CN1186497A - 人半胱氨酸蛋白酶抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种人类CysE多肽和编码这种多肽的DNA(RNA),以及通过重组技术生产这种多肽的方法。本文也公开了利用这种多肽治疗骨质疏松、肿瘤转移、微生物感染、病毒感染、脓毒性休克、炎症、视网膜刺激、骨溃疡、恶病质和肌肉消瘦的方法。本文还公开了用于检测编码序列中的突变和得自宿主的样品中的多肽浓度的改变的诊断方法。
Description
本发明涉及最新鉴别的多核苷酸、由这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途以及这些多核苷酸和多肽的生产方法。更具体地说,本发明的多肽已被推定性地鉴定为人半胱氨酸蛋白酶抑制剂E,下文有时称为“CysE”。本发明也涉及抑制这些多肽的作用的方法。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族包括一组半胱氨酸蛋白酶抑制因子,它们在人类组织和体液中广泛地分布,并且与半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶B,H,L和S)形成紧密的和可逆的复合物。半胱氨酸蛋白酶抑制剂很可能涉及这些蛋白酶所参与的正常或者是病理过程的调节。这样,半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以影响蛋白质和肽类的细胞内和细胞外分解代谢(Barret,A.J.和Kirchke,H,酶学方法,80:535-561(1981)),调节原激素的蛋白水解加工(Orlowski,M.,分子细胞生物化学,52:49-74(1983))和原酶(Taugner,R.等,组织化学,83:103-108(1985)),保护正常组织免受恶性细胞(Sloane,B.F.,Semin.CancerBiol,,1:137-152(1990))或微生物(Bjorck,L.等,自然,337:385-386(1989)和Bjorck,L.等,J.Virol.,64:941-943(1990))的侵入和在风湿性关节炎(Mort,J.S.等,Arthritis Rheum.,27:509-515(1984))和化脓性支气管扩张(Buttle,D.J.等,Scand.J.Clin.Lab.Invest.,50:509-516(1990))中调节局部炎症的方法。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族细分成I,II和III家族(分别也称为stefin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和激肽原家族),各自具有在结构构成和生物学分布上不同于其它家族的成员(Barret,A.J.等,生物化学杂志,236:312(1986))。I族半胱氨酸蛋白酶抑制剂A和B是由没有二硫桥的大约100个氨基酸残基的单一多肽链组成的小蛋白质。II族半胱氨酸蛋白酶抑制剂由具有两个链内二硫键的大约120个氨基酸残基的多肽链组成。最后,III族半胱氨酸蛋白酶抑制剂(激肽原)显示出以存在三个类II族半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域为特征的高度的结构复杂性,各自具有两个在同源于II族半胱氨酸蛋白酶抑制剂的那些位点上的二硫桥(Muller-gsterl,W.等,Transbiochem.Sci.,11:336-339(1986)).I和II族半胱氨酸蛋白酶抑制剂主要存在于胞内和分泌液中(Abrahamson,M.等,生物化学杂志,261:11282-11289(1986)),而激肽原在血浆中具有高浓度(Adam,A.等,Clin.Chem.,31:423-426(1985))。
至少一种类型的II族半胱氨酸蛋白酶抑制剂(命名为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)似乎在所有组织中表达(Abrahamson,M.等,生物化学杂志,268:287-294(1990))。相反,S-型半胱氨酸蛋白酶抑制剂主要在唾液中发现(Abrahamson,M.,等,生物化学杂志,261:11282-11289(1986))。半胱氨酸蛋白酶抑制剂和衍生物肽类具有抗细菌和抗病毒活性(Bjorck等(1989,1990)),与它们存在于直接暴露于环境中的分泌浴上皮表面中相一致。半胱氨酸蛋白酶抑制剂也可以调节免疫反应,这可以通过抑制从巨噬细胞释放的半胱氨酸蛋白酶直接发生(Bieth,J.,半胱氨酸蛋白酶和它们的抑制因子,V.Turk,ed.(Waiter De Gruyter &Company,纽约)pp.693-703(1986)),或者是通过抑制细胞的趋药性反应和吞噬作用相关的呼吸脉冲间接发生(Leung-Tack等,生物化学,371:255-258(1990))。这些信息说明II型半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以在上皮发挥各种保护功能。人II型半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族由至少七个成员组成。
疾病遗传性半胱氨酸蛋白酶抑制剂C淀粉样蛋白血管病(HCCAA)与编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂C之基因中的谷氨酸→亮氨酸的突变有关。它导致由这种突变体半胱氨酸蛋白酶抑制剂C组成的淀粉样蛋白纤丝在脑部动脉上沉积,后者似乎导致致命的出血(Ghiso,J.等,PNAS.USA,83:2974-2978(1986))。
作为与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C氨基酸序列同源性的结果,本发明的多肽已经被推定性地鉴定为CysE。作为氨基酸序列同源性的结果,进行了这种鉴定。
按照本发明的一个方面,本发明提供了新的成熟多肽以及其生物学活性的并且在诊断上或治疗上有用的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是人类来源的。
按照本发明的另一个方面,本发明提供了编码本发明的多肽的分离的核酸分子,包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及其类似物和其生物学活性的并且在诊断上或治疗上有用的片段和衍生物。
按照本发明的另一个方面,本发明提供了通过重组技术生产这种多肽的方法,该方法包括在促进所说蛋白质表达的条件下培养含有编码本发明多肽的人核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞,并且随后回收所说的蛋白质。
按照本发明的另一个方面,本发明提供了将这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法,所述治疗目的例如,抑制组织蛋白酶和预防骨质疏松、肿瘤转移、病毒复制、炎症、化脓性支气管扩张、保护视网膜、预防脑白质病、降低骨溃疡、治疗***反应、治疗恶病质和肌肉消瘦以及预防淀粉样变性和作为抗微生物剂。
按照本发明的另一个方面,本发明也提供了核酸探针,这种核酸探针包含长度足以特异性地与编码本发明的多肽的核酸序列杂交的核酸分子。
按照本发明的另一个方面,本发明提供了抗这些多肽的抗体。
按照本发明的另一个方面,本发明提供了检测与编码本发明的多肽之核酸序列中的突变有关的疾病和疾病的易感性的诊断测定方法。
按照本发明的另一个方面,本发明提供了将这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸体外用于与科学研究、DNA合成及DNA载体的制备有关目的的方法。
从本文的教导中,本领域技术人员会清楚本发明的这些和其它方面。
下列附图用来说明本发明的实施方案,而无意于用它们来限制本发明权利要求所包括的范围。
图1描述了本发明的多肽的cDNA序列和相应的推导的氨基酸序列。使用了氨基酸标准单字母缩写。用373自动DNA测序仪(AppliedBiosystem公司)进行测序。
图2说明本发明的多肽(上排)与人类半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(下排)之间的氨基酸同源性。
