CN1183803A - 成纤维细胞生长因子－14 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人成纤维细胞生长因子－14多肽以及编码该多肽的DNA(RNA)。本发明还提供了一种通过重组技术生产该多肽的方法。本发明还公开了利用这种多肽以促进伤口愈合的方法,例如治愈烧伤与溃疡,防止由于中风所致/与中风有关的神经元的损伤及促进神经元生长的方法,防止皮肤老化与头发脱落的方法,在早期胚胎中刺激血管生成、中胚层诱导的方法以及促进四肢再生的方法。本发明也公开了抗这种多肽的拮抗剂及其用作一种防止异常细胞增殖,血管过多的疾病以及上皮晶状体细胞增殖的治疗剂的用途。本发明还公开了一种用于检测在编码序列中的突变以及在从宿主得到的样品中该多肽浓度改变的诊断方法。

Description

成纤维细胞生长因子-14

本发明涉及最近鉴定的多核苷酸，该多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸和多肽的用途以及该多核苷酸和多肽的生产。更具体地讲，本发明的多肽经推断鉴定为成纤维细胞生长因子/肝素结合生长因子，在下文中称作“FGF-14”。本发明也涉及抑制该多肽的作用。

成纤维细胞生长因子是具有与肝素结合的特征的一个蛋白质家族，并且因此也称之为肝素结合生长因子(HBGF)。发现这些蛋白质的不同成员在不同的组织中表达，并且这种表达处于特定的时序和空间的控制之下。对于中胚层、外胚层以及内胚层起源的各种细胞而言，这些蛋白质是有效的促细胞***剂，上述细胞包括成纤维细胞，角膜及血管内皮细胞，粒细胞，肾上腺皮质细胞，软骨细胞，成肌细胞，血管平滑肌细胞，上皮晶状体细胞，黑色素细胞，角质形成细胞，少突神经胶质细胞，星形细胞，成骨细胞以及造血细胞。

每种蛋白质成员都具有与其它蛋白质成员重叠的功能，并且也具有其独特的功能范围。除具有刺激血管内皮细胞增殖的能力以外，FGF-1与2均对内皮细胞具有趋化性，并且已经表明FGF-2可以使内皮细胞渗透至基底膜。按照这种性质，FGF-1与2均具有刺激血管生成的能力。这些生长因子另一个重要的特征为其促进伤口愈合的能力。FGF家族中许多其它的成员都享有与FGF-1与2类似的活性，例如促进血管生成与伤口愈合的活性。已经表明FGF家族的几个成员可以诱导中胚层的形成并且可以调节神经元细胞，脂肪细胞和骨骼肌细胞的分化。

除了这些在正常组织中的生物学活性以外，已经暗示FGF蛋白通过促进肿瘤血管生成以促进癌症和肉瘤中的肿瘤发生，并且当其表达失控时这些蛋白可以充当转化蛋白。

FGF家族目前由8个在结构上相关的多肽组成：碱性FGF，酸性FGF，int 2，hst 1/k-FGF，FGF-5，FGF-6，角质形成细胞生长因子，AIGF(FGF-8)，并且近来已经表明一种神经胶质活化因子是一种新的肝素结合生长因子，该因子是从一种人神经胶质瘤细胞系的培养上清液中纯化出来的(Miyamoto，M.等，分子和细胞生物学，13(7)：4251-4259(1993))。每种多肽的基因已经被克隆并且进行了测序。该成员中的两种，即FGF-1与FGF-2已被赋予了许多名称，但是最常用的分别称作酸性和碱性成纤维细胞生长因子。正常的基因产物影响了大多数由中胚层和神经外胚层所产生的细胞一般的增殖能力。它们能够诱导体内的血管生成并且可以在早期发育中发挥重要的作用(Burges s，w.H.和Maciag，T.，生化回顾年报，58：575-606，(1989))。

许多上面所鉴定的FGF家族的成员也可以结合到同样的受体上，并且通过结合到这些受体上而诱导第二信使。

通过基因转移已经把编码一种分泌型FGF-1的真核表达载体引入到猪动脉中。这一模型确定了位于体内动脉内壁的基因功能。在基因转移21天后，FGF-1的表达诱导猪动脉内膜加厚(Nabel，E.G.，等，自然，362：844-6(1993))。这进一步表明碱性成纤维细胞生长因子可以调节神经胶质瘤的生长与恶化，其中的生长与恶化不依赖于该因子在肿瘤血管生成中所起的作用，并且表明碱性成纤维细胞生长因子的释放或分泌可能是这些作用所需要的(Morrison，R.S.，等，神经科学研究杂志，34：502-9(1993))。

已经进一步暗示出象碱性FGF这样的成纤维细胞生长因子在体外卡波西肉瘤细胞的生长中起作用(Huang，Y.Q.，等，临床研究杂志，91：1191-7(1993))。而且，在由噬菌体T7 RNA聚合酶所识别的转录启动子的下游已克隆了编码人的碱性成纤维细胞生长因子的cDNA序列。已经表明由此得到的碱性成纤维细胞生长因子具有无法区别于人胎盘成纤维细胞生长因子在促有丝***活性(mitogenicity)、血纤蛋白溶酶原激活剂的合成与血管生成测定方面的生物活性(Squires，C.H.，等.生物化学杂志，263：16297-302(1988))。

美国专利No.5，155,214公开了基本上纯的哺乳动物的碱性成纤维细胞生长因子及其生产。该专利公开了牛与人的碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列以及编码牛物种的这一多肽的DNA序列。

最近发现FGF-9与FGF家族的其它成员间具有大约30％的序列相似性。该家族成员中的两个半胱氨酸残基与其它的共有序列在FGF-9的序列中也是完全保守的。人们发现FGF-9在其N末端没有象在酸性与碱性FGF中的典型信号序列。但是，尽管FGF-9缺乏一种典型的信号序列FGF，人们发现在合成后它却可以从细胞中分泌出来(Miyamoto，M.等，分子和细胞生物学，13(7)：4251-4259(1993))。而且，人们发现FGF-9刺激少突神经胶质细胞类型2星形细胞祖细胞、BALB/c3T3与PC-12细胞的细胞生长，但却不促进人脐静脉内皮细胞的生长(Naruo，K.，等.生物化学杂志，268：2857-2864(1993))。

碱性FGF与酸性FGF是细胞增殖，细胞活动性，分化与存活的有效的调节剂，并且影响来自于外胚层，中胚层与内胚层的细胞类型。通过蛋白质的纯化鉴定了这两类FGFs以及KGF和AIGF。但是，其它的四个成员作为癌基因而被分离，其中基因的表达局限于胚胎发育与某种类型的癌症。已经表明FGF-9是一种抗神经胶质细胞的促细胞***原。曾报道FGF家族的成员具有致癌的潜能。当将FGF-9转化到BALB/c3T3细胞中时，已经表明FGF-9具有转化的潜能(Miyamoto，M.，等，分子细胞生物学，13(7)：4251-4259(1993))。

又被称作FGF-8的雄激素诱导生长因子(AIGF)是从以睾酮刺激的小鼠***癌细胞(SC-3)的条件培养基中纯化出来的。AIGF是特殊的一类FGF生长天子，它具有推定的信号肽并且与FGF家族的已知成员间享有30-40％的同源性。采用AIGF转化的哺乳动物细胞显示出对缺乏雄激素的SC-3细胞的生长具有显著的刺激效应。由于AIGF可以通过肿瘤细胞自身分泌出来，因此AIGF介导了SC-3细胞并且可能还有其它细胞的雄激素诱导的生长。

由于本发明的多肽的氨基酸序列与FGF家族其它成员的同源性，已经推断鉴定该多肽为FGF家族的一个成员。

根据本发明的一个方面，提供了新的成熟多肽及其具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用的片段，类似物与衍生物。本发明的多肽是人源的。

根据本发明的另一个方面，提供了编码本发明的多肽的分离的核酸分子，该核酸分子包括mRNAs，DNAs，cDNAs.基因组DNA，以及它的反义类似物和其具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用的片段。

根据本发明的另一个方面，提供了通过使用诸如在本发明的多肽的重组生产中用作试剂的克隆和表达质粒的重组载体通过重组技术生产这种多肽的方法，以及含有编码本发明的多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。

