.9以与纯化的内源PAF-AH类似的方式与脂蛋白结合。

                        实施例11

通过RNA印迹杂交进行了人血浆PAF-AH mRNA在人组织中表达型式的初步分析。

使用RNA Stat 60(Tel-Test“B”，Friendswood，TX)从人大脑皮质、心脏、肾脏、胎盘、胸腺和扁桃体制备RNA。另外，从人造血前体样细胞系THP-1(ATCC TIB 202)制备RNA，该细胞系用佛波醇酯乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)诱导分化成为巨噬细胞样表现型。将组织RNA和诱导前和诱导后1-3天从早幼粒细胞THP-1细胞系制备的RNA通过1.2％琼脂糖甲醛凝胶进行电泳，接着转移至硝酸纤维素膜。通过随机引发标记全长人血浆PAF-AH cDNA，sAH 406-3，在与实施例3中对文库筛选所描述的那些条件的相同条件下与所述膜杂交。初始的结果表明，该PAF-AH探针与胸腺、扁桃体的1.8kb条带杂交，在较小的程度上与胎盘RNA杂交。

PAF在大脑中在正常生理以及病理病症下合成。已知该分子的促炎性质和潜在的神经毒性性质，预期PAF合成定位机制或其快速分解代谢机制对神经组织的健康是关键的。PAF乙酰水解酶在神经组织中的存在与其起这种保护性作用是一致的。有趣的是，在大脑中都鉴别到牛异三聚体胞内PAF-AH[在Hattori等，J.Biol.Chem.，269(37)：23150-23155(1994)中描述了它的克隆]和本发明的PAF-AH。为确定这二种酶是否在大脑的类似或不同的区室表达，克隆了牛大脑胞内PAF-AH cDNA的人同源物，通过RNA印迹，使用前段中描述的基本相同的方法，将其在脑中的mRNA表达型式与本发明的PAF-AH的mRNA表达型式相比较。通过RNA印迹检测的脑区域是小脑、髓质、脊髓、豆状核、杏仁核(amygdala)、尾状核、丘脑和枕极、大脑皮层的额叶和颞叶。在每种这些组织中都检测到这二种酶的信息，尽管异三聚体胞内形式比分泌形式丰富的多。其它组织的RNA印迹分析进一步揭示异三聚体胞内形式在广泛的各种组织和细胞中表达，包括胸腺、***、睾丸、卵巢、小肠、结肠、外周血白细胞、巨噬细胞、大脑、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏和肾上腺。这种普遍存在的表达提示，异三聚体胞内PAF-AH在细胞内具有一般性管家功能。

亦检测了从人血分离的单核细胞以及在其在培养中自发分化成为巨噬细胞时的PAF-AH表达。在新鲜单核细胞中未检测到或极少检测到RNA，但在分化成为巨噬细胞期间表达被诱导和保持。在分化细胞的培养基中有PAF-AH活性的伴随积累。亦在诱导后1天而不是3天的THP-1细胞RNA中观察到人血浆PAF-AH转录物的表达。THP-1细胞在基础状态不表达PAF-AH的mRNA。

                        实施例12

通过原位杂交检测了人和小鼠组织中的PAF-AH表达。

从国家疾病研究和交换和合作性人组织网络得到人组织。从S/JLJ小鼠收集正常小鼠大脑和脊髓以及EAE阶段3小鼠脊髓。从受精后7至18天收集正常S/JLJ小鼠胚胎。

使用少量的OCT化合物(Miles，Inc.，Elkhart，IN)将组织块置于Tissue Tek II冷冻模具(cryomolds)(Miles Laboratories，Inc.，Naperville，IL)中。将它们置于冷冻模具中央，用OCT化合物充满冷冻模具，然后置于装有2-甲基丁烷[C₂H₅CH(CH₃)₂，Aldrich Chemical Company，Inc.，Milwaukee，WI]的容器中，将该容器置于液氮中。一旦冷冻模具中的组织和OCT化合物冷冻，则将所述块置于-80℃保存直至切片。将组织块切成6μm厚，粘附于Vectabond(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)包被载玻片上，储存于-70℃，置于50℃约5分钟使其温暖并除去冷凝水，然后于4℃在4％多聚甲醛中固定20分钟，在每个级别于4℃脱水1分钟(70％、95％、100％乙醇)，然后于室温风干30分钟。将切片于70C在70％甲酰胺/2X SSC中变性2分钟，在2X SSC中清洗2次，脱水然后风干30分钟。将所述组织与放射标记的单链mRNA原位杂交，该单链mRNA从源自PAF-AH基因的内部1Kb HindIII片段(SEQ ID NO：7的核苷酸308-1323)的DNA通过体外RNA转录掺入³⁵S-UTP(Amersham)制备，或从源自由Hattori等鉴别的异三聚体胞内PAF-AH cDNA的DNA制备。使用各种长度的250-500bp的探针。于50℃杂交过夜(12-16小时)；将³⁵S标记的核糖探针(riboprobe)(6×10⁵cpm/切片)、tRNA(0.5μg/切片)和焦碳酸二乙酯(depc)处理的水加入杂交缓冲液，使其最终浓度为50％甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris pH7.5、10％葡聚糖硫酸酯、1X Denhardt溶液、100mM二硫苏糖醇(DTT)和5mM EDTA。杂交后，于室温在4XSSC/10mM DTT中洗涤切片1小时，然后于60℃于50％甲酰胺/1XSSC/10mM DTT中洗涤40分钟，于室温在2X SSC中洗涤30分钟，于室温在0.1X SSC中洗涤30分钟。将切片脱水，风干2小时，用Kodak NTB2照相乳胶包埋，风干2小时，显影(于4℃在完全黑暗中储存后)，用苏木精/曙红复染。

A. 脑

小脑。在小鼠和人的脑中，在小脑浦肯野细胞层、在篮细胞和齿状核(小脑的四个深核之一)中的单个神经元胞体中观察到强烈的信号。在这些细胞类型中亦观察到异三聚体胞内PAF-AH的信息。另外，在灰质的颗粒层和细胞层的单个细胞上观察到血浆PAF-AH信号。

海马。在人海马切片中，看来是神经元胞体的整个切片中的单个细胞显示了强烈的信号。这些被鉴别为多形胞体和颗粒细胞。亦在海马中观察到异三聚体胞内PAF-AH信息。

脑干。在人和小鼠的脑干切片上，在灰质中的单个细胞上有强烈信号。

皮层。在从大脑、枕和颞皮层上取的人皮层切片上和在小鼠全脑切片上，整个皮层的单个细胞都显示强烈信号。这些细胞被鉴别为锥状、星状和多形胞体。在皮层的不同层中看来没有表达显示的分化。这些原位杂交结果与通过RNA印迹得到的大脑皮层结果不同。这种差异可能是原位杂交比RNA印迹更加敏感的结果。在小脑和海马中，观察到异三聚体胞内PAF-AH的类似表达型式。

垂体。在人组织切片的远部中的分散的单个细胞上观察到较弱的信号。

B. 人结肠

正常的结肠和局限性结肠炎结肠都在切片的粘膜中存在的淋巴聚集物中展示信号，局限性结肠炎患者的切片中的信号稍强。局限性结肠炎结肠亦在固有层中有强烈信号。类似地，在患病的阑尾切片中观察到高水平的信号，而正常的阑尾表现出较低的但可以检测的信号。溃疡性结肠炎患者的切片在淋巴聚集物中或者固有层中均未显示明显的信号。

C. 人扁桃体和胸腺

在扁桃体的生发中心内和胸腺内的单个细胞的分散群中观察到强烈的信号。

D. 人***

在从正常供体取得的***切片上观察到强烈的信号，在从败血症体克的供体切片的***中观察到较弱的信号。

E. 人小肠

正常和局限性结肠炎的小肠在切片的淋巴集结和固有层中都有弱信号，疾病组织的信号略高。

F. 人脾脏和肺

在任何脾脏(正常切片和脾脓肿(abcess)切片)或肺(正常切片和气肿切片)组织中均未观察到信号。

G. 小鼠脊髓

在正常和EAE阶段3的脊髓中，在脊髓灰质中有强烈信号，EAE阶段3脊髓中的表达略高。在EAE阶段3脊髓中，在白质和血管周套(perivascalar cuff)中的细胞(可能是浸润巨噬细胞和/或其它白细胞)显示在正常脊髓中所没有的信号。

F. 小鼠胚胎

在11天的胚胎中，在第四脑室的中枢神经***中信号是明显的，该信号在胚胎发育成为小脑和脑干时的时间进程中保持恒定。在胚胎成熟时，脊髓(第12天)、初生皮层和神经节(第14天)和垂体(第16天)中的中枢神经***中的信号变得明显。在离开脊髓的神经上的***神经***(起始于第14或第15天)中观察到信号，在第17天，在胚胎须周围出现强烈信号。亦在第14天的肝脏和肺脏中观察到表达，在肠(起始于第15天)和口/喉的后面部分(起始于第16天)中观察到表达。第18天时，表达型式已分化成为皮层、后脑(小脑和脑干)、离开脊髓腰区的神经、口/喉后面部分、肝脏、肾脏中的信号，肺和肠中信号可能较弱。

G. 概述

PAF-AH mRNA在扁桃体、胸腺、***、淋巴集结、阑尾和结肠淋巴集结物中的表达与PAF-AH的可能占优势的体内源是巨噬细胞的结论是一致的，因为这些组织均有大量组织巨噬细胞，其做为吞噬和抗原处理细胞起作用。

炎症组织中PAF-AH的表达与单核细胞源的巨噬细胞的作用是消除炎症的假说一致。预期PAF-AH将钝化PAF和促炎磷脂，由此向下调节由这些介质引发的炎症事件级联。

在整个脑组织中已检测到PAF，培养中的大鼠小脑颗粒细胞分泌PAF。体外和体内实验已证实，PAF结合神经组织中的特异性受体，诱导功能性和表型变化，例如钙动员、转录激活基因向上调节、神经前体细胞系PC12的分化。这些观察提示PAF在脑中的生理作用，与之一致的是，近期使用海马组织切片培养物和PAF类似物以及拮抗剂的实验已暗示，PAF做为海马长期增强的重要退行信使：因此，除了其在炎症中的病理作用之外，看来PAF参与日常神经元信号发生过程。胞外PAF-AH在脑中的表达可以起调节PAF介导的信号发生的时间长度和强度的作用。

                        实施例13

使用产生PAF-AH的大肠杆菌做为免疫原，制备了对重组人血浆PAF-AH特异性的单克隆抗体。

用重组PAF-AH于第0天、第19天和第40天注射小鼠#1342。对于融合前加强，用PBS中的该免疫原注射所述小鼠，4天后处死小鼠，无菌取出其脾脏并置于10ml无血清RPMI 1640中。通过浸泡于无血清RPMI 1640中的二个玻璃显微镜载玻片的冷冻末端之间研磨脾脏，形成单细胞悬浮液，该无血清RPMI 1640补充了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco，加拿大)。将细胞悬浮液通过无菌70目Nitex细胞滤过器(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)过滤，通过于200g离心5分钟洗涤2次，将沉淀再悬浮于20ml无血清RPMI中。以类似的方式制备3只首次用于实验的Balb/c小鼠的胸腺细胞。将融合前3天在含有11％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，Utah)的RPMI中保持在对数期的NS-1骨髓瘤细胞于200g离心5分钟，如前述段落中所述洗涤沉淀2次。

将1×10⁸脾脏细胞与2.0×10⁷NS-1细胞混合，离心，吸去上清液。通过轻敲试管使细胞沉淀松动，在1分钟的时间内一边搅拌一边加入1ml的37℃ PEG 1500(75mM Hepes中50％，pH8.0)(BoehringerMannheim)，接着在7分钟的时间内加入7ml无血清RPMI。另外加入8mlRPMI，将细胞于200g离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀再悬浮于含有15％FBS、100μM次黄嘌呤钠、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷(HAT)(Gibco)、25单位/mlIL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×10⁶胸腺细胞/ml的200ml RPMI中，接种子10个Corning平底96孔组织培养板(Corning，Coming New York)中。

于融合后的第2、4和6天，从融合板的孔中取出100μl的培养基并用新鲜培养基置换。第8天时，通过ELISA筛选融合物，检测与重组PAF-AH结合的小鼠IgG的存在。用100ng/孔在25mM TRIS、pH7.5中稀释的重组PAF-AH于37℃将Immulon4平板(Dynatech，Cambridge，MA)包被2小时。吸去包被溶液，加入200ul/孔的封闭溶液[在CMF-PBS中稀释的0.5％鱼皮明胶(Sigma)]，于37℃温育30分钟。用含有0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤板三次，加入50μl培养上清液。于37℃温育30分钟后，如上述洗涤，加入在PBST中稀释1∶3500的50μl辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。如上述温育板，用PBST洗涤四次，加入由100mM柠檬酸盐中的1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H₂O₂、pH4.5组成的100μl底物。通过加入50μl15％H₂SO₄，在5分钟内终止颜色反应。在读板仪上测定A₄₉₀。

通过在96孔板中稀释，将选择的融合孔克隆二次，于5天后目视计数每孔的集落数。克隆的杂交瘤是90D1E、90E3A、90E6C、90G11D(ATCC HB 11724)和90F2D(ATCC HB 11725)。

使用Isostrip***(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)对杂交瘤产生的单克隆抗体进行同型分析。结果显示融合90的杂交瘤产生的单克隆抗体都是IgG₁。

融合90的杂交瘤产生的所有单克隆抗体在ELISA检测中功能良好，但是在蛋白印迹中不能结合PAF-AH。为制备可以通过蛋白印迹识别PAF-AH的抗体，用重组酶免疫小鼠#1958。如对融合90所述的那样制备杂交瘤，但是通过蛋白印迹而不是ELISA筛选，以鉴别可以进行蛋白印迹的克隆。

对于蛋白印迹，用含有125mM Tris pH6.8、4％SDS、100mM二硫苏糖醇和0.05％溴酚蓝的等体积样品缓冲液混合重组PAF-AH，在上样至12％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Novex)之前煮沸5分钟。于40毫安电泳后，在192mM甘氨酸、25mM Tris碱、20％甲醇和0.01％SDS中于125V1小时将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜(Pierce)上。将该膜于4℃在含有5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的20mM Tris、100mM NaCl(TBS)中温育过夜。将印迹于室温与在含有5％BSA的TBS中稀释1/8000的兔多克隆抗血清温育1小时，然后用TBS洗涤，与在含有5％BSA的TBS中的碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG于室温温育1小时。用TBS再次洗涤印迹，然后与100mM Tris-HCl pH9.5、100mM NaCl和5mM MgCl₂中的0.02％磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚酯和0.03％氮蓝四唑温育。反复进行水洗涤终止所述反应。

将蛋白印迹分析中其上清液阳性的选择的融合孔如上述进行处理。杂交瘤143A在蛋白印迹中与PAF-AH反应，将其克隆(ATCC HB11900)。

通过用弗氏佐剂中的100μg纯化的重组酶通过三个月免疫，在兔子中产生对人血浆PAF-AH特异性的多克隆抗血清。

                              实施例14

使用大鼠足水肿模型[Henriques等，Br.J.Pharmacol.，106：579-582(1992)]进行实验研究，以评价本发明的重组PAF-AH对急性炎症的疗效。这些研究的结果证实rPAF-AH阻断了PAF诱导的水肿。进行了平行研究，以比较PAF-AH与二种市售PAF拮抗剂的效力。

A. 制备PAF-AH

在显微流态仪中将用PAF-AH表达载体puc trp AH转化的大肠杆菌溶菌，离心除去固体，将细胞上清液上样至S-Sepharose柱(Pharmacia)。该柱用由50mM NaCl、10mM CHAPS、25mM MES和1mM EDTA、pH5.5组成的缓冲液充分地洗涤。通过将缓冲液的NaCl浓度提高至1M洗脱PAF-AH。然后将使用Blue Sepharose柱(Pharmacia)的亲和层析做为额外的纯化步骤使用。在将PAF-AH制备物上样至Blue Sepharose柱之前，稀释样品1∶2以将NaCl的浓度降至0.5M，将pH调节至7.5。在用由0.5M NaCl、25mM Tris、10mM CHAPS和1mM EDTA、pH7.5组成的缓冲液充分地洗涤Blue Sepharose柱后，通过将NaCl浓度提高至3.0M洗脱PAF-AH。

通过SDS-PAGE评价，这种方式分离的PAF-AH的纯度一般为95％，活性范围为5000-10,000U/ml。对每个PAF-AH制备物进行的其它质量控制包括测定内毒素水平和对新鲜得到的大鼠红细胞的溶血活性。含有25mM Tris、10mM CHAPS、0.5M NaCl、pH7.5的缓冲液做为该酶的储存介质以及给药的载体。在实验中使用的剂量基于在实验即将开始之前进行的酶活性检测。

B. 诱导水肿

将重量为180-200克的6-8周龄雌性Long Evans大鼠(Charles River，Wilmington，MA)用于所有的实验。在实验操作之前，用麻醉剂***(Fort Dodge Laboratories，Fort Dodge，IA)、甲苯噻嗪(Miles，ShawneeMission，KS)和乙酰丙嗪(Aveco，Fort Dodge，IA)的混合物麻醉动物，每剂量每只动物皮下给予约2.5mg***、1.6mg甲苯噻嗪、0.2mg乙酰丙嗪。通过如下给予或者PAF或者酵母聚糖在足部诱导水肿。从于-20℃储存于氯仿/甲醇(9∶1)的19.1mM母液为每个实验新鲜制备PAF(Sigma#P-1402)。在N₂下干燥至需要的体积，在含有150mM NaCl、10mM Tris pH7.5和0.25％BSA的缓冲液中稀释1∶1000，超声处理5分钟。动物在后足垫之间皮下接受50μl PAF(最终剂量为0.96nmole)，1小时后评价水肿，在一些实验中在2小时后再次评价水肿。为每个实验新鲜制备作为PBS中的10mg/ml悬浮液的酵母聚糖A(Sigma #A-8800)。动物在后足垫之间皮下接受50μl酵母聚糖(最终剂量为500μg)，2小时后评价水肿。