按照本发明的一个方面,本发明提供了一种分离的核酸(多核苷酸),这种核酸编码具有图1(SEQ ID NO:2)的推导的氨基酸序列的成熟多肽或由1995年3月20日以保藏号ATCC 97103保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
本发明的多核苷酸在来源于原代培养羊膜细胞的cDNA文库中发现。其在结构上和半胱氨酸蛋白酶抑制剂II超家族相关。其包含一个编码148个氨基酸残基之蛋白质的开放读框,其中大约前28个氨基酸残基是推定的前导序列(这样所说成熟蛋白质包含120个氨基酸)。所述蛋白质和人类半胱氨酸蛋白酶抑制剂C显示出最高程度的同源性,在一段147个氨基酸的序列上具有33.566%的相同性和53.846%的相似性。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式,其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。这种DNA可以是双链或单链,如果是单链,其可以是编码链或非编码(反义)链。这种编码成熟多肽的编码序列可以和图1(SEQ ID NO:1)所示的编码序列或保藏的克隆的编码序列相同;由于遗传密码的丰余性或简并性,这种编码序列也可以是一种不同的编码序列,其可以和图1的DNA(SEQ ID NO:1)或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1(SEQ ID NO:2)的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括:仅仅是编码成熟多肽的编码序列;编码成熟多肽的编码序列和附加的编码序列,如前导或分泌序列或蛋白原序列;编码成熟多肽的编码序列(和可有可无的附加的编码序列)和非编码序列,如内含子或成熟多肽编码序列的5′和/或3′非编码序列。
这样,“编码多肽的多核苷酸”这一术语包括只含有多肽编码序列的多核苷酸以及还含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上文描述的多核苷酸变体,这种变体编码具有图1(SFQ ID NO:2)的推定的氨基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这种多核苷酸变体可以是天然产生的多核苷酸等位变体或是非天然产生的多核苷酸变体。
这样,本发明包括编码如图1(SEQ ID NO:2)所示的相同成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸,以及编码如图1(SEQ ID NO:2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽的片段、衍生物和类似物的多核苷酸变体。这些核苷酸变体包括缺失变体、取代变体、添加或***变体。
正如上文所表明的,所述多核苷酸可以具有一种编码序列,该序列是图1(SEQ ID NO:1)中所示的编码序列或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体。本领域已知等位变体是多核苷酸序列的另一种形式,其可以具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加,而实质上不改变所编码的多肽的功能。
本发明也包括这样的多核苷酸,其中所说的成熟多肽的编码序列可以在相同的阅读框架中与帮助从宿主细胞表达和分泌多肽的多核苷酸序列融合,所述的多核苷酸序列如作为分泌序列在控制多肽从细胞转运中起作用的前导序列。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein),并且可以具有由宿主细胞切割形成成熟形式的多肽的前导序列。这种多核苷酸也编码蛋白原(proprotein),这种蛋白原是添加有附加的5’氨基酸残基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原,是一种无活性的蛋白形式。一旦切除原序列,留下的就是有活性的成熟蛋白。
这样,本发明的多核苷酸例如可以编码一种成熟蛋白或编码具有原序列的蛋白质或编码既有原序列又有前序列(presequence)(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列,所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸。在细菌宿主的情况下,所述的标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记,其提供来纯化融合进标记的成熟多肽,或例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时,标记序列可以是血细胞凝集素(HA)标记。所说的HA标记相应于来源于流感血细胞凝集素蛋白质的一种表位(Wilson,I.等,细胞,37:767(1984))。
术语“基因”是指和产生多肽链有关的DNA区段;其包括在编码区前面的和后面的区域(前导区和尾随序列)以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
全长CysE基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针,用来分离全长CysE基因和与CysE基因有高度的序列类似性或类似生物活性的其它基因。这种类型的探针优选地是具有至少30个碱基,并且可以含有,例如50个或更多的碱基。所说的探针也可以用于鉴别相应于全长转录物的cDNA克隆和含有包括调节和启动子区、外显子和内含子的完整CysE基因的基因组克隆。筛选的实例包括通过利用已知DNA序列合成寡核苷酸探针来分离CysE基因的编码区。具有互补于本发明的基因序列之序列的标记寡核苷酸可以用来筛选人类cDNA、基因组DNA或mRNA文库,以确定探针和哪些文库成员杂交。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(条件是两个序列之间具有至少70%,优选地具有至少90%,更优选地具有至少95%的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的,术语“严格条件”指仅在序列间具有至少95%,优选地具有至少97%的同源性时杂交才可以发生。在一个优选的实施方案中,与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码这样一种多肽,其实质上保持与由图1(SEQ ID NO:1)的cDNA或保藏的cDNA(s)编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
此外,所述多核苷酸可以具有至少20个碱基,优选地是至少30个碱基,更优选地是至少50个碱基,其与本发明的多核苷酸杂交,并且具有如上文所述的相同性,可以保留或不保留活性。例如,这种多核苷酸可以用作SEQ ID NO:1多核苷酸的探针,例如用于回收多核苷酸或作为诊断探针或作为PCR引物。
这样,本发明涉及与编码图1(SEQ ID NO:2)多肽之多核苷酸具有至少70%相同性,优选地至少90%相同性并且更优选地至少95%相同性的多核苷酸及其片段(这种片段具有至少30个碱基,优选地至少50个碱基)和这些多核苷酸编码的多肽。
本文所提及的保藏物将按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定保持。这些保持物仅仅是为了给本领域技术人员提供方便,并不是35 U.S.C 112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列本文一并参考,并且用于解决本文序列描述上的任何矛盾。对保藏材料的任何制造、使用或销售需要经过许可,在此未给予任何这样的许可。
本发明还涉及具有图1(SEQ ID NO:2)的推导的氨基酸序列的CysE多肽或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的多肽,以及这种多肽的片段、类似物和衍生物。
术语“片段”、“衍生物”和“类似物”,当有关图1(SEQ ID NO:2)的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时,指基本上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽。这样,类似物包括蛋白原,这种类似物可以由蛋白原部分切除进而产生活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽,天然多肽或合成多肽,优选地是重组多肽。