根据本发明的再一个方面，提供了一种利用该多肽或编码该多肽的多核苷酸用于筛选其***(agonist)及其拮抗剂以及用于治疗目的的方法，例如促进伤口愈合，比如治愈烧伤与溃疡，防止由于与中风有关的神经元的损伤并促进神经元的生长，防止皮肤老化与头发脱落，刺激在早期胚胎中血管生成、中胚层诱导以及刺激四肢再生。

根据本发明的又一个方面，提供了抗这种多肽的抗体。

根据本发明的另一个方面，提供了抗这种多肽的拮抗剂及其用于抑制这种多肽的作用的方法，例如在治疗细胞转化(如肿瘤)、减少结疤与治疗血管过多的疾病方面。

根据本发明的另一个方面，提供了含有足够长的核酸分子的核酸探针，该探针可以特异地杂交到编码本发明的多肽的多核苷酸上。

根据本发明的又一个方面，提供了检测与在本发明的核酸序列中的突变有关的疾病或疾病的易感性，以及检测由该序列所编码的多肽的过度表达的诊断测定方法。

根据本发明的又一个方面，提供了一种将这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸用于与科学研究，DNA的合成以及DNA载体的生产有关的体外目的的方法。

根据本文的教导，本发明的这些以及其它的方面对于本领域的技术人员而言应该是显而易见的。

下面的附图仅仅意味着是对本发明的具体实施方案的说明，而并不意味着以任何的方式限制本发明。

图1示出了FGF-14的cDNA序列以及相应推导的氨基酸序列。起始的26个氨基酸残基代表推定的前导序列。

根据本发明的一个方面，提供了分离的核酸分子(多核苷酸)，该分子编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NOS：2)的成熟多肽或者编码由在1995年5月12日保藏于ATCC、保藏号为97148的克隆的cDNA所编码的成熟多肽。

编码本发明的FGF-14的多核苷酸最初从人小脑组织所得到的cDNA文库中发现。它在结构上与成纤维细胞生长因子家族的所有成员均相关，并且含有一个编码225个氨基酸的多肽的开放读框，其中该多肽起始的26个氨基酸代表推定的信号序列，从而成熟多肽包含199个氨基酸。其中最为匹配的情况是：1)在一段126个氨基酸序列的区域内，与人FGF-9存在40％的相同性和61％的序列相似性；2)在一段126个氨基酸的区域内，与大鼠FGF-9存在40％的相同性和61％的相似性；3)在一段148个氨基酸序列的范围内，与人KGF存在36％的相同性和57％的相似性。

FGF/HBGF家族的特征，GXLX(S，T，A，G)X6(D，E)CXFXE在本发明的多肽中是保守的(X代表任意氨基酸残基；(D，E)代表或者为D或者为E残基，X6代表任意6个氨基酸残基)。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因组DNA与合成DNA，DNA可以是双链或者是单链的。编码成熟多肽的编码序列可以与显示在图1中的编码序列(SEQ ID NOS：1)或者所保藏的克隆的编码序列相同，或者由于遗传密码子的重复或简并该序列可以是一个不同的编码序列，但它编码与图1的DNA(SEQ ID NOS：1)或所保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽(SEQ ID NOS：2)或者编码由所保藏的cDNA(s)编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括：仅编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列与附加的编码序列，诸如前导或分泌序列或者蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(以及任选的附加的编码序列)和非编码序列如内含子或者成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有该多肽编码序列的多核苷酸以及含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明进一步涉及如上所述的多核苷酸的变异体，其编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NOS：2)的多肽的片段、类似物与衍生物，或者编码由所保藏的克隆的cDNA(s)编码的多肽的片段、类似物与衍生物。多核苷酸的变异体可以是该多核苷酸的天然发生的等位基因变异体，或者是多核苷酸的非天然发生的变异体。

因此，本发明包括编码如图1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NOS：2)或由所保藏的克隆的cDNA(s)编码的相同成熟多肽的多核苷酸及其变异体，其中变异体编码图1的多肽(SEQ ID NOS：2)或者由所保藏的克隆的cDNA(s)编码的多肽的片段、衍生物或者类似物。核苷酸变异体包括缺失变异体，取代变异体以及添加或***变异体。

如上文所示，多核苷酸可以具有图1所示的编码序列(SEQ ID NOS：1)或者所保藏的克隆的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列。正如在本领域中已知的，等位基因变异体是多核苷酸序列的可选择的形式，它可以具有一个或多个核苷酸的取代，缺失或添加，但它基本上不改变被编码多肽的功能。

本发明也包括多核苷酸，其中可以在同一读框内将该成熟多肽的编码序列融合到如下一个多核苷酸序列中，所述的多核苷酸序列协助多肽从宿主细胞表达与分泌，例如一个前导序列，它作为控制多肽从细胞运输的分泌序列发挥作用。具有前导序列的多肽是一种蛋白质前体，并且它可以经宿主细胞裂解前导序列以形成该多肽的成熟形式。多核苷酸也可以编码一种为成熟蛋白加上附加的5’氨基酸残基的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一种蛋白原并且是该蛋白的一种非活性形式。一旦序列原被裂解，活性成熟蛋白便保留下来。

因此，本发明的多核苷酸例如可以编码一种成熟蛋白，或者编码一种具有个序列原的蛋白，或者编码一种具有序列原与前序列(前导序列)的蛋白。

本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与标记序列融合的编码序列，该标记序列便于本发明的多肽纯化。标记序列可以是一个由PQE-9载体所提供的六组氨酸标记物从而保证在细菌宿主的情况下与标记物融合的成熟多肽的纯化，或者例如当使用哺乳动物宿主、例如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素(HA)标记物。HA标记对应于从流感血凝素蛋白得到的表位(Wilson，I.，等，细胞，37：767(1984))。

术语“基因”是指涉及生产一个多肽链的DNA区段；它包括在编码区之前与之后的区域(前导区与尾区)以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

全长的FGF-14基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，以便于分离全长的基因并且分离与该基因具有高的序列相似性或相似的生物活性的其它基因。这种类型的探针优选具有至少30个碱基并且可以含有例如50或更多个碱基。该探针也可以用于鉴定对应于全长转录物的cDNA克隆以及含有完整的FGF-14基天的一个基因组克隆或多个克隆，其中完整的FGF-14基因包括调节区与启动区，外显子和内含子。一个筛选的实例包括通过使用已知的DNA序列分离出FGF-14基因的编码区以合成寡核苷酸探针。具有互补于本发明基因的序列的标记寡核苷酸可以用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA的文库，从而测定与该探针杂交的文库成员。

如果序列间存在至少70％、优选至少90％且更优选至少95％的相同性时，本发明进一步涉及与上述序列杂交的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。文中所使用的术语“严格条件”是指只有序列间存在至少95％且优选至少97％的相同性时才发生杂交。在一个优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保留了与由图1的cDNAs(SEQID NO：1)或保藏的cDNAs所编码的成熟多肽同样的生物功能或活性的多肽。

另一方面，多核苷酸可以含有至少20个碱基，优选30个碱基并且更优选至少50个碱基，它们可以和本发明的多核苷酸杂交并且与之具有相同性，并且如上所述可以保留或不保留活性。例如这样的多核苷酸可以用作SEQ ID NO：1的多核苷酸的探针，比如用于回收多核苷酸或用作诊断探针或PCR引物。

因此，本发明涉及与编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸具有至少70％的相同性、优选至少90％的相同性且更优选至少95％的相同性的多核苷酸及其片段，以及该多核苷酸所编码的多肽，其中的片段具有至少30个碱基并且优选至少50个碱基。

本文所涉及的保藏物将按照关于国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行保存。这些保藏物仅为了本领域技术人员的方便而提供，不是对按35 U.S.C.§112要求保藏物的许可。包含在保藏材料中的多核苷酸的序列及其所编码的多肽的氨基酸序列在本文中作为参考而附入，并且在与本文序列描述有冲突的任意的一种情况下起决定作用。制造、使用或销售该保藏材料需要许可证，并且此处不颁发这样的许可证。

本发明进一步涉及一种具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或者具有由保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的FGF多肽以及该多肽的片段、类似物和衍生物。

当涉及图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”与“类似物”是指基本上保留了该多肽的同样的生物学功能或活性的多肽。因此，一种类似物包括可以通过该蛋白原部分的裂解而激活从而产生有活性的成熟多肽的蛋白原。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。

