CN1188529C - 一种基因芯片的纳米金标记银染检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种基因芯片的纳米金标记银染检测法涉及的是一种基因芯片检测方法,特别是一种基因芯片的非放射性标记、非荧光标记检测法。该检测法包括以下步骤:抽提了标本中待测目的基因后,将待检测样品的基因标记地高或物素分子,得到地高辛或生物素标记的脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA),用于与基因芯片杂交;杂交后使用纳米金标记的地高辛抗体与地高辛结合,或使用纳米金标记亲合素与生物素结合;使用银染试剂对杂交后的基因芯片进行染色;用直接用显微镜进行观察、CCD(电荷耦合器件)记录信号或用普通光学扫描仪进行扫描检测可得到相应的杂交结果;并可使用相关软件对结果进行进一步分析。
Description
技术领域
本发明一种基因芯片的纳米金标记银染检测法涉及一种基因芯片检测方法,特别是一种基因芯片的非放射性标记、非荧光标记检测法。
背景技术
DNA芯片(基因芯片)是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是微电子学、物理学、化学、材料科学与生命科学交叉结合的高科技。基因芯片[又称DNA芯片、生物芯片、DNA微探针阵列(microarray)是将大量基因探针,按特定的排列方式固定在固体载体上,它通过与被检测基因的碱基序列进行互补匹配,实现核酸序列的分子识别,是高效地大规模获取相关生物信息的重要手段。基因芯片的相关技术包括:基因芯片的制备技术、样品的处理和标记技术、杂交和检测技术以及基因芯片设计和杂交图像的分析技术等。对于分子生物学、生物医学的研究来说,一个基本的前提是DNA序列的测定和分析。在对传统DNA测序方法和序列分析方法进行改进的过程中,以基因芯片为代表的生物芯片技术应运而生。基因芯片的原型是80年代中期提出的,具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测、多态性分析、基因组文库作图、药物筛选、疾病诊断和预测及杂交测序等,它使得合成、固定高密度的数以万计不同种类的探针分子切实可行,而且借助激光共聚焦显微扫描技术,可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。
基因芯片技术将生命科学研究中所涉及的许多不连续的分析过程,如样品制备、化学反应和分析检测等,通过采用微电子、微机械等工艺集成到芯片中,使之连续化、集成化和微型化。这一技术的成熟和应用将在新世纪里给遗传研究、疾病诊断和治疗、新药发现和环境保护等生命科学相关领域带来一场革命。
目前,常规的分子杂交结果的检测方法主要是荧光标记检测法和同位素标记检测法。膜芯片的分子杂交过程是,将待检测样品固定于滤膜上,与同位素或荧光标记的探针在一定杂交液及温度下进行杂交,一般均需要较长的时间(4-24h)才能完成分子杂交过程,且一般每次只能检测为数不多的一个到几个探针。基因芯片是将已知序列的DNA探针,固化于玻璃等基片的表面,而将待检测样品进行标记并与微集成阵列进行杂交。同位素标记检测法由于操作复杂,有污染,获取数据速度慢等缺点,逐步为荧光标记检测法所替代,而基因芯片检测不仅使得检测过程平行化,可以同时检测成百上千的基因序列;而且由于集成的显微化,使得杂交所需的探针及待检测样品均大为减少,杂交时间明显缩短,一般的分子杂交过程可在30min内完成。但是由于其信号读取设备价格昂贵,从而大大制约了芯片技术在医学临床诊断方面的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前基因芯片检测设备价格昂贵的问题,提供一种不需昂贵检测仪器的而且试剂有效保存时间长的纳米金标记银染基因芯片检测技术。
本发明的技术解决方案是利用最新的银在纳米金颗粒上沉积使杂交信号通过呈现于芯片表面,即在待检测样品的聚合酶链式反应(PCR)过程中,加入地高辛或生物素标记,然后与芯片进行杂交,杂交以后用抗体与纳米金标记的地高辛或生物素标记结合,再加入银染试剂就可得到相应的信号。