所说的图1(SEQ ID NO:2)的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是:(i)这样一种,其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代(优选地是保守氨基酸残基取代)并且取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码子编码的氨基酸残基;或(ii)这样一种,其中一个或多个氨基酸残基包含取代基;或(iii)这样一种,其中成熟多肽与另一种化合物融合,所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇);或(iv)这样一种,其中附加氨基酸与成熟多肽融合,例如前导或分泌序列或用来纯化成熟多肽的序列或原序列。通过本文的阐述,可以认为这样的片段、衍生物以及类似物在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明优选地是提供分离形式的多肽和多核苷酸,并且优选地是将所述多肽和多核苷酸纯化成同质性的。
术语“分离的”意指所述的物质脱离了其原始环境(例如,天然环境,如果其是天然产生的)。例如,一种存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的,但是与天然***中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分,和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分,其仍然是分离的,这是因为这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。
本发明的多肽包括图1(SEQ ID NO:2)的多肽(特别是成熟多肽)以及和图1(SEQ ID NO:2)的多肽具有至少70%的相似性(最好是70%的相同性),更优选地是90%的相似性(最好是90%的相同性),最优选地是95%的相似性(最好是95%相同性)的多肽,也包括这些多肽的部分,这种多肽的部分通常包含至少30个氨基酸,并且优选地是至少50个氨基酸。
如本领域所熟知的,两个多肽之间的“相似性”是通过比较一个多肽和另一个多肽序列的氨基酸序列和其保守氨基酸取代来确定的。
本发明多肽的片段或部分通过肽合成可以用于生产相应的全长多肽;因此,此片段可以用作生产全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术生产本发明的多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体经基因工程(转导、转化或转染)产生的,所说的载体可以是克隆载体或表达载体。该载体可以是例如,质粒、病毒颗粒和噬菌体等形式。工程宿主细胞可以在改良的适于激活启动子、选择转化体或扩增CysE基因的常规营养培养基中培养。培养条件,例如温度和pH值等,是以前用于表达选择的宿主细胞的那些,对普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可以用来经重组技术生产多肽。这样,例如,多核苷酸可以包含在各种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列,例如SV40衍生物;细菌质粒;噬菌体DNA;杆状病毒;酵母质粒;从质粒和噬菌体DNA组合衍生的载体、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒、和假狂犬病病毒)。然而,任何其它载体也可以使用,只要其在宿主中可复制和稳定。
可以用多种方法将合适的DNA序列***到载体中。一般来说,用本领域已知的方法将DNA序列***到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。
在表达载体中的所说的DNA序列是可操作地连接到适当的指导mRNA合成表达控制序列(启动子)上的。这样的启动子的代表性例子可以提到的是:LTR或SV 40启动子,大肠杆菌的lac或trp、噬菌体λPL启动子,和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。所说的表达载体也包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。该载体也可以包含供扩增表达的合适的序列。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征,例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性,或例如大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。
包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体可以用于转化适当的宿主,以使其能够表达蛋白质。
作为合适宿主的代表性例子,这里可以提到的是:细菌细胞,如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌;真菌细胞,如酵母;昆虫细胞,如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9;动物细胞,如CHO、COS或Bowes黑素瘤;腺病毒;植物细胞等。通过本文的阐述,对适当的宿主的选择在本领域技术人员的知识范围之内。
更具体地说,本发明也包括重组构建体,该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体,如质粒或病毒的载体,该载体已正向或反向***了本发明的序列。在这一实施方案的更为理想的情况下,构建体还包含可操作连接到所述序列上的调节序列,包括,例如,启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的,并且是通过商业途径可获得的。以举例的方式给出下列载体:细菌:pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca);真核:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而,任何其它质粒或载体都可以使用,只要它们在宿主中可复制和稳定。
可以用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。对适当的载体与启动子的选择在本领域普通技术人员的水平之内。
在另一个实施方案中,本发明涉及包含以上所述构建体的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞),或低等真核细胞(如酵母细胞),或宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。可以由磷酸钙转染、DHAE-葡聚糖介导的转染,或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,分子生物学中的基本方法(1986))。
宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式生产由重组序列编码的基因产物。此外,本发明的多肽可以由常规肽合成器合成产生。
成熟蛋白质可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当的启动子控制下表达。采用来源于本发明的DNA构建体的RNA,无细胞翻译***也可以用来产生这种蛋白质。Sambrook等,分子克隆:实验室手册,再版,冷泉港,N.Y.,(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。
高等真核生物编码本发明的多肽的DNA的转录被***到载体中的增强子序列增强。增强子是DNA的顺式作用元件,通常约10至300bp,作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点晚期一侧100至270bp上的SV40增强子、细胞肥大病毒早期启动子增强子、复制起点晚期一侧上的多形瘤增强子以及腺病毒增强子。