图1的多肽(SEQ ID NO：2)或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(i)一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基被一个保守的或非保守的氨基酸残基(优选一个保守的氨基酸残基)所取代并且被取代的氨基酸残基可以是或可以不是由该遗传密码所编码，或者(ii)一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基包含一个取代基，或者(iii)一种多肽，其中，成熟多肽与另一种化合物，诸如一种提高该多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)一种多肽，其中成熟多肽与附加的氨基酸融合，诸如融合一个前导或分泌序列或者一个用于该成熟多肽的纯化的序列或者一个蛋白原序列。从本文的教导出发，这样的片段、衍生物与类似物视为是在本领域的技术人员所熟知的范围内的。

本发明的多肽与多核苷酸优选以一种分离的形式而提供，并且优选将其纯化成均一物质。

术语“分离的”是指从其原始环境(例如如果该物质是天然存在的，即指天然环境)中分离出该物质。例如，一种存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但是从天然***中一些或所有的共存物质里分离出的同样的多核苷酸或DNA或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是一个载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是一种组合物的一部分，并且如果该载体或组合物并非是其天然环境的一部分，则其仍然是分离的。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ IDNO：2的多肽具有至少70％的相似性(优选至少70％的相同性)的多肽、更优选与SEQ ID NO：2的多肽具有至少90％的相似性(更优选至少90％的相同性)的多肽、并且特别优选与SEQ ID NO：2的多肽具有至少95％的相似性(特别优选至少95％的相同性)的多肽，本发明的多肽也包括该多肽的部分，其中该多肽的这些部分通常含有至少30个氨基酸并且更优选至少50个氨基酸。

正如在本领域中已知的，两种多肽之间的“相似性”是通过把一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与第二个多肽的序列进行比较而测定的。

通过肽合成，本发明多肽的片段或部分可以用于生产相应的全长的多肽；因此，该片段可以用作生产全长多肽的中间体。本发明的多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长的多核苷酸。

本发明也涉及含有本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明的多肽。

宿主细胞可以是用本发明的载体进行遗传工程化的(转导或转化或转染)，其中载体例如可以是克隆载体或表达载体，载体例如可以呈质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。改造的宿主细胞可以在经改良以适于激活启动子、筛选转化体或扩增FGF基因的常规营养培养基上培养。培养条件(诸如温度、pH及其它)是为了表达而选择的宿主细胞以前所采用的条件，并且对本领域的普通技术人员来讲是显而易见的。

通过重组技术，本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。因此，例如该多核苷酸序列可以包含在表达多肽的多种表达载体中的任意一种中，具体而言如载体或质粒中。这样的载体包括染色体、非染色体及合成DNA序列，例如：SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；质粒与噬菌体DNA结合所得到的载体、病毒DNA(诸如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒与假狂犬病)。但是，只要任意一种其它的载体或质粒在宿主中可以复制并且存活便可以使用它们。

可通过许多种方法把合适的DNA序列***到载体中。一般而言，通过本领域已知的方法可以把DNA序列***到一个合适的限制性内切酶位点上。该方法及其它方法被视为是在本领域的技术人员所熟知的范围之内。

表达载体中的DNA序列可操作地与一个合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA的合成。作为上述启动子有代表性的实例可以提到的有：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λP_L启动子以及其它已知调控原核细胞或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。表达载体也含有一个用于翻译起始的核糖体结合位点与一个转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。

此外，表达载体优选含有一种为转化宿主细胞的筛选而提供一种表型性状的基因，诸如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者诸如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

含有如上所述的合适的DNA序列以及一个合适的启动子或调控序列的载体可以用于转化一种合适的宿主从而允许该宿主表达蛋白。作为合适宿主有代表性的实例可以提到的有：细菌细胞，诸如大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏杆菌，链霉菌属；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇S2与苜蓿银纹夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。根据本文的教导，选择合适的宿主被认为是在本领域的技术人员所熟知的范围之内。

更具体地讲，本发明也包括含有一个或多个如上广义所述的序列的重组构建体。构建体包括将本发明的序列以正向或逆向***其中的载体，如质粒或病毒载体。在这一实施方案一个优选方面，构建体进一步包括可操作地与序列连接的调节序列，例如启动子。许多合适的载体与启动子是本领域的技术人员所熟知的且可以通过商业途径得到。下面的载体以举例的方式提供：细菌：pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pBSKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)；真核细胞：pWLneo，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。但是，只要任意一种其它的质粒或载体在该宿主中可以复制并存活便可以使用它们。

采用具有选择标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其它载体，可以从任意一种所需要的基因中筛选出启动子区域。两个合适的载体为pKK232-8与pCM7。特别指出的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λP_R，P_L和trp。真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期与晚期SV40，来自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体与启动子在本领域普通的技术水平上是可以完成的。

 在更进一步的实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或是低等真核细胞(如酵母细胞)，或者宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔可以实现该构建体向宿主细胞的引入(Davies，L.，Dibner.M.，Battey，I.，分子生物学基本方法，(1986))。

宿主细胞中的构建体可以以常规的方式使用从而生产由该重组序列所编码的基因产物。另一方面，本发明的多肽也可以通过常规的肽合成仪合成生产。

在合适的启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或它细胞中表达。采用从本发明的DNA构建体得到的RNAs，也可通过无细胞翻译***生产该蛋白。用于原核与真核宿主的合适的克隆与表达载体在Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册第二版)》(纽约冷泉港，1989)中进行了描述，此处以参考文献引用其公开内容。

通过向载体中***一个增强子序列可提高通过高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，一般大约从10至300bp，它作用于启动子以提高其转录。它的例子包含有位于复制起点晚期一侧的SV40增强子(bp100至270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点晚期一侧的多瘤增强子与腺病毒增强子。

一般而言，重组表达载体包括复制起点与允许宿主细胞转化的选择标记(例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母TRP1基因)以及从一个高度表达的基因中得到的指导下游结构序列的转录的启动子。这些启动子可以从编码如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)这样的糖酵解酶、α因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白等的操纵子中得到。异源结构序列以合适的方式与翻译起始和终止序列，以及优选地一个能够指导被翻译的蛋白分泌至周质空间或胞外培养基中的前导序列进行装配。异源序列可以任选地编码一种融合蛋白，该蛋白含有一个N-末端鉴定肽，其中的鉴定肽赋予了表达的重组产物所需要的特征，例如稳定性或易于纯化的特性。

通过将编码一种所需蛋白的结构DNA序列与合适的翻译起始与终止信号以可操纵的阅读方式和一个功能启动子一起***，可以构建对细菌的使用而言有用的表达载体。该载体将包括一个或多个表型选择标记和一个复制起点，以确保维持该载体并且如果需要的话可以保证在宿主中进行扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及属于假单胞杆菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的许多种，当然其它种的生物也可以采用。

作为代表性但却无限制性的例子，对细菌的使用而言有用的表达载体可以包括一个选择标记和来自含有所熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的细菌复制起点。这些商购载体包括如pKK223-3(Phamacia精细化学公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”部分与一种合适的启动子和待表达的结构序列相结合。

进行合适的宿主株系的转化并且该宿主株系生长至合适的细胞密度后，通过合适的方法(例如温度变动或化学诱导)诱导所选择的启动子并且再将细胞培养一段时间。

细胞通常经离心收获，通过物理或化学方法进行破碎，并且保留得到的粗提物以便进一步的纯化。

在蛋白表达中所使用的微生物细胞可以通过任意一种方便的方法进行破碎，该方法包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破碎，或者使用细胞裂解剂。

各种哺乳动物细胞的培养***也可以用于表达重组蛋白。哺乳动物表达***的实例包括由Gluzman(细胞，23：175(1981))所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系以及可以表达相容载体的其它细胞系，例如C127，3T3，CHO，HeLa与BHK细胞系。哺乳动物表达载体包括复制起点、合适的启动子和增强子、以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受***点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。从SV40病毒基因组中得到的DNA序列，例如SV40起点，早期启动子，增强子，剪接与聚腺苷酸化位点可以用于提供所需要的非转录遗传因子。

本发明的多肽可以通过迄今为止所使用的方法从重组的细胞培养物中回收并纯化，该方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析与凝集素层析。如果需要的话，在完成该成熟蛋白的构型中可以采用蛋白重折叠步骤。最后，可以采用高效液相层析(HPLC)用于最终的纯化步骤。