通过在就要给予PAF或酵母聚糖之前和在用PAF或酵母聚糖功击之后的指定时间点测定足体积来定量水肿。以足体积增加的毫升数表示水肿。使用测定浸入的足置换的水体积的体积计(plethysmometer)(UGO Basile，#7150型)对麻醉的动物测定体积置换测量。为保证一个时间点到下一个时间点的足浸入是可比的，用去不掉的墨水标记后足发际线与后跟相交的地方。使用这一技术重复测定同一足表明精确度在5％之内。

C. PAF-AH给药途径和剂量

在足垫之间局部注射PAF-AH，或者通过在尾静脉静脉内注射***注射。对于局部给予，大鼠接受了在右后足垫之间皮下传递的100μl PAF-AH(4000-6000U/ml)。左足通过给予100μl载体(缓冲盐溶液)做为对照。对于***给予PAF-AH，大鼠在尾静脉中接受在300μl载体中静脉给予的表明单位的PAF-AH。对照在尾静脉接受适当体积的载体静脉内注射。

D. 局部给予PAF-AH

在大鼠(N＝4)右足垫之间皮下注射100μl PAF-AH(4000-6000U/ml)。用100μl载体(缓冲盐溶液)注射左足。另外四只大鼠仅用载体注射。所有的大鼠都立即用通过皮下足注射的PAF攻击，攻击后1小时评价足体积。图6描绘了通过局部给予PAF-AH阻断了PAF诱导的足水肿，其中以每个处理组的足体积的平均增加(ml)±SEM表达水肿。在PAF攻击之前接受了局部PAF-AH处理的组显示比对照注射组降低的炎症。与载体处理的对照的0.63±0.14(SEM)相比，在PAF-AH组中观察到0.08ml±008(SEM)的足体积的增加。足体积的增加是PAF注射的直接结果，因为仅用载体在足中注射的动物未表现足体积的增加。

E. 静脉内给予PAF-AH

在PAF攻击之前15分钟，用或者PAF-AH(300μl载体中2000U)或者仅用载体预先静脉内注射大鼠(每组N＝4)。图7描绘了通过静脉内给予PAF-AH于攻击后1和2小时时阻断了PAF诱导的足水肿，其中以每个处理组的足体积的平均增加(ml)±SEM表达水肿。通过静脉内途径接受2000U PAF-AH的组显示在2小时时间进程中炎症降低。2小时时PAF-AH处理组的平均体积增加是0.10ml±0.08(SEM)，载体处理的对照的平均体积增加是0.56ml±0.11。

F. 比较在通过PAF或酵母聚糖诱导的水肿中的PAF-AH保护

用或者PAF-AH(300μl载体中2000U)或者仅用载体预先静脉内注射处理大鼠(每组N＝4)。预处理后15分钟，各组接受或者PAF或者酵母聚糖A，分别于1和2小时后评价足体积。如图8中所示，***给予PAF-AH(2000U)有效降低PAF诱导的足水肿，但未能阻断酵母聚糖诱导的水肿，其中以每个处理组的足体积的平均增加(ml)±SEM表达水肿。PAF-AH处理组的平均体积增加是0.08±0.02，对照组的平均体积增加是0.49ml±0.03。

G. PAF-AH保护的有效剂量滴定

在二个独立实验中，在PAF攻击前15分钟，将各组大鼠(N＝34/组)用300μl体积的或者PAF-AH系列稀释液或者载体对照静脉内预处理。将双足都用PAF攻击(如上述)，1小时后评价水肿。图9描绘了在用增加的剂量的PAF-AH注射的大鼠中增强了保护免受PAF诱导的水肿，其中以每个处理组的体积的平均增加(ml)±SEM表达水肿。在这些实验中，发现通过静脉内途径给予的PAF-AH的ID₅₀在40-80U/大鼠之间。

H. 随给予后时间变化的PAF-AH的体内效力

在二个独立实验中，将2组大鼠(N＝3-4/组)用或者PAF-AH(300μl载体中2000U)或者载体自身静脉内预处理。给予后，各组于PAF-AH给予后15分钟至47小时的时间点接受PAF。PAF攻击1小时后评价水肿。如图10所示，给予2000U的PAF-AH保护大鼠免受PAF诱导的水肿至少24小时，其中以每个处理组的体积的平均增加(ml)±SEM表达水肿。

I. PAF-AH的药物动力学

4只大鼠通过静脉内注射接受300μl体积中的2000U PAF-AH。于各时间点收集血浆，储存于4℃，通过使用双单克隆抗体捕获测定的ELISA测定PAF-AH的血浆浓度。简言之，将单克隆抗体90G11D(实施例13)在50mM碳酸缓冲液pH9.6中稀释至100ng/ml，在Immulon 4ELISA板上于4℃固定过夜。用含有0.05％吐温20的PBS充分洗涤后，将所述板用在PBS中稀释的0.5％鱼皮明胶(Sigma)于室温封闭1小时。将含有15mM CHAPS的PBS中稀释的血清样本以双份加入洗涤的ELISA平板中，于室温温育1小时。洗涤后，将单克隆抗体90F2D(实施例13)的生物素缀合物以在PBS中稀释的5μg/ml的浓度加入孔中，于室温温育1小时。洗涤后，将50μl的ExtraAvidin(Sigma)的1∶1000稀释液加入孔中，于室温温育1小时。洗涤后，使用OPD做为底物使各孔显色，定量。然后从标准曲线计算酶活性。图11显示1小时血浆酶水平达到了基于对于180-200克大鼠的5-6ml血浆体积的预期浓度，平均＝374U/ml±58.2，其中数据点代表平均±SEM。1小时后血浆水平持续下降，于24小时达到平均血浆浓度19.3U/ml±3.4，仍显著高于通过酶测定发现约为4U/ml的内源大鼠PAF-AH水平。

J. PAF-AH与PAF拮抗剂的效力比较

将各组大鼠(N＝4/组)用3种潜在抗炎剂的一种预处理：腹膜内给予的PAF拮抗剂CV3988(Biomol#L-103)(200μl乙醇中2mg)、腹膜内给予的PAF拮抗剂Alproazolam(Sigma #A-8800)(200μl乙醇中2mg)或静脉内给予的PAF-AH(2000U)。对照大鼠用300μl体积的载体静脉内注射。腹膜内给予PAF拮抗剂，因为它们溶于乙醇。给予PAF拮抗剂后30分钟，用PAF攻击注射了或者CV3988或者Alprazolam的大鼠，以使PAF拮抗剂进入循环，而PAF-AH和载体处理的大鼠在酶给予后15分钟被攻击。用PAF-AH注射的大鼠表现出超过由已确立的PAF拮抗剂CV3988和Alprazolam对PAF诱导的水肿的降低。参见图12，其中以每个处理组的体积的平均增加±SEM表示水肿。

概括地讲，rPAF-AH在体内有效地阻断由PAF介导的水肿。可以或者局部给予或者通过静脉内注射***性给予PAF-AH产物。在剂量研究中，发现160-2000U/大鼠范围内的静脉内注射显著地降低PAF介导的炎症，而ID₅₀剂量看来在40-80U/大鼠的范围内。基于180-200克大鼠的血浆体积的计算，预测25-40U/ml范围内的血浆浓度应该阻断PAF引发的水肿。这些预测受到初步药物动力学研究的支持。发现2000UPAF-AH的剂量有效阻断PAF介导的水肿至少24小时。给予PAF-AH后24小时，发现该酶的血浆浓度为约25U/ml。发现PAF-AH比测试的所述2种已知的PAF拮抗剂更有效地阻断PAF诱导的水肿。

总之，这些结果证实PAF-AH有效地阻断PAF诱导的炎症，可能在PAF是主要介质的疾病中具有治疗价值。

                           实施例15

在第二个体内模型即PAF诱导的胸膜炎中测试本发明的重组PAF-AH。当导入胸膜腔时，PAF已显示诱导血管泄漏[Henriques等，见上述]。用200μl在具有300μl重组PAF-AH(1500μmol/ml/小时，如实施例14中所述的制备)的0.9％对照缓冲液中或等体积对照缓冲液中的1％Evans蓝染料在尾静脉注射雌性大鼠(Charles River，180-200g)。15分钟后，所述大鼠接受注射入胸膜腔的100μl PAF(2.0nmol)。PAF攻击1小时后，处死大鼠，通过用3ml肝素化磷酸缓冲盐水清洗该腔收集胸膜液。通过胸膜腔中Evans蓝染料的量(由620nm的吸收值定量)确定血管泄漏的程度。发现用PAF-AH预处理的大鼠比对照动物的血管泄漏少(代表炎症减轻超过80％)。

以上结果支持用本发明的重组PAF-AH酶治疗患有胸膜炎的受治疗者。

                          实施例16

亦在抗原诱导的嗜酸性粒细胞募集模型中测试了本发明的重组PAF-AH酶。气道中嗜酸性粒细胞的聚集是哮喘、鼻炎和湿疹中发生的晚期免疫应答的特征。以2周的间隔，通过2次腹膜内注射将BALB/c小鼠(Charles River)致敏，注射液由在4mg氢氧化铝(Imject alum，PierceLaboratories，Rockford，IL)中的1μg卵清蛋白(OVA)组成。第二次免疫14天后，用或者气溶胶化的OVA或者做为对照的盐水攻击致敏的小鼠。

攻击之前，将小鼠随机分为4组，4只小鼠/组。组1和3的小鼠用通过静脉内注射给予的由25mM Tris、0.5M NaCl、1mM EDTA和0.1％吐温80组成的140μl对照缓冲液预处理。组2和4的小鼠用750单位的PAF-AH(140μl PAF-AH缓冲液中给予的活性为5,500单位/ml)预处理。给予PAF-AH或者缓冲液后30分钟，如下述将组1和2组的小鼠暴露给气溶胶化的PBS，而组3和4的小鼠暴露给气溶胶化的OVA。24小时后，通过静脉内注射用或者140μl缓冲液(组1和3)或者140μl缓冲液中的750单位的PAF-AH(组2和4)第二次处理小鼠。

通过将动物暴露给气溶胶化的OVA，在致敏的小鼠中诱导嗜酸性粒细胞浸润气管。将致敏的小鼠置于50ml锥形离心管(Coring)中，使用喷雾器(646型，DeVilbiss Corp.，Somerset，PA)强迫呼吸溶解于0.9％盐水中的气溶胶化的OVA(50mg/ml)20分钟。以类似方式处理对照小鼠，但在喷雾器中使用的是0.9％盐水。暴露给气溶胶化OVA或盐水48小时后，处死小鼠，切出气管。将各组的气管包埋于OCT中，在切片之前储存于-70℃。

为评价气管的嗜酸性粒细胞浸润，用或者Luna溶液和苏木精-曙红溶液或用过氧化物酶染色4组小鼠的组织切片。从每组小鼠切出12个6μm厚切片，并相应编号。如下述将奇数编号的切片用Luna染料染色。将切片于室温在甲醛缩醇(formal alcohol)中固定5分钟，于室温用三遍2分钟自来水清洗，然后于室温在二遍5分钟dH₂O清洗。于室温用Luna染料将组织切片染色5分钟(Luan染料由90ml Weigert铁苏木精和10ml1％Biebrich Scarlet组成)。将染色的载玻片在1％酸性酒精中蘸6次，于室温在自来水中清洗1分钟，在0.5％碳酸锂溶液中蘸5次，于室温在流动的自来水中清洗2分钟。通过70％-95％-100％乙醇(各1分钟)将载玻片于室温脱水，然后于室温在二遍1分钟二甲苯中透明，于Cytoseal60中封固。

对于过氧化物酶染色，将偶数编号的切片在4℃丙酮中固定10分钟，风干。向每个切片加入200μl DAB溶液，在室温静置5分钟。将载玻片于室温在自来水中清洗5分钟，将2滴1％锇酸用于每个切片3-5秒钟。于室温将载玻片在自来水中清洗5分钟，用25℃的Mayers苏木精于室温复染。然后在流动的自来水中清洗载玻片5分钟，通过70％-95％-100％乙醇(各1分钟)将载玻片于室温脱水，然后于室温在二遍1分钟二甲苯中透明，于Cytoseal 60中封固。

评价气管粘膜下组织中的嗜酸性粒细胞数目。发现组1和2的小鼠的气管在整个粘膜下组织中有分散的极少的嗜酸性粒细胞。如对组3小鼠的气管所预期的那样(该组小鼠用缓冲液预处理并暴露给雾化OVA)，在整个粘膜下组织中发现大量的嗜酸性粒细胞。与之相反，在用PAF-AH预处理并暴露给雾化OVA的组4小鼠的气管中在粘膜下组织中发现了可以与二个对照组即组1和2中观察到的相当的极少的嗜酸性粒细胞。

因此，表明用PAF-AH治疗性治疗了表现出晚期免疫应答的受治疗者，所述晚期免疫应答包括诸如在哮喘和鼻炎中发生的嗜酸性粒细胞在气道中聚集。

                          实施例17

亦在二个不同的治疗坏死性小肠结肠炎(NEC)(即在低出生体重婴儿中发生的并引起显著发病率和死亡率的急性出血性肠坏死)的大鼠模型中测试了本发明的PAF-AH产物。先前的实验已证实，用糖皮质激素处理降低了动物中和早产婴儿中NEC的发生率，已提示糖皮质激素的活性是通过增加血浆PAF-AH活性而发生。

A.由PAF攻击诱导的NEC的大鼠中的活性

1. 预防NEC

将重组PAF-AH产物rPH.2(0.3ml中25,500单位，组2和4)或载体/缓冲液本身(25mM Tris、0.5M NaCl、1mM EDTA和0.1％吐温80)(组1和3)给予重量为180-220克雌性Wistar大鼠(n＝3)的尾静脉。如先前Furukawa等[J.Pediatr.Res.34：237-241(1993)]所述，在rPH.2或载体注射后15分钟时，将或者BSA(0.25％)-盐水(组1和2)或者悬浮于BSA盐水中的PAF(0.2μg/100g)在肠系膜上动脉的水平注射入腹主动脉。2小时后从Trietz至盲肠的韧带取出小肠，用冷盐水彻底洗涤，大体地检查。从小肠的上部、中部和下部的显微镜检查得到样本。在组织在缓冲的***中固定，通过用苏木精和曙红染色处理样本以进行显微镜检查。重复实验三次。

大体发现表明，用BSA盐水的载体处理的组中是正常外观的肠。类似的，缺乏PAF时注射的rPH.2对大体检查没有影响。与之相反，PAF注射入降主动脉导致所述肠的浆膜表面快速、严重变色和出血。当在粘膜面检查一节小肠时注意到类似的出血，所述小肠看来已相当的坏死。当在将PAF给予主动脉之前15分钟通过尾静脉注射rPH.2时，所述肠看来正常。

在进行显微镜检查时，从组1、2和4得到的小肠证实固有层内的正常绒毛结构和正常细胞群体。与之相反，仅用PAF处理的组显示在整个粘膜中的全厚度坏死和出血。

在上述实验中使用的大鼠中亦测定了血浆PAF-AH的活性。如下述测定PAF-AH活性。在尾静脉注射之前，得到血液样本。随后就在注射PAF之前和处死大鼠时从大静脉得到血液样本。将约50μl的血液收集于肝素化毛细管中。离心后得到血浆(980xg5分钟)。如Yasuda和Johnston(Endocrinology，130：708-716(1992))先前所述检测酶。

发现注射前所有大鼠的平均血浆PAF-AH活性为75.5±2.5单位(1单位等于1nmolex分钟^-1xml^-1血浆)。注射载体后15分钟的平均血浆PAF-AH活性为组1为75.2±2.6单位、组3为76.7±3.5单位。15分钟后，用25,500单位rPH.2注射的动物的血浆PAF-AH活性为组2为2249±341单位和组4为2494±623单位。组2和4的活性保持较高(1855±257单位)直至处死时(rPH.2注射后2.25小时)(组2＝1771±308；组4＝1939±478)。这些结果表明，仅用载体注射的大鼠的血浆PAF-AH活性(组1和3)在实验过程中没有改变。所有仅接受PAF注射的动物都有NEC发展，而用rPH.2注射接PAF注射的大鼠受到完全保护。

2. NEC预防的剂量依赖性

为确定大鼠中对抗NEC的保护是否是剂量依赖的，在PAF给予之前15分钟用增加剂量的rPH.2处理动物。起初，将25.5-25,500单位范围的rPH.2给予大鼠尾静脉。然后将PAF(0.2ml BSA盐水中0.4μg)在给予rPH.2后15分钟注射入腹主动脉。PAF给予2小时后取出小肠，检查NEC的发展。在外源给予该酶之前和rPH.2给予后2.25小时后测定血浆PAF-AH活性。结果是每组中2-5只动物的平均值。

大体检查的发现表明，所有接受小于2,000单位该酶的大鼠发展了NEC。接受最低保护量(2040单位)酶的动物中在15分钟后血浆PAF-AH活性是每毫升血浆363单位，代表高出基底水平5倍。当以低于1,020总单位给予rPH.2时，得到的血浆酶活性平均约为160或更低，所有的动物都发展了NEC。