具体的说,一种基因芯片的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特点在于包括下列步骤;
1.待测基因的纯化,可使用任意有效的核酸纯化方法如:(1)蛋白酶K消化裂解法、(2)直接裂解法、(3)碱变性法、(4)煮沸法、(5)碘化钠法、(6)异硫氰酸胍法、(7)异硫氰酸胍—二氧化硅法、(8)异硫氰酸胍—玻璃粉法、(9)Chelex-100法、(10)尿素消化裂解法、(11)全血直接扩增法,以获得脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA);详细方法参见《分子克隆实验指南》,科学出版.作者,J.萨姆布鲁克;
2.待测目的脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)进行基因扩增;基因扩增方法是跟据实际需要选用下列方法之一或者它们的组合:(1)聚合酶链式反应(PCR);(2)反转录扩增聚合酶链式(RT-PCR);(3)依赖核酸序列的扩增(Nucleicacid sequence-based amplification,NASBA),(4)芯片原位基因扩增;
3.核酸标记方法选用下列方法之一:(1)掺入法在脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶链式反应或反转录扩增聚合酶链式反应体系中加入了地高辛或生物素标记的核酸单体,(2)末端标记法用地高辛或生物素标记的引物进行脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶链式反应或反转录扩增聚合酶链(3)化学标记法,此方法可以对基因扩增产物或纯化的核酸直接进行标记;
4.脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)在进行聚合酶链式反应或反转录扩增聚合酶链式被扩增并标记后用于与基因芯片杂交;如果选用的是芯片原位扩增,则此步省去。杂交时使用杂交液与基因扩增产物混合,改变基因扩增产物中的离子强度并在其中加入封闭剂;
5.根据核酸标记物不同,杂交后使用纳米金标记的地高辛抗体与地高辛充分结合,或使用纳米金标记亲合素(streptavidin or avidin)与生物素充分结合;
6.利用银染试剂的氧化还原反应中形成的银颗粒聚集在纳米金上,放大杂交信号;
7.使用普通光学扫描仪进行扫描检测,使用基于CCD的显微镜进行检测,可将图象进行数字化,并可对图象进行进一步分析杂交结果。如果仅仅是初步观测,则可用放大镜或普通光学显微镜直接观察。
8.基因扩增的片段是指检测对象包含有(1)保守基因片段、(2)基因突变的片段;或者(1)(2)的组合。
9.基因扩增的片段所使用的引物至少有能够扩增检测对象的保守基因片段或者包含基因突变的片段。
所述的样品的处理过程是:待测样品基因的抽提,针对样品不同,可选择使用蛋白酶K消化裂解法、直接裂解法、碱变性法、煮沸法、碘化钠法、异硫氰酸胍法、异硫氰酸胍—二氧化硅法、异硫氰酸胍—玻璃粉法、Chelex-100法、全血直接扩增法、尿素消化裂解法;可参见《分子克隆实验指南》,科学出版社.作者,J.萨姆布鲁克;可以使用
所述的样品的标记过程,根据不同方法分别说明(1)掺入法在脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶链式反应或反转录扩增聚合酶链式反应体系中加入了地高辛或生物素标记的核酸单体,例如,DIG-16-dUTP、Biotin-11-dUTP;(2)末端标记法在引物合成时用地高辛或生物素标记,脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶链式反应、反转录扩增聚合酶链式或依赖核酸序列的扩增;(3)化学标记法,此方法可以对基因扩增产物或纯化的核酸直接进行标记,例如使用BrightStarTM Psoralen-Biotin Nonisotopic Labeling Kit可标记RNA、DNA、PCR产物和寡核苷酸。