本发明的多肽可以是一种天然纯化的产物，或者是一种化学合成方法的产物，或者是从原核或真核宿主(例如通过细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞培养)经重组技术制备的。根据在重组生产方法中所使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化或者可以是非糖基化的。该多肽也可以包含一个起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多肽由于具有刺激血管内皮细胞生长的能力，所以可以用于刺激由不同的疾病状况(如血栓、动脉硬化)以及其它的心血管状况所造成的局部缺血组织再形成血管的治疗中。这些多肽也可以用于促进血管生成与四肢再生。

由于该多肽对于不同来源的不同细胞(如成纤维细胞与骨骼肌细胞)是促***的并且因此有利于所损伤或患病组织的修复或替换，所以该多肽也可以用于治疗由于损伤、烧伤、手术后组织修复和溃疡所造成的伤口。

本发明的多肽也可以用于刺激神经元的生长并且用于治疗和预防与中风有关的以及在某种神经紊乱或神经变性状况下(如阿尔茨海默病，帕金森氏病)发生的神经元的损伤和与AIDS有关的综合症。FGF-14具有促进软骨细胞生长的能力，因此它们可以用于刺激骨骼和牙周的再生并且协助组织移植或骨骼移植。

本发明的多肽通过促进角质形成细胞的生长也可以用于防止由太阳烧伤所造成的皮肤老化。

由于FGF家族的成员可以激活毛发生成细胞并且促进黑素细胞的生长，所以FGF-14多肽也可以用于防止头发脱落。与该方法一致，当把本发明的多肽与其它的细胞因子结合使用时，该多肽也可以用于促进造血细胞和骨髓细胞的生长与分化。

FGF-14多肽也可以用于在移植前维持器官或者用于支持初级组织的细胞培养。

本发明的多肽也可以用于诱导中胚层来源的组织在早期胚胎中进行分化。

根据本发明更进一步的方面，本发明提供了一种利用该多肽或者编码该多肽的多核苷酸的方法，它们可作为与科学研究、DNA的合成、DNA载体的生产有关的体外目的中的研究试剂，以用于开发治疗人类疾病的治疗学和诊断学方法。

本发明提供了一种鉴定本发明多肽的受体的方法。编码受体的基因可以通过许多为本领域普通技术人员已知的方法进行鉴定，例如配体淘选与FACS分选(Coligan，等，免疫学通用方案，1(2)，第五章，(1991))。优选采用表达克隆法，从对该多肽有反应的细胞、例如已知对FGF家族的蛋白含有多个受体的NIH3T3细胞和SC-3细胞中制备聚腺苷酸化的RNA，并且把从该RNA产生的cDNA文库分割成多个集合体并且将其用于转染COS细胞或其它对该多肽无反应的细胞。将生长于玻璃载玻片上的转染细胞与标记后的本发明的多肽接触，可通过许多方法，包括碘化作用或引入一个位点特异性蛋白激酶的识别位点来标记本发明的多肽。

固定与温育后，对玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合体并且采用一种重复亚合并与再筛选方法来制备和再转染亚集合体，最终得到一种编码推定的受体的单一克隆。

作为一种用于受体鉴定的替代方法，标记的多肽可以和细胞膜或表达该受体分子的提取物的制剂光亲和连接。交联物质通过PAGE分析进行分辨并且在X-光胶片上曝光。可以切下含有该多肽受体的标记复合物，分解成肽片段并且使之进行蛋白微量测序。从微量测序得到的氨基酸序列可以用来设计一套简并的用于筛选cDNA文库的寡核苷酸探针，从而鉴定编码该推定受体的基因。

本发明还涉及一种筛选化合物的方法，以便于鉴定那些调节本发明多肽的作用的物质。这种测定的一个实例包括在成纤维细胞可以正常增殖的细胞培养条件下将一种哺乳动物成纤维细胞、本发明的多肽、待筛选的化合物和³[H]胸苷结合。对照测定可以在缺少待筛选化合物的条件下进行，并且将其与在该化合物存在下成纤维细胞增殖的数量进行比较，从而通过测定每种情况下³[H]胸苷的吸收以确定该化合物是否促进增殖。成纤维细胞的增殖通过可以测量³[H]胸苷掺入的液闪计数进行测定。

按照另一种方法，在该化合物存在下采用被标记的本发明的多肽来温育表达本发明多肽的受体的哺乳动物细胞或膜制剂，于是可以测定该化合物促进或阻遏这一反应的能力。另一方面，在测定了待筛选的化合物与FGF-14受体之间的反应之后再测定一种已知的第二信使***的反应，并且测定该化合物结合到该受体上以及刺激第二信使反应的能力，从而确定该化合物是否是一种潜在的***或拮抗剂。上述第二信使***包括cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道，酪氨酸磷酸化作用或磷酸肌醇水解作用，但是该***并不局限于此。

拮抗剂化合物的实例包括抗体或在某些情况下包括寡核苷酸，它们结合到本发明的多肽的受体上但却不刺激第二信使的反应，或者会结合到FGF-14多肽自身上。另一方面，一种潜在的拮抗剂可以是该多肽的一种突变异体形式，它结合到受体上但却不刺激第二信使的反应并且因此有效地阻止了该多肽的作用。

针对FGF-14基因及其基因产物的另一种拮抗剂化合物为一种采用反义技术制备的反义构建体。通过三股螺旋形成反义DNA或RNA，反义技术可以用于控制基因的表达，上述两种方法均是建立在一种多核苷酸结合到DNA或RNA的基础上的。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用于设计一种反义RNA寡核苷酸，其长度从大约10至40个碱基对。将一种DNA寡核苷酸设计成互补于涉及转录的基因区域(三股螺旋一参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，241：456(1988)；与Dervan等，科学，251：1360(1991))，从而阻止转录以及本发明多肽的生产。反义RNA寡核苷酸在体内杂交到mRNA上并且阻止mRNA分子翻译成多肽(反义-Okano，神经化学杂志，56：560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。还可以把上述寡核苷酸传递至细胞，从而该反义RNA或DNA可以在体内表达以抑制多肽的生产。

潜在的拮抗剂包括一些小分子，这些小分子可以结合多肽的活性位点、受体结合位点或多肽的其它生长因子结合位点从而阻止多肽的正常生物学活性。小分子的实例包括但不限于小肽或类肽分子。

拮抗剂化合物可以用于抑制本发明多肽的细胞生长与增殖作用对赘生性细包与组织的影响，即刺激肿瘤的血管生成，并且因此而阻滞或防止了异常细胞的生长与增殖，比如肿瘤的形成或生长。

拮抗剂也可以用于预防血管过多的疾病，并且阻止了囊外白内障外科手术后上皮晶状体细胞的增殖。在如气囊(balloon)血管成形术之后再狭窄的病例中可能也需要阻止本发明多肽的促细胞***活性。

拮抗剂也可以用于防止在伤口愈合期间伤疤组织的生长。

拮抗剂可以与一种如下所述的药物学可接受的载体一起用于一种组合物中。

本发明的多肽、***和拮抗剂可以结合一种合适的药物载体而使用，从而形成一种肠胃外给药的药物组合物。这种组合物包括一种治疗上有效量的多肽、***或拮抗剂以及一种药用可接受的载体或赋形剂。这样的一种载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其混合物。该配方应当适合于给药的方式。

本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，它们包括一个或多个容器，该容器中装有一种或多种本发明的药物组合物的成分。与该容器相伴的可以是一则以管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式存在的通知，该通知反映出生产、使用或销售机构对人体给药的批准。此外，该药物组合物可以与其它的治疗化合物结合使用。

该药物组合物可以按照常规的方式给药，如通过口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或者真皮内的途径。该药物组合物以对治疗和/或预防具体症状有效的量进行给药。一般而言，该组合物以至少约10μg/kg体重的量进行给药，并且在大多数情况下该组合物的给药量将不超过约8mg/kg体重/天。在大多数情况下考虑到给药的途径、症状等，该剂量从每天约10μg/kg体重至约1mg/kg体重。在局部给药的特殊情况下，给药剂量优选从约0.1μg至9mg/cm²。

根据本发明，本发明的多肽以及同为多肽的***(agonist)和拮抗剂化合物也可以通过在体内表达所述多肽而使用，这通常称作“基因治疗”。

因此，例如可以采用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在体外工程化来自患者细胞，随后将工程化的细胞提供给待采用该多肽治疗的患者。上述方法是本领域所熟知的。例如，可以通过本领域已知的方法、采用一种含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒来工程化细胞。