3. 对抗NEC的保护的时间长度

为确定外源PAF-AH产物提供对NEC发展的保护的时间长度，通过尾静脉对大鼠注射一次固定量的该酶，接着在不同的时间点用PAF攻击。将rPH.2(0.3ml中8,500单位)或仅用载体给予大鼠尾静脉中，将PAF(0.2ml BSA盐水中0.36μg)于该酶给予后不同时间注射入腹主动脉。PAF注射后2小时取出小肠，进行大体检查和组织学检查以评价NEC发展。在酶给予后不同时间和PAF给予后2小时测定血浆PAF-AH活性。确定每个组的酶活性平均值±标准差。

结果表明，在注射rPH.2后的前8小时内没有大鼠发展NEC，但是在注射该酶的24和48小时后用PAF攻击的动物100％地发展NEC。

4. NEC的逆转

为确定给予PAF-AH产物是否可以逆转由PAF注射诱导的NEC的发展，将25,500单位的该酶在给予PAF(0.4μg)之后2分钟通过注射入大静脉给予。没有动物发展NEC。但是，当在注射PAF后15分钟通过该途径给予rPH.2时，所有的动物均发展NEC，与Furukawa等[见上述]先前报道的通过给予PAF诱导的NEC发展的快速时间进程是一致的。

这些观察的总结表明，血浆PAF-AH活性的相对较小的增加(5倍)可以防止NEC。这些观察与先前已证实胎兔[Maki，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：728-732(1988)]和早产婴儿[Caplan，等，J.Pediatr.116：908-964(1990)]中血浆PAF-AH活性相对较低的报道相结合，提示向低出生重量婴儿预防性给予人重组PAF-AH产物可以用于治疗NEC。

B. NEC新生儿模型中的活性

如下述在NEC模型中评价PAF-AH产物rPH.2的效力，该模型中通过配方饲喂和窒息这二种人类疾病的常见风险因子协迫新生大鼠。在该模型中，在生命的第3天，约70-80％的动物发展了与新生儿NEC类似的大体上的和显微水平的肠损伤。从用CO₂麻醉并通过腹部切口接生的怀孕Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)得到新生大鼠。收集新生动物，干燥，在整个实验中在新生儿保育箱中保持。

首先，使用独立的动物组评价rPH.2的给予和吸收特征。于时间0点给予正常新生大鼠仔三种不同的肠或腹膜内剂量的rPH.2(3λ，15λ或75λ)之一，于1小时、6小时或24小时后收集血液以评价血浆PAF-AH活性。使用底物温育检测[Gray等，Nature，374：549(1995)]和使用每个样本的抗人rPAF-AH单克隆抗体(90F2D和90G11D，描述于实施例13中)的ELISA，测定PAF-AH活性。对于选择的样本，使用针对人rPAF-AH开发的二种不同的单克隆抗体(90F2D和90G11D，描述于实施例13中)进行免疫组织化学分析。采用使用1∶100稀释的抗体和过夜温育的标准技术进行免疫组织化学。

在正常新生大鼠肠道给予rPH.2之后，在任何时间点使用或者底物温育检测或者ELISA技术都没有可检测的血浆PAF-AH活性。使用腹膜内给予rPH.2时，在给药后1小时，使用这二种方法都有可检测的显著的循环PAF-AH活性，该活性在6小时达到高峰。较高剂量的rPH.2(从3至75λ，10-250U)导致较高的血浆PAF-AH活性。免疫组织化学分析揭示，在肠给药后在肠粘膜的上皮细胞中存在rPAF-AH产物。该反应性主要在肠绒毛中聚集，隐窝细胞中染色最少。回肠中的染色比空肠多，在结肠的部分中免疫化学鉴别了一些rPAF-AH产物。在任何对照样本中或在从通过腹膜内给药的动物中获得的样本中没有任何可证实的染色。因此，肠给予rPAF-AH产物导致该酶的局部粘膜上皮积累，没有任何可检测的***性吸收，而与之相反，腹膜内给予rPAF-AH产物导致高循环酶水平，但没有局部粘膜积累。

在所述NEC模型中，按照Caplan等，Pediatr.Pathol.，14：1017-1028(1994)在新生大鼠中诱导NEC。简言之，用从粉末(Esbiliac，Borden Inc)重构的新生鼠仔配方每隔3小时通过饲喂管喂动物。饲喂体积以0.1ml/饲喂起始，根据耐受提高至该方案的第4天。所有的动物通过每日在密闭的塑料箱内呼吸二次100％氮气50秒钟，并暴露于冷冻(4℃)10分钟，用窒息侵扰(asphyxial insalt)攻击。用每次饲喂后，以柔和操纵刺激肠道和膀胱功能。将动物保持96小时或直至它们显示痛苦的症状。发病的动物腹胀、血粪、呼吸窘迫、发绀和昏睡，通过断头术无痛致死。处死后，大体检查每只大鼠肠的坏死迹象，然后***固定以进行以后的组织学分析。将样本以石蜡包埋，用切片机切片，用苏木精和曙红染色，由二个观察者以盲法检查。将肠损伤打分，1+是上皮细胞提升或分离、2+是上皮细胞脱去至中等绒毛(mid-villous)水平、3+是整个绒毛坏死、4+是透壁坏死。

为评价rPH.2的效力，用该化合物通过肠传递、腹膜内传递或同时用这二种方法处理3个不同的大鼠组。该rPH.2制备物具有0.8mg/ml蛋白和约4000单位/mg PAF-AH活性，＜0.5EU/mg内毒素/蛋白比例。通过口胃管将稀释入每次饲喂(每隔3小时)的25λ(80U)的rPH.2肠道给药的动物。通过每天二次的腹膜内注射给予腹膜内给药的动物75λ。对照动物接受了不含rPH.2的适当体积的缓冲液(20mM NaPO₄，pH7.4)，与每个实验组同时研究。对每个处理组评价死亡率和NEC症状，使用FischerExact检测统计分析差异。＜0.05的p-值被认为显著。结果示于以下的表9。

                                  表9

                                              NEC             死亡

对照(腹膜内给予)                              7/10            8/10

rPH.2(240U每天2次腹膜内)                      6/11            8/11

对照(肠道给予)                                19/26           21/26

rPH.2(每隔3小时肠道给予80                     6/26            7/26

U)

对照(腹膜内+肠道给予)                         10/17           12/17

rPH.2(每天2次腹膜内给予240                    3/14            7/14

U和每隔3小时肠道给予80U)

数据代表腹膜内给药的四个不同实验、肠道给药的四个实验和腹膜内+肠道给药的三个实验的累积结果。

与对照动物相比，肠道rPH.2给予显著地降低了NEC和死亡的发生率。四个不同的肠道给药的实验的结果显示，用rPH.2预处理将NEC从19/26(对照)降低至6/26(p＜0.001)。在处理和对照动物之间肠损伤是可变，但是大多数情况下特征为一些节中的中等绒毛坏死、在其它区域中的全部绒毛坏死、有时有透壁坏死区、剩余部分具有正常小肠组织学。具有肠损伤的处理动物和对照动物的NEC的最坏程度是类似的(对照的平均打分为2.8，rPH.2处理的大鼠的平均打分为2.4，p＞0.05)。

腹膜内给药rPH.2对该模型的NEC或死亡无显著影响。症状的发生在该组与对照之间是类似的(对照为40±5小时，rPH.2处理的大鼠为36±7小时)，这二组中NEC的程度是类似的(对照的平均打分为2.6，rPH.2处理大鼠的平均打分为2.5)。

进行了其它的实验，其中对大鼠用与单处理组相同的剂量，即进行肠道亦进行腹膜内给药rPH.2(每隔3小时在每次饲喂中25λrPH.2，加上每天二次通过腹膜内注射75λ)。结果示于上述表9中。尽管处理组和对照组在死亡率方面没有显著差异，rPH.2处理显著地降低了NEC的发生率(对照中10/17，rPH.2处理大鼠中3/14，p＝0.04)。应注意，rPH.2处理组中死亡的7只动物中的6只在死亡前得到的血液培养物中大肠杆菌阳性。

这些结果进一步支持PAF-AH产物在非PAF诱导的NEC的新生儿模型中的保护作用。用rPAF-AH产物进行肠道处理防止了NEC，而此剂量的腹膜内处理没有可证实的效应。这些发现提示，用于有NEC风险的配方喂养的未成熟新生儿补充PAF-AH产物可以降低该疾病的发生率。

                          实施例18

检测了PAF-AH产物在急性呼吸窘迫综合症(ARDS)豚鼠模型中的效力。

静脉内注射入豚鼠的血小板激活因子(PAF)在人类中产生了早期ARDS的显著肺炎症回忆。静脉内给予PAF几分钟内，肺实质充血，支气管和细支气管收缩[Lellouch-Tubiana等，见上述]。血小板和多形核嗜中性白细胞开始壁立，沿着肺的小动脉可以容易地鉴别细胞聚集物[Lellouch-Tubiana，Br.J.Exp.Path.，66：345-355(1985)]。PAF输注亦破坏支气管上皮细胞，其从气道壁分离并在气道腔中聚集。对气道上皮细胞的这种破坏与在ARDS发展的人类中发生的透明膜形成是一致的。嗜中性白细胞和血小板壁立，紧接着这些细胞血细胞渗出进入肺的肺泡隔和肺泡腔。由PAF引发的细胞浸润伴随着导致气道水肿的显著的血管泄漏[Kirsch，Exp.Lung Res.，18：447-459(1992)]。水肿的证据受到体外研究的进一步支持，其中PAF在灌注的豚鼠肺中诱导了¹²⁵I标记的血纤蛋白原的剂量依赖性(10-1000ng/ml)外渗[Basran，Br.J.Pharmacol.，77：437(1982)]。

基于上述观察，开发了豚鼠ARDS模型。将插管置于麻醉的雄性Hartly豚鼠(约350-400克)的颈静脉中，将在500μl体积的做为载体的含有0.25％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS-BSA)中稀释的PAF，以100-400ng/kg范围的总剂量在15分钟时间内输注。在PAF输注后各种时间点，处死动物，收集肺组织。在用PAF输注的豚鼠中，到15分钟时剂量依赖性肺损伤和炎症是非常明显的，在60分钟时继续存在。嗜中性白细胞和红血细胞存在于PAF处理的豚鼠的肺泡腔，但在对照或假输注动物中不存在。上皮细胞破坏的证据亦是明显的，是人ARDS患者透明膜形成的回忆。从用PAF输注的豚鼠取得的支气管肺泡灌洗(BAL)样本的蛋白测定，显示炎症肺中蛋白的显著积累，是血管泄漏的明显证据。

发现rPH.2在ARDS豚鼠模型中完全保护免受PAF介导的肺损伤。用或者rPH.2(500μl中2000单位)或仅500μl PAF-AH缓冲液预处理豚鼠组。15分钟后用500μl体积中的400ng/kg PAF输注这些豚鼠，在15分钟时间内输注。另外，用500μlPBS-BSA输注豚鼠假组。PAF输注完成后，处死动物，通过用含有2μ/ml肝素的10ml盐水灌洗肺二次，以防止凝血收集BAL流体。为测定BAL中的蛋白浓度，将样品在盐水中稀释1∶10，测定OD280。发现假处理豚鼠的BAL流体的蛋白浓度为2.10±1.3mg/ml。与之截然相反，发现用PAF输注的动物的BAL流体的蛋白浓度为12.55±1.65mg/ml。在用rPH.2预处理的豚鼠中，发现BAL流体的蛋白浓度为1.13±0.25mg/ml，这与假处理对照相当，证实PAF-AH产物完全阻断了对PAF应答的肺水肿。

                          实施例19

在二个不同的急性胰腺炎模型中评价了PAF-AH产物rPH.2的效力。

A. 大鼠胰腺炎模型中的活性

从Charles River Laboratories(Wilmngton，MA)购买雄性Wistar大鼠(200-250g)。将其置于23±2℃、具有12小时光/暗循环的控制环境房间中，用标准实验室食物(chew)和水随意饲养动物。将动物随机分配至或者对照组或者实验组。用50mg/kg戊巴比妥钠腹膜内麻醉大鼠，通过切入颈动脉安放聚乙烯导管(V3大小，Biolab products，Lake Havasu，AZ)。将导管皮下穿插至露出颈背侧区域，使动物从麻醉苏醒。使大鼠得到水，但禁食过夜。对清醒的动物于次日进行实验。在间歇期间，通过持续输注盐水(0.2ml/h)保持导管开放。在实验日，用rPH.2或载体对照静脉内注射动物，接着输注或者(1)每小时5μg/kg雨蛙肽3.5小时，或者(2)每小时10μg/kg雨蛙肽5小时，(Research Plus，Bayonne，NJ)。输注完成后，立即用戊巴比妥钠麻醉动物，切开其腹部，从下腔静脉吸取5ml血液以进行后续检测。然后通过放血处死动物。测定血清淀粉酶、血清脂酶和血清胆红素，收集胰脏。将胰脏块或者在4％磷酸缓冲甲醛溶液中固定以进行组织学检测，或者立即深冻于-80℃以测定髓过氧化物酶活性。如下述评价其它胰脏块的胰脏含水量和胰脏淀粉酶和胰蛋白酶。如下述在胰脏和肺中评价做为嗜中性白细胞汇集(sequestration)的测定的髓过氧化物酶活性。亦如下述评价肺血管通透性。使用未配对斯氏t检验完成数据的统计学分析。报告的数据代表至少三个不同实验的平均±S.E.M.。当p＜0.05时，将结果中的差异认为显著的。

1. 胰脏含水量

将胰脏块吸干、称重(湿重)，然后于120℃干燥34小时，再称重(干重)。将湿重和干重之间的差异计算为胰脏含水量并以胰脏湿重的百分比表达。认为胰脏含水量升高是水肿的发展。

2. 血清和胰脏淀粉酶

使用4，6-亚乙基(G₇)-对硝基苯(G₁)-α₁D-maltoplaside(ET-G7PNP)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)做为底物，按照Pierre等，Clin.Chem.，22：1219(1976)测定血清中淀粉酶活性。使用同样方法测定匀浆于10mM磷酸缓冲液pH7.4中的胰脏组织的淀粉酶活性。

3. 胰脏胰蛋白酶

使用Boc-Gin-Ala-Arg-MCA做为底物，荧光测定胰蛋白酶活性。简言之，在杯中混合200μl的样品和2.7ml的含有150mM NaCl、1mMCaCl₂和0.1％牛血清白蛋白的50mM Tris缓冲液(pH8.0)。预温育20秒钟后，将100μl底物加入样品开始反应。读取荧光读数(激发380nm，发射440nm)，以斜率表达。为合并不同实验的数据，将多个部分中的胰蛋白酶活性表达为总胰蛋白酶活性的百分比。

4. 组织学和形态计量法

对于光学显微术，将胰脏的头、体和尾的完整的随机横切片在10％中性磷酸缓冲***中固定。将石蜡包埋的5μm切片用苏木精-曙红(H&E)染色，由熟练的形态学家以盲式检查。将腺泡细胞损伤/坏死定义为或者(a)存在腺泡细胞空胞或(b)腺泡细胞空泡形成和膨胀、腺泡的整个或部分组织结构破坏，这二者都与炎症反应相关。使用装备有NIH-1200图象分析软件的计算机化面积计图象分析视频装置(CCD-72型，Dage-MTI，Michigan city，IN)，对腺泡细胞损伤/坏死的数量和腺泡组织占据的总面积进行形态计量定量。对每个组织样本检查10个随机选择的显微镜视野(125x)。以由符合损伤/坏死标准的面积所占据的总腺泡组织的百分比表达腺泡细胞损伤/坏死的程度。

5. 胰脏和肺髓过氧化物酶(MPO)活性测定

通过测定组织过氧化物酶活性评价胰脏和肺中嗜中性白细胞汇集。将处死时收集的组织样本储存于-70℃直至检测。将样本(50mg)解冻并在1ml20mM磷酸缓冲液(pH7.4)中匀浆和离心(10,000xg，10分钟4℃)。将产生的沉淀再悬浮于含有0.5％溴化十六烷基三甲基铵(Sigma，St.Louis，MO)的50mM磷酸缓冲液(pH6.0)中，进行四个循环的冷冻-解冻。然后通过超声处理40秒钟进一步破碎悬浮液和离心(10,000xg，5分钟4℃)。将由所述提取的酶、1.6mM N-四甲联苯胺(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)、80mM磷酸钠缓冲液(pH5.4)和0.3mM过氧化氢的反应混合物于37℃温育110秒钟，在CobasBio自动分析仪中测定655nm的吸收。然后针对组织样本的部分干重校正该吸收值。

6. 测定肺血管通透性

胰胆总管的梗阻亦通常导致可以由肺血管通透性和组织检查定量的严重胰腺炎相关肺损伤。

处死动物前2小时，给予静脉内大剂量注射5mg/kg异硫氰酸荧光素白蛋白(FITC-白蛋白，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。通过定量FITC-白蛋白从血管腔泄漏入支气管肺泡腔，评价肺微血管通透性。简言之，刚刚处死后，使用钳子阻断右支气管，暴露出气管。接着，通过使用***气管的插管灌洗右肺。合并三次盐水(60ml灌洗液)洗液，于激发494nm和发射520nm下测定血清和灌洗液中的FITC荧光。计算灌洗液与血液的荧光比例，做为肺中微血管通透性的测定。亦用H&E将肺染色并进行组织学检查。