一般来说,重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如,大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表达基因的指导下游结构序列转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列以合适的方式(phase)与翻译起始和终止序列装配,优选地,与能够指导翻译的蛋白质分泌进周质空间或细胞外培养基的前导序列装配。异源序列可以也可以不编码融合蛋白,这种蛋白质包括赋予所需特征的N-末端鉴别肽,所需特征例如,表达的重组产物稳定或简化纯化步骤。
通过将带有合适的翻译起始和终止信号的编码所需蛋白质的结构DNA序列***具有功能性启动子的可操作读框来构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点,以在宿主来保证保持载体和需要时提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种(当然其它的也可以选择来使用)。
作为一个代表性的但不是限制性的例子,用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括,例如,pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司,Uppsala,瑞典)和GEM1(Promega Biotec,Madison,WI,美国)。这些pBR322“骨架”片段与适当的启动子和待表达的结构序列组合。
在合适的宿主菌株转化和合适的宿主菌株生长至适当的细胞密度之后,用合适的方法(例如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞培养另外一段时间。
典型地经离心收获细胞,经物理或化学方法破碎细胞,保持所形成的粗产物用于进一步的纯化。
可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞,所述方法包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂,这些方法是本领域技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞培养***也可以用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达***的例子包括由Gluzman(细胞,23:175(1981))描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系,例如,C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、适合的启动子和增强子,也可以包含任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。
本发明的多肽可以用多种方法从重组细胞培养物回收和纯化,所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽取、阴离子或阳离子交换层析、磷纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和性层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后,可以使用高效液相色谱(HPLC)作为最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或化学合成方法的产物,或经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组生产方法中使用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
本发明的CysE多肽可以用于抑制人类组织蛋白酶和所形成的与这些组织蛋白酶的作用有关的病理状态。例如,CysE可以用于治疗骨质疏松、贝切特氏病、血钙过多、骨软化(osteomalicia)、***性皮肤病,***性鼻炎和***性紫癜。
人们也认为组织蛋白酶在肿瘤的转移中具有至关重要的作用;因此,CysE可以用于预防肿瘤转移。
CysE多肽可以用作抗微生物剂,用于阻止某些微生物病原体(例如,链球菌)的生长,并通过减少与龋齿有关的酸的产生减少牙龋。
CysE多肽也可以用作抗病毒剂,用于治疗由病毒引起的感染,例如,用于阻止单纯疱疹病毒(HSV)的复制。CysE多肽也用于保护视网膜使其不受半胱氨酸蛋白酶的攻击。
本发明的CysE多肽也可以用于通过阻止半胱氨酸蛋白酶的作用治疗恶病质和肌肉消瘦。
CysE多肽也可以用于改善炎症(例如与风湿性关节炎相关的炎症)和用于治疗脓毒性休克。CysE多肽也用于治疗化脓性支气管扩张。
本发明的多核苷酸和多肽可以用作人类疾病诊断的治疗研究试剂和诊断材料。
本发明提供了鉴别半胱氨酸蛋白酶抑制剂E多肽受体的方法。可以用本领域技术人员已知的许多方法鉴别编码所说受体的基因,所述方法如配体淘选和FACS分选(Coligan等,免疫学当代方案,1(2),第5章,(1991))。优选地,使用表达克隆,其中从对半胱氨酸蛋白酶抑制剂E多肽反应性的细胞制备聚腺苷酸化RNA,将从这一RNA产生的cDNA文库分成集合体,用于转染COS细胞或对半胱氨酸蛋白酶抑制剂E多肽非反应性的其它细胞。使生长在载玻片上的标记后的转染细胞暴露在半胱氨酸蛋白酶抑制剂E多肽下,半胱氨酸蛋白酶抑制剂E多肽可以由多种方法(包括碘化或引入位点特异性蛋白质激酶的识别位点)标记。在固定和温育后,将载玻片进行放射自显影分析。鉴别阳性集合体,制备亚集合体,用交互式亚集合和再筛选方法再转染,最终产生编码推定的受体的单克隆。受体鉴别的另一种方法是可以将标记的多肽与表达受体分子的细胞膜和抽提制剂光亲和连接,经PAGE分离交联材料,并对X-光胶片曝光。可以切下包含配体-受体的标记复合物,分离成肽片段进行蛋白质微测序。从微测序获得的氨基酸序列用于设计一套筛选cDNA文库的简并寡核苷酸探针,以鉴别编码推定的受体的基因。
本发明提供了筛选化合物以鉴别结合到半胱氨酸蛋白酶抑制剂E受体上并由此诱导第二信使***反应的化合物的方法。例如将哺乳动物细胞或者表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂E受体的膜制剂在所述化合物存在下与本发明的标记的多肽一起培养。测定在所说化合物和所说受体相互作用后的已知第二信使***的反应,并与由半胱氨酸蛋白酶抑制剂E引发的第二信使反应比较。这种第二信使***包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或者是磷酸肌醇水解。
本发明的多肽和激动剂化合物可以就抑制半胱氨酸蛋白酶活性的能力进行试验,该试验包括通过用10μM Z-Phe-Arg-NHMec为底物,在100M磷酸钠缓冲液中的连续的速率测定(Nicklin,M.J.H.,和Barrett,A.J.,生物化学杂志,223:245-258(1984),测定半胱氨酸蛋白酶抑制剂E复合物与木瓜蛋白酶和人类组织蛋白酶B解离的平衡常数(Ki)。缓冲液包含1mM二硫苏糖醇和2mM乙二胺四乙酸,用木瓜蛋白酶进行测定时pH调节至6.5,用组织蛋白酶B进行测定时pH调节至6.0。组织蛋白酶B在使用之前于室温下在测定缓冲液中事先温育20分钟。在测定中的酶浓度是0.05-0.25nM。在组织蛋白酶B测定中所试的最高半胱氨酸蛋白酶抑制剂E浓度是100nM。在木瓜蛋白酶测定中,给出可见抑制(即在添加抑制剂之后1小时内形成新的稳定状态的速率)的抑制剂浓度是20-50nM。于37℃分别在360和460毫微米的激发和发射波长下在Perkin-Elmer Cetus LS50荧光计中监测底物的水解。经以下关系式将所测定的Z-Phe-Arg-NHMec水解的Km值用于补偿所获得的抑制剂的底物诱导的解离的表观Ki值:表观Ki=Ki(1+[S]/Km)。
本发明的多肽和激动剂化合物可以与合适的药物载体组合使用。这样的组合物包含治疗有效量的所说多肽或激动剂和药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它们的组合物。其配方应该适宜于施用的方式。