类似地，为了在体内表达多肽，例如可以通过本领域已知的方法在体内工程化细胞。正如在本领域已知的，为了在体内工程化细胞并且在体内表达多肽，可以给予患者一种生产含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞。从本发明的教导出发，通过上述方法给予本发明的一种多肽的这些或者其它的方法对本领域的普通技术人员是显而易见的。例如，除了逆转录病毒颗粒以外，用于工程化的细胞的表达载体还可以是如一种腺病毒，它可以在与一种合适的输送载体结合后用于在体内工程化细胞。

可以得到上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney小鼠白血病病毒，脾坏死病毒，逆转录病毒诸如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，长臂猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生性肉瘤病毒与***肿瘤病毒。在一个具体的实施方案中，逆转录病毒质粒载体是从Moloney小鼠白血病病毒得到的。

载体包含一个或者多个启动子。可以采用的合适的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；以及在Miller，等，生物技术，第7卷，第9期，第980-990页(1989)中所描述的人巨细胞病毒(CMV)启动子，或者任何一种其它的启动子(例如细胞启动子，如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。其它可以采用的病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子及B19细小病毒启动子。根据本文中的教导，选择合适的启动子对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。

编码本发明多肽的核酸序列受到一个合适的启动子的控制。可以采用的合适的启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或者异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒的胸苷激酶启动子，如单纯疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括上述修饰的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；以及人生长激素启动子。启动子也可以是控制编码该多肽的基因的天然启动子。

采用逆转录病毒质粒载体来转导包装细胞系从而形成生产细胞系。可以被转导的包装细胞的实例包括但不限于PE501，PA317，φ-2，φ-AM，PA12，T19-14X,VT-19-17-H2，φCRE，φCRIP，GP+E-86，GP+envAm12以及在Miller，人类基因治疗，第1卷，第5-14页(1990)中所描述的DAN细胞系，其中该文献以其全文引入本文以供参考。载体可以通过本领域已知的任何一种方法来转导包装细胞，这些方法包括但不限于电穿孔，采用脂质体以及CaPO₄沉淀。在另一种方法中，逆转录病毒质粒载体可以包埋在脂质体中，或者被偶联到脂类上，然后再将该载体引入宿主中。

生产细胞系产生含有编码该多肽的核酸序列的侵染性逆转录病毒载体颗粒，然后可以使用这些逆转录病毒载体颗粒或在体外或在体内转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码该多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于胚干细胞，胚胎癌性细胞，以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质形成细胞，内皮细胞和支气管上皮细胞。

本发明也涉及本发明的基因作为一种诊断分析的一部分的用途，从而检测疾病或疾病易感性，其中的疾病与在编码本发明多肽的核酸序列中存在的突变有关。

在本发明的基因中个体携带的突变可以通过许多技术在DNA水平上进行检测。用于诊断的核酸可以从病人的细胞中得到，如来自血液、尿液、唾液、活组织检查与尸体剖检材料的细胞。基因组DNA可以直接用于检测或者在分析之前可以通过采用PCR(Saiki等，自然，324：163-166(1986))进行酶促扩增。RNA或cDNA也可以用于同样的目的。作为一个实例，互补于编码本发明的多肽的核酸的PCR引物可以用于测定和分析突变。例如，与正常的基因型比较，通过扩增产物大小的变化可以检测缺失和***。通过把扩增的DNA与放射性标记的RNA或者放射性标记的反义DNA序列杂交便可以测定点突变。通过RNase A消化或通过解链温度的差异，完全配对序列可以同错配的双螺旋区别开来。

基于DNA序列差异的基因检验可以通过检测DNA片段在含有或者不含变性剂的凝胶中的电泳迁移率的变化来实现。小的序列缺失与***可以通过高分辨率的凝胶电泳用肉眼观测。不同序列的DNA片段可以在变性的甲酰胺梯度凝胶上进行区分，其中根据DNA片段的特殊解链温度或部分解链温度、不同DNA片段的迁移率被阻滞在凝胶不同的位置上(参见例如，Myers等，科学，230：1242(1985))。

通过如RNase和S1保护的核酸酶保护分析或化学裂解方法(例如，Cotton等，PANS，美国，85：4397-4401(1985))也可以揭示在特定位置上的序列变化。

因此可以通过如杂交，RNase保护，化学裂解，直接的DNA测序或者使用限制性酶(例如，限制性片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹法这些方法来实现特定DNA序列的检测。

除了更常规的凝胶电泳和DNA测序外，突变也可以通过原位分析进行检测。

本发明也涉及一种用于检测在不同组织中FGF-14蛋白的变化水平的诊断分析，这是由于与正常对照组织样品相比该蛋白的过量表达可以检测出存在异常细胞增殖，例如肿瘤。用于检测从宿主得到的样品中的蛋白含量的分析方法是本领域普通技术人员所熟知的，并且包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹法、酶联免疫吸附测定和“夹心”测定。酶联免疫吸附测定(Coligan，等，免疫学通用方案，1(2)，第六章，(1991))最初包括制备一种对本发明多肽的抗原特异的抗体，其优选为一种单克隆抗体。此外制备一种抗该单克隆抗体的报道抗体。将该报道抗体结合到一个可检测的试剂上，如放射性、荧光性或在本实施例中为辣根过氧化物酶上。将从宿主中取样并在一种结合样品中的蛋白的固相载体如聚苯乙烯平皿上进行温育。然后通过用一种非特异的蛋白牛血清白蛋白的温育来覆盖平皿上任何游离的蛋白结合位点。接下来，在该单克隆抗体结合到已附着在聚苯乙烯平皿上的任何本发明多肽的期间内，在平皿上温育该单克隆抗体。用缓冲液洗去所有来结合的单克隆抗体。马上将连接到辣根过氧化物酶上的报道抗体放置在平皿上，于是使该报道抗体结合到已和感兴趣的蛋白结合的任何单克隆抗体上。

然后洗去未附着的报道抗体。随后把过氧化物酶的底物加入平皿中，并且与标准曲线进行对照，在给定的时间段内的显色量是对存在于给定体积的病人样品中的本发明多肽的量的测量值。

可以采用一种竞争测定，其中把对本发明的多肽特异的抗体结合到固相载体上，并把标记的FGF-13和从宿主得到的样品引入该固相载体，然后所检测的标记的总量例如可以通过液闪计数与该样品中本发明多肽的量相互关联。

“夹心”测定类似于酶联免疫吸附测定。在“夹心”测定中，将本发明的多肽引入固相载体并结合到已附着在该固相载体的抗体上，然后将第二抗体结合到感兴趣的多肽上。随后把已被标记并且特异于第二抗体的第三抗体引入固相载体并结合到该第二抗体上，之后可以定量测定其总量。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向位于单个的人染色体上的特定位置并能与之杂交。此外，现在需要鉴定染色体上的特定位点。目前，仅有少数几种以实际的序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可以用于标记染色体的位置。本发明的DNA染色体作图是将这些序列和疾病相关基因相关联的重要的第一步。

简而言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选10-25bp)便可以把序列定位到染色体上。采用3’未翻译区域的计算机分析可以快速地选择引物，其中引物不应跨越超过基因组DNA上的一个外显子，否则使得扩增方法复杂化。然后采用这些引物用于PCR筛选含有单个的人染色体的体细胞杂交体。只有那些含有与该引物对应的人基因的杂交体才会生产扩增片段。

体细胞杂交体的PCR作图是将一个特定的DNA定位于特定的染色体上的快速程序。根据本发明采用同样的寡核苷酸引物，用来自于特定染色体或者大基因组克隆集合体的一组片段、按照类似方式可以实现亚定位(sublocalization)。可以类似地用于对染色体作图的其它的作图策略包括原位杂交，用标记的经流式分选的染色体进行预筛选以及通过杂交进行预选，从而构建出染色体特异性的cDNA文库。

cDNA克隆与一个中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来实现一步法准确染色体定位。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。关于该技术的综述参阅Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦一个序列已定位到一个准确的染色***置，则染色体上该序列的物理位置可与遗传图谱数据相关联。这些数据例如可在V.McKusick，人类的孟德尔遗传中找到(可以通过Johns Hopkins大学Welch医学文库联机得到)。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)来鉴定基因与已定位到相同染色体区域上的疾病之间的关系。

接下来需要测定在受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果突变是在一些或所有的受影响个体中观察到的、但是又没有在任何一个正常个体中被观察到的话，那么该突变可能是疾病的病原体。

