CN118324974A - 一种细胞外囊泡的富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞外囊泡的富集方法。包括以下物质的量份的原料：去离子水100000‑200000份、丙烯酸2000‑8000份、氢氧化钠1000‑5500份、N‑异丙基丙烯酰胺1500‑2800份、过硫酸钾10‑50份、N,N'‑亚甲基双丙烯酰胺5‑1000份。本发明通过简单的孵育，即可减少细胞条件培养基的体积，实现EVs的浓缩，简化了操作、降低了成本，提高了EVs的产率。本发明富集到的细胞外囊泡结构完整，且具有完好的生物活性，可对其进行蛋白质组学、基因组学等后续下游分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞外囊泡分离技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡的富集方法。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是所有真核细胞分泌到细胞外的一种膜性纳米囊泡，直径范围是30-1000nm。大量实验证据表明，EVs主动运输蛋白质、核酸和脂质，参与多种生物功能并发挥重要作用。近些年，特别是间充质干细胞来源的EVs在再生医学研究中获得了突出的地位，已被用于调节免疫反应，以及体内肾脏、心脏和神经等组织的修复和再生。
由于用于治疗的EVs制剂需保证高纯度与大剂量，例如治疗创伤性脊髓损伤引起的神经炎症需要高达100μg/mL的EVs，因此高效富集具有生物活性的EVs对于其治疗应用至关重要。
目前，超速离心仍然是最主要的EVs富集方法，但是受到离心管和设备的影响，限制了可处理细胞条件培养基的体积，且通过超速离心分离的EVs会受到非囊泡大分子的污染。其他方法，如超滤、尺寸排阻色谱、免疫磁珠等并不能显著提高EVs的产量且需要复杂的样品处理过程。因此发展简单、高效、经济的EVs富集技术已经成为目前世界上相关领域的研究热点和当务之急。
发明内容
对于EVs的大规模富集来说，细胞条件培养基体积的减少(EVs的浓缩)以及简单高效的EVs分离是必要的，针对现有技术的不足和实际需求，本发明的目的是提供一种基于离子网络的高吸水性聚合物的制备以及基于电荷中和的高效富集EVs的提取试剂，通过二者的结合，可以实现EVs的大规模生产。
一种高吸水性聚合物，包括以下物质的量份的原料：去离子水100000-200000份、丙烯酸2000-8000份、氢氧化钠1000-5500份、N-异丙基丙烯酰胺1500-2800份、过硫酸钾10-50份、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺5-1000份。
一种提取试剂，包括以下重量份的原料：聚丙烯酸钠1-50份、去离子水50-1000份。
优选的，所述聚丙烯酸钠的分子量为2000-6000kDa。
一种细胞外囊泡的富集方法，按照如下步骤进行：
(1)通过低速离心，对细胞条件培养基中的细胞外囊泡进行粗提取，获得粗提液；
(2)将步骤(1)获得的粗提液与所述高吸水性聚合物共孵育；
(3)孵育后，将所得样品与所述提取试剂按照体积比为(1-3):1混合，得到混合液，进行孵育；
(4)孵育后，将所得样品于8000-10000g离心30-60min，去除上清液，收集沉淀；
(5)取清洗缓冲液重悬步骤(4)获得的沉淀，得到重悬液，加入超滤离心管中进行竞争洗脱，将其离心，向超滤离心管的膜上继续加入清洗缓冲液，重复该步骤1-8次后，加入PBS缓冲液继续清洗，最后将滤膜上的细胞外囊泡用PBS缓冲液重悬，完成富集。
优选的，所述低速离心条件为：在4℃及以下分别以200g和2000g离心10min和20min。
步骤(1)粗提取过程中产生的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤。
步骤(2)所述孵育的具体方法为：将权利要求1所述聚合物按照8-12mg/mL的浓度与粗提液在振荡的条件下孵育2-3h。
步骤(5)所述的清洗缓冲液为CaCl2溶液、KCl溶液或MgCl2溶液，溶液的浓度为0.1M-5M。
本发明的有益效果：本发明通过简单的孵育，即可减少细胞条件培养基的体积，实现EVs的浓缩；本发明不需要昂贵的设备超速离心机；本发明简化了操作、降低了成本，提高了EVs的产率；本发明富集到的细胞外囊泡结构完整，且具有完好的生物活性，可对其进行蛋白质组学、基因组学等后续下游分析。
附图说明
图1是通过超速离心法富集得到的EVs的透射电镜图。
图2是通过本发明富集得到的EVs的透射电镜图。
图3是通过将细胞条件培养基经本发明所述的高吸水性聚合物浓缩后，实际超速离心机上机量与未经过浓缩的对比例3条件培养基上机体积对比。
图4是通过将细胞条件培养基经本发明所述的高吸水性聚合物浓缩后，实际单次细胞条件培养基的处理量与未经浓缩的对比例2条件培养基处理体积对比(以50mL离心管为例)。