7. 雨蛙肽和rPH.2给予的影响

仅用雨蛙肽以5μg/kg/小时输注3.5小时，导致大鼠中典型的轻度促分泌素诱导的胰腺炎，其特征是血淀粉酶过多、由胰脏含水量测定的胰脏水肿和包括显著的腺泡细胞空泡化和胰脏水肿的组织学变化。对照动物中的盐水输注不会导致这些生物化学或组织学变化。在开始雨蛙肽输注之前30分钟。静脉内给予5、10或20mg/kg的rPH.2，不会显著改变由仅输注雨蛙肽诱导的胰脏水肿(含水量)和组织学变化的程度。给予rPH.2亦对雨蛙肽诱导的胰脏胰蛋白酶原的激活或淀粉酶含量没有影响。

以较高计量的雨蛙肽即10μg/kg/小时向大鼠输注5小时，导致更加严重的胰腺炎，与对照相比其特征在于血清淀粉酶活性和胰脏水肿的更显著的增加、胰脏MPO活性的显著增加和胰脏中胰蛋白酶原激活和淀粉酶活性的显著增加。胰脏组织学表明，不仅有胰脏水肿和腺泡细胞空泡化，亦有一些片状坏死和少量浸润细胞。

在开始输注雨蛙肽(10μg/kg/小时)之前30分钟给予rPH.2(5或10mg/kg静脉内)，减轻了由仅输注雨蛙肽诱导的许多胰脏变化的程度。结果示于以下表10中。剂量为5mg/kg的rPH.2处理导致血清淀粉酶活性降低(从10984±1412至6763±1256)。较高的10mg/kgrPH.2剂量未导致血淀粉酶过多的进一步改善。用或者5或者10mg/kgrPH.2处理，亦导致由含水量测定的雨蛙肽诱导的胰脏水肿发展的一些减退(仅雨蛙肽为90.61±0.27，雨蛙肽+5mg/kg rPH.2为88.21±0.61)。5mg/kg剂量的rPH.2提供了胰脏MPO活性的显著减轻(仅雨蛙肽为超过对照2.92+0.32倍，雨蛙肽和rPH.2为1.19+0.21，p＜0.05)。较高剂量的rPH.2未导致MPO活性的进一步提高。这二种剂量的rPH.2都未显著地改变胰脏中胰蛋白酶原激活或淀粉酶含量。胰脏组织学表明，在rPH.2预处理后在显微坏死和浸润方面有一些改善。

已经在临床上和在胰腺炎的几个模型中观察了胰腺炎相关的肺损伤。以5μg/kg/小时输注雨蛙肽3.5小时，导致较轻形式的胰腺炎，未导致肺的显著损伤。但是，以10μg/kg/小时输注雨蛙肽5小时，导致更严重的胰腺炎，亦导致由增加的肺血管通透性(0.31±0.04至0.79±0.09)、肺MPO活性(表明嗜中性白细胞汇集)和组织学检查的嗜中性白细胞浸润定量的肺损伤。

在输注雨蛙肽之前30分钟以5mg/kg的剂量给予rPH.2，显著地减轻了由仅输注雨蛙肽诱导的肺MPO活性的上升(仅雨蛙肽为3.55±0.93，雨蛙肽和rPH.2为1.51±0.26)。rPH.2处理显著地降低了雨蛙肽输注后在肺组织中观察到的显微变化的严重性。rPH.2处理降低了雨蛙肽诱导的肺血管通透性增加，尽管没有统计学的显著性。在降低雨蛙肽诱导的肺损伤的严重性方面，较高的10mg/kgrPH.2剂量不比较低的剂量更有效。

                                            表10

                      对照           雨蛙肽(CER)       CER+             CER+

                      (无CER)        10μg/kg/h        5mg/kgrPH.2      10mg/kgrPH.2

血清淀粉酶

(U/l)                 961±174       10984±1412       6763±1256       8576±1024

胰脏含水量

(％湿重)              72.71±0.64    90.61±0.27       88.21±0.61      89.00±0.94

胰脏MPO

(比对照增加           1.0            2.92±0.32        1.19±0.21       1.42±0.19

的倍数)

胰脏胰蛋白酶活性

(1000x斜率/           0.12±0.06     9.70±2.50        8.33±1.75       9.15±1.28

μgDNA)

胰脏淀粉酶含量

(U/μg DNA)           0.28±0.06     0.42±0.07        0.45±0.04       0.46±0.044

肺血管通透性

(灌洗液/血清％)       0.31±0.04     0.79±0.09        0.70±0.09       0.70±0.07

肺MPO

(比对照增加           1.0            3.55±0.93        1.51±0.26       1.64±0.22

的倍数)

B. 负鼠(opossum)胰腺炎模型中的活性

从Scott-Hass得到二种性别的健康、随机捕获的美洲负鼠(Didelphis virginiana)(2.0kg-4.0kg)，将其置于23±2℃、具有12小时光/暗循环的控制环境房间中，用标准实验室食物和水随意饲喂。禁食过夜后，用50mg/kg戊巴比妥钠(Veterinary Laboratories Inc.，Lenexa，KS)腹膜内麻醉大鼠。在无菌条件下通过中线切开进行剖腹术，将所有动物的胆胰总管结扎以诱导急性坏死性胰腺炎。另外，结扎胆囊管以防止胆囊做为胆汁库。将动物随机分配至或者对照或者实验组。从结扎胰管的第二天起，实验组通过尾静脉静脉内接受每天5mg/kg体重的rPH.2(以4mg/ml的溶液提供)，而对照组仅接受同样体积的安慰剂载体的静脉内注射。处理后1天和2天(胰管结扎后第三天和第四天)，使用过量的戊巴比妥钠将动物无痛致死。从心脏抽取血液样本以测定血清淀粉酶、血清脂酶和血清胆红素，收集胰脏。将胰脏块或者在4％磷酸缓冲甲醛溶液中固定以进行组织学检测，或者立即深冻于-80℃以测定髓过氧化物酶活性。如上述本实施例的A节那样评价其它胰脏块的胰脏含水量和胰脏淀粉酶。如上述在胰脏中评价做为嗜中性白细胞汇集的测定的髓过氧化物酶活性。亦如上述评价肺血管通透性。

报告的数据代表从三个或更多的独立实验中的多个测定得到的平均±平均标准差(SEM)。当数据仅由二组组成时使用斯氏t-检验，或当比较三组或更多的组时通过变异分析(ANOVA)，评价变化的显著性。如果ANOVA表明有显著差异，则使用Tukey方法做为post hoc检验，分析组间数据的差异。当p值＜0.05时，认为表明显著差异。

结果示于表11。胰胆总管梗阻导致以血淀粉酶过多、血脂酶过多和胰脏深度坏死为特征的严重坏死性胰腺炎。另外，胰胆总管梗阻与血清胆红素水平的显著增加相关。胰管结扎后的第二天开始静脉内给予rPH.2(5mg/kg/天)，减轻了由管梗阻和仅安慰剂处理诱导的许多胰脏变化的程度。与安慰剂处理的动物相比，rPH.2处理一天降低了血清淀粉酶水平，尽管该差异在统计学上不显著，与安慰剂相比，rPH.2处理二天(胰管结扎后第四天)显著地降低了血清淀粉酶水平。与对照相比，rPH.2处理一天或二天降低了血清脂酶水平，尽管该差异在统计学上不显著。与对照相比，rPH.2处理二天降低了胰脏淀粉酶含量，尽管处理一天导致胰脏淀粉酶增加。未观察到用rPH.2处理影响血清胆红素水平、胰脏髓过氧化物酶活性或胰脏含水量。

由胆胰管梗阻诱导的主要特征性组织学变化，包括显著坏死、炎症细胞浸润、腺泡细胞空泡化和腺泡腔的显著扩张。对胰脏腺泡细胞损伤的形态计量检查显示。在rPH.2处理一天和二天后rPH.2对胰脏的主要保护效应。rPH.2处理一天后，腺泡细胞损伤降低至总腺泡细胞组织的约23％，与安慰剂处理的动物的48％损伤形成对比。处理二天后，腺泡细胞损伤的这种降低更加显著，此时rPH.2处理导致总腺泡细胞组织的约35％损伤，与安慰剂处理的动物的约60％损伤形成对比。

由FITC注射定量的肺血管通透性显示。与安慰剂组相比，rPH.2处理一天和二天后的高度显著差异。肺的组织学检查显示所有安慰剂处理的动物中都有严重的肺损伤。肺损伤的特征为具有主要巨噬细胞、淋巴细胞和嗜中性白细胞的间质和肺泡内浸润的深度炎症反应，以及片状但是显著的间质水肿和肺泡膜增厚。给予rPH.2导致炎症细胞浸润的显著减少和所有时间的间质水肿降低。

总之，这些结果显示，胰管结扎后48小时开始以5mg/kg/天的剂量静脉内给予rPH.2，导致淀粉酶和脂酶血液水平上升的显著减轻和由H&E染色切片的形态计量分析定量的腺泡细胞损伤的显著减轻，和胰腺炎诱导的肺损伤的严重性的显著减轻。在胰腺炎的这个临床相关模型中，给予rPAF-AH产物显示了降低胰腺炎严重性的有益效应。

                                                       表11

                         处理一天后(于第三天处死)            处理二天后(于第四天处死)

                         安慰剂            rPH.25            安慰剂         rPH.25mg/kg

                                           mg/kg

血清胆红素(mg/dl)        5.49±0.96        7.10±0.60        6.54±0.55     4.91±0.79

血清淀粉酶(U/升)         5618±899         4288±675         6538±1355     3106±467^*

血清脂酶(U/升)           2226±554         1241±263         1424±257      1023±295

胰脏含水量(％)           81.10±0.56       81.52±0.79       80.05±1.07    79.32±0.49

胰脏MPO                  1345±286         1142±83          1149±232      1033±130

(OD/部分干重)

胰脏淀粉酶               706±92           1101±105         950±85        712±131

(U/μg DNA)

肺血管通透性             0.76±0.09        0.21±0.04^**     0.57±0.13     0.23±0.04^*

(FITC灌洗液/血清％)

腺泡细胞损伤             48％              23％              60％           35％

(总腺泡组织％)

^*p＝0.02，与安慰剂相比

^**p＜0.001，与安慰剂相比

                         实施例20

进行研究以评价PAF-AH产物rPH.2对与HIV感染相关的神经毒性的影响。人1型免疫缺陷病毒(HIV-1)感染中枢神经***导致由细胞凋亡引起的神经元损失。由各种抗原性刺激包括与神经细胞接触激活的HIV-1感染的单核细胞，分泌高水平的神经毒性促炎细胞因子，包括PAF。评价了rPH.2对由HIV感染和激活的单核细胞的条件培养基的神经毒性的影响。

如下述用HIV感染和激活单核细胞。在白细胞提取法(leukopheresis)之后从HIV和乙肝血清阴性供体的外周骨髓细胞(PBMC)回收单核细胞，如Genis等，J.Exp.Med.176：1703-1718(1992)中所述通过逆流离心淘洗纯化(＞98％)。在含有重组人巨噬细胞集落刺激因子(MSCF)(Genetics Institute，Inc.Cambridge，MA)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)中做为贴壁单层培养细胞(T-75培养瓶中1×10⁴细胞/ml)。在这些条件下，单核细胞分化成为巨噬细胞。培养7-10天后，以感染复数(MOI)0.01的感染性病毒粒子/靶细胞将巨噬细胞暴露给HIV-1_ADA(保藏号码M60472)。在这些条件下，20-50％的单核细胞在HIV-1接种后7天被感染，由免疫荧光和原位杂交技术可以确定[Kalter等，J.Immunol.，146：298-306(1991)]。每隔2-3天，用新鲜培养基再流加所有的培养物。HIV-1感染后5-7天和在按照Kalter等，见上述评价的逆转录酶活性高峰期(10⁷cpm/ml)，将HIV-1感染的培养物和未感染单核细胞的平行培养物用LPS(10ng/ml)或载体于37℃刺激30分钟，然后于-80C快速冷冻直至用于神经毒性检测。

如下述建立人大脑皮层神经元细胞培养物。按照修改的Banker和Cowan，Brain Res.，126：397-425(1977)的程序，从第二个三个月(妊娠13-16周)的人胎儿脑组织端脑得到人胎儿脑组织。简言之，收集脑组织，在30ml冷Hank BSS(含有Ca⁺²和Mg⁺²+25mM HEPES和5X庆大霉素)中洗涤，从粘附的脑脊膜和血液分离，切成2mm³块。将组织压迫通过230μM Nitex袋并通过火焰打磨的Pasteru吸管研磨10-15次。将组织于4℃于550rpm离心5分钟，将沉淀再悬浮于5-10ml的含有N1组分(胰岛素，5mg/l；运铁蛋白，5mg/l；***盐，5μg/l；孕酮20nM；腐胺，100μMM)以及10％胎牛血清(FCS)、PSN抗生素混合物(青霉素，50mg/l；链霉素，50mg/l；新霉素，100mg/l)和两性霉素(2.5mg/l)的MEM-hipp(D-葡萄糖，5g/l；L-谷氨酰胺，2mM；HEPES，10mM；丙酮酸钠，1mM；KCl，20mM)中。通过用0.4％锥虫蓝稀释Hank BSS(1∶1v/v)并用血细胞计数器计数测定细胞计数和存活率。用10ml吸管柔和研磨细胞5次，以10⁵细胞/12mm玻璃盖玻片的密度植板，所述盖玻片用多聚-L-赖氨酸(70K-150K MW，Sigma，St.Louis，MO)预包被，置于24孔培养皿中。将1ml培养基吸入每个培养孔。在5％CO₂/95％空气的湿润空气中于37℃培养细胞10-28天，每隔3天更换培养基。在这些条件下，培养物是＞60-70％均质的神经元，有20-30％星形胶质细胞，＜1％小胶质和～10％巨噬细胞和小胶质染色。培养14-28天后，神经元培养物表达足够水平的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)或非-NMDA受体，在给予NMDA或α-氨基-3-羟基-5-甲基-4异噁唑丙酸(AMPA)兴奋毒性(excitotoxic)剂量后死亡。

如下述进行神经毒性检测。将测试样品以1∶10v/v浓度用于神经元细胞培养物24小时，测试样品是(a)LPS刺激的HIV-1感染的单核细胞的条件培养基，(b)对照培养基，(c)含有以51μg/ml添加的rPH.2的条件培养基或(d)添加了rPH.2的载体的条件培养基。使用市售药盒(Apop Tag；ONCOR，Gaithersburg，MD)，通过在4％多聚甲醛中固定的神经元盖玻片上原位鉴别凋亡细胞核而测定神经毒性，该药盒使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以将洋地黄毒苷-dUPT结合至新酶切DNA的游离3’-OH端(TUNEL染色)。使用计算机化形态计量仪(MCID，Imaging Research，St.Catherine，Ontario，Canada)，分析≥15个随机选择的显微镜视野中TUNEL染色的神经元的数字化图象的每个50X视野的TUNEL染色细胞核数量/总神经元数。以TUNEL染色阳性的神经元细胞核百分比±SEM表达数据，示于图13中。通过ANOVA或配对t-检验确定对照和实验处理之间的统计学显著性检验，显著性为p≤0.05。这些培养物的定量确认了HIV感染并激活的单核细胞的条件培养基，在大脑皮层神经元的总群体中的接近25％中诱导了神经元细胞死亡，rPH.2可以将该毒性降低至小于总神经元的5％。rPH.2自身无神经毒性，因为50μg/mlrPH.2与用对照培养基处理的培养物相比对神经元细胞死亡没有影响。这些结果清楚地表明，通过使用激活的HIV感染的单核细胞的条件培养基诱导的神经毒性的主要成分一定是因为PAF，因为通过与PAF-AH产物共温育可以几乎完全消除神经毒性，该酶对中枢神经***中PAF的代谢负责。这些发现提示。在治疗与HIV-1感染相关的CNS神经疾病中潜在的治疗干预。

                        实施例21

接近4％的日本人口的血浆PAFAH活性水平低或不可检测。这种缺陷已与哮喘儿童的严重呼吸综合症相关[Miwa等，J.Clin.Invest.，82：1983-1991(1988)]，这种儿童看来以常染色体隐性方式遗传了这种缺陷。

为确定是否这种缺陷由无活性但是存在的酶或由不能合成PAF-AH引起，检测多个PAF-AH活性缺陷的患者血浆的PAF-AH活性(通过实施例10对转染体描述的方法)和如下在夹心ELISA中使用单克隆抗体90G11D和90F2D(实施例13)检测PAF-AH的存在。用100ng/孔的单克隆抗体90G11D包被Immulon 4平底板(Dynatech，Chantilly，VA)并储存过夜。用在CMF-PBS中稀释的0.5％鱼皮明胶(Sigma)于室温封闭所述板1小时，然后洗涤3次。在含有15mM CHAPS的PBS中稀释患者血浆，加入板的每个孔中(50μl/孔)。于室温温育这些板1小时，洗涤4次。将通过标准方法生物素化并在PBST中稀释的50μl 5μg/ml单克隆抗体90F2D加入每个孔中，于室温温育这些板1小时，然后洗涤3次。接着将在CMF-PBST中稀释1/1000的50μl ExtraAvidin(Sigma)加入每个孔中，将这些板在显色之前于室温温育1小时。

观察到PAF-AH活性与酶水平的直接相关。患者血清中缺乏活性由缺乏可检测的酶所反映。类似地，具有一半正常活性的血浆样本含有一半正常水平的PAF-AH。这些观察提示，PAF-AH活性缺陷是由于不能合成该酶或由于所述单克隆抗体不能识别的无活性酶引起的。

进一步的实验揭示，该缺陷是由于人血浆PAF-AH基因的遗传损害。分离了PAF-AH缺陷个体的基因组DNA，用做用PAF-AH基因特异性引物的PCR反应的模板。首先扩增一个个体的每个编码序列外显子并测序。观察到外显子9内的单个核苷酸变化(SEQ ID NO：7的位置996的G变为T)。该核苷酸变化导致PAF-AH序列(V279F)的位置279的缬氨酸被苯丙氨酸置换。从发现具有同样点突变的另外11个PAF-AH缺陷个体的基因组DNA扩增外显子9。