根据物理作图和遗传作图技术目前的分辨率，一个被准确定位到与疾病有关的染色体区域的cDNA可以是50-500个潜在的病原(causative)基因中的一种(其中假定有1兆碱基的作图分辨率且每20kb为一个基因)。

多肽、其片段或该多肽的其它衍生物或类似物、或者表达上述物质的细胞可以用作生产其抗体的免疫原。这些抗体可以是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明也包括嵌合，单链和人源化的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于生产这些抗体和片段。

针对相应于本发明的序列的多肽而产生的抗体可以通过将该多肽直接注射人动物体内或者通过将该多肽向动物给药来得到，其中的动物优选非人类。然后，如此得到的抗体会结合到该多肽上。通过这种方式，即使是仅仅编码该多肽的一个片段的序列也可用于产生能结合整个天然多肽的抗体。然后，该抗体可以用于从表达该多肽的组织中分离这种多肽。

为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler与Milstein，1975，自然，256：495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，4：72)以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体与癌症治疗，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。

可以将用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)进行修改从而生产出针对本发明免疫原性多肽制品的单链抗体。也可以使用转基因小鼠来表达针对本发明免疫原性多肽制品的人源化抗体。

本发明将参照下面的实施例进一步加以说明；但是，应当了解本发明并不局限于这些实施例。除非另作声明的以外，所有的份或量均为重量。

为了利于理解以下的实施例，现叙述一些经常出现的方法和/或术语。

“质粒”通过一个在前的小写p和/或跟随几个大写字母和/或数字加以命名。本文中的起始质粒或者可以通过商业途径得到或在不受限制的基础上公众可得到，或者可以根据已公开的方法从可得到的质粒中构建出来。此外，对于与那些所述等价的质粒是本领域已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。

DNA的“消化”是指用一种仅对DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多种限制性酶可以通过商业途径得到，并且其反应条件、辅因子和其它使用要求对本领域普通技术人员是已知的。为了分析目的，通常把1μg的质粒或DNA片段与溶于约20μl缓冲溶液的约2单位的酶一起使用。为了分离用于质粒构建的DNA片段，通常在一个更大的体积内用20至250单位的酶消化5至50μg的DNA。针对具体的限制性酶而言，合适的缓冲溶液和底物的量是由生产者规定的。通常采用在37℃下约1小时的温育时间，但是该时间可以根据产品供应者的指示而变化。在消化后，反应混合物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离出所需的片段。

采用由Goeddel，D.等，核酸研究，8：4057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离。

“寡核苷酸”或指一种单链多脱氧核苷酸，或指可以通过化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一种激酶存在下以ATP添加一个磷酸时，该寡核苷酸将不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸将连接到未被去磷酸化的片段上。

“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，出处同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的缓冲液和条件、每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)来实现连接。

除非另有说明，按Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)所述的方法进行转化。

                       实施例1

            FGF-14蛋白质的细菌表达与纯化

编码FGF-14 ATCC # 97148的DNA序列是采用与加工后的蛋白(减去信号肽序列)的5’序列和对应于该基因3’的载体序列相对应的PCR寡核苷酸引物进行起始扩增的。与该基因相对应的添加的核苷酸可以加入到5’和3’序列中。5’寡核苷酸引物具有序列5’  GCCAGAGCATGCAGCGGCGCGTGTGTCCCCGC  3’(SEQ ID NO：3)，并且含有一个SphI限制性酶的位点。3’序列为5’GCCAGAAGATCTGGGGGCAGGGGGACTGGAAGG  3’(SEQ ID NO：4)，它含有互补于BgIII位点的序列并且后跟FGF-14编码序列的21个核苷酸。

限制性酶的位点与在细菌表达载体pQE70(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA91311)上的限制性酶的位点对应。pQE-70编码抗生素抗性(Amp^r)，一个细菌的复制起点(ori)，一个IPTG-可调节的启动子操纵基因(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-组氨酸标记物和限制性酶位点。然后用NcoI和BgIII消化pQE-70。将扩增的序列连接到pQE-70上，并且将其***含有编码组氨酸标记物和核糖体结合位点(RBS)的序列的框架中。然后，通过在Sambrook.J.等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，(1989)中所描述的方法，把该连接混合物用于转化大肠杆菌菌株M15/rep 4(Qiagen，Inc.)。M15/rep 4含有质粒pREP4的多个拷贝，其中该质粒表达lacI阻抑物并且也具有卡那霉素抗性(Kan^r)。转化体通过其在LB平板上生长的能力而加以鉴定，并且筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并且通过限制酶切分析加以证实。将含有所需构建体的克隆以液体培养、在补充有Amp(1 00 μg/m1)和Kan(25μg/ml)的LB培养基上培育过夜(O/N)。按照1：100至1：250的比例将O/N培养物用于接种大的培养物。将细胞培育至光密度600(O.D.⁶⁰⁰)介于0.4与0.6之间。然后加入IPTG(“异丙基-B-D-巯基半乳糖吡喃糖苷”)至终浓度为1mM。IPTG通过灭活lacI阻抑物、启动P/O进行诱导从而提高基因表达。将细胞再培育3至4小时，然后通过离心收集该细胞。将细胞沉淀溶解在6摩尔盐酸胍的离液剂中。澄清后，通过镍-螯合柱层析、在允许含有6-组氨酸标记物的蛋白紧密结合的条件下，从该溶液中提纯溶解的FGF-14(Hochuli，E.等，层析杂志，411：177-184(1984))。该蛋白以6摩尔盐酸胍、pH5.0从柱中洗脱，并且为了使之复性将洗脱液调节到3摩尔盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔谷胱甘肽(还原型)与2毫摩尔谷胱甘肽(氧化型)。在该溶液中温育12小时之后将该蛋白对10毫摩尔的磷酸钠透析。

                 实施例2

       采用杆状病毒表达***克隆和表达FGF-14

采用与基因的5’和3’序列对应的PCR寡核苷酸引物来扩增编码全长FGF-14蛋白的DNA序列，ATCC#97148。

FGF-145’引物具有针对pA2载体的序列5’CTAGTGGATCCCATCATGGCGGCGCTGGCCAGT3’(SEQ ID NO：5)，并且它含有一个其后跟随了4个核苷酸的BamHI限制性酶位点(以黑体书写)，这4个核苷酸类似于在真核细胞中用于起始翻译的有效信号(Kozak，M.，分子生物学杂志，196：947-950(1987))，而它仅位于该基因前18个核苷酸之后(用于翻译的起始密码子“ATG”下已被划线)。对于pA2gp载体而言，5’引物具有序列5’CGACTGGATCCCCAGCGGCGCGTGTGTCCC3’(SEQ ID NO：6)。

 3’引物具有序列5’CGACTTCTAGAATCAGGGGGCAGGGGGACTGGA3’(SEQ ID NO：7)，并且含有限制性内切核酸酶XbaI(以黑体书写)的切割位点以及互补于该基因的3’未翻译序列的22个核苷酸。

采用一种可以通过商业途径得到的试剂盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，LaJolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶中分离扩增序列。然后，该片段用相应的内切核酸酶进行消化并且在1％的琼脂糖凝胶上再次纯化。该片段命名为F2。

通过杆状病毒表达***，利用载体pA2gp(和pA2)(pVL941载体的改进，将在下面进行讨论)来表达该蛋白(为了回顾，参阅Summers，M.D.与Smith，G.E.1987，杆状病毒载体与昆虫细胞培养步骤的方法手册，得克萨斯农业实验站会刊No.1555)。该表达载体含有苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的强的多角体蛋白启动子，其后跟随了限制性内切核酸酶BamHI和XbaI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化作用。为了容易地选择出重组病毒，将来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同样的取向***，其后面是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。为了实现细胞介导的共转染野生型病毒DNA的同源重组，多角体蛋白序列两侧为病毒序列。许多其它的杆状病毒载体，如pRG1，pAc373，pVL941和pAcIml可以用于代替pA2(Luckow，VA.与Summers，M.D.，病毒学，170：31-39)。

质粒以限制性酶消化并且通过本领域已知的方法采用牛肠磷酸酶使其去磷酸化，然后采用可以通过商业途径得到的试剂盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶中分离出DNA。该载体DNA命名为V2。