所述的杂交过程是:取适量标记的脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)加入一定量的杂交液混合均匀后,滴于已封闭的基因芯片阵列表面,盖上盖玻片,置于与基因芯片探针Tm值相关的温度下预热的杂交盒中保温20-30分钟,使地高辛或生物素标记的DNA样品与芯片上的特异性探针结合。对于脱氧核糖核酸(DNA)双链,预变性可以提高信噪比。
所述的纳米金标记过程是:在室温下,取出芯片,去除盖玻片,用芯片清洗液中洗涤5分钟,不时摇晃,清洗两次,同时封阻芯片上的蛋白非特异性结合位点,然后取出芯片,用吸水纸吸除多余液体,另取纳米金标记的地高辛抗体或纳米金标记的亲和素溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片静置30分钟左右,使纳米金标记的地高辛抗体或纳米金标记的亲和素与地高辛或生物素充分结合。然后用芯片清洗液中洗涤5分钟。
所述的银染过程是:在基因芯片杂交区域内,滴上银染试剂,并盖上盖玻片静置30分钟左右,用去离子水冲掉芯片表面液体,凉干。
所述的检测过程是:杂交信号借助放大镜或普通光学显微镜肉眼可见灰色或黑色圆点,使用基于CCD的显微镜或用普通光学扫描仪扫描记录并分析结果。
本发明优点与效果
1.本发明的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法可以进行基因检测,具有高的灵敏度和杂交特异性。
2.本发明中的样品标记处理,采用标记方法具有成本低廉,试剂有效期长,操作简便等优点。
3.可使用基于CCD(电荷耦合器件)的普通光学检测设备进行扫描,如使用普通光学扫描仪进行扫描,或使用基于CCD的显微镜进行扫描,在某些情况下,用放大镜或普通光学显微镜进行观察。
4.在一种基因芯片的纳米金标记银染检测法中将地高辛或生物素标记在引物上,具有成本低廉,并能够长时间保存,大大降低了芯片的使用成本。
5.在一种基因芯片的纳米金标记银染检测法中使用信号显示方法是银颗粒,结果易于保存、对比,以及标准化;同时,该方法比使用酶显色法要求的环境条件低,反应时间短等优点。
6.在一种基因芯片的纳米金标记银染检测法中使用电荷耦合器件(CCD)作为信号采集器,甚至可以使用普通扫描仪进行信号采集。从而可以彻底改善目前芯片价格昂贵和芯片检测设备价格昂贵而难以推广的现状。
具体实施方式
实施实例1
乙型肝炎检测基因芯片一种基因芯片的纳米金标记银染检测法过程:
1、自制乙型肝炎检测基因芯片;
2、按试剂盒提供的试剂用SDS煮沸法进行基因抽提;取20μl血清加入裂解液混匀后煮沸10分钟,每分钟12000转离心10分钟;
3、跟据芯片所用基因片断,进行基因抽提及基因扩增。其引物采用芯片试剂盒附带的引物,在每对引物的其中一个引物的5′端标记了生物素,如5′-biotin-CCTGGTTATCGCTGGATG-3′;5′-AGGGTTCAAATGTATACCC-3′。按芯片指定的条件进行PCR温度循环,首先95℃,变性3分钟;再以95℃,30秒,52℃,30秒,72℃,30秒循环30次,最后,72℃延伸4分钟;获得标记了生物素的基因扩增产物;
4、取芯片试剂盒中封闭液对乙型肝炎检测基因芯片进行封闭;
5、取标记了生物素的基因扩增产物在94℃下充分变性后在冰上急冷,取2ul与1ul杂交液混和,滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片,置于40℃预热的杂交盒中保温20-30分钟,使生物素标记的DNA样品与芯片上的特异性探针结合。
6、在室温下,取出芯片,去除盖玻片,浸入芯片试剂盒提供的清洗液中洗涤5分钟,两次,不时晃动溶液,用吸水纸吸除多余液体;再浸入芯片试剂盒提供的平衡液中1分钟;
7、取5μl芯片试剂盒提供纳米金标记亲合素溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片,静置10分钟,使亲合素与生物素充分结合;去除盖玻片,吸除多余液体,然后置于平衡液中洗涤1分钟,取出芯片,用吸水纸吸除多余液体;
8、取芯片试剂盒提供银染试剂10μl滴于芯片表面,盖上盖玻片;