图5是本发明实施例1富集的脐带间充质干细胞来源EVs的NTA结果。
图6是本发明实施例3浓缩后样品的NTA结果。
图7是本发明实施例1与对比例富集的脐带间充质干细胞来源EVs的NTA结果对比。
图8是本发明实施例1与对比例富集的脐带间充质干细胞来源EVs的Western Blot结果对比；
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
基于离子网络的高吸水性聚合物，由以下物质的量份的原料组成：去离子水111000份、丙烯酸5000份、氢氧化钠3250份、N-异丙基丙烯酰胺2150份、过硫酸钾11份、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺30份。
所述的高吸水性聚合物的制备方法，步骤如下：按比例将去离子水与丙烯酸、氢氧化钠和N-异丙基丙烯酰胺在40℃、600r的条件下搅拌，然后按比例加入过硫酸钾和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，并提高温度至60℃，同时降低转速至400r，持续搅拌10min后，置于75℃烘箱，完成聚合后，将烘箱温度调低至60℃，保持24h。
基于电荷中和高效富集EVs的提取试剂，由以下重量份的原料组成：聚丙烯酸钠4份、去离子水100份；所述聚丙烯酸钠的分子量为4000kDa。
一种细胞外囊泡的富集方法，按照如下步骤进行：
(1)通过低速离心，对细胞条件培养基中(培养脐带间充质干细胞)的细胞外囊泡进行粗提取，获得粗提液；所述低速离心条件为：在4℃分别以200g和2000g离心10min和20min；离心后的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤；
(2)将步骤(1)获得的粗提液与所述高吸水性聚合物共孵育；所述聚合物按照10mg/mL的浓度与粗提液在振荡的条件下孵育2.5h；
(3)孵育后，将所得样品与所述提取试剂按照体积比为2:1混合，得到混合液，进行孵育；
(4)孵育后，将所得样品于9000g离心45min，去除上清液，收集沉淀；
(5)取清洗缓冲液重悬步骤(4)获得的沉淀，得到重悬液，加入超滤离心管中进行竞争洗脱，将其离心，向超滤离心管的膜上继续加入清洗缓冲液，重复该步骤5次后，加入PBS缓冲液继续清洗，最后将滤膜上的细胞外囊泡用PBS缓冲液重悬，完成富集；所述的清洗缓冲液为浓度1M的CaCl2溶液。
实施例2
基于离子网络的高吸水性聚合物，由以下物质的量份的原料组成：去离子水120000份、丙烯酸3000份、氢氧化钠2250份、N-异丙基丙烯酰胺1800份、过硫酸钾12份、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺50份。
所述的高吸水性聚合物的制备方法，步骤如下：按比例将去离子水与丙烯酸、氢氧化钠和N-异丙基丙烯酰胺在40℃、600r的条件下搅拌，然后按比例加入过硫酸钾和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，并提高温度至60℃，同时降低转速至400r，持续搅拌10min后，置于75℃烘箱，完成聚合后，将烘箱温度调低至60℃，保持24h。
基于电荷中和高效富集EVs的提取试剂，由以下重量份的原料组成：聚丙烯酸钠20份、去离子水500份；所述聚丙烯酸钠的分子量为3000kDa。
一种细胞外囊泡的富集方法，按照如下步骤进行：
(1)通过低速离心，对细胞条件培养基中(培养脐带间充质干细胞)的细胞外囊泡进行粗提取，获得粗提液；所述低速离心条件为：在4℃及以下分别以200g和2000g离心10min和20min；离心后的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤；
(2)将步骤(1)获得的粗提液与所述高吸水性聚合物共孵育；所述聚合物按照8mg/mL的浓度与粗提液在振荡的条件下孵育2h；
(3)孵育后，将所得样品与所述提取试剂按照体积比为1:1混合，得到混合液，进行孵育；
(4)孵育后，将所得样品于8000g离心60min，去除上清液，收集沉淀；
(5)取清洗缓冲液重悬步骤(4)获得的沉淀，得到重悬液，加入超滤离心管中进行竞争洗脱，将其离心，向超滤离心管的膜上继续加入清洗缓冲液，重复该步骤4次后，加入PBS缓冲液继续清洗，最后将滤膜上的细胞外囊泡用PBS缓冲液重悬，完成富集；所述的清洗缓冲液为浓度2M的KCl溶液。
实施例3
基于离子网络的高吸水性聚合物，由以下物质的量份的原料组成：去离子水180000份、丙烯酸7500份、氢氧化钠5050份、N-异丙基丙烯酰胺2500份、过硫酸钾40份、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺500份。