为测试该突变是否削弱了该酶，通过与实施例10中描述的类似的方法制备含有该突变的大肠杆菌表达构建物。当导入大肠杆菌时，该表达构建物未产生PAF-AH活性，而没有该突变的对照构建物有完全活性。该氨基酸置换大概导致结构修饰，该修饰引起了观察到的活性缺陷和缺乏与本发明的PAF-AH抗体的免疫反应性。

因此本发明的PAF-AH特异性抗体可以用于检测血清中PAF-AH异常水平(正常水平为约1-5U/ml)和跟踪用PAF-AH的治疗病理病症的进展的诊断方法。另外，鉴别PAF-AH基因中的基因损害使得可以筛选日本患者表现出的PAF-AH缺陷。该突变造成增加限制性内切酶位点(MaeII)，因此使得可以用限制性长度多态性(RFLP)分析的简单方法区分活性和突变等位基因。参见Lewin，第136-141页，载于Genes V，Oxford University Press，New York，New York(1994)：

通过用MaeII消化DNA、DNA印迹和与外显子9探针(SEQ ID NO：17的核苷酸1-396)杂交，进行筛选12个PAF-AH缺陷患者的基因组DNA。发现所有的患者均具有与所述突变等位基因一致的RFLP。

虽然已在具体实施方案中描述本发明，但应理解本领域技术人员将会想到多种变化和修饰。因此，只有附录的权利要求书中出现的这种限制才能限制本发明。

                           序列表

(1)一般资料：

  (i)申请人：ICOS CORPORATION

  (ii)发明名称：血小板激活因子乙酰水解酶

  (iii)序列数：30

  (iv)联系地址：

    (A)收信人：Mrshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borun

    (B)街道：6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive

    (C)城市：芝加哥

    (D)州：Illinois

    (E)国家：美国

    (F)邮政编码：60606-6402

  (v)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25

  (vi)当前申请数据：

    (A)申请号：

    (B)申请日：

    (C)分类：

  (viii)代理律师/代理人资料：

    (A)姓名：Rin-Laures，Li-Hsien

    (B)注册号：33，547

    (C)参考/档案号：27866/34026

  (ix)电信资料：

    (A)电话：(312)474-6300

    (B)传真：(312)474-0448

    (C)电传：25-3658

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：17个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala

1               5                   10                  15

Phe

(2)SEQ ID NO：2的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：16个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Ile Gln Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro

1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：3的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：11个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Met Lys Pro Leu Val Val Phe Val Leu Gly Gly

1               5                   10

(2)SEQ ID NO：4的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：32个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：修饰位点

    (B)位置：基团(13，21，27)

    (C)其它信息：/注释＝″于每个这些位置的核苷酸为肌苷。″

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA                              32

(2)SEQ ID NO：5的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：30个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG                                 30

(2)SEQ ID NO：6的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：32个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC                                  32

(2)SEQ ID NO：7的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1520个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：162..1484

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

GCTGGTCGGA GGCTCGCAGT GCTGTCGGCG AGAAGCAGTC GGGTTTGGAG CGCTTGGGTC    60

GCGTTGGTGC GCGGTGGAAC GCGCCCAGGG ACCCCAGTTC CCGCGAGCAG CTCCGCGCCG    120

CGCCTGAGAG ACTAAGCTGA AACTGCTGCT CAGCTCCCAA G ATG GTG CCA CCC        173

                                              Met Val Pro Pro

                                                1

AAA TTG CAT GTG CTT TTC TGC CTC TGC GGC TGC CTG GCT GTG GTT TAT      221

Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu Ala Val Val Tyr

  5                  10                  15                  20

CCT TTT GAC TGG CAA TAC ATA AAT CCT GTT GCC CAT ATG AAA TCA TCA      269

Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile Asn Pro Val Ala His Met Lys Ser Ser

                25                   30                  35

GCA TGG GTC AAC AAA ATA CAA GTA CTG ATG GCT GCT GCA AGC TTT GGC      317

Ala Trp Val Asn Lys Ile Gln Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly

             40                  45                  50

CAA ACT AAA ATC CCC CGG GGA AAT GGG CCT TAT TCC GTT GGT TGT ACA    365

Gln Thr Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser Val Gly Cys Thr

         55                  60                  65

GAC TTA ATG TTT GAT CAC ACT AAT AAG GGC ACC TTC TTG CGT TTA TAT    413

Asp Leu Met Phe Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe Leu Arg Leu Tyr

     70                  75                  80

TAT CCA TCC CAA GAT AAT GAT CGC CTT GAC ACC CTT TGG ATC CCA AAT    461

Tyr Pro Ser Gln Asp Asn Asp Arg Leu Asp Thr Leu Trp Ile Pro Asn

85                  90                  95                  100

AAA GAA TAT TTT TGG GGT CTT AGC AAA TTT CTT GGA ACA CAC TGG CTT    509

Lys Glu Tyr Phe Trp Gly Leu Ser Lys Phe Leu Gly Thr His Trp Leu

                105                 110                 115

ATG GGC AAC ATT TTG AGG TTA CTC TTT GGT TCA ATG ACA ACT CCT GCA    557

Met Gly Asn Ile Leu Arg Leu Leu Phe Gly Ser Met Thr Thr Pro Ala

            120                 125                 130

AAC TGG AAT TCC CCT CTG AGG CCT GGT GAA AAA TAT CCA CTT GTT GTT    605

Asn Trp Asn Ser Pro Leu Arg Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Leu Val Val

        135                 140                 145

TTT TCT CAT GGT CTT GGG GCA TTC AGG ACA CTT TAT TCT GCT ATT GGC    653

Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Leu Tyr Ser Ala Ile Gly

    150                 155                 160

ATT GAC CTG GCA TCT CAT GGG TTT ATA GTT GCT GCT GTA GAA CAC AGA    701

Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala Val Glu His Arg

165                 170                 175                 180

GAT AGA TCT GCA TCT GCA ACT TAC TAT TTC AAG GAC CAA TCT GCT GCA    749

Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp Gln Ser Ala Ala

                185                 190                 195

GAA ATA GGG GAC AAG TCT TGG CTC TAC CTT AGA ACC CTG AAA CAA GAG    797

Glu Ile Gly Asp Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Lys Gln Glu

            200                 205                 210

GAG GAG ACA CAT ATA CGA AAT GAG CAG GTA CGG CAA AGA GCA AAA GAA    845

Glu Glu Thr His Ile Arg Asn Glu Gln Val Arg Gln Arg Ala Lys Glu

        215                 220                 225

TGT TCC CAA GCT CTC AGT CTG ATT CTT GAC ATT GAT CAT GGA AAG CCA    893

Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp Ile Asp His Gly Lys Pro

    230                 235                 240

GTG AAG AAT GCA TTA GAT TTA AAG TTT GAT ATG GAA CAA CTG AAG GAC    941

Val Lys Asn Ala Leu Asp Leu Lys Phe Asp Met Glu Gln Leu Lys Asp

245                 250                 255                 260

TCT ATT GAT AGG GAA AAA ATA GCA GTA ATT GGA CAT TCT TTT GGT GGA    989

Ser Ile Asp Arg Glu Lys Ile Ala Val Ile Gly His Ser Phe Gly Gly

                265                 270                 275

GCA ACG GTT ATT CAG ACT CTT AGT GAA GAT CAG AGA TTC AGA TGT GGT    1037

Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp Gln Arg Phe Arg Cys Gly

            280                 285                 290

ATT GCC CTG GAT GCA TGG ATG TTT CCA CTG GGT GAT GAA GTA TAT TCC    1085

Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Leu Gly Asp Glu Val Tyr Ser

        295                 300                 305

AGA ATT CCT CAG CCC CTC TTT TTT ATC AAC TCT GAA TAT TTC CAA TAT    1133

Arg Ile Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu Tyr Phe Gln Tyr

    310                 315                 320

CCT GCT AAT ATC ATA AAA ATG AAA AAA TGC TAC TCA CCT GAT AAA GAA    1181

Pro Ala Asn Ile Ile Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser Pro Asp Lys Glu

325                 330                 335                 340

AGA AAG ATG ATT ACA ATC AGG GGT TCA GTC CAC CAG AAT TTT GCT GAC    1229

Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln Asn Phe Ala Asp

                345                 350                 355

TTC ACT TTT GCA ACT GGC AAA ATA ATT GGA CAC ATG CTC AAA TTA AAG    1277

Phe Thr Phe Ala Thr Gly Lys Ile Ile Gly His Met Leu Lys Leu Lys

            360                 365                 370

GGA GAC ATA GAT TCA AAT GTA GCT ATT GAT CTT AGC AAC AAA GCT TCA    1325

Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Ser Asn Lys Ala Ser

        375                 380                 385

TTA GCA TTC TTA CAA AAG CAT TTA GGA CTT CAT AAA GAT TTT GAT CAG    1373

Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys Asp Phe Asp Gln

    390                 395                 400

TGG GAC TGC TTG ATT GAA GGA GAT GAT GAG AAT CTT ATT CCA GGG ACC    1421

Trp Asp Cys Leu Ile Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu Ile Pro Gly Thr

405                 410                 415                 420

AAC ATT AAC ACA ACC AAT CAA CAC ATC ATG TTA CAG AAC TCT TCA GGA    1469

Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln Asn Ser Ser Gly

                425                 430             435

ATA GAG AAA TAC AAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAAAAAA AAAAAA        1520

Ile Glu Lys Tyr Asn

            440

(2)SEQ ID NO：8的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：441个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：蛋白质

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

Met Val Pro Pro Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu

  1               5                  10                  15

Ala Val Val Tyr Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile Asn Pro Val Ala His

             20                  25                  30

Met Lys Ser Ser Ala Trp Val Asn Lys Ile Gln Val Leu Met Ala Ala

         35                  40                  45

Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser

     50                  55                  60

Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe

 65                  70                  75                  80

Leu Arg Leu Tyr Tyr Pro Ser Gln Asp Asn Asp Arg Leu Asp Thr Leu

                 85                  90                  95

Trp Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Gly Leu Ser Lys Phe Leu Gly

            100                 105                 110

Thr His Trp Leu Met Gly Asn Ile Leu Arg Leu Leu Phe Gly Ser Met

        115                 120                 125

Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn Ser Pro Leu Arg Pro Gly Glu Lys Tyr

    130                 135                 140

Pro Leu Val Val Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Leu Tyr

145                 150                 155                 160

Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala

                165                 170                 175

Val Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp

            180                 185                 190

Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly Asp Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Thr

        195                 200                 205

Leu Lys Gln Glu Glu Glu Thr His Ile Arg Asn Glu Gln Val Arg Gln

    210                 215                 220

Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp Ile Asp

225                 230                 235                 240

His Gly Lys Pro Val Lys Asn Ala Leu Asp Leu Lys Phe Asp Met Glu

                245                 250                 255

Gln Leu Lys Asp Ser Ile Asp Arg Glu Lys Ile Ala Val Ile Gly His

            260                 265                 270

Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp Gln Arg

        275                 280                 285

Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Leu Gly Asp

    290                 295                 300

Glu Val Tyr Ser Arg Ile Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Phe Gln Tyr Pro Ala Asn Ile Ile Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser

                325                 330                 335

Pro Asp Lys Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln

            340                 345                 350

Asn Phe Ala Asp Phe Thr Phe Ala Thr Gly Lys Ile Ile Gly His Met

        355                 360                 365

Leu Lys Leu Lys Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Ser

    370                 375                 380

Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys

385                 390                 395                 400

Asp Phe Asp Gln Trp Asp Cys Leu Ile Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu

                405                 4l0                 415

Ile Pro Gly Thr Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln

            420                 425                 430

Asn Ser Ser Gly Ile Glu Lys Tyr Asn

    435                     440

(2)SEQ ID NO：9的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1123个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：未确定

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

AAATATAAAT TTTAATAACA CCACACATAA ATTTCAAACT ACTTTCCCTA AGTTTCTAGC    60

TGAAGTTTTA AATGAGTGTG TTTTTAATTT ATTAGAAAGT GGATTGAAGA GAAAACATTG    120

GAAGATGAAG GAAGGCGTTT CAGTTAAACC CCAAATAACT CTGTGTTACA CTGAGCTATG    180

AAACGGCTCC TTCTAGCTCC ATTTCTCCTC AGACCTAAGT GCTATTCCTG ATTGTCCTTC    240

ATTGTCATTT CCAGGGAGAA ATGACACCAG CACAGTGGCA GGCCTTCCAA TCTGGAGCAC    300

GGTCCACACA ACTTCCGAAT TGGTGTTCAG TGTAAAGTGT ATCGGAGTGC GGAAAATGCG    360

CAGGGCATTG CCAACTATAG ATGCTCGGAG TAATTCAGTG TATTCAGAGA ACACGGTGAA    420

ACAAGGAAAA CCGGCCTGAC TGGGGGGTGA ATTCAGCAGG GAGTAAATCT GATCGGCATC    480

AGGTCTGCGG AAAGGAGCTG GTGAGCACGA CACCACCAGG CATTGCCTGG CTCTCTCCGC    540

GGCGGGCTAA GTTAACCTCG GGTCCAGGTG CGGGCCATGG TCTTGGGGAG GGTGCTGGGT    600

GCGCTCGAGC AGGCTACGTC GGGAGCCGCC GCTGCTAGTG AGAGCCGGGC CACACACGCT    660

CCTCCCCGGT ACCTCCTCCA GCATCACCAG GGGAGGAGAG GGTCGGGCAC AAGGCGCGCT    720

AGGCGGACCC AGACACAGCC GCGCGCAGCC CACCCGCCCG CCGCCTGCCA GAGCTGCTCG    780

GCCCGCAGCC AGGGGGACAG CGGCTGGTCG GAGGCTCGCA GTGCTGTCGG CGAGAAGCAG    840

TCGGGTTTGG AGCGCTTGGG TCGCGTTGGT GCGCGGTGGA ACCCCCCAGG GACCCCAGTT    900

CCCGCGAGCA GCTCCGCGCC GCGCCTGAGT GAGGAGGGGC CCCGGGGGCG AGGCGGGAGT    960

GGGAGGAAGG GCACGGTCGC CGCGCTGGAG GTCGGGACCC CGGAGCGGCG ACCGGCCGGG    1020

GTGGGCTCGC TGAGTCGCAC CCGCTCTGCT GGCCGGTCCT GGGCTCACAG TCCCTGCAGC    1080

CCTCGGAAAC AGCGCTAGGA TCCTTCGGGA GAGGAGAGAT GAC                      1123

(2)SEQ ID NO：10的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：417个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：145..287

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

GTACCAATCT AAAACCCAGC ACAGAAAAAT ACATGTTTTA TTTTTTCCAA GTGTTACTAG    60

TACCTCAGCC TTTCTTGATT TGTCAGCTTA TTTAAGGCCT CTTCATTGCA TACTTCTTTT    120

TTCTTTTAAT CATCTGCTTC GAAGGAGACT AAGCTGAAAC TGCTGCTCAG CTCCCAAGAT    180

GGTGCCACCC AAATTGCATG TGCTTTTCTG CCTCTGCGGC TGCCTGGCTG TGGTTTATCC    240

TTTTGACTGG CAATACATAA ATCCTGTTGC CCATATGAAA TCATCAGGTA AGAGGTGTAT    300

TTGTTCAAGG TCTTGAGCAA CTGATCTGTC GCCATACTTC AAGTGGGCCC CAAGAAGTTG    360

CACATCTGCA CATCTAAACA AGTCCTATTT AAAGGCTTAT GGAGATCCTG TATTCTC       417

(2)SEQ ID NO：11的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：498个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：251..372

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

CATTAGGAGG TAACAGTCCA AGGCAGCTGA GAGAAAGGCT ATGTCTACTT TCATCTCTTT    60

ACCCTCCAAA ACCCCTACAC AGTGTTTCAA ACAGAGAGAC CCTCAATAAT TGCATATCTT    120

ACTTGTTAGG TTGAGAAAGA AAGAAGGCCA GAAACTATGG GAAGTAACTT GATTCCGTTG    180

GAATTCTTTT GCATAATAAA ATCTGATATG TAATGGATGA CAAATGAGAT AATATTTACC    240

TGTTTTTCAG CATGGGTCAA CAAAATACAA GTACTGATGG CTGCTGCAAC GTTTGGCCAA    300

ACTAAAATCC CCCGGGGAAA TGGGCCTTAT TCCGTTGGTT GTACAGACTT AATGTTTGAT    360

CACACTAATA AGGTAATGCT TTGATTTATA CAACTTATCC TGATACTCTA ATATTGTCTG    420

TCGCTATGGA CCACTAGAAG GTGTTCAAAT GTGACCTTGC CCTCACCTGA GAATGACTCA    480

TTTTCGAATT TGTATTGT                                                  498

(2)SEQ ID NO：12的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：433个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：130..274

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

CAGCAGCCTA AAGTCTTAGA CTTTGTGAAC ACAGAGGTAT TGAGTCCCAC TAATTAATAT    60

CGAAAATAGC TGCTGGAATA TGTTTGAGAC ACAACTTCTC TAAAAGTGCA TTAATTTCTT    120

TCTTAACAGG GCACCTTCTT GCGTTTATAT TATCCATCCC AAGATAATGA TCACCTTGAC    180

ACCCTTTGGA TCCCAAATAA AGAATATTTT TGGGGTCTTA GCAAATTTCT TGGAACACAC    240

TGGCTTATGG GCAACATTTT GAGGTTACTC TTTGGTAAGA TTTCTGTTGA TCCTTCTTTG    300

TAGGCTCTTG CATGTATGAA AACCTTGAAA ACAACAAGAA CTTCAAGTAG TTAAGACCAA    360

AGTAGATTTT TCTTCAGTCC AAATAGCTCC TAAAATGATA AGGAAAGTAT TTCTTTAAAG    420

CCCAGGCAAC TAC                                                       433

(2)SEQ ID NO：13的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：486个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：164..257