9、用芯片试剂盒提供清洗液清洗芯片表面,吹干,在10倍放大镜下可见杂交信号呈灰色或黑色的圆点。用普通光学扫描仪扫描记录;
10、可运用多种芯片杂交信号分析软件对杂交信号分析。
实施实例2
多种血液传染病检测型基因芯片的纳米金标记银染检测过程:
1、取血液传染病检测型基因芯片,芯片表面固定了多种基因的检测(如HTLV、HIV、HBV、HCV、HPVS、EV、CMV、EBV、HSV)用多聚寡核苷酸,寡核苷酸序列含有检测目的基因保守序列,检测对象有RNA病原体和DNA病原体;
2、按试剂盒提供的试剂及使用方法进行基因抽提;注意,在实验过程中应防止RNA被酶解;使用RNase free器材;
3、取10uL萃取好的RNA至RNase free微量离心管,加入2uL RT primer,70℃下,作用10分钟,使RNA变性,之后置於冰上;
4、取出一支新的RT管,加入38uL DEPC水,置冰上。在数分钟内将RT管内溶液,全部加至步骤3中的RNA管中;在42℃反应45分钟,然后70℃反应10分钟,即完成反录;
5、跟据芯片所用基因片断,按试剂盒提供的引物基因扩增。在每对引物的正向引物的5′端标记了生物素,如5′-biotin-CCTGGTTATCGCTGGATG-3′;5′-AGGGTTCAAATGTATACCC-3′。按芯片指定的条件进行PCR温度循环,首先95℃,变性3分钟;再以95℃,30秒,52℃,30秒,72℃,30秒循环30次,最后,72℃延伸4分钟;获得标记了生物素的基因扩增产物,对于RNA病原体则同时完成了反转录及基因扩增;
6、取芯片试剂盒中封闭液对检测基因芯片进行封闭;
7、取标记了生物素的基因扩增产物在94℃下充分变性后在冰上急冷,取2ul与1ul杂交液混和,滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片,置于40℃预热的杂交盒中保温20-30分钟,使生物素标记的DNA样品与芯片上的特异性探针结合。
8、在室温下,取出芯片,去除盖玻片,浸入芯片试剂盒提供的清洗液中洗涤5分钟,两次,不时晃动溶液,用吸水纸吸除多余液体;再浸入芯片试剂盒提供的平衡液中1分钟;
9、取5μl芯片试剂盒提供纳米金标记亲合素溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片,静置10分钟,使亲合素与生物素充分结合;去除盖玻片,吸除多余液体,然后置于平衡液中洗涤1分钟,取出芯片,用吸水纸吸除多余液体;
10、取芯片试剂盒提供银染试剂10μl滴于芯片表面,盖上盖玻片;
11、用芯片试剂盒提供清洗液清洗芯片表面,吹干,在放大镜下可见杂交信号呈灰色或黑色的圆点。用普通光学扫描仪扫描记录;
12、可运用多种芯片杂交信号分析软件对杂交信号分析。
实施实例3
1、自制乙型肝炎突变检测基因芯片;所有突变位点位于正向引物的3′端的三个碱基中,其中大部分位于3′端第一个碱基位置上,5′端修饰了氨基,这些引物作为探针固定在芯片表面;
2、按试剂盒提供的试剂用SDS煮沸法进行基因抽提;取20μl血清加入裂解液混匀后煮沸10分钟,每分钟12000转离心10分钟;
3、跟据芯片所用基因片断,进行基因抽提及基因扩增。使用2×HotStar Tag RCRbuffer、50μM dNTPs、20μg/μl BSA、0.1-0.4uM反向引物和3u HotStar TagDNA polymerase(Qiagen);其中反向每个引物的的5′端标记了生物素,如5′-biotin-GGGCATTTGGTGGTCT(G/A)T-3′;5′-biotin-AGGGTTCAAATGTATACCC-3′。按芯片指定的条件进行PCR温度循环,首先95℃,变性4分钟;再以95℃,40秒,52℃,40秒,72℃,40秒循环35次,最后,72℃延伸4分钟;获得标记了生物素的基因扩增产物,并且产物特异地结合在芯片表面;
4、在室温下,取出芯片,去除盖玻片,浸入芯片试剂盒提供的清洗液中洗涤5分钟,两次,不时晃动溶液,用吸水纸吸除多余液体;再浸入芯片试剂盒提供的平衡液中1分钟;