所述的高吸水性聚合物的制备方法，步骤如下：按比例将去离子水与丙烯酸、氢氧化钠和N-异丙基丙烯酰胺在40℃、600r的条件下搅拌，然后按比例加入过硫酸钾和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，并提高温度至60℃，同时降低转速至400r，持续搅拌10min后，置于75℃烘箱，完成聚合后，将烘箱温度调低至60℃，保持24h。
基于电荷中和高效富集EVs的提取试剂，由以下重量份的原料组成：聚丙烯酸钠80份、去离子水800份；所述聚丙烯酸钠的分子量为6000kDa。
一种细胞外囊泡的富集方法，按照如下步骤进行：
(1)通过低速离心，对细胞条件培养基中(培养脐带间充质干细胞)的细胞外囊泡进行粗提取，获得粗提液；所述低速离心条件为：在4℃及以下分别以200g和2000g离心10min和20min；离心后的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤；
(2)将步骤(1)获得的粗提液与所述高吸水性聚合物共孵育；所述聚合物按照12mg/mL的浓度与粗提液在振荡的条件下孵育3h；
(3)孵育后，将所得样品与所述提取试剂按照体积比为3:1混合，得到混合液，进行孵育；
(4)孵育后，将所得样品于10000g离心30min，去除上清液，收集沉淀；
(5)取清洗缓冲液重悬步骤(4)获得的沉淀，得到重悬液，加入超滤离心管中进行竞争洗脱，将其离心，向超滤离心管的膜上继续加入清洗缓冲液，重复该步骤7次后，加入PBS缓冲液继续清洗，最后将滤膜上的细胞外囊泡用PBS缓冲液重悬，完成富集；所述的清洗缓冲液为浓度1M的MgCl2溶液。
对比例1
基于离子网络的高吸水性聚合物，由以下物质的量份的原料组成：去离子水111000份、丙烯酸5000份、氢氧化钠3250份、N-异丙基丙烯酰胺2150份、过硫酸钾11份、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺30份。
所述的高吸水性聚合物的制备方法，步骤如下：按比例将去离子水与丙烯酸、氢氧化钠和N-异丙基丙烯酰胺在40℃、600r的条件下搅拌，然后按比例加入过硫酸钾和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，并提高温度至60℃，同时降低转速至400r，持续搅拌10min后，置于75℃烘箱，完成聚合后，将烘箱温度调低至60℃，保持24h。
一种细胞外囊泡的富集方法，按照如下步骤进行：
(1)通过低速离心，对细胞条件培养基中(培养脐带间充质干细胞)的细胞外囊泡进行粗提取，获得粗提液；所述低速离心条件为：在4℃分别以200g和2000g离心10min和20min；离心后的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤；
(2)将步骤(1)获得的粗提液与所述高吸水性聚合物共孵育；所述聚合物按照10mg/mL的浓度与粗提液在振荡的条件下孵育2.5h；
(3)孵育后，将所得样品于9000g离心45min，去除上清液，收集沉淀；
(4)取清洗缓冲液重悬步骤(3)获得的沉淀，得到重悬液，加入超滤离心管中进行竞争洗脱，将其离心，向超滤离心管的膜上继续加入清洗缓冲液，重复该步骤5次后，加入PBS缓冲液继续清洗，最后将滤膜上的细胞外囊泡用PBS缓冲液重悬，完成富集；所述的清洗缓冲液为浓度1M的CaCl2溶液。
对比例2
基于电荷中和高效富集EVs的提取试剂，由以下重量份的原料组成：聚丙烯酸钠4份、去离子水100份；所述聚丙烯酸钠的分子量为4000kDa。
一种细胞外囊泡的富集方法，按照如下步骤进行：
(1)通过低速离心，对细胞条件培养基中(培养脐带间充质干细胞)的细胞外囊泡进行粗提取，获得粗提液；所述低速离心条件为：在4℃分别以200g和2000g离心10min和20min；离心后的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤；
(2)将步骤(1)获得的粗提液与所述提取试剂按照体积比为2:1混合，得到混合液，进行孵育；
(3)孵育后，将所得样品于9000g离心45min，去除上清液，收集沉淀；
(4)取清洗缓冲液重悬步骤(3)获得的沉淀，得到重悬液，加入超滤离心管中进行竞争洗脱，将其离心，向超滤离心管的膜上继续加入清洗缓冲液，重复该步骤5次后，加入PBS缓冲液继续清洗，最后将滤膜上的细胞外囊泡用PBS缓冲液重悬，完成富集；所述的清洗缓冲液为浓度1M的CaCl2溶液。
对比例3(超速离心法)
超速离心法分离细胞外囊泡按照如下步骤进行：
(1)在4℃条件下分别以200g、2000g和10000g离心10min、20min和30min；离心后的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤；
(2)然后将滤液在4℃条件下以100000g离心2h，收集沉淀；
(3)取PBS缓冲液重悬步骤(2)获得的沉淀，得到重悬液，并再次以100000g离心2h进行洗涤，最后将沉淀用PBS缓冲液重悬，完成富集。
