CN1195965A - 利用氧气去除延长冷藏红细胞的保质期 - Google Patents

利用氧气去除延长冷藏红细胞的保质期 Download PDF

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Abstract

利用去除氧气延长冷藏红细胞有效保质期的方法。公开了一种成本合理、有效的4℃保存红细胞的方法,该方法可保持红细胞质量,延长输血后红细胞在体内的成活时间。4℃保存时间较长的红细胞在保存时去除其中的氧气,实现维持其三磷酸腺苷的浓度,减少溶血和膜囊泡形成。通过加入磷酸铵,在某些样本中保存红细胞的三磷酸腺苷浓度得到了提高。

Description

利用氧气去除延长冷藏红细胞的保质期
                 发明领域
本发明一般涉及血液的液态保存，更具体地讲，涉及血液的无氧冷藏。本发明的完成了在合同号为W-7405-ENG-36下得到政府的支持，该合同是美国能源部授予加利福尼亚大学董事会的。美国政府在本发明中享有一定的权利。
                 发明背景
目前血液的供应量比其需要量要小得多。储藏的血液在储藏中持续变质5-6周后被认为不可用，这由输血后这类细胞在循环***中不能成活来确定，其部分原因是血红蛋白被氧化和降解，以及三磷酸腺苷(ATP)被耗尽。此外，涉及接受非自体供体血液的危险性仍很大。为了满足目前的需要，血液保存技术必须简便、成本低廉，保存期长。
红细胞(RBC)在人体湍流条件下可在无蛋白质合成时存活约4个月。氧气(O2)对于血红蛋白(Hb)转变为met-Hb来说是必须的，后者降解后将产生一些有毒物质，如高铁血原素、氯化血红素、游离Fe3+。这些产物与O2一起催化羟基(OH·)的形成，OH·和met-Hb降解物均能破坏红细胞脂质膜、膜骨架和细胞内容物。正如下面将要讨论的，目前的红细胞保存方法并未处理血红蛋白降低的机制。
冷冻可逆地使met-Hb体内还原所需的酶失活，增加红细胞环境中破坏性O2的溶解度(几乎增大2倍)，并通过降低糖酵解速率而使ATP浓度降低(4℃时该速率为37℃时的1%)。红细胞中ATP浓度的降低导致棘红细胞(红细胞的一种不稳定形式)的形成，增加膜囊泡化速度，红细胞表面积减少，脾巨噬细胞加速红细胞凋亡。囊泡化作用在冷藏全过程中都在进行，并被棘红细胞的形成所加剧，而且通过减少红细胞膜面积而减低红细胞的成活。
已有人研究了提高与维持ATP浓度在血液保存中的作用，例如，在“红细胞保存研究之七：改良的磷酸铵添加液法的体内和体外研究”(Greenwalt等，Vox Sang65，87-94(1993))一文中，作者确定了实验添加液(EAS-2)能将人红细胞的保存期从目前标准的5-6周延长至较长的标准的8-9周，该添加液含有20mM NH4Cl、30mMNa2HPO4、2mM腺嘌呤、110mM葡萄糖、55mM甘露醇，pH7.15。用一个洗涤步骤除去上清后，封装的细胞适用于输血。Greenwalt等人还得出结论，保存50天以后，ATP浓度以外的因素似乎在决定RBC成活性方面起的作用越来越大。他们引用了L.Wood和E.Beutler在“保存于磷酸腺嘌呤介质中的人血的成活性”(Transfusion 7，401-408(1967))一文中的结果，发现在他们的实验中，ATP浓度与RBC的24hr成活率之间的关系在保存8周后变得越来越不明显。在“红细胞浓缩液于CPD-A2中保存42和49天”(J.Lab.Clin.Med.102，53-62(1983))一文中E.Beutler和C.west再次指出，在延长保存时间后，红细胞ATP浓度和其成活性的关系很弱。