5、取5μl芯片试剂盒提供纳米金标记亲合素溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片,静置10分钟,使亲合素与生物素充分结合;去除盖玻片,吸除多余液体,然后置于平衡液中洗涤1分钟,取出芯片,用吸水纸吸除多余液体;
6、取芯片试剂盒提供银染试剂10μl滴于芯片表面,盖上盖玻片;
7、用芯片试剂盒提供清洗液清洗芯片表面,吹干,在10倍放大镜下可见杂交信号呈灰色或黑色的圆点。用普通光学扫描仪扫描记录;
8、可运用多种芯片杂交信号分析软件对杂交信号分析。
Claims (8)
1、一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于包括:
a)针对不同标本中待测目的脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)抽提方法使用下列方法之一:(1)蛋白酶K消化裂解法、(2)直接裂解法、(3)碱变性法、(4)煮沸法、(5)碘化钠法、(6)异硫氰酸胍法、(7)异硫氰酸胍-二氧化硅法、(8)异硫氰酸胍-玻璃粉法、(9)Chelex-100法、(10)尿素消化裂解法、(11)全血直接扩增法,以获得脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA);
b)目的基因标记地高辛或生物素,其方法可使用化学标记法或者基因扩增法;
c)脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)在地高辛或生物素标记后用于与基因芯片杂交;
d)杂交后使用纳米金标记的地高辛抗体与地高辛结合,或使用纳米金标记亲合素与生物素结合;
e)使用银染试剂对杂交后的基因芯片进行染色;
f)使用普通光学扫描仪进行扫描检测或使用基于CCD的显微镜进行检测。
2、根据权利要求1所述的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于:基因扩增方法是指检测对象的基因片断通过扩增方法使之数量增加,扩增方法可使用下列方法之一或其组合使用,一是聚合酶链式反应;二是反转录扩增聚合酶链式;三是依赖核酸序列的扩增,四是芯片原位基因扩增。
3、根据权利要求1所述的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于:基因扩增法标记地高辛或生物素样品的标记过程是以下方法之一,一是在脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶链式反应或反转录扩增聚合酶链式反应体系中加入了地高辛或生物素标记的核酸单体;二是用地高辛或生物素标记的引物进行脱氧核糖核酸(DNA)或核酸(RNA)的聚合酶链式反应或反转录扩增聚合酶链式;三是在基因扩增后直接进行化学标记。
4、根据权利要求1所述的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于:杂交时使用杂交液与基因扩增产物混合,改变基因扩增产物中的离子强度并在其中加入封闭剂。
5、根据权利要求1所述的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于:使用芯片原位基因扩增法同时对基因进行扩增、标记和杂交。
6、根据权利要求1所述的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于:杂交后使用纳米金标记的地高辛抗体与地高辛充分结合,或使用纳米金标记亲合素与生物素充分结合。
7、根据权利要求1或2所述的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于:基因扩增的片段是指检测对象包含有(1)保守基因片段、(2)基因突变的片段;或者(1)(2)的组合。
8、根据权利要求1或2所述的一种基因芯片的纳米金标记银染检测法,其特征在于:基因扩增的片段所使用的引物至少有能够扩增检测对象的保守基因片段或者包含基因突变的片段。
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