片段F2和去磷酸化的质粒V2通过T4 DNA连接酶进行连接。然后转化大肠杆菌DH5 α细胞并且采用相应的限制性酶来鉴定含有质粒(pBacFGF-14)的细菌。克隆片段的序列通过DNA测序加以证实。

采用脂质体转染法(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，84：7413-7417(1987))将5μg的质粒pBacFGF-14和1.0μg的一种商购线性化的杆状病毒(“BaculoGold^TM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)进行共转染。

将1μg的BaculoGold^TM病毒DNA和5μg的质粒在一个含有50μl无血清的Grace培养基(生命技术公司，Gaithersburg，MD)的无菌微量滴定板的孔中进行混合。之后加入10μl的Lipofectin和90μl的Grace培养基，混合并在室温下温育15分钟。然后将该转染混合物逐滴加入在35mm组织培养平板上接种的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)，其中平板上含有1毫升无血清Grace培养基。来回摇动该平板以混合新添加的溶液。然后该平板于27℃下温育5小时。5小时后，从平板中除去转染溶液并且加入1ml补充有10％的胎牛血清的Grace昆虫培养基。将该平板放回温育箱中并且于27℃下持续培养4天。

4天后收集上清液，并且与Summers和Smith所述(出处同上)类似地进行噬斑测定。作为一种改进，采用一种含有“Blue Gal”(生命技术公司，Gaithersburg，MD)的琼脂糖凝胶，它可以使染上蓝色的噬斑易于分离。(“噬斑测定”的详细描述也可以在用于昆虫细胞培养和杆状病毒学的使用者指南的第9-10页中找到，该指南由生命技术公司，Gaithersburg分发)。

在连续稀释4天后将病毒加入细胞中，并且用一个Eppendorf移液管的尖端挑取染上蓝色的噬斑。然后将含有该重组病毒的琼脂重新悬浮在一个含有200μlGrace培养基的Eppendorf管中。通过短时间的离心除去琼脂并且采用含有该重组杆状病毒的上清液去感染在35mm平皿上接种的Sf9细胞。4天后收集这些培养平皿中的上清液，然后于4℃下进行储藏。

将Sf9细胞在补充有10％热灭活的FBS的Grace培养基上进行培育。在感染复数(MOI)为2的条件下，采用重组杆状病毒V-FGF-14感染细胞。6小时后除去该培养基并且代之以不含甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培养基(生命技术公司，Gaithersburg)。42小时后加入5μCi的³⁵S-甲硫氨酸和5μCi的³⁵S半胱氨酸(Amersham)。在离心收获细胞前将细胞进一步温育16小时，通过SDS-PAGE和放射性自显影观察被标记的蛋白。

              实施例3

       在COS细胞中表达重组FGF-14

表达质粒FGF-14-HA从载体pcDNA3/Amp(Invitrogen)衍生得到，pcDNA3/Amp包括：1)SV40复制起点；2)氨苄青霉素抗性基因；3)大肠杆菌复制起点；4)后跟多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点的CMV启动子。把框内融合到3’末端的编码整个FGF-14前体的DNA片段和HA标记克隆到该载体的多接头区，从而在CMV启动子的控制下指导重组蛋白的表达。HA标记对应于如以前所述的从流感血凝素蛋白得到的一个表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly和R.Lerner，1984，细胞，37：767(1984))。HA标记与靶蛋白的融合使得用识别HA表位的抗体易于检测重组蛋白。

质粒构建的策略如下所述：

通过PCR采用两个引物来构建编码FGF-14，ATCC#97148的DNA序列，其中5’引物为5’CTAGTGGATCCCATCATGGCGGCGCTGGCCAGT 3’(SEQID NO：8)，它含有一个BamHI位点，后面紧跟从起始密码子开始的编码序列的18个核苷酸；3’序列为5’GATTTACTCGAGGGGGGCAGGGGGACTGGA 3’(SEQ ID NO：9)，它含有互补于XhoI位点、翻译终止密码子、HA标记和FGF-14编码序列(不包括终止密码子)的最后18个核苷酸的序列。因此，PCR产物含有一个BamHI位点、后跟框内融合的HA标记物的编码序列、HA标记物之后的翻译终止密码子和一个XhoI位点。

PCR扩增的DNA片段与载体pcDNA3/Amp用相应的限制性酶消化并加以连接。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE(可以从Stratagene克隆***，La Jolla，CA92037中得到)中，将转化的培养物铺在氨苄青霉素培养基平板上并且选择抗性克隆。从转化体中分离质粒DNA并通过限制酶切分析检验正确片段的存在。为了表达重组FGF-14，通过DEAE-DEXTRAN方法(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989))用表达载体转染COS细胞。FGF-14-HA蛋白的表达通过放射性标记和免疫沉淀方法(E.Harlow，D.Lane，抗体：实验室手册，冷泉港Harbor实验室出版社(1988))进行测定。转染后2天，用³⁵S-半胱氨酸标记细胞8小时。然后收集培养基并用去污剂(RIPA缓冲液(150 mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5))(Wilson，I.，等，出处同上，37：767(1984))裂解细胞。所有的细胞裂解物和培养基均采用一种HA特异的单克隆抗体加以沉淀。在15％SDS-PAGE凝胶上分析被沉淀的蛋白。

              实施例5

        通过基因治疗的表达

成纤维细胞是通过皮肤活组织检查从一个研究对象中得到的。将得到的组织放置在组织培养基上并且分割成小块。将小的组织块放置在组织培养瓶的湿表面上，其中每个瓶中放置约10块组织。将瓶颠倒放置，盖紧并于室温下保留过夜。在室温下过24小时后反转瓶，组织块固定在瓶底部，加入新鲜培养基(例如含有10％FBS，青霉素和链霉素的Ham's F12培养基)，然后于37℃下温育大约1周。这时加入新鲜培养基，随后每隔几天更换一次培养基。再培养2周后，出现了一单层成纤维细胞。该单层细胞经胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。

用EcoRI和Hind III消化旁侧有Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7：219-25(1988))，接下来用牛肠磷酸酶进行处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分级分离并使用玻璃珠加以纯化。

采用分别与5’和3’末端序列对应的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5’引物包含一个EcoRI位点，3’引物含有一个Hind III位点。在T4 DNA连接酶存在下，将等量的Moloney鼠肉瘤病毒的线性化骨架与扩增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在适于两个片段连接的条件下保持所得到的混合物。将该连接混合物用于转化细菌HBl01，然后为了证实该载体具有***正确的感兴趣的基因而将细菌涂布在含有卡那霉素的琼脂上。

将兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco's改良Eagles培养基(DMEM)的组织培养板上进行培育，直至达到汇合密度。然后将含有基因的MSV载体加入培养基中并用该载体转导包装细胞。包装细胞随即生产含有该基因的具有感染性的病毒颗粒(现在包装细胞被称作生产细胞)。

向转导的生产细胞中加入新鲜的培养基，接下来从一个铺满生产细胞的10cm平板中收集培养基。含有感染性病毒颗粒的培养基经微孔过滤器过滤以除去脱附(detached)的生产细胞，然后利用该培养基去感染成纤维细胞。从成纤维细胞的亚铺满平板中除去培养基并迅速地代之以来自于生产细胞的培养基。除去该培养基并代之以新鲜的培养基。如果该病毒的滴度高的话，那么实质上所有的成纤维细胞均被感染并且无需选择。如果滴度非常低，那么就需要采用一个具有如neo或his这样的可选择性标记物的逆转录病毒。