本发明也提供了药物包或试剂盒,它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物的一种或多种成份的容器。这种容器中还可以包括管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构规定形式的告示,这一告示反映了制造、使用或销售人类使用品得到政府机构的同意。此外,本发明的多肽或组合物可以与其它治疗化合物结合使用。
所述药物组合物可以以方便的方式施用,所述方式例如口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说,它们以至少大约10微克/千克体重的量施用,在大多数情况下,它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下,考虑用药途径和病症等因素,剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重。
CysE多肽和多肽形式的激动剂,可以依据本发明通过体内表达这样的多肽来利用,这常被称作“基因治疗”。
这样,例如,可以体外对患者细胞用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)进行基因工程操作,用工程细胞向被治疗的患者提供所说的多肽。这样的方法是本领域众所周知的,并且由本文的描述也显而易见。例如,可以用包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。
同样地,可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作,以便体内表达多肽。例如,将包装(packaging)细胞用含有编码本发明多肽的RNA的反转录病毒质粒载体转导,以便包装细胞能产生含有兴趣基因的传染性病毒颗粒。可以将这种生产细胞施用给患者以便体内将细胞基因工程化并体内表达所说的多肽。经本发明的描述,通过这种方式施用本发明多肽的这些或其它方法对本领域技术人员是清楚的。
可以获得上文描述的反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不限于:莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿猩猩白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒、和***肿瘤病毒。在一个实施方案中,反转录病毒质粒载体来自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述载体包含一个或多个启动子。可以使用的合适的启动子包括但不限于:反转录病毒LTR;SV40启动子;和人类巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller,等,生物技术,Vol.7,No.9,980-990(1989)描述);或其它任何启动子(例如真核细胞启动子,如包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。使用的其它病毒启动子包括但不限于:腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文的描述,合适的启动子的选择在本领域技术人员的知识范围内。
编码本发明多肽的核酸序列在合适的启动子控制下。可以使用的合适的启动子包括但不限于:腺病毒启动子(如腺病毒主要晚期启动子);或异源启动子(如巨细胞病毒(CMV)启动子);呼吸合胞体病毒(RSV)启动子;可诱导的启动子(如MMT启动子、金属硫蛋白启动子);热休克启动子;清蛋白启动子;ApoAI启动子;人类珠蛋白启动子;病毒胸苷激酶启动子(如单纯疱疹胸苷激酶启动子);反转录病毒LTRs(包括上文描述的修饰的反转录病毒LTRs);β-肌动蛋白启动子;和人类生长激素启动子。所说的启动子也可以是控制编码所述多肽之基因的天然启动子。
使用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以便形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于:PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系(Miller,人类基因治疗,Vol.1,pgs.5-14(1990)描述的,其全部内容本文一并参考)。可以通过本领域任何已知的方法用所述载体转导包装细胞。这些方法包括但不限于:电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外,反转录病毒质粒载体可以包囊在脂质体中,或和脂类偶合,然后施用到宿主中。
生产细胞系产生传染性的反转录病毒载体颗粒,这种颗粒包含编码所述多肽的核酸序列。然后可以使用这些反转录病毒载体颗粒体内或体外转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不限于:胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
疾病遗传性半胱氨酸蛋白酶抑制剂C淀粉样蛋白血管病导致致命的出血,并且可能与阿耳茨海默氏病、Down’综合症、帕金森氏病、dimentia相关联并在40岁前导致死亡。
因此,本发明也涉及用CysE基因作为诊断剂。CysE基因的突变形式的检测使得可以诊断由CysE基因中突变引起的类似于HCCAA的疾病。
可以用各种技术在DNA水平上检测具有本发明的人基因突变的个体。可以从患者的细胞(包括但不限于血液,尿,唾液,组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测,或在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等,自然,324:163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同的目的。作为一个例子,可以用与编码CysE的核酸互补的PCR引物鉴别和分析CysE突变。例如,可以通过与正常基因型比较扩增产物大小上的改变来检测缺失或***。点突变可以经扩增的DNA与放射性标记的CysE RNA或放射性标记的CysE反义DNA序列杂交鉴别。经核糖核酸酶A消化,或从熔点温度的不同辨别完美配对的序列和错配双链体。
可通过直接的DNA测序方法揭示参照基因和具有突变的基因间的序列差异。此外,克隆的DNA区段可以用作探针以检测特异性DNA区段。当和PCR结合时,这种方法的敏感性大大提高。例如,将测序引物和双链的PCR产物或由改良的PCR方法产生的单链模板分子一起使用。通过常规的放射标记核苷酸方法或具有荧光标记的自动测序方法确定序列。
基于DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电泳迁移率的改变完成。小的序列缺失和***可以由高分辨率凝胶电泳显示出。不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上的区别,其中不同的DNA片段的迁移按照其特定的熔点或部分解链温度而停滞在凝胶的不同位置(参见,例如,Myers等,科学,230:1242(1985))。
也可以由核酸酶保护测定法揭示特定位置上的序列变化,所述测定法如核糖核酸酶保护和S1保护以及化学裂解方法(例如,Cotton等,PNAS,美国,85:4397-4401(1985))。
这样,可以由以下方法检测特定DNA序列,所述方法例如杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接DNA测序、或使用限制酶(例如,限制片段长度多形性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法。
除很多常规凝胶电泳和DNA测序法之外,也可用原位分析检测突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向位于单个的人染色体上的特定位置并能与之杂交。此外,现在需要鉴定染色体上的特定位点。目前,仅有少数几种以实际的序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可以用于标记染色体的位置。本发明的DNA染色体作图是将这些序列和疾病相关基因相关联的重要的第一步。
