CN118307653A - 小麦转录因子TaHRP1在小麦抗病育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了小麦转录因子TaHRP1在小麦抗病育种中的应用，属于基因工程技术领域，本发明公开了小麦转录因子TaHRP1在提高小麦条锈病抗性、调控小麦条锈病抗性、小麦抗条锈病品种培育或小麦抗病育种中的应用，该小麦转录因子TaHRP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明发现TaHRP1基因在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用，即TaHRP1基因能够提高小麦抗条锈病的能力。TaHRP1基因在植物体内过量表达时，可以转录激活一系列下游抗病功能基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果。本发明证实TaHRP1基因可作为目的基因用于提高小麦抗病性，在培育抗病小麦品种中具有较好应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及小麦转录因子TaHRP1在小麦抗病育种中的应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是全球分布范围最广、种植面积最大、商品率最高的粮食作物之一。由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的小麦条锈病是一种危害极其严重的流行性真菌病害，严重影响小麦的产量。种植抗病品种是目前最为绿色有效的病害防控措施，但是品种抗性会因条锈菌致病小种的毒性变异而被克服，导致病害再次爆发。因此，不断挖掘新的小麦抗条锈病基因，创制持久的抗病品种是防控小麦条锈病的根本途径。
为了应对病原菌的入侵，植物进化出了成熟的防御机制。当通过质膜定位的模式识别受体(PRR)感知到称为微生物/病原体相关分子模式(MAMPs/PAMP)的保守分子结构时，就会触发植物免疫的第一层。由该模式触发的免疫称为PAMP/模式触发免疫(PTI)；适应的病原菌获得了许多抑制植物免疫的毒力机制，例如通过分泌效应蛋白来抑制植物免疫。作为对策，植物进化出先天免疫***的第二层，以直接或间接识别这种效应蛋白，从而引发效应蛋白触发的免疫(ETI)。
在植物与病原菌相互博弈的过程中，存在复杂的调控网络及其信号传导，转录因子(Transcription factor,TF)扮演着十分重要的角色。转录因子，也称反式作用因子，通过与靶基因上游特定的DNA元件(顺式作用元件)结合，来激活或抑制靶基因的转录活性，进而调控靶基因的时空特异性表达。
因此，研究小麦与条锈菌互作过程中转录因子调控抗病信号通路，揭示转录因子抗条锈病的分子机理，对于优良抗性品种的培育、抗性品种的合理利用及小麦条锈病的持久控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供小麦转录因子TaHRP1在小麦抗病育种中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现小麦转录因子TaHRP1及TaHRP1基因在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用，能够提高小麦抗条锈病的能力，在培育抗病小麦品种中具有较好应用前景，为小麦抗病育种奠定重要基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供小麦转录因子TaHRP1在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用；
所述小麦转录因子TaHRP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供所述小麦转录因子TaHRP1的编码基因在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用；
所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供包含所述编码基因的重组载体在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用。
本发明还提供包含所述重组载体的工程菌在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用。
进一步地，通过上调所述小麦转录因子TaHRP1或所述编码基因的表达量，提高小麦条锈病抗性。
本发明还提供一种创制抗条锈病转基因小麦品种的方法，包括将包含小麦转录因子TaHRP1编码基因的生物材料导入受体植株中的步骤；所述小麦转录因子TaHRP1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，所述生物材料包含重组载体、表达盒和工程菌。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过基因功能研究，发现TaHRP1基因在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用，即TaHRP1基因能够提高小麦抗条锈病的能力。TaHRP1基因在植物体内过量表达时，可以转录激活一系列下游抗病功能基因的表达，赋予转基因植物良好的抗病效果。本发明证实TaHRP1基因可作为目的基因用于提高小麦抗病性，在培育抗病小麦品种中具有较好应用前景，为小麦抗病育种奠定重要基础。