在“4℃液态保存时氧气对红细胞的影响”(Hogman等，VoxSang 51，27-34(1986))一文中，作者讨论到，2-3周后，无氧保存的红细胞ATP浓度比有氧保存时要维持得略好。在保存期间，将静脉血冷却，将透氧血液保存袋置于氮气环境中，由此逐步减少氧气饱和度，除去额外的氧气。在4℃保存期间，氧气浓度缓慢下降，但远不完全，开始时血红蛋白饱和度约60％，5周时达到约30％。不能得出这种方法对储存细胞的整体质量影响的有关结论。这些作者都未重视或极大地低估了对血红蛋白依赖于氧气的破坏作用和血红蛋白降解产物引起的氧气介导的破坏作用。
因此，本发明的目标之一就是提供一个血液保存的方法，该方法解决了血红蛋白降解、红细胞裂解(溶血)、ATP耗尽的问题，其方式与自体输液和改进的异体输液的后勤学一致，该方法大大延长了细胞保存时间，在此期间内，冷冻保存的红细胞不会对其以后的用途造成损害。
本发明的另一目标是提供一个方法，以延长血液保存时间，同时减小制备输液样本所需步骤的复杂性。
本发明的其它目标、优点和新特征将在以下描述中部分提出，本领域技术人员检查以下说明时会明显看出本发明的部分目标、优点和新特征，或在实施本发明时可以认识到。通过所附的权利要求书中特别提出的手段和组合物，可以达到本发明的目标和优点。
                 发明概述
为了实现本发明的前述目标和其他目标，并遵照本发明的目的，本文具体和广泛描述的保存红细胞的方法包括以下步骤：将含有待保存红细胞的全血样本与一种抗凝血剂溶液混合，由此形成红细胞第一悬液，从第一悬液的液体部分(血浆)中浓缩红细胞，由此形成大量封装的红细胞，将由此产生的封装红细胞与一种含有葡萄糖、腺嘌呤和盐的添加液混合，由此形成红细胞第二悬液，由红细胞第二悬液中去除氧气，并将红细胞第二悬液冷却至4℃。
最好不要将此冻存的红细胞再暴露于氧气。
在本发明的另一方面，按照其目标和目的，保存红细胞的方法包括以下步骤：形成大量封装红细胞，将封装红细胞与含有葡萄糖、腺嘌呤和盐的添加液混合，由此形成红细胞悬液，去除红细胞悬液中的氧气，将红细胞悬液冷却至4℃。
冷却红细胞最好不要再暴露于氧气。
本发明的利益和优点包括，在冷藏的RBC中维持其ATP浓度，减少溶血和膜囊泡积聚，这是由于创造了一个防止血红蛋白降解(氧气去除)的环境，其结果是有效冷藏期可以延长。
                 附图简述
包括在本说明书并形成本说明书一部分的附图，说明本发明的实施例，与附图说明一起解释本发明的原理。
图1表示，经磷酸铵处理过的红细胞4℃保存期间，不同的保存气体作为时间的函数对红细胞膜囊泡累积量的影响。
图2表示，经磷酸铵处理过的红细胞4℃保存期间，不同的保存气体作为时间的函数对溶血速率的影响。
图3表示，在有磷酸铵和无磷酸铵的情况下4℃保存红细胞期间，不同的保存气体作为时间的函数对细胞ATP浓度的影响。
图4表示，相对于未处理的对照组样本，红细胞4℃保存3.5周时，去除氧气对红细胞总ATP、溶血程度、囊泡积聚量的影响。
                 详细说明
简单的讲，本发明包括通过保存时去除保存红细胞中的氧气，防止保存红细胞再次暴露于氧气中，改进在4℃保存较长时间的输血红细胞的体内存活特性。体外溶血、囊泡形成和ATP浓度的一起诊断，提供了一个体内存活的有用指标。而且，某些样本中保存红细胞内的三磷酸腺苷浓度因为添加了磷酸铵而得到了提高。
我们研究了离心后保存于标准聚氯乙烯(PVC)血袋内血红细胞的氧气去除和各种添加液的作用，该血袋具有二(2-乙基己基)邻苯二甲酸盐(DEHP)增塑剂，含有柠檬酸盐、磷酸盐、氯化钠、腺嘌呤和葡萄糖(抗凝剂/缓冲液，AS3)。通过用氩气冲洗血袋7-10次，除去温RBC中的氧气，这将RBC中的氧气浓度分别降至其饱和水平的8-5％。将每单位血液分装(约120ml的等份)到容量为150ml的儿科用DEHP增塑的PVC转移袋中。血液保存于避光的血库冷柜中，通过一无菌隔膜取样口取样。必须在快速吹扫后进行快速冷却，以防止RBC中形成乳酸。