简而言之,通过从cDNA制备PCR引物(优选10-25bp)便可以把序列定位到染色体上。采用3’未翻译区域的计算机分析可以快速地选择引物,其中引物不应跨越超过基因组DNA上的一个外显子,否则使得扩增方法复杂化。然后采用这些引物用于PCR筛选含有单个的人染色体的体细胞杂交体。只有那些含有与该引物对应的人基因的杂交体才会生产扩增片段。
体细胞杂交体的PCR作图是将一个特定的DNA定位于特定的染色体上的快速程序。根据本发明采用同样的寡核苷酸引物,用来自于特定染色体或者大基因组克隆集合体的一组片段、按照类似方式可以实现亚定位(sublocalization)。可以类似地用于对染色体作图的其它的作图策略包括原位杂交,用标记的经流式分选的染色体进行预筛选以及通过杂交进行预选,从而构建出染色体特异性的cDNA文库。
cDNA克隆与一个中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来实现一步法准确染色体定位。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。关于该技术的综述参阅Verma等,人类染色体:基本技术手册,Pergamon出版社,纽约(1988)。
一旦一个序列已定位到一个准确的染色***置,则染色体上该序列的物理位置可与遗传图谱数据相关联。这些数据例如可在V.McKusick,人类的孟德尔遗传中找到(可以通过Johns Hopkins大学Welch医学文库联机得到)。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)来鉴定基因与已定位到相同染色体区域上的疾病之间的关系。
接下来需要测定在受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果突变是在一些或所有的受影响个体中观察到的、但是又没有在任何一个正常个体中被观察到的话,那么该突变可能是疾病的病原体。
根据物理作图和遗传作图技术目前的分辨率,一个被准确定位到与疾病有关的染色体区域的cDNA可以是50-500个潜在的病原(causative)基因中的一种(其中假定有1兆碱基的作图分辨率且每20kb为一个基因)。
多肽、其片段或该多肽的其它衍生物或类似物、或者表达上述物质的细胞可以用作生产其抗体的免疫原。这些抗体可以是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明也包括嵌合,单链和人源化的抗体,以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于生产这些抗体和片段。
针对相应于本发明的序列的多肽而产生的抗体可以通过将该多肽直接注射入动物体内或者通过将该多肽向动物给药来得到,其中的动物优选非人类。然后,如此得到的抗体会结合到该多肽上。通过这种方式,即使是仅仅编码该多肽的一个片段的序列也可用于产生能结合整个天然多肽的抗体。然后,该抗体可以用于从表达该多肽的组织中分离这种多肽。
为了制备单克隆抗体,可以采用任何一种通过连续的细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler与Milstein,1975,自然,256:495-497),三体杂交瘤技术,人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,1983,今日免疫学,4:72)以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole,等,1985,单克隆抗体与癌症治疗,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。
可以将用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)进行修改从而生产出针对本发明免疫原性多肽制品的单链抗体。也可以使用转基因小鼠来表达针对本发明免疫原性多肽制品的人源化抗体。
本发明将参照下面的实施例进一步加以说明;但是,应当了解本发明并不局限于这些实施例。除非另作声明的以外,所有的份或量均为重量。
为了利于理解以下的实施例,现叙述一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”通过一个在前的小写p和/或跟随几个大写字母和/或数字加以命名。本文中的起始质粒或者可以通过商业途径得到或在不受限制的基础上公众可得到,或者可以根据已公开的方法从可得到的质粒中构建出来。此外,对于与那些所述等价的质粒是本领域已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用一种仅对DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多种限制性酶可以通过商业途径得到,并且其反应条件、辅因子和其它使用要求对本领域普通技术人员是已知的。为了分析目的,通常把1μg的质粒或DNA片段与溶于约20μl缓冲溶液的约2单位的酶一起使用。为了分离用于质粒构建的DNA片段,通常在一个更大的体积内用20至250单位的酶消化5至50μg的DNA。针对具体的限制性酶而言,合适的缓冲溶液和底物的量是由生产者规定的。通常采用在37℃下约1小时的温育时间,但是该时间可以根据产品供应者的指示而变化。在消化后,反应混合物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离出所需的片段。
采用由Goeddel,D.等,核酸研究,8:4057(1980)所述的8%聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离。
“寡核苷酸”或指一种单链多脱氧核苷酸,或指可以通过化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸,因此如果不在一种激酶存在下以ATP添加一个磷酸时,该寡核苷酸将不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸将连接到未被去磷酸化的片段上。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis,T.,等,出处同上,p.146)。除非另行提供的以外,采用已知的缓冲液和条件、每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)来实现连接。
除非另有说明,按Graham,F.和Van der Eb,A.,病毒学,52:456-457(1973)所述的方法进行转化。
实施例1
细菌表达和纯化可溶性的CysE
利用PCR寡核苷酸引物起始扩增编码CysE的DNA序列(ATCC#97103),所说的引物相当于加工过的CysE蛋白质的5’序列(减去信号肽序列)和CysE基因3’的载体序列。将相应于CysE的附加核苷酸分别加入到5’和3’序列中。所说的5’寡核苷酸引物具有序列5’CGCCCATGGCGGCCGCAGGAG3’(SEQ ID NO:3),此引物含有NcoI限制性内切酶位点,接着由加工过的蛋白质的假定的末端氨基酸开始的CysE编码序列。所说的3’序列5’CGCAAGCTTTCACATCTGCAAAAAGTTGGC3’(SEQ ID NO:4)包含和HindIII位点互补的序列,并接着CysE编码序列。所说的限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-9的限制性内切酶位点(Qiagen,Chatsworth公司,CA,91311)。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)、细菌的复制起点(ori)、IPTG可调节的启动子操纵子(P/O)、核糖体结合位点(RBS)、6-组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用NcoI和HindIII消化pQE-9。将扩增的序列连接到pQE-9中并将其***到带有编码组氨酸标记之序列和RBS的框架中。然后通过Sambrook等(分子克隆:实验手册,冷泉港实验室出版社,(1989))描述的方法,用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen,公司)。M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝,这种质粒表达lacI阻遏物同时赋予卡那霉素抗性(Kanr)。