然后将工程化的成纤维细胞注射入宿主，它或单独注射或在一个cytodex 3微载体珠上已培育至铺满之后再注射。

根据以上的教导，本发明的许多改进和变化都是可能的，因此在附加的权利要求的范围内可以另外的方式实施本发明。

            序列表(1)一般信息：

(i)申请人：HU等人

(ii)发明名称：成纤维生长因子-14

(iii)序列数：8

(iv)联系地址：

  (A)地址：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，

           STEWART&OLSTEIN

  (B)街道：6BECKERFARMROAD

  (C)城市：ROSELAND

  (D)州：  新泽西

  (E)国家：美国

  (F)邮政编码：07068

(v)计算机可读形式：

  (A)存储媒体类型：3.5英寸软磁盘

  (B)计算机：IBM PS/2

  (C)操作***：MS-DOS

  (D)软件：WORD PERFECT 5.1

(vi)目前申请数据：

  (A)申请号：

  (B)申请日：同时

  (C)分类：

(vii)在先申请数据：

  (A)申请号：08/207,412

  (B)申请日：1994年3月8日

(viii)律师/代理人信息：

  (A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

  (B)登记号：36，134

  (C)案号/文档号：325800-402

(ix)电讯信息：

  (A)电话：201-994-1700

  (B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：680个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGGCGGCGC TGGCCAGTAG CCTGATCCGG CAGAAGCGGG AGGTCCGCGA GCCCGGGGGC    60AGCCGGCCGG TGTCGGCGCA GCGGCGCGTG TGTCCCCGCG GCACCAAGTC CCTTTGCCAG   120AAGCAGCTCC TCATCCTGCT GTCCAAGGTG CGACTGTGCG GGGGGGGGCC CGCGCGGCCG   180GACCGCGGCC CGGAGCCTCA GCTCAAAGGC ATCGTCACCA AACTGTTCTG CCGCCAGGGT   240TTCTACCTCC AGGCGAATCC CGACGGAAGC ATCCAGGGCA CCCCAGAGGA TACCAGCTCC   300TTCACCCACT TCAACCTGAT CCCTGTGGGC CTCCGTGTGG TCACCATCCA GAGCGCCAAG   360CTGGGTCACT ACATGGCCAT GAATGCTGAG GGACTGCTCT ACAGTTCGCC GCATTTCACA   420GCTGAGTGTC GCTTTAAGGA GTGTGTCTTT GAGAATTACT ACGTCCTGTA CGCCTCTGCT   480CTCTACCGCC AGCGTCGTTC TGGCCGGGCC TGGTACCTCG GCCTGGACAA GGAGGGCCAG   540GTCATGAAGG GAAACCGAGT TAAGAAGACC AAGGCAGCTG CCCACTTTCT GCCCAAGCTC   600CTGGAGGTGG CCATGTACCA GGAGCCTTCT CTCCACAGTG TCCCCGAGGC CTCCCCTTCC   660AGTCCCCCTG CCCCCCTGAA                                               680(2)SEQIDNO：2信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：225个氨基酸

  (B)类型：  氨基酸

  (C)链型：

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQIDNO：2：Met Ala Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ile Arg Gln Lys Arg Glu Val

-25                 -20                 -15Arg Glu Pro Gly Gly Ser Arg Pro Val Ser Ala Gln Arg Arg Val

-10                  -5                   1Cys Pro Arg Gly Thr Lys Ser Leu Cys Gln Lys Gln Leu Leu Ile5                  10                  15Leu Leu Ser Lys Val Arg Leu Cys G1y Gly Arg Pro Ala Arg Pro20                  25                  30Asp Arg Gly Pro Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Lys Leu35                  40                  45Phe Cys Arg Gln Gly Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Pro Asp Gly Ser50                  55                  60Ile Gln Gly Thr Pro Glu Asp Thr Ser Ser Phe Thr His Phe Asn65                  70                  75Leu Ile Pro Val Gly Leu Arg Val Val Thr Ile Gln Ser Ala Lys80                  85                  90Leu Gly His Tyr Met Ala Met Asn Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ser95                 100                 105Ser Pro His Phe Thr Ala Glu Cys Arg Phe Lys Glu Cys Val Phe110                 115                 120Glu ASn Tyr Tyr Val Leu Tyr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Gln Arg125                 130                 135Arg Ser Gly Arg Ala Trp Tyr Leu Gly Leu Asp Lys Glu Gly Gln140                 145                 150Val Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr Lys Ala Ala Ala His155                 160                 165Phe Leu Pro Lys Leu Leu Glu Val Ala Met Tyr Gln Glu Pro Ser170                 175                 180Leu His Ser Val Pro Glu Ala Ser Pro Ser Ser Pro Pro Ala Pro185                 190                 195(2)SEQ ID NO：3信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：32个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQIDNO：3：GCCAGAGCAT GCAGCGGCGC GTGTGTCCCC GC               32(2)SEQ ID NO：4信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：33个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GCCAGAAGAT  CTGGGGGCAG GGGGACTGGA AGG           33(2)SEQ ID NO：5信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：33个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CTAGTGGATC  CCATCATGGC  GGCGCTGGCC AGT            33(2)SEQ ID NO：6信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：30个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CGACTGGATC CCCAGCGGCG CGTGTGTCCC                 30(2)SEQ ID NO：7信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：33个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CGACTTCTAG AATCAGGGGG  CAGGGGGACT  GGA           33(2)SEQ ID NO：8信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：33个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CTAGTGGATC  CCATCATGGC  GGCGCTGGCC  AGT             33(2)SEQ ID NO：9信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：30个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：EQ ID NO：9：GATTTACTCG  AGGGGGGCAG  GGGGACTGGA                 30

Claims (20)

1、一种分离的多核苷酸，它包括选自如下一组中的一个成员：

(a)一种编码包括如SEQ ID NO：2所示的第-26位氨基酸至第199位氨基酸的多肽的多核苷酸；

(b)一种编码包括如SEQ ID NO：2所示的第1位氨基酸至第199位氨基酸的多肽的多核苷酸；

(c)一种能够与(a)或(b)的多核苷酸杂交并且与(a)或(b)的多核苷酸之间至少有70％相同性的多核苷酸；以及

(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的一个多核苷酸片段。

2、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。

3、权利要求1的多核苷酸，它包括如SEQ ID NO：1所示的第1位核苷酸至第680位核苷酸。

4、权利要求1的多核苷酸，它包括如SEQ ID NO：1所示的第79位核苷酸至第680位核苷酸。

5、一种分离的多核苷酸，它包括选自如下一组中的一个成员：

(a)一种编码由ATCC保藏号97148中所含的DNA编码的成熟多肽的多核苷酸；

(b)一种编码由ATCC保藏号97148中所含的DNA表达的多肽的多核苷酸；

(c)一种能够与(a)或(b)的多核苷酸杂交并且与(a)或(b)的多核苷酸之间至少有70％相同性的多核苷酸；以及

(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的一个多核苷酸片段。

6、一种含有权利要求2的DNA的载体。

7、一种用权利要求6的载体遗传工程化的宿主细胞。

8、一种生产多肽的方法，该方法包括：从权利要求7的宿主细胞中表达由所说的DNA编码的多肽。

9、一种生产能够表达多肽的细胞的方法，该方法包括用权利要求6的载体遗传工程化细胞。

10、一种包括选自如下一组中的一个成员的多肽：(i)一种具有SEQ ID NO：2的推导的氨基酸序列的多肽及其片段，类似物与衍生物；以及(ii)一种由ATCC保藏号97148的cDNA编码的多肽，以及所说多肽的片段，类似物和衍生物。

11、一种抗权利要求10的多肽的抗体。

12、一种抑制权利要求10的多肽的生物学作用的化合物。

13、一种激活权利要求10的多肽的受体的化合物。

14、一种治疗需要FGF-14多肽的病人的方法，该方法包括：将治疗学有效量的权利要求10的多肽给予病人。

15、一种治疗需要抑制FGF-14多肽的病人的方法，该方法包括：将治疗学有效量的权利要求12的化合物给予病人。

16、权利要求14的方法，其中所说的治疗学有效量的所说多肽是通过向病人提供编码所说多肽的DNA并在体内表达该多肽的方式来给药。

17、权利要求15的方法，其中所说的化合物是一种多肽并且治疗学有效量的该化合物是通过向病人提供编码所说拮抗剂的DNA并在体内表达该拮抗剂的方式来给药。

18、一种鉴定作为权利要求10的多肽的***有活性的化合物的方法，该方法包括：

(a)在以所说的多肽正常刺激细胞的条件下，将待筛选的化合物与含有细胞的反应混合物合并，所说的反应混合物含有当细胞增殖时掺人细胞的标记；以及

(b)测定细胞的增殖程度以鉴定该化合物是否是一种有效的***。

19、一种鉴定作为权利要求10的多肽的拮抗剂有活性的化合物的方法，该方法包括：

(a)在以所说的多肽正常刺激细胞的条件下，将待筛选的化合物，多肽和含有细胞的反应昆合物合并，所说的反应混合物含有当细胞增殖时掺人细胞的标记；以及

(b)测定该细胞的增殖程度以鉴定该化合物是否是一种有效的拮抗剂。

20、一种诊断与权利要求10的多肽表达不足有关的疾病或疾病的易感性的方法，该方法包括：测定在编码所说的多肽的核酸序列中的突变。

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