另外，应注意氧气也可在RBC冷却后除去。但是，由于一旦冷却，就不能防止RBC的氧化作用，并且与4℃时相比较，37℃或21℃时氧气去除更快，所以，优选方法是先除氧后冷却。根据Hogman等人supra的报道，O2可以透过常规PVC血液保存袋。一单位的封装红细胞需要常规保存大约4周才能完全氧合。为了评价更换保存气体的长期效果，将转移袋保存于充有诸如氩气的惰性气体的无氧小室中。将无氧小室暴露于部分真空中，然后补充适当的气体，如此2-3次，进一步加强血袋的气体交换。此外，将具有钯催化剂的氢气发生***置于收藏保存血液的无氧小室中，可以继续除去出现的微量O2。
本发明人对Greenwalt等人supra描述并称为EAS2的磷酸铵添加液对提高ATP的影响作了进一步的研究。如上所述，这一添加剂使得ATP浓度逐步升高，在延长的4℃保存期内，红细胞保持ATP逐步升高。
现在详细参考本发明的优选实施方案，其实施例在附图中进行说明。现在转到图1，显示经磷酸铵处理过的红细胞4℃保存期间，不同的保存气体作为时间的函数对膜囊泡累积量的影响。图中给出了以囊泡形式获得的蛋白质的量，这些蛋白质是在用AS3(空心圆)、EAS2(X)和EAS2加氩气(+)保存期间红细胞释放的。数据点代表的是五个个体的平均值。加入NH4Cl形式的10mM NH4 +和Na2HPO4形式的20mM PO4 -3(EAS2)，在整个保存过程中略微提高ATP浓度并减少囊泡形成。可以看出，用氩气去除O2或利用O2清除剂(H2/Pd)进一步减少囊泡的形成。在有(NH4)3PO4存在时，用氩气除去氧气还降低溶血速率和进一步提高ATP浓度，达到的ATP浓度比在不去除O2时加入(NH4)3PO4达到的ATP浓度还要高。
图2表示，经磷酸铵处理过的红细胞4℃保存期间，不同的保存气体作为时间的函数对溶血速率的影响。图中给出了用AS3(空心圆)、EAS2(X)和EAS2加Ar(+)的溶血百分比。数据点代表10个(AS3)或5个(其它)个体的平均值。所有样本的溶血程度都比库存血的预期值要稍高，这是因为冷藏RBC因体外诊断而反复取样之前需要倒转、混匀。可再次明显看出，当RBC悬液的氧气除去后，其溶血百分比提高。
图3表示，在有磷酸铵和无磷酸铵的情况下4℃保存红细胞期间，不同的保存气体作为时间的函数对ATP浓度的影响。总细胞ATP以μrnol ATP/g Hb表示。符号为：AS3对照(空心圆)、EAS2(X)，EAS2加氩气(+)。数据点代表5-10个个体的平均值。在考察了11周后，去除氧气的样本比添加了(NH4)3PO4的样本保持更高浓度的ATP。
对本发明进行了基本的描述后，下面的实施例给出了其方法的细节。
                 实施例
图4表示，相对于未处理的对照样本，红细胞4℃保存3.5周时，去除氧气对红细胞总ATP、溶血程度、囊泡积聚量的影响。将6单位封装的红细胞在商用血库中，在Adsol或AS3保存液中保存3-4天。在22℃，将大致等体积的超纯氩气导入含有约300ml细胞的血袋中，并轻轻地水平搅动(40rpm)。在4小时内进行7次气体交换，这时测得的血红蛋白的氧气饱和度为约5％。然后将细胞置于150ml的转移袋中，把输血袋放入气密容器中，气密容器内含有90％的氩气、10％的氢气以及一种钯催化剂。该血保存于4℃。很容易观察到，仅仅通过去除氧气，所有的体内存活指标均得到了提高。由于所用的血液样本已在有氧情况下冷藏了2-4天，所以未能充分地如实报道结果。
本发明前面的描述是为了进行说明和描述，不是详尽无遗的说明或将本发明局限于公开的精确形式，很明显，依照前面所述，可以进行许多改良或变化。
实施例的选取和描述是为了更好地解释本发明的原理及其实际应用，以便本领域技术人员在各种实施方案中更好的利用本发明，并且在适应特殊用途时作出各种改进。本发明的范围将由所附的权利要求书定义。