通过转化体在LB平板上的生长能力鉴定转化体,并筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。通过限制分析分离并确认质粒DNA。将含有所需构建体的菌落在补充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜(O/N)生长。将O/N培养物以1∶100至1∶250的比率用于接种大体积培养物。细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(O.D.600)时,加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最终浓度为1mM。IPTG通过失活lacI阻遏物,清除P/O,导致增加基因表达。将细胞再培养3至4小时。通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶解在6M盐酸胍离液剂中。澄清后,在允许含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下,在镍-螯合物柱中通过层析从溶液中纯化溶解的CysE(Hochuli,E.等,层析法杂志411:177-184(1984))。将CysE(85%纯度)以6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱下来,为了复性,调至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mm谷胱甘肽(还原型)、2mM谷胱甘肽(氧化型)。在溶液中温育12小时后,将蛋白质对10mM磷酸钠透析。
实施例2
利用杆状病毒表达***克隆和表达CysE
利用PCR寡核苷酸引物扩增编码全长CysE蛋白质的DNA序列(ATCC#97103),所说引物相应于该基因的5’和3’序列:
5’引物具有序列5′CGCGGATCCGCCATCATGGCGCGTTCGAACCTC3′(SEQ ID NO:5),包含BamHI限制位点(粗体),后接真核细胞翻译起始的有效信号(Kozak,M.,分子生物学杂志,196:947-950(1987))和CysE基因的18个核苷酸(翻译起始密码子“ATG”有下划线)。
3’引物具有序列5′CGCGGATCCTCACATCTGCAAAAAGTTGGCTT3’(SEQ ID NO:6),包含限制性内切酶BamHI的切割位点(粗体)和互补于CysE基因3’-非翻译序列的核苷酸。用市售试剂盒(“Geneclean”’BIO 101公司,La Jolla,Ca.)从1%琼脂糖凝胶分离扩增的序列。然后将所说的片段用核酸内切酶BamHI消化,并在1%琼脂糖凝胶上再次纯化。此片段命名为F2。
载体pA2(由pVL941载体修饰而成,见下文讨论)用于表达CysE蛋白质,这种表达使用杆状病毒表达***(综述参见:Summer,M.D.和Smith,G.E.1987,杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册,得克萨斯农业的试验站公报1555)。这种表达载体包含苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)强多角体蛋白启动子,其后面是限制性核酸内切酶BamHI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒,把大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同样的方向***,其后是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列的两侧是用于细胞介导的共转染的野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列。可以用很多其它的杆状病毒载体代替PA2,所说的载体如GPR1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow,V.A.和Summer,M.D.,病毒学,170:31-39)。
用限制酶BamHI消化所说的质粒,然后用本领域已知的方法利用牛肠磷酸酶使质粒去磷酸化。然后用市售试剂盒(“Geneclean”,BIO 101公司,La Jolla,Ca.)从1%琼脂糖凝胶分离DNA。这种载体DNA命名为V2。
用T4 DNA连接酶连接F2片段和所说的去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌HB101细胞并用酶BamHI鉴别含有所说质粒(pBacCysE)的细菌。通过DNA测序确认所克隆的片段的序列。
用脂转染法(Felgner等,美国科学院学报,84:7413-7417(1987))将5μg质粒pBacCysE和1.0μg市售的线性杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”,Pharmingen,San Diego,CA.)共转染。
将1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg质粒pBacCysE在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司,Gaithersburg,MD)的微滴板的无菌孔中混合。在添加10微升脂转染试剂和90微升Grace’s培养基后,混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中,所说细胞接种在具有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后,从平板除去转染溶液,添加1微升补充有10%胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱,在27℃下连续培养4天。
4天后,收集上清液,用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。一点改变是使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies公司, Gaithersburg),其使得易于分离染蓝的噬斑(“噬斑测定”的详尽的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。
四天后,将系列稀释的病毒添加到细胞中,用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮于含200微升Grace’s培养基的Eppendorf管中。经简短离心除去琼脂,将含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后,收获这些培养皿中的上清液,于4℃贮存。
使Sf9细胞在补充有10%热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-CysE感染细胞。6小时后,除去培养基,用SF900II培养基(减甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司,Gaithersburg)替代。42小时后,添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在经离心收获之前,将细胞进一步培养16小时,标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。
实施例3
在COS细胞中表达重组CysE
质粒CysE HA的表达来源于载体pcDNAI/Amp(Invitrogen),其包含:1)SV 40复制起点,2)氨苄青霉素抗性基因,3)大肠杆菌的复制起点,4)CMV启动子,其后为多接头区、SV 40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整的CysE前体的DNA片段和在读框中融合进3’末端的HA标记克隆到所说的载体的多接头区,因此,重组蛋白质的表达在CMV启动子控制之下。HA标记相应于来自流感血细胞凝集素蛋白质的表位,这一点以前已经描述过(I.Wilson,H.Niman,R.Heighten,A Cherenson,M.Connolly,and R.Lerner,1984,细胞37:767,(1984))。HA和靶细胞蛋白的融合,使得用识别HA表位的抗体很容易检测重组蛋白质。