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

TTGGTGGGTA TCTAGTAGCA GTCTTTTTAA TGAATCTACT ATTCATCCAT AAAAAAGTAG    60

ATATAAATCA GATGGGTCTG CATTTTATGC TAATGAGATA TGAATTAAAT TCACTAGCAA    120

CACTCAGAGA AAACCTTAAC TATAACCTTC CATTGTTGTC TAGGTTCAAT GACAACTCCT    180

GCAAACTGGA ATTCCCCTCT GAGGCCTGGT GAAAAATATC CACTTGTTGT TTTTTCTCAT    240

GGTCTTGGGG CATTCAGGTA ATGTTTGAGA GGTTGAACAA TTTTGGCTTC CAGGAATAAA    300

TGACAATTTT TTTATTCAAG AAAGAAATAG CAGAGTTTGG AATGTCATGC AGGCCCTTGT    360

CTGGAGGAGT TGGGGTTCCT CAATAATTGG CTGTGGGTCT ATTGATCAGT CCTAGACCTG    420

TCTGGTCAAG TAGTTTTTTC CCTACTATCA GCTCATTGGG ATTAGCCTCA CAGCAGAGAA    480

GAAAGG                                                               486

(2)SEQ ID NO：14的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：363个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：113..181

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

CCCCAGGCTC TACTACAGGG TGTAATGGCC TCCATGTTCC CAGTTTTATT ACTGACTCAG    60

CCTTGTAATT CATGACTGGT AGTTGTAATT CTTCCCTCTT TTTGTTTTGA AGGACACTTT    120

ATTCTGCTAT TGGCATTGAC CTGGCATCTC ATGGGTTTAT AGTTGCTGCT GTAGAACACA    180

GGTATGTTAC CTGATATAAT TGGGCTCTTT GGCCAACTAC AGGGAATGTC AATGCTCATA    240

ACTATGTTTC TAATTTTCAT AAAAGTTTAT TTAAAATGTT GATGGAACTT TCAAGTATGG    300

TAACATCATG AGCAAAAAAG GAGATTGAGT TTTATCGACT TAAAAGACTT AAAAGCACCT    360

AAC                                                                  363

(2)SEQ ID NO：15的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：441个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：68..191

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

GAACTGAGAA ACATGGTCAG ATGAGGAAGG GAAGGAGCAT GCATAAATAA TTTTGCTTGT    60

ATTATAGAGA TAGATCTGCA TCTGCAACTT ACTATTTCAA GGACCAATCT GCTGCAGAAA    120

TAGGGGACAA GTCTTGGCTC TACCTTAGAA CCCTGAAACA AGAGGAGGAG ACACATATAC    180

GAAATGAGCA GGTACATTGC AGTGAAAGGA GAGGTGGTTG GTGACCTAAA AGCATGTACA    240

AAAGGATGAC ATTTGTTAAT TTAATTTTAC ACCTGGCAAG TTATGCTCCT AGCTCTCCTA    300

TTTCCCATTC CCAAAAGATC TGTCAATAGA TTCCTGGAGC AGTAAAATTC CCTTAATGGA    360

ATATCTAGTT CATAGTAAAA ACAAAGGCAA ATACAAAAAT TTGGGAGATG ACAGTGAATA    420

TTCAGAATTC CTCGAGCCGG G                                              441

(2)SEQ ID NO：16的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：577个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：245..358

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

GGTTAAGTAA ATCGTCTGAA GTCACATAGT AGGTAAGGCA AAACAGAGCC AGGATTTGGA    60

CTAAGGCTAT ACCTATGTGC AAAGCTGGGG CCTGTGTCAT TATGGTAGCA AGTAATAGTC    120

ACTAATCAGA TTTCCAGTTT ATAACTGACC AACGATTTTT CCCAAATACA GCTTCTACCT    180

AAACTTTAAA ATAAGTGTTA TAACTTTTTA CTTTGTCATT TCCTTGTTCT AATAATTATA    240

TTAGGTACGG CAAAGAGCAA AAGAATGTTC CCAAGCTCTC AGTCTGATTC TTGACATTGA    300

TCATGGAAAG CCAGTGAAGA ATGCATTAGA TTTAAAGTTT GATATGGAAC AACTGAAGGT    360

AAGCTATAAA AAGTAATTTT TCTCTTGTCC TACAGTTCTT TATTGTTTTT TGTCATTTAA    420

TTTTCTGCCT ATATTGCAAG GTACAATATG ATAAAGGGCT GCAACCAGCC CCTCCCCAAT    480

GCGCACACAC AGACACACAA AGCAGTACAG GTAAAGTATT GCAGCAATGA AGAATGCATT    540

ATCTTGGACT AGATATGAAT GCAAAGTTAG TCAGTTT                             577

(2)SEQ ID NO：17的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：396个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：108..199

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

ATCAATGTAT TTACCATCCC CATGAAATGA ACAATTATAT GATTGACAAA TCATTTCTTC    60

TAACACCACG AAATAGCTAT AAATTTATAT CATGCTTTTT CAAATAGGAC TCTATTGATA    120

GGGAAAAAAT AGCAGTAATT GGACATTCTT TTGGTGGAGC AACGGTTATT CAGACTCTTA    180

GTGAAGATCA GAGATTCAGG TAAGAAAATA AGATAGTAAA GCAAGAGAAT AGTAAATTAT    240

TGGAAGAAAT TATATTGTGA GATATAATTT TTATTCAAAT TCTTAGTGAA GGAAGGGGAT    300

CTCTTGGAGT TTATAAGGCT ATTCTTTTGC CCCCATAAAA TACTCTATAT ACATTTTCCT    360

AGGCTAAAAC ATCTCCTCTC CTGCTATTAA AATGTC                               396

(2)SEQ ID NO：18的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：519个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：181..351

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

CTTACAAAGT TAATCATATC CCTTTCCCAC ATTGAAGTAT GATACCTCTT TATTCCAATC    60

AGATAACCCA TAATAAACTG GTATGGTGCG TGTCCACCAA TCCTAGCATT ATTAGGATGT    120

CCTCAATGTT GGCTAGTATG TAACCAGTTT AATTTCATCA TTGTCAACAA ATATCTACAG    180

ATGTGGTATT GCCCTGGATG CATGGATGTT TCCACTGGGT GATGAAGTAT ATTCCAGAAT    240

TCCTCAGCCC CTCTTTTTTA TCAACTCTGA ATATTTCCAA TATCCTGCTA ATATCATAAA    300

AATGAAAAAA TGCTACTCAC CTGATAAAGA AAGAAAGATG ATTACAATCA GGTAAGTATT    360

AGTGACTTAT TTCATTATGT GAAACAAACT TGAAGCTTGG GTAAATATCA ATCGATATCA    420

TTTGGTAACT ATTAAAGAAT TGCTGAATTG GTTGTTTAGA CTTTCAATAA GGAGAGAATT    480

AGATAATCTC AGTTTCTAAG TACATTTAGT CTACTCTTT                           519

(2)SEQ ID NO：19的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：569个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：156..304

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

TGAAACACAT CTAAGTAGAT CAAATTACAA GTTTTATTTC TTCTTTGGTT TTCAGTAAAC    60

AGACCAACAA GACCAGTACC TTTCCTTACA CTCTAACTAA AAAAATAATA ATTTTATCAA    120

ACAATGTGAC TTTTAAATGT CTTGTTCTCT TTTAGGGGTT CAGTCCACCA GAATTTTGCT    180

GACTTCACTT TTGCAACTGG CAAAATAATT GGACACATGC TCAAATTAAA GGGAGACATA    240

GATTCAAATG TAGCTATTGA TCTTAGCAAC AAAGCTTCAT TAGCATTCTT ACAAAAGCAT    300

TTAGGTAAGA AACTATTTTT TTCATGACCT AAACCGAGAT GAATCTCGAG GACAAAGCTG    360

TCTATCTTAA TACAGCTTTA GTACTATTTA AACTATTTCC AGTTGGTTTA CAATGGAACA    420

AAGCAGTATA TCAATTTGAA AACAGAAATT TGAGAAAGTC AATTTTGCTG CTTTACATCT    480

CTATATCATA GAAAGCAAAT CAACTGTTAA AGGTAATATT CTTTGTATGA GCTAGAGTGA    540

CTCATGTGAG GATATCGAAC GACGGTGCT                                      569

(2)SEQ ID NO：20的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：469个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：137..253

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

GATACAGAGG CACATCGTCT CTACCATCCT AACGGAACTT GTGTAATTTG TAAATCTTTA    60

TTGCCACCTA GGGGCATCCA AACTGTTTAA TGCTCTCAAA AGTTTAATAT GTTGATTAAC    120

ACTTTATATT TTATAGGACT TCATAAAGAT TTTGATCAGT GGGACTGCTT GATTGAAGGA    180

GATGATGAGA ATCTTATTCC AGGGACCAAC ATTAACACAA CCAATCAACA CATCATGTTA    240

CAGAACTCTT CAGGAATAGA GAAATACAAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAGTCTT    300

GTTTCAAAAC TGTCTAAAAT TATGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGAGAGAGAG    360

AGAGAGAGAG AGAGAGAATT TTAATGTATT TTCCCAAAGG ACTCATATTT TAAAATGTAG    420

GCTATACTGT AATCGTGATT GAAGCTTGGA CTAAGAATTT TTTCCCTTT                469

(2)SEQ ID NO：21的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1494个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：117..1436

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

GGCACGAGCT AGGATCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC    60

CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG        116

ATG GTA CCA CTC AAA CTG CAG GCG CTT TTC TGC CTC CTC TGC TGC CTC    164

Met Val Pro Leu Lys Leu Gln Ala Leu Phe Cys Leu Leu Cys Cys Leu

  1               5                  10                  15

CCA TGG GTC CAT CCT TTT CAC TGG CAA GAC ACA TCT TCT TTT GAC TTC    212

Pro Trp Val His Pro Phe His Trp Gln Asp Thr Ser Ser Phe Asp Phe

             20                  25                  30

AGG CCG TCA GTA ATG TTT CAC AAG CTC CAA TCG GTG ATG TCT GCT GCC    260

Arg Pro Ser Val Met Phe His Lys Leu Gln Ser Val Met Ser Ala Ala

         35                  40                  45

GGC TCT GGC CAT AGT AAA ATC CCC AAA GGA AAT GGA TCG TAC CCC GTC    308

Gly Ser Gly His Ser Lys Ile Pro Lys Gly Asn Gly Ser Tyr Pro Val

     50                  55                  60

GGT TGT ACA GAT CTG ATG TTC GGT TAT GGG AAT GAG AGC GTC TTC GTG    356

Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Gly Tyr Gly Asn Glu Ser Val Phe Val

 65                  70                  75                  80

CGT TTG TAC TAC CCA GCT CAA GAT CAA GGT CGC CTC GAC ACT GTT TGG    404

Arg Leu Tyr Tyr Pro Ala Gln Asp Gln Gly Arg Leu Asp Thr Val Trp

                 85                  90                  95

ATC CCA AAC AAA GAA TAT TTT TTG GGT CTT AGT ATA TTT CTT GGA ACA    452

Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Ile Phe Leu Gly Thr

            100                 105                 110

CCC AGT ATT GTA GGC AAT ATT TTA CAC CTC TTA TAT GGT TCT CTG ACA    500

Pro Ser Ile Val Gly Asn Ile Leu His Leu Leu Tyr Gly Ser Leu Thr

        115                 120                 125

ACT CCT GCA AGC TGG AAT TCT CCT TTA AGG ACT GGA GAA AAA TAC CCG    548

Thr Pro Ala Ser Trp Asn Ser Pro Leu Arg Thr Gly Glu Lys Tyr Pro

    130                 135                 140

CTC ATT GTC TTT TCT CAT GGT CTC GGA GCC TTC AGG ACG ATT TAT TCT    596

Leu Ile Val Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Ile Tyr Ser

145                 150                 155                 160

GCT ATT GGC ATT GGC TTG GCA TCT AAT GGG TTT ATA GTG GCC ACT GTC    644

Ala Ile Gly Ile Gly Leu Ala Ser Asn Gly Phe Ile Val Ala Thr Val

                165                 170                 175

GAA CAC AGA GAC AGA TCT GCA TCG GCA ACT TAC TTT TTT GAA GAC CAG    692

Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Phe Phe Glu Asp Gln

            180                 185                 190

GTG GCT GCA AAA GTG GAA AAC AGG TCT TGG CTT TAC CTG AGA AAA GTA    740

Val Ala Ala Lys Val Glu Asn Arg Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Lys Val

        195                 200                 205

AAA CAA GAG GAG TCG GAA AGT GTC CGG AAA GAA CAG GTT CAG CAA AGA    788

Lys Gln Glu Glu Ser Glu Ser Val Arg Lys Glu Gln Val Gln Gln Arg

    210                 215                 220

GCA ATA GAA TGT TCC CGG GCT CTC AGT GCG ATT CTT GAC ATT GAA CAT    836

Ala Ile Glu Cys Ser Arg Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu His

225                 230                 235                 240

GGA GAC CCA AAA GAG AAT GTA CTA GGT TCA GCT TTT GAC ATG AAA CAG    884

Gly Asp Pro Lys Glu Asn Val Leu Gly Ser Ala Phe Asp Met Lys Gln

                245                 250                 255

CTG AAG GAT GCT ATT GAT GAG ACT AAA ATA GCT TTG ATG GGA CAT TCT    932

Leu Lys Asp Ala Ile Asp Glu Thr Lys Ile Ala Leu Met Gly His Ser

            260                 265                 270

TTT GGA GGA GCA ACA GTT CTT CAA GCC CTT AGT GAG GAC CAG AGA TTC    980

Phe Gly Gly Ala Thr Val Leu Gln Ala Leu Ser Glu Asp Gln Arg Phe

        275                 280                 285

AGA TGT GGA GTT GCT CTT GAT CCA TGG ATG TAT CCG GTG AAC GAA GAG    1028

Arg Cys Gly Val Ala Leu Asp Pro Trp Met Tyr Pro Val Asn Glu Glu

    290                 295                 300

CTG TAC TCC AGA ACC CTC CAG CCT CTC CTC TTT ATC AAC TCT GCC AAA    1076

Leu Tyr Ser Arg Thr Leu Gln Pro Leu Leu Phe Ile Asn Ser Ala Lys

305                 310                 315                 320

TTC CAG ACT CCA AAG GAC ATC GCA AAA ATG AAA AAG TTC TAC CAG CCT    1124

Phe Gln Thr Pro Lys Asp Ile Ala Lys Met Lys Lys Phe Tyr Gln Pro

                325                 330                 335

GAC AAG GAA AGG AAA AAT GAT TAC AAT CAA GGG CTC AGG CAC CAG AAC    1172

Asp Lys Glu Arg Lys Asn Asp Tyr Asn Gln Gly Leu Arg His Gln Asn

            340                 345                 350

TTT GAC GAC TTT ACT TTT GTA ACT GGC AAA ATA ATT GGA AAC AAG CTG    1220

Phe Asp Asp Phe Thr Phe Val Thr Gly Lys Ile Ile Gly Asn Lys Leu

        355                 360                 365

ACA CTG AAA GGA GAA ATC GAT TCC AGA GTA GCC ATC GAC CTC ACC AAC    1268

Thr Leu Lys Gly Glu Ile Asp Ser Arg Val Ala Ile Asp Leu Thr Asn

    370                 375                 380

AAA GCT TCG ATG GCT TTC TTA CAA AAG CAT TTA GGG CTT CAG AAA GAC    1316

Lys Ala Ser Met Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu Gln Lys Asp

385                 390                 395                 400

TTT GAT CAG TGG GAC CCT CTG GTG GAA GGA GAT GAT GAG AAC CTG ATT    1364

Phe Asp Gln Trp Asp Pro Leu Val Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu Ile

                405                 410                 415

CCT GGG TCA CCC TTT GAC GCA GTC ACC CAG GCC CCG GCT CAG CAA CAC    1412

Pro Gly Ser Pro Phe Asp Ala Val Thr Gln Ala Pro Ala Gln Gln His

            420                 425                 430

TCT CCA GGA TCA CAG ACC CAG AAT TAGAAGAACT TGCTTGTTAC ACAGTTGCCT   1466

Ser Pro Gly Ser Gln Thr Gln Asn

        435                 440

TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG                                     1494

(2)SEQ ID NO：22的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：2191个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：92..1423

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG  60

TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G ATG TTG CCA CCC AAA CTG CAT     112