实验例：
对比例3是传统进行细胞外囊泡的富集方法，通过超速离心法富集得到的EVs的透射电镜图如图1所示，本发明实施例1制备的EVs的透射电镜图如图2所示。
由图1和图2的对比可以看出，本发明实施例1制备的EVs细胞外囊泡结构完整，更饱满，轮廓更加清晰，而对照例制备的EVs细胞外囊泡轮廓不清晰，结构不完整，可能由于过高的转速导致EVs结构的损坏。
对比例3中，通过超速离心法对细胞条件培养基(培养脐带间充质干细胞)的细胞外囊泡进行富集，一次实验，超速离心机能够处理的培养基的体积为228mL，由图3可以看出，通过本发明所述高吸水性聚合物对细胞条件培养基(培养脐带间充质干细胞)浓缩，能够有效提高超速离心机单次细胞条件培养基的上机量，提高传统细胞外囊泡富集方法的效率。
对比例2中，通过本发明所述提取试剂对细胞条件培养基(培养脐带间充质干细胞)中的EVs进行分离，在50mL离心管中，按照细胞条件培养基与提取试剂体积比2:1混合，所能处理的培养基的体积为30mL，由图4可以看出，通过本发明所述的高吸水性聚合物对细胞条件培养基浓缩后，能够有效提高单次细胞条件培养基的处理量，提高本发明富集细胞外囊泡的效率。
采用Nanoparticle Tracking Analysis对实施例1和对比例1所获得的样品进行表征，结果如图5和图6所示，实施例1获得的EVs样品的均一性优于对比例1所获得的样品，这表明高吸水性聚合物仅能对细胞条件培养基进行浓缩，通过与本发明提到的提取试剂结合使用才能获得具有良好均一性的EVs样品。
采用Nanoparticle Tracking Analysis对实施例1和对比例3获得的EVs(等量条件培养基提取)进行表征，结果如图7所示，实施例1获得EVs的量优于对照例所获得的EVs，这表明本发明富集方法的高效性。
采用Western blot对实施例1、对比例3获得的EVs(等量条件培养基提取)进行表征，结果如图8所示，实施例1获得的EVs样品中特征蛋白HSP70、CD63、CD9均稳定表达，对照例获得的EVs不能稳定表达，这进一步表明本发明富集方法的可靠性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种高吸水性聚合物，其特征在于，包括以下物质的量份的原料：去离子水100000-200000份、丙烯酸2000-8000份、氢氧化钠1000-5500份、N-异丙基丙烯酰胺1500-2800份、过硫酸钾10-50份、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺5-1000份。
2.一种提取试剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：聚丙烯酸钠1-50份、去离子水50-1000份。
3.根据权利要求2所述提取试剂，其特征在于，所述聚丙烯酸钠的分子量为2000-6000kDa。
4.一种细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)通过低速离心，对细胞条件培养基中的细胞外囊泡进行粗提取，获得粗提液；
(2)将步骤(1)获得的粗提液与权利要求1所述高吸水性聚合物共孵育；
(3)孵育后，将所得样品与权利要求2所述提取试剂按照体积比为(1-3):1混合，得到混合液，进行孵育；
(4)孵育后，将所得样品于8000-10000g离心30-60min，去除上清液，收集沉淀；
(5)取清洗缓冲液重悬步骤(4)获得的沉淀，得到重悬液，加入超滤离心管中进行竞争洗脱，将其离心，向超滤离心管的膜上继续加入清洗缓冲液，重复该步骤1-8次后，加入PBS缓冲液继续清洗，最后将滤膜上的细胞外囊泡用PBS缓冲液重悬，完成富集。
5.根据权利要求4所述细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，所述低速离心条件为：在4℃及以下分别以200g和2000g离心10min和20min。
6.根据权利要求4所述细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，步骤(1)粗提取过程中产生的上清液通过0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤。
7.根据权利要求4所述细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，步骤(2)所述孵育的具体方法为：将权利要求1所述聚合物按照8-12mg/mL的浓度与粗提液在振荡的条件下孵育2-3h。
8.根据权利要求4所述细胞外囊泡的富集方法，其特征在于，步骤(5)所述的清洗缓冲液为CaCl2溶液、KCl溶液或MgCl2溶液，溶液的浓度为0.1M-5M。
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