并且与传统的抗病育种技术相比，本发明采用的植物抗病基因工程技术可以突破物种间的生殖隔离和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内实现目标性状的定向改良，给作物提供更为全面而持续、广谱且特异的保护。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TaHRP1转基因小麦材料鉴定图；其中，(a)tahrp1编辑植株为编辑染色体A、B、D上TaHRP1基因示意图；(b)TaHRP1过表达转基因小麦材料中TaHRP1表达量测定结果图；(c)TaHRP1过表达转基因小麦材料中TaHRP1蛋白水平的测定结果图；
图2为T2代tahrp1编辑植株减弱了小麦抗条锈病能力结果图；其中，(a)是tahrp1基因编辑植株叶片侵染条锈菌后表型图；(b)是基因编辑植株叶片条锈菌生物量水平图；(c)是条锈菌侵染后24h和48h的组织学观察图；(d)和(e)是条锈菌侵染后24h和48h的菌丝长度(d)和菌丝面积(e)统计图；
图3为TaHRP1过表达转基因材料提高了小麦抗条锈病能力结果图；其中，(a)是TaHRP1过表达转基因植株叶片侵染条锈菌后表型图；(b)是TaHRP1过表达转基因植株叶片条锈菌生物量水平图；(c)和(d)TaHRP1过表达转基因植株接种条锈菌后抗病相关基因TaPR1(c)和TaPR2(d)的表达水平图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1TaHRP1转基因编辑植株的创制与鉴定
小麦TaHRP1基因的CDS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述转录因子TaHRP1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：
ATGGATCCGCCGCACCCTCCACACCACCACCACCACCACCACCGGCTCCACCTCCGCCTCGACCCCGGCCACCACCACCGCATCCACATCCACCTCCGCCACCACGCCGCCCACCTCCTGCCCGCCGCCGCTCCCTGTGCCCACCACCACCACCACACATCGGTTCCTCTTCCTCCTCCCCACACGCTTCCCCACCCGCCGACCGCGGCGGAAGGACCACTCCCCGGGCCGCAGGGAGAGGCGGCGGGGGACGCGGATGAGCCGGCGCCGCAGGCGGAGCGAGGAGAGGAAGTTTACCTCGGGCAGGAAGAAGAGTGGGGGGAGGAGGAGGAGGAGCCGGTGTTCGTTCTGACGGAGGAGTGGGCCGAGTTCTTCGCCAAGGCCGACGCCAAGAGGAGGCTGGCCAAGCAGCAGAGGAAGAACCGGAAGAAATAG(SEQ ID NO：1)；
MDPPHPPHHHHHHHRLHLRLDPGHHHRIHIHLRHHAAHLLPAAAPCAHHHHHTSVPL PPPHTLPHPPTAAEGPLPGPQGEAAGDADEPAPQAERGEEVYLGQEEEWGEEEEEPVFVLTEEWAEFFAKADAKRRLAKQQRKNRKK*(SEQ ID NO：2)。
1sgRNA靶点设计
根据小麦TaHRP1基因的基因组序列和CRISPR/Cas9技术设计靶点的要求，设计了在小麦TaHRP1基因A，B和D染色体上同时含有的guide RNA(gRNA)序列，其序列为GAGGAGAGGAAGTTTACCT，将gRNA构建到基因编辑载体上。
CRISPR-Cas9-gRNA载体的构建方法如下：首先吸取MT1T2-F和MT1T2-R引物各100μL，吸取MT1T2-F0和MT1T2-R0各6μL混匀。配置以下体系：混合引物2μL，pCBC-DT1T2载体1μL，ddH2O 17μL，Mix酶23μL。PCR反应程序为98℃45s；98℃15s；60℃30s；72℃1min；35个循环，72℃5min。4种引物为：TaHRP1-MT1T2-F:ATATATGGTCTCTGGCGACTCAGGACCACTCCCCGGGCCGCAGG；TaHRP1-MT1T2-F0：gACTCAGGACCACTCCCCGGGCCGCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；TaHRP1-MT1T2-R0：CCCGAGGTAAACTTCCTCTCCTCGAGTCGCTTCTTGGTGCC；TaHRP1-MT1T2-R：ATTATTGGTCTCTAAACCCCGAGGTAAACTTCCTCTCCTCGAGT。
扩增产物切胶回收后，以下体系进行连接：PCR产物2μL，pBUE411(四川农业大学小麦所保存)2μL，10x NEB buffer 1.5μL，10x BSA 1.5μL，BsaI 1μL，T4连接酶1μL，ddH2O 6μL。反应程序为：37℃，5h；50℃5min；50℃10min。
2农杆菌介导小麦愈伤组织遗传转化