                                   Met Leu Pro Pro Lys Leu His

                                     1               5

GCG CTT TTC TGC CTC TGC AGC TGC CTC ACA CTG GTT CAT CCT ATT GAC    160

Ala Leu Phe Cys Leu Cys Ser Cys Leu Thr Leu Val His Pro Ile Asp

         10                  15                  20

TGG CAA GAC CTA AAT CCT GTT GCC CAT ATT AGA TCA TCA GCA TGG GCC    208

Trp Gln Asp Leu Asn Pro Val Ala His Ile Arg Ser Ser Ala Trp Ala

     25                  30                  35

AAT AAA ATA CAA GCT CTG ATG GCT GCT GCA AGT ATT AGG CAA AGT AGA    256

Asn Lys Ile Gln Ala Leu Met Ala Ala Ala Ser Ile Arg Gln Ser Arg

 40                  45                  50                  55

ATT CCC AAA GGA AAT GGA TCT TAT TCT GTC GGT TGT ACA GAT TTG ATG    304

Ile Pro Lys Gly Asn Gly Ser Tyr Ser Val Gly Cys Thr Asp Leu Met

                 60                  65                  70

TTT GAT TAT ACT AAT AAG GGC ACC TTT TTG CGT TTG TAT TAT CCA TCG    352

Phe Asp Tyr Thr Asn Lys Gly Thr Phe Leu Arg Leu Tyr Tyr Pro Ser

             75                  80                  85

CAA GAG GAT GAC CAC TCT GAC ACG CTT TGG ATC CCA AAC AAA GAA TAT    400

Gln Glu Asp Asp His Ser Asp Thr Leu Trp Ile Pro Asn Lys Glu Tyr

         90                  95                 100

TTT TTT GGT CTT AGT AAA TAT CTT GGA ACA CCC TGG CTT ATG GGC AAA    448

Phe Phe Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Gly Thr Pro Trp Leu Met Gly Lys

    105                 110                 115

ATA TTG AGC TTC TTT TTT GGT TCA GTG ACA ACT CCT GCG AAC TGG AAT    496

Ile Leu Ser Phe Phe Phe Gly Ser Val Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn

120                 125                 130                 135

TCC CCT CTG AGG ACT GGT GAA AAA TAT CCA CTG ATT GTT TTT TCT CAT    544

Ser Pro Leu Arg Thr Gly Glu Lys Tyr Pro Leu Ile Val Phe Ser His

                140                 145                 150

GGT CTT GGA GCA TTC CGG ACA ATT TAT TCT GCT ATT GGC ATT GAT CTA    592

Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu

            155                 160                 165

GCA TCA CAT GGG TTC ATC GTT GCT GCT ATA GAA CAC AGA GAT GGA TCC    640

Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala Ile Glu His Arg Asp Gly Ser

        170                 175                 180

GCC TCT GCG ACT TAC TAT TTC AAG GAC CAG TCT GCT GCA GAA ATA GGG    688

Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly

    185                 190                 195

AAC AAA TCT TGG TCT TAT CTT CAA GAA CTA AAA CCA GGG GAT GAG GAG    736

Asn Lys Ser Trp Ser Tyr Leu Gln Glu Leu Lys Pro Gly Asp Glu Glu

200                 205                 210                 215

ATA CAT GTT CGA AAT GAG CAG GTA CAG AAA AGG GCA AAG GAG TGC TCC    784

Ile His Val Arg Asn Glu Gln Val Gln Lys Arg Ala Lys Glu Cys Ser

                220                 225                 230

CAA GCT CTC AAC TTG ATT CTG GAC ATT GAT CAT GGA AGG CCA ATT AAG    832

Gln Ala Leu Asn Leu Ile Leu Asp Ile Asp His Gly Arg Pro Ile Lys

            235                 240                 245

AAT GTA CTA GAC TTA GAG TTT GAT GTG GAA CAA CTG AAG GAC TCT ATT    880

Asn Val Leu Asp Leu Glu Phe Asp Val Glu Gln Leu Lys Asp Ser Ile

        250                 255                 260

GAC AGG GAT AAA ATA GCA GTA ATT GGA CAT TCT TTT GGT GGA GCC ACA    928

Asp Arg Asp Lys Ile Ala Val Ile Gly His Ser Phe Gly Gly Ala Thr

    265                 270                 275

GTT CTT CAG GCT CTT AGT GAA GAC CAG AGA TTT AGG TGC GGG ATT GCC    976

Val Leu Gln Ala Leu Ser Glu Asp Gln Arg Phe Arg Cys Gly Ile Ala

280                 285                 290                 295

TTG GAT GCA TGG ATG CTT CCA CTG GAT GAT GCA ATA TAT TCC AGA ATC    1024

Leu Asp Ala Trp Met Leu Pro Leu Asp Asp Ala Ile Tyr Ser Arg Ile

                300                 305                 310

CCT CAG CCC CTC TTT TTT ATT AAC TCG GAA CGG TTC CAA TTT CCT GAG    1072

Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu Arg Phe Gln Phe Pro Glu

            315                 320                 325

AAT ATC AAA AAA ATG AAA AAA TGC TAC TCA CCT GAC AAA GAA AGA AAA    1120

Asn Ile Lys Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser Pro Asp Lys Glu Arg Lys

        330                 335                 340

ATG ATT ACA ATC AGG GGT TCA GTC CAT CAG AAC TTT GCT GAT TTC ACT    1168

Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln Asn Phe Ala Asp Phe Thr

    345                 350                 355

TTT ACA ACT GGC AAA ATA GTT GGA TAC ATA TTC ACA TTA AAA GGA GAT    1216

Phe Thr Thr Gly Lys Ile Val Gly Tyr Ile Phe Thr Leu Lys Gly Asp

360                 365                 370                 375

ATA GAT TCA AAT GTA GCA ATT GAT CTT TGC AAC AAA GCT TCA TTG GCA    1264

Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Cys Asn Lys Ala Ser Leu Ala

                380                 385                 390

TTT TTA CAA AAG CAT TTA GGA CTG CGG AAA GAT TTT GAT CAG TGG GAT    1312

Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu Arg Lys Asp Phe Asp Gln Trp Asp

            395                 400                 405

TCT TTG ATT GAA GGA AAA GAC GAA AAT CTT ATG CCA GGG ACC AAC ATT    1360

Ser Leu Ile Glu Gly Lys Asp Glu Asn Leu Met Pro Gly Thr Asn Ile

        410                 415                 420

AAC ATC ACC AAC GAA CAT GAC ACT CTA CAG AAC TCT CCA GAA GCA GAG    1408

Asn Ile Thr Asn Glu His Asp Thr Leu Gln Asn Ser Pro Glu Ala Glu

    425                 430                 435

AAA TCG AAT TTA GAT TAAAAGCACT TTTTTAAAGA TCTTGTTTAA AAACTGTCAA    1463

Lys Ser Asn Leu Asp

440

AAAATGTGTG TATGACTTTT AATATATTTT CTCAAATAAC TCATATTGGA AAATGTAGGC  1523

TATCCCATAA AAGTGATTGA AGCTTGGACT AGGAGGTTTT TTTCTTTAAA GAAAGATTGG  1583

TGTCTATCGA AATCATGCCA GCCTAAATTT TAATTTTACT AAAATGATGC TGTGTCAAAA  1643

TTAATAACTA CTTTTACATT CTTTAATGGA CAAGTATAAC AGGCACAAGG CTAATGAAAA  1703

CGTGTTGCAA TGACATAACA ATCCCTAAAA ATACAGATGT TCTTGCCTCT TTTTTCTATT    1763

ATAATTGAGT TTTAGCAACA TGTTATGCTA GGTAGAATTT GGAAGCACTT CCCTTTGACT    1823

TTTGGTCATG ATAAGAAAAA TTAGATCAAG CAAATGATAA AAGCAGTGTT TTACCAAGGA    1883

TTAGGGATAC TGAACAATTT CACTATGGTA ACTGAATGGG GAGTGACCAA GGGTAAAAAT    1943

ATTAAAGCCA AGGCAAAGGC AGCAGATTAG AATGGATTAA AGAGAGTTTA TAATTTGTTT    2003

GCATTTACTT GATGGTTTAT CTCATGGATT CATGAGTCAA GAAAGGTGCG TAGGACAGGC    2063

CAGGGATTCC AGTTATAACA CATTATTCAC CCAAAGGGTT CTTTAATTCT GTATGAGTAT    2123

TGGGAGTGGA TTAGCACAAT AGAGGCATAT GTTGCTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA    2l83

AAAAAAAA                                                             2191

(2)SEQ ID NO：23的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1533个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：蛋白质

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：62..1394

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

CCGCGAGCAG TTCACCGCGG CGTCCGGAAG GTTAAGCTGA AACGGCAGCT CAGCTTCGGA    60

G ATG TTA CCG TCC AAA TTG CAT GCG CTT TTC TGC CTC TGC ACC TGC        106

  Met Leu Pro Ser Lys Leu His Ala Leu Phe Cys Leu Cys Thr Cys

    1               5                  10                  15

CTT GCA CTG GTT TAT CCT TTT GAC TGG CAA GAC CTG AAT CCA GTT GCC    154

Leu Ala Leu Val Tyr Pro Phe Asp Trp Gln Asp Leu Asn Pro Val Ala

                 20                  25                  30

TAT ATT GAA TCA CCA GCA TGG GTC AGT AAG ATA CAA GCT CTG ATG GCT    202

Tyr Ile Glu Ser Pro Ala Trp Val Ser Lys Ile Gln Ala Leu Met Ala

             35                  40                  45

GCT GCA AAC ATT GGT CAA TCT AAA ATC CCC AGA GGA AAT GGA TCT TAT    250

Ala Ala Asn Ile Gly Gln Ser Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Ser Tyr

         50                  55                  60

TCC GTC GGT TGT ACA GAC TTG ATG TTT GAT TAC ACT AAT AAG GGC ACC    298

Ser Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Asp Tyr Thr Asn Lys Gly Thr

     65                  70                  75

TTC TTG CGT TTG TAT TAT CCA TCT CAA GAT GAT GAT CAC TCC GAC ACC    346

Phe Leu Arg Leu Tyr Tyr Pro Ser Gln Asp Asp Asp His Ser Asp Thr

 80                  85                  90                  95

CTT TGG ATC CCA AAC AAA GAA TAT TTT TTG GGT CTT AGT AAA TTT CTT    394

Leu Trp Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Lys Phe Leu

                100                 105                 110

GGA ACA CAC TGG CTT GTG GGC AAA ATT ATG GGC TTA TTC TTC GGT TCA    442

Gly Thr His Trp Leu Val Gly Lys Ile Met Gly Leu Phe Phe Gly Ser

            115                 120                 125

ATG ACA ACT CCT GCA GCC TGG AAT GCA CAT CTG AGG ACT GGG GAA AAA    490

Met Thr Thr Pro Ala Ala Trp Asn Ala His Leu Arg Thr Gly Glu Lys

        130                 135                 140

TAC CCA CTA ATT ATT TTT TCT CAT GGT CTT GGA GCA TTC AGG ACG ATT    538

Tyr Pro Leu Ile Ile Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Ile

    145                 150                 155

TAT TCT GCT ATT GGC ATT GAT CTG GCA TCC CAC GGG TTT ATA GTT GCT    586

Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala

160                 165                 170                 175

GCT GTA GAA CAC AGG GAT GGC TCT GCA TCC TCG ACA TAC TAT TTC AAG    634

Ala Val Glu His Arg Asp Gly Ser Ala Ser Ser Thr Tyr Tyr Phe Lys

                180                 185                 190

GAC CAG TCT GCT GTA GAA ATA GGC AAC AAG TCT TGG CTC TAT CTC AGA    682

Asp Gln Ser Ala Val Glu Ile Gly Asn Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg

            195                 200                 205

ACC CTG AAG CGA GGA GAG GAG GAG TTT CCT TTA CGA AAT GAG CAG TTA    730

Thr Leu Lys Arg Gly Glu Glu Glu Phe Pro Leu Arg Asn Glu Gln Leu

        210                 215                 220

CGG CAA CGA GCA AAG GAA TGT TCT CAA GCT CTC AGT TTG ATT CTG GAC    778

Arg Gln Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp

    225                 230                 235

ATT GAT CAC GGG AGG CCA GTG ACG AAT GTA CTA GAT TTA GAG TTT GAT    826

Ile Asp His Gly Arg Pro Val Thr Asn Val Leu Asp Leu Glu Phe Asp

240                 245                 250                 255

GTG GAA CAG CTG AAG GAC TCT ATT GAT AGG GAT AAA ATA GCC ATT ATT    874

Val Glu Gln Leu Lys Asp Ser Ile Asp Arg Asp Lys Ile Ala Ile Ile

                260                 265                 270

GGA CAT TCT TTT GGT GGA GCC ACA GTT ATT CAG ACT CTT AGT GAA GAC    922

Gly His Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp

            275                 280                 285

CAG AGA TTC AGG TGT GGC ATT GCT CTG GAT GCA TGG ATG TTT CCC GTG    970

Gln Arg Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Val

        290                 295                 300

GGT GAT GAA GTA TAT TCC AGA ATT CCT CAA CCC CTC TTT TTT ATC AAC    1018

Gly Asp Glu Val Tyr Ser Arg Ile Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn

    305                 310                 315

TCG GAA CGA TTC CAA TAC CCT TCT AAT ATC ATA AGA ATG AAA AAA TGC    1066

Ser Glu Arg Phe Gln Tyr Pro Ser Asn Ile Ile Arg Met Lys Lys Cys

320                 325                 330                 335

TTC TTA CCT GAT AGA GAA CGA AAA ATG ATT ACA ATC AGG GGT TCG GTC    1114

Phe Leu Pro Asp Arg Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val

                340                 345                 350

CAT CAG AAT TTT GTT GAC TTC ACT TTT GCC ACT AGC AAA ATA ATT GGC    1162

His Gln Asn Phe Val Asp Phe Thr Phe Ala Thr Ser Lys Ile Ile Gly

            355                 360                 365

TAC CTA TTC ACA CTG AAA GGA GAC ATC GAT TCC AAT GTA GCC ATC AGC     1210

Tyr Leu Phe Thr Leu Lys Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Ser

        370                 375                 380

CTT AGC AAC AAA GCT TCC TTA GCG TTC TTA CAA AAA CAT TTA GGA CTT     1258

Leu Ser Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu

    385                 390                 395

CAG AAA GAT TTT GAT CAG TGG GAT TCT TTA GTT GAA GGC GAA GAT CAC     1306

Gln Lys Asp Phe Asp Gln Trp Asp Ser Leu Val Glu Gly Glu Asp His

400                 405                 410                 415

AAT CTT ATT CCA GGG ACC AAC ATT AAC ACA ACC AAC CAC CAA GCC ATT     1354

Asn Leu Ile Pro Gly Thr Asn Ile Asn Thr Thr Asn His Gln Ala Ile

                420                 425                 430

CTG CAG AAC TCC ACA GGA ATA GAG AGA CCA AAT TTA GAT T AAAAGAGCTT    1404

Leu Gln Asn Ser Thr Gly Ile Glu Arg Pro Asn Leu Asp

            435                 440

TTTAAAAAGT TTTGTTTACG AACTTGTCTA AAAGTGTGTG TGTGTATGAT TTAAATGTAT   1464

TTTCTCAAAT AGCTCATATT AAAAAATGTA GGCTATAGCA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA   1524

AAAAAAAAA                                                           1533

(2)SEQ ID NO：24的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1876个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：蛋白质

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：468..1734

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

CGGCGGGCTG CTGGCCCTTC CCGGCTGTTC GTAGAGCCGG ATCCTGCAGC GCCCCTGAGA    60

CGAACCGCCC CGATGCGGTG CTCCTCAGCG CCACGGGACG CAGCCGGGGC CGGCCGTGTT    120

GGCGCAGCTC CCACGACGTA CGCTTCCTTT CCAGGCTCGA GGAAAGCCTC TCCCACAAAC    180

ACCGTCCCAG CTGGGAAGTG AGGCGGAGTT TTGGTCCCTC CCCTCCGGCA GCGCCCGGCA    240

TTCCGTCCGT CCGTCCGTCC GTCCGTGCGG CGCACGGCGC CCTGCAGAGC CGGGACACCG    300

CAGCAGGGTA GGAGGACCCG GAGGTGGTGT GCAGCCACAG GTTTCCATCC TGCCCCCACC    360

TCCCGGGGAG CAGCCCTGTG CTATACCCAA CCCCCCGCAC AGAGCACTGA GCCGGCTGCT    420

GCCTGCCTGC ACCCCGCCGT GGGACCTTCT GCTCTTCCCA ACAAGTG ATG GCA TCG      476

                                                    Met Ala Ser

                                                      1

CTG TGG GTG AGA GCC AGG AGG GTG TTC ATG AAA AGT CGT GCT TCA GGT      524

Leu Trp Val Arg Ala Arg Arg Val Phe Met Lys Ser Arg Ala Ser Gly

      5                  10                  15

TTC TCG GCG AAG GCG GCG ACG GAG ATG GGG AGC GGC GGC GCG GAG AAG      572

Phe Ser Ala Lys Ala Ala Thr Glu Met Gly Ser Gly Gly Ala Glu Lys

 20                  25                  30                  35

GGC TAT CGG ATC CCC GCC GGG AAG GGC CCG CAC GCC GTG GGC TGC ACG      620

Gly Tyr Arg Ile Pro Ala Gly Lys Gly Pro His Ala Val Gly Cys Thr

                 40                  45                  50

GAT CTG ATG ACC GGC GAC GCG GCC GAG GGA AGC TTT TTG CGC CTG TAT      668

Asp Leu Met Thr Gly Asp Ala Ala Glu Gly Ser Phe Leu Arg Leu Tyr

             55                  60                  65

TAC CTA TCG TGT GAC GAC ACA GAT ACT GAA GAG ACA CCC TGG ATT CCA      716

Tyr Leu Ser Cys Asp Asp Thr Asp Thr Glu Glu Thr Pro Trp Ile Pro

         70                  75                  80

GAT AAA GAG TAC TAC CAG GGG CTG TCT GAC TTC CTC AAC GTG TAC CGG      764

Asp Lys Glu Tyr Tyr Gln Gly Leu Ser Asp Phe Leu Asn Val Tyr Arg

     85                  90                  95

GCC CTG GGA GAA AGG CTT TTC CAG TAC TAC GTT GGC TCA GTG ACC TGT    812

Ala Leu Gly Glu Arg Leu Phe Gln Tyr Tyr Val Gly Ser Val Thr Cys

100                 105                 110                 115

CCT GCA AAA TCA AAC GCT GCT TTT AAG CCA GGA GAG AAA TAC CCA CTG    860

Pro Ala Lys Ser Asn Ala Ala Phe Lys Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Leu