质粒构建策略描述如下:
用两种引物在克隆的原始的EST上通过PCR方法构建编码CysE的DNA序列(ATCC#97103),所说的引物是:5’引物5’GCGCGGATCCACCATGGCGCGTTCG 3’(SEQ ID NO:7),包含BamHI位点,之后是由起始密码子开始的CysE编码序列的12个核苷酸;3’引物5’GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACATCTGCACAAA 3’(SEQ ID NO:8),包含互补于XbaI位点、翻译终止密码子、HA标记和CysE编码序列的核苷酸(不包括终止密码子)的序列。因此,PCR产物包含BamHI位点,CysE编码序列和接着它的融合进读框的HA标记、与HA标记相邻的翻译终止密码子和XbaI位点。用BamHI和XbaI限制性内切酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp并连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE中(可从Stratagene克隆***,11099 North Torrey Pines Road,LaJolla,CA92037得到)。将转化的培养物接种在氨苄青霉素培养基平板上,并筛选抗性克隆。从转化体中分离质粒DNA,并用限制分析检测是否存在正确的片段。为了表达重组CysE,通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染COS细胞(J.Sambrook,E.Fritsch,T.Maniatis,分子克隆:实验手册,冷泉港实验室出版,(1989))。通过放射标记和免疫沉淀法检测CysE HA蛋白质的表达(E.Harlow,D.Lane,抗体:实验手册,冷泉港实验室出版,(1988))。将细胞在转染后的两天用15S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养物培养基并用去垢剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl,1%NP-40,0.1%SDS,1%NP-40,0.5%DOC,50mM Tris,pH7.5)(Wilson,I.等,Id.37:767(1984))裂解细胞。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养物培养基。在15%SDS-PAGE凝胶上分析蛋白质沉淀。
实施例4
经由基因治疗的表达
成纤维细胞是通过皮肤活组织检查从一个研究对象中得到的。将得到的组织放置在组织培养基上并且分割成小块。将小的组织块放置在组织培养瓶的湿表面上,其中每个瓶中放置约10块组织。将瓶颠倒放置,盖紧并于室温下保留过夜。在室温下过24小时后反转瓶,组织块固定在瓶底部,加入新鲜培养基(例如含有10%FBS,青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基),然后于37℃下温育大约1周。这时加入新鲜培养基,随后每隔几天更换一次培养基。再培养2周后,出现了一单层成纤维细胞。该单层细胞经胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。
用EcoRI和HindIII消化旁侧有Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier,P.T.等,DNA,7:219-25(1988)),接下来用牛肠磷酸酶进行处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分级分离并使用玻璃珠加以纯化。
采用分别与5’和3’末端序列对应的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5’引物包含一个EcoRI位点,3’引物含有一个HindIII位点。在T4DNA连接酶存在下,将等量的Moloney鼠肉瘤病毒的线性化骨架与扩增的EcoRI和HindIII片段加在一起,在适于两个片段连接的条件下保持所得到的混合物。将该连接混合物用于转化细菌HB101,然后为了证实该载体具有***正确的感兴趣的基因而将细菌涂布在含有卡那霉素的琼脂上。
将兼嗜性(amphotropic)pA3 17或GP+am12包装细胞在含有10%小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)的组织培养板上进行培育,直至达到汇合密度。然后将含有基因的MSV载体加入培养基中并用该载体转导包装细胞。包装细胞随即生产含有该基因的具有感染性的病毒颗粒(现在包装细胞被称作生产细胞)。
向转导的生产细胞中加入新鲜的培养基,接下来从一个铺满生产细胞的10cm平板中收集培养基。含有感染性病毒颗粒的培养基经微孔过滤器过滤以除去脱附(detached)的生产细胞,然后利用该培养基去感染成纤维细胞。从成纤维细胞的亚铺满平板中除去培养基并迅速地代之以来自于生产细胞的培养基。
Claims (15)
- 6.权利要求1的多核苷酸,该多核苷酸包括图1所示的1至576位核苷酸的序列。
- 7.权利要求1的多核苷酸,该多核苷酸包括图1所示的14至459位核苷酸的序列。
- 8.一种包含权利要求2的DNA的载体。
- 9.一种用权利要求10的载体经基因工程操作产生的宿主细胞。
- 10.一种生产多肽的方法,该方法包括从权利要求11的宿主细胞表达由所说的DNA编码的多肽。
- 11.一种生产能够表达多肽之细胞的方法,该方法包括用权利要求10的载体对细胞进行基因工程操作。
- 12.一种多肽,该多肽包括选自如下一组的成员:(i)一种具有图1的推导的氨基酸序列的多肽和其片段、类似物及衍生物;和(ii)一种由ATCC保藏物97103号的cDNA编码的多肽和其片段、类似物及衍生物。
- 13.一种激活权利要求12的多肽的受体的化合物。
- 14.一种抑制权利要求12的多肽的受体的化合物。
- 15.一种治疗需要CysE之患者的方法,该方法包括:对患者施用治疗有效量的权利要求12的多肽。
- 16.权利要求15的方法,其中所说的治疗有效量的多肽是通过对患者提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说的多肽来施用的。
- 17.一种治疗需要抑制CysE多肽之患者的方法,该方法包括:对患者施用治疗有效量的权利要求14的化合物。
- 18.一种诊断与权利要求12的多肽的表达不足相关的疾病或疾病的易感性的方法,该方法包括:测定编码所说多肽之核酸序列中的突变。
- 19.一种诊断方法,该方法包括:分析来源于宿主细胞的样品中是否存在权利要求12的多肽。
- 20.一种鉴别结合并激活权利要求12之多肽的受体的化合物的方法,该方法包括:在允许结合所说受体的条件下,使在其表面表达所说多肽受体的细胞与待筛选的化合物接触,所说受体与能够提供响应化合物结合所说受体的可检测信号的第二组分相联;和通过检测所说化合物与所说受体的相互作用所产生的信号的存在与否确定所说化合物是否结合并激活所说受体。
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CN105254753A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-01-20 | 苏州大学 | 一种蛋白酶抑制剂cystatin及其免疫抑制作用 |
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1995
- 1995-06-05 CN CN95197884A patent/CN1186497A/zh active Pending
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CN100368018C (zh) * | 2005-05-26 | 2008-02-13 | 福建医科大学 | 蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂抗肿瘤侵袭与转移作用及应用 |
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