Claims (14)

1.一个保存红细胞的方法，它包括以下步骤：
a.将包含待保存红细胞的全血样本与一种抗凝血剂溶液混合，由此形成红细胞第一悬液；
b.从第一悬液的液体部分中浓缩红细胞，由此形成大量的封装红细胞；
c.将由此产生的封装红细胞与一种含有葡萄糖、腺嘌呤和盐的添加液混合，由此形成红细胞第二悬液；
d.由此第二悬液中去除氧气；和
e.将红细胞第二悬液冷却至4℃。
2.权利要求1所描述的保存红细胞的方法，其中所述的从红细胞第二悬液中除去氧化的步骤包括用一种惰性气体反复中洗红细胞第二悬液。
3.权利要求1所描述的保存红细胞的方法，它还包括以下步骤：将红细胞第二悬液保存于位于无氧环境中的透氧包入物中。
4.权利要求1所描述的保存红细胞的方法，它还包括以下步骤：将红细胞第二悬液保存于位于含氧气清除物质的无氧环境中的透氧包入物中。
5.权利要求1所描述的保存红细胞的方法，还包括以下步骤：将磷酸铵加入第二悬液中，以提高红细胞中的三磷酸腺苷浓度。
6.权利要求1所描述的保存红细胞的方法，其中所述从第二悬液中除去氧气的步骤在将第二悬液冷却至4℃的所述步骤之前进行。
7.权利要求1所描述的保存红细胞的方法，还包括以下步骤：在红细胞使用之前，用一种含有葡萄糖的盐溶液洗涤这些红细胞，以降低其磷酸铵浓度。
8.一个保存红细胞的方法，包括以下步骤：
a.形成大量的封装红细胞；
b.将封状红细胞与含有葡萄糖、腺嘌呤和盐的添加液混合，由此形成红细胞悬液；
c.去除红细胞悬液中的氧气；和
d.将红细胞悬液冷却至4℃。
9.权利要求8所描述的保存红细胞的方法，其中所述从红细胞悬液中除去氧气的步骤包括用一种惰性气体反复冲洗红细胞悬液。
10.权利要求8所描述的保存红细胞的方法，还包括以下步骤：将红细胞悬液保存于位于无氧环境中的透氧包入物中。
11.权利要求8所描述的保存红细胞的方法，它还包括以下步骤：将红细胞悬液保存于位于含氧气清除物质的无氧环境中的透氧包入物中。
12.权利要求8所描述的保存红细胞的方法，还包括以下步骤：将磷酸铵加入悬液中，以提高红细胞中的三磷酸腺苷浓度。
13.权利要求8所描述的保存红细胞的方法，其中从悬液中除去氧气的所述步骤在将悬液冷却至4℃的所述步骤之前进行。
14.权利要求8所描述的保存红细胞的方法，包括以下步骤：在红细胞使用之前，用一种含有葡萄糖的盐溶液洗涤这些红细胞，以降低其磷酸铵浓度。
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