                120                 125                 130

CTC GTT TTT TCC CAT GGA CTT GGA GCT TTT CGG ACC ATC TAT TCT GCT    908

Leu Val Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Ile Tyr Ser Ala

            135                 140                 145

ATC TGC ATA GAG ATG GCT TCT CAA GGC TTT CTA GTG GCA GCT GTG GAG    956

Ile Cys Ile Glu Met Ala Ser Gln Gly Phe Leu Val Ala Ala Val Glu

        150                 155                 160

CAC AGA GAT GAA TCG GCT TCA GCA ACG TAT TTC TGT AAA AAG AAG GCT    1004

His Arg Asp Glu Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Lys Lys Ala

    165                 170                 175

GAT TCT GAG CCA GAG GAG GAT CAA ACA TCA GGC GTG GAG AAG GAG TGG    1052

Asp Ser Glu Pro Glu Glu Asp Gln Thr Ser Gly Val Glu Lys Glu Trp

180                 185                 190                 195

ATC TAC TAC AGG AAG CTC AGA GCA GGA GAG GAG GAG CGC TGT CTG CGT    1100

Ile Tyr Tyr Arg Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Glu Arg Cys Leu Arg

                200                 205                 2l0

CAC AAG CAG GTA CAG CAG AGA GCA CAG GAG TGC ATC AAA GCG CTC AAC    1148

His Lys Gln Val Gln Gln Arg Ala Gln Glu Cys Ile Lys Ala Leu Asn

            215                 220                 225

CTC ATT CTT AAG ATC AGT TCA GGA GAG GAA GTG ATG AAT GTG CTG AAC    1196

Leu Ile Leu Lys Ile Ser Ser Gly Glu Glu Val Met Asn Val Leu Asn

        230                 235                 240

TCA GAC TTT GAC TGG AAC CAC CTG AAG GAT TCT GTT GAT ACT AGC AGA    1244

Ser Asp Phe Asp Trp Asn His Leu Lys Asp Ser Val Asp Thr Ser Arg

    245                 250                 255

ATA GCT GTG ATG GGA CAC TCT TTT GGT GGT GCT ACA GTT ATT GAG AGC    1292

Ile Ala Val Met Gly His Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Ile Glu Ser

260                 265                 270                 275

CTC AGC AAA GAA ATT AGA TTT AGG TGT GGC ATT GCC CTT GAT GCG TGG    1340

Leu Ser Lys Glu Ile Arg Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Ala Trp

                280                 285                 290

ATG CTC CCG GTA GGC GAT GAC ACT TAC CAA AGC AGT GTG CAG CAA CCA    1388

Met Leu Pro Val Gly Asp Asp Thr Tyr Gln Ser Ser Val Gln Gln Pro

            295                 300                 305

CTG CTC TTT ATT AAT TCC GAA AAA TTC CAG TGG GCT GCC AAT ATC TTA    1436

Leu Leu Phe Ile Asn Ser Glu Lys Phe Gln Trp Ala Ala Asn Ile Leu

        310                     315                 320

AAG ATG AAG AAG CTT AGC TCC AAT GAT ACC AAC AAG AAA ATG ATC ACC    1484

Lys Met Lys Lys Leu Ser Ser Asn Asp Thr Asn Lys Lys Met Ile Thr

    325                 330                 335

ATC AAA GGA TCG GTA CAT CAG AGC TTT CCT GAT TTT ACT TTT GTG AGT    1532

Ile Lys Gly Ser Val His Gln Ser Phe Pro Asp Phe Thr Phe Val Ser

340                 345                 350                 355

GGA GAA ATC ATT GGA AAG TTT TTC AAG TTA AAA GGA GAA ATA GAC CCA    1580

Gly Glu Ile Ile Gly Lys Phe Phe Lys Leu Lys Gly Glu Ile Asp Pro

                360                 365                 370

AAT GAA GCT ATT GAT ATA TGC AAC CAC GCT TCA TTG GCC TTC CTG CAG    1628

Asn Glu Ala Ile Asp Ile Cys Asn His Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln

            375                 380                 385

AAA CAT CTG AGT CTT AAG AGA GAT TTT GAT AAG TGG GAT TCA CTC GTG    1676

Lys His Leu Ser Leu Lys Arg Asp Phe Asp Lys Trp Asp Ser Leu Val

        390                 395                 400

GAT GGC ATA GGA CCC AAT GTT ATT TCT GGT ACC AAT ATC GAC TTA TCT    1724

Asp Gly Ile Gly Pro Asn Val Ile Ser Gly Thr Asn Ile Asp Leu Ser

    405                 410                 415

CCA ACT GAG T AAGGAGTACA AGAAGTACTG CAAAGGCCAC CAGCAGCAGG          1774

Pro Thr Glu

420

ACACCAACGT TGGCCACACA TTGCTTGGAG CTGAGATAGC ACTGGCCTCC CACACAGCTT  1834

TTGGAGTGTG AAACAACAAA AAAAAAAATC ACAGGGGAGC CG                   1876

(2)SEQ ID NO：25的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：517个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：2..514

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

G GGG CAT TCT TTT GGA GGA GCA ACA GTT TTT CAA GCC CTA AGT GAA      46

  Gly His Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Phe Gln Ala Leu Ser Glu

    1               5                  10                  15

GAC CAG AGA TTC AGA TGT GGG ATT GCC CTT GAT CCG TGG ATG TTT CCC    94

Asp Gln Arg Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Pro Trp Met Phe Pro

                20                  25                  30

GTG AGT GAG GAG CTG TAC TCC AGA GTT CCT CAG CCT CTC TTC TTT ATC    142

Val Ser Glu Glu Leu Tyr Ser Arg Val Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile

            35                  40                  45

AAC TCT GCC GAA TTC CAG ACT CCA AAG GAC ATT GCA AAA ATG AAA AAC    190

Asn Ser Ala Glu Phe Gln Thr Pro Lys Asp Ile Ala Lys Met Lys Asn

        50                  55                  60

TTC TAC CAG CCT GAC AAG GAA AGG AAA ATG ATT ACG ATC AAG GGC TCA    238

Phe Tyr Gln Pro Asp Lys Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Lys Gly Ser

    65                  70                  75

GTG CAC CAG AAT TTT GCT GAC GGG ACT TTT GTA ACT GGC AAA ATA ATT    286

Val His Gln Asn Phe Ala Asp Gly Thr Phe Val Thr Gly Lys Ile Ile

80                  85                  90                  95

GGA AAC AAG CTG TCA CTG AAA GGA GAC ATA GAC TCC AGA GTT GCC ATA    334

Gly Asn Lys Leu Ser Leu Lys Gly Asp Ile Asp Ser Arg Val Ala Ile

                100                 105                 110

GAC CTC ACC AAC AAG GCT TCC TTG GCT TTC TTA CAA AAA CAT TTA GGA    382

Asp Leu Thr Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly

            115                 120                 125

CTT CAT AAA GAC TTT GAT CAG TGG GAC TGT CTG GTG GAG GGA GAG AAC    430

Leu His Lys Asp Phe Asp Gln Trp Asp Cys Leu Val Glu Gly Glu Asn

        130                 135                 140

GAG AAC CTC ATC CCG GGG TCA CCC TTT GAT GTA GTC ACC CAG TCC CCG    478

Glu Asn Leu Ile Pro Gly Ser Pro Phe Asp Val Val Thr Gln Ser Pro

    145                 150                 155

GCT CTG CAG AGT TCT CCC GGA TCA CAC AAC CAG AAT TAG                517

Ala Leu Gln Ser Ser Pro Gly Ser His Asn Gln Asn

160                 165                 170

(2)SEQ ID NO：26的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：580个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)位置：1..580

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

CAA GTA CTG ATG GCT GCT GCA AGC TTT GGC GAA CGT AAA ATC CCT AAG    48

Gln Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Glu Arg Lys Ile Pro Lys

  1               5                  10                  15

GGA AAT GGG CCT TAT TCC GTT GGT TGT ACA GAC TTA ATG TTT GAT TAC    96

Gly Asn Gly Pro Tyr Ser Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Asp Tyr

            20                  25                  30

ACT AAA AAG GGC ACC TTC TTG CGT TTA TAT TAT CCA TCC CAA GAT GAT    144

Thr Lys Lys Gly Thr Phe Leu Arg Leu Tyr Tyr Pro Ser Gln Asp Asp

        35                  40                  45

GAT CGC CTT GAC ACC CTT TGG ATC CCA AAT AAG GAG TAT TTT TGG GGT    192

Asp Arg Leu Asp Thr Leu Trp Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Gly

    50                  55                  60

CTT AGC AAG TAT CTT GGA AAA CAC TGG CTT ATG GGC AAC ATT TTG AGT    240

Leu Ser Lys Tyr Leu Gly Lys His Trp Leu Met Gly Asn Ile Leu Ser

65                  70                  75                  80

TTA CTC TTT GGT TCA GTG ACA ACT CCT GCA AAC TGG AAT TCC CCT CTG    288

Leu Leu Phe Gly Ser Val Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn Ser Pro Leu

                85                  90                  95

AGG CCT GGT GAA AAA TAC CCA CTT GTT GTT TTT TCT CAT GGT CTT GGA    336

Arg Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Leu Val Val Phe Ser His Gly Leu Gly

            100                 105                 110

GCA TTC AGG ACA ATT TAT TCT GCT ATT GGC ATT GAC CTG GCA TCT CAT    384

Ala Phe Arg Thr Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His

        115                 120                 125

GGG TTT ATA GTT GCT GCT GTA GAA CAC AGA GAT AGA TCT GCA TCT GCA    432

Gly Phe Ile Val Ala Ala Val Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala

    130                 135                 140

ACT TAC TAT TTC AAG AAC CAA TCT GCT GCA GAA ATA GGG AAA AAG TCT    480

Thr Tyr Tyr Phe Lys Asn Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly Lys Lys Ser

145                 150                 155                 160

TGG CTC TAC CTT AGA ACC CTG AAA GAA GAG GAG GAG ATA CAT ATA CGA    528

Trp Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Lys Glu Glu Glu Glu Ile His Ile Arg

                165                 170                 175

AAT AAG CAG GTA CGA CAA AGA GCA AAA GAA TGT TCC CAA GCT CTC AGT    576

Asn Lys Gln Val Arg Gln Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser

            180                 185                 190

   CTG A                                                              580Leu(2)SEQ ID NO：27的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：5个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：27：

Gly Xaa Ser Xaa Gly

1               5

(2)SEQ ID NO：28的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：41个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G                         41

(2)SEQ ID NO：29的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：32个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：29：

ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG                                   32

(2)SEQ ID NO：30的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1335个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：30：

ATGGTACCCC CAAAGCTGCA CGTCCTGTTT TGTCTGTGTG GATGTCTCGC CGTCGTGTAC    60

CCCTTCGATT GGCAGTATAT CAACCCCGTG GCTCACATGA AGAGCAGCGC CTGGGTGAAT    120

AAGATCCAGG TGCTCATGGC CGCACCAAGC TTCGGTCAGA CCAAGATTCC TAGAGGCAAC    180

GGCCCCTACA GCGTGGGCTG CACCGATCTG ATGTTCGACC ATACCAACAA AGGAACTTTT    240

CTGAGACTGT ACTACCCCAG CCAGGACAAC GACAGACTGG ATACTCTGTG GATCCCAAAT    300

AAAGAATATT TTTGGGGTCT TAGCAAATTT CTTGGAACAC ACTGGCTTAT GGGCAACATT    360

TTGAGGTTAC TCTTTGGTTC AATGACAACT CCTGCAAACT GGAATTCCCC TCTGAGGCCT    420

GGTGAAAAAT ATCCACTTGT TGTTTTTTCT CATGGTCTTG GGGCATTCAG GACACTTTAT    480

TCTGCTATTG GCATTGACCT GGCATCTCAT GGGTTTATAG TTGCTGCTGT AGAACACAGA    540

GATAGATCTG CATCTGCAAC TTACTATTTC AAGGACCAAT CTGCTGCAGA AATAGGGGAC    600

AAGTCTTGGC TCTACCTTAG AACCCTGAAA CAAGAGGAGG AGACACATAT ACGAAATGAG    660

CAGGTACGGC AAAGAGCAAA AGAATGTTCC CAAGCTCTCA GTCTGATTCT TGACATTGAT    720

CATGGAAAGC CAGTGAAGAA TGCATTAGAT TTAAAGTTTG ATATGGAACA ACTGAAGGAC    780

TCTATTGATA GGGAAAAAAT AGCAGTAATT GGACATTCTT TTGGTGGAGC AACGGTTATT    840

CAGACTCTTA GTGAAGATCA GAGATTCAGA TGTGGTATTG CCCTGGATGC ATGGATGTTT    900

CCACTGGGTG ATGAAGTATA TTCCAGAATT CCTCAGCCCC TCTTTTTTAT CAACTCTGAA    960

TATTTCCAAT ATCCTGCTAA TATCATAAAA ATGAAAAAAT GCTACTCACC TGATAAAGAA    1020

AGAAAGATGA TTACAATCAG GGGTTCAGTC CACCAGAATT TTGCTGACTT CACTTTTGCA    1080

ACTGGCAAAA TAATTGGACA CATGCTCAAA TTAAAGGGAG ACATAGATTC AAATGTAGCT    1140

ATTGATCTTA GCAACAAAGC TTCATTAGCA TTCTTACAAA AGCATTTAGG ACTTCATAAA    1200

GATTTTGATC AGTGGGACTG CTTGATTGAA GGAGATGATG AGAATCTTAT TCCAGGGACC    1260

AACATTAACA CAACCAATCA ACACATCATG TTACAGAACT CTTCAGGAAT AGAGAAATAC    1320

AATTAGGATT CTAGA                                                     1335

Claims (17)

1.纯化和分离的人血浆血小板激活因子乙酰水解酶PAF-AH多肽片段，其缺失陈述于SEQ ID NO：8中的成熟人PAF-AH氨基酸序列的最多达前12个N末端氨基酸。

2.选自以下的权利要求1的PAF-AH多肽片段：

(a)具有SEQ ID NO：8的Met₄₆做为起始N末端氨基酸的多肽；

(b)具有SEQ ID NO：8的Ala₄₇做为起始N末端氨基酸的多肽；

和

(c)具有SEQ ID NO：8的Ala₄₈做为起始N末端氨基酸的多肽。

3.权利要求1或2的任何一项的PAF-AH多肽片段，其缺失SEQ IDNO：8的氨基酸序列的最多达30个C末端氨基酸。

4.具有选自以下的SEQ ID NO：8的残基做为其C末端残基的权利要求1或2的任何一项的PAF-AH多肽片段：

(a)Ile₄₂₉，

(b)Leu₄₃₁，和

(c)Asn₄₄₁。

5.人PAF-AH多肽片段，其具有SEQ ID NO：8的Met₄₆做为N末端残基，具有Ile₄₂₉或Asn₄₄₁做为C末端残基。

6.权利要求1的PAF-AH多肽片段的变异体，其在SEQ ID NO：8的序列中具有一个选自以下的氨基酸置换：

(a)S 108 A，

(b)S 273 A，

(c)D 286 A，

(d)D 286 N，

(e)D 296 A，

(f)D 304 A，

(g)D 338 A，

(h)H 351 A，

(i)H 395 A，

(j)H 399 A，

(k)C 67 S，

(l)C 229 S，

(m)C 291 S，

(n)C 334 S，和

(o)C 407 S。

7.人PAF-AH多肽变异体，其在SEQ ID NO：8的序列中具有一个氨基酸置换D 304 A。

8.编码按照权利要求1-4，6或7的任何一项的PAF-AH多肽片段、多肽片段的变异体或多肽变异体的分离的多核苷酸。

9.编码具有SEQ ID NO：8的Met₄₆做为N末端残基和Ile₄₂₉或Asn₄₄₁做为C末端残基的人PAF-AH片段的分离的多核苷酸。

10.是DNA的权利要求8或9的任何一项的多核苷酸。

11.包含权利要求10的DNA的DNA载体。

12.用按照权利要求10的DNA以所述PAF-AH多肽片段、多肽片段的变异体或多肽变异体在宿主细胞中可表达的方式稳定转化或转染的宿主细胞。

13.产生血浆PAF-AH的PAF-AH多肽片段、变异体或变异体片段的方法，包括在合适的营养物中使按照权利要求12的宿主细胞生长，并从所述细胞或其生长的培养基分离所述PAF-AH多肽片段、多肽片段的变异体或多肽变异体。

14.通过权利要求13的方法产生的PAF-AH多肽片段、多肽片段的变异体或多肽变异体。

15.药学组合物，包含权利要求1-7或14的任何一项的PAF-AH多肽片段、多肽片段的变异体或多肽变异体的以及药学可接受的稀释剂、辅助剂或载体。

16.权利要求1-7或14的任何一项的PAF-AH多肽片段、多肽片段的变异体或多肽变异体或权利要求15的药用组合物在制备用于治疗对PAF介导的病理病症易感或患有PAF介导的病理病症的哺乳动物的药物中的用途，其中所述药物的量足以补充PAF-AH活性和钝化PAF的病理效应。

17.按照权利要求16的用途，其中所述药物用于治疗易感或患有以下疾病的哺乳动物：胸膜炎、哮喘、鼻炎、坏死性小肠结肠炎、急性呼吸窘迫综合症、急性胰腺炎、再灌注损伤、败血症、早产或与HIV感染相关的神经疾病。

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