种植受体材料小麦品种Fielder，光周期温度为24℃、时间为16h；暗周期温度为20℃，时间为8h。受体材料开花后14-16天后取种子，分离幼胚。把构建好的CRISPR-Cas9-gRNA载体转化至EHA105农杆菌菌种，挑取阳性单斑接种于MGL液体培养基中，28℃黑暗过夜培养。用侵染液将收集的菌液重悬混匀后加入到受体材料的幼胚中进行侵染，共培养两天后去掉幼胚的胚轴，经过恢复培养、筛选培养、分化培养和生根培养后，获得了转CRISPR-Cas9-gRNA的阳性植株。对转基因阳性植株后代进行检测及测序分析，最终获得了TaHRP1基因A，B和D染色体上都成功编辑的转基因植株(tahrp1)(见图1中a)。
3tahrp1转基因编辑植株的抗病性鉴定
为探究TaHRP1是否参与条锈菌侵染过程中寄主小麦的免疫反应，将tahrp1转基因编辑植株和对照品种fielder在温度为16℃、光/暗周期为16h/8h的培养箱中培养。待小麦生长至二叶一心期时对其接种条锈菌CYR23。用毛笔蘸取浸在适量无菌水中的条锈菌，均匀涂抹在小麦叶片上，于10℃保湿培养箱黑暗培养24h，之后正常培养。对第二片叶接种条锈菌CYR23并于不同时间点(0h、24h、48h、120h)取样进行观察。
接菌后第14天，tahrp1转基因编辑植株叶片产孢与对照组相比明显增加(图2中a)。接菌后120h，对产孢叶片生物量进行分析，发现tahrp1转基因编辑植株叶片上条锈菌的相对生物量与对照相比显著增加(图2中b)。生物量检测方法如下：
用含有小麦的EF和条锈菌EF的质粒分别进行双标准曲线的绘制，然后提取接菌后120h叶片的DNA进行定量，检测引物分别是TaEF-F和TaEF-R；PstEF1-F和PstEF1-R，在双标准曲线的结果下计算出样品中含有小麦EF的拷贝量和条锈菌EF的拷贝量，进行相对于对照组计算。所用反应体系为：模板产物2μL，正反向引物各0.5μL，定量MIX 10μL，ddH2O 7μL。所用扩增程序为：95℃，10min；40个循环(95℃，15s；55℃，20s)；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。所用引物如下：TaEF-F：TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT，TaEF-R：ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT，PstEF1-F：TTCGCCGTCCGTGATATGAGACAA，PstEF1-R：ATGCGTATCATGGTGGTGGAGTGA。
接菌后24h和48h，将被侵染的小麦叶片剪成2cm左右叶段，置于脱色液中，37℃水浴脱色至叶段完全褪绿。用50mM Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液冲洗3次，每次10min。加入20μg/mL浓度的小麦胚凝集素荧光染液避光染色24h。荧光显微镜观察并统计菌丝的长度和面积。结果如图2中c所示，tahrp1转基因编辑植株叶片与对照组均可观察到气孔下囊和入侵菌丝，但tahrp1转基因编辑植株气孔下囊较对照相比更大且入侵菌丝更长(图2中d，e)。表明TaHRP1基因的敲除影响了条锈菌菌丝的生长发育，可能促进条锈菌侵染初期入侵菌丝的扩展，暗示该转录因子在小麦抗条锈菌中的重要作用。
实施例2TaHRP1OE过表达转基因植株的创制与鉴定
1创制TaHRP1OE过表达转基因小麦材料
为了进一步明确TaHRP1在抗条锈病中作用，利用TaHRP1的CDS序列构建过表达载体pEarleyGate101(保存于四川农业大学小麦研究所)，构建过程如下：TaHRP1 CDS胶回收产物2.5μL，中间载体pDONR 2210.3-0.4μL(100ng)，BP反应酶0.2μL，1×TE Buffer2μL。25T孵育过夜。然后进行大肠杆菌转化获得BP重组载体。接着进行LR重组反应。BP重组载体2.5μL，pEarleyGate1010.3μL，LR反应酶0.2μL，1×TE Buffer 2μL。25℃孵育过夜，然后进行大肠杆菌转化，获得TaHRP1的过表达载体pEarleyGate101。
参照实施例1，把构建好的过表达载体pEarleyGate101转化至EHA105农杆菌菌种，再利用农杆菌转化创制TaHRP1OE过表达转基因小麦材料。采取T2代转基因植株二叶做定量，检测TaHRP1的表达量(图1中b)。同时提取植物总蛋白进行TaHRP1蛋白检测，明确TaHRP1OE过表达转基因小麦材料的阳性植株(图1中c)。检测TaHRP1的表达量所用定量引物为：TaHRP1-qRT-F：AGAGGAAGTTTACCTCGGGCA；TaHRP1-qRT-R：CGAAGAACTCGGCCCACTC。所用体系和程序参照上述生物量检测方法。TaHRP1蛋白质检测步骤为：1)取0.5g小麦叶片样品磨碎，加入2mL裂解缓冲液(10mM MgCl2，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，20mM HEPES-KOH，pH7.4，5mM DTT，1mM PMSF，1％protease inhibitor cocktail)，用力涡旋，置于冰上。(2)然后4℃12000g离心10min后，取上清加入等体积的2x蛋白上样缓冲液，沸水浴10分钟后进行SDS-PAGE实验。
2TaHRP1OE过表达转基因植株的抗病性鉴定
接菌后第14天，TaHRP1OE转基因植株叶片产孢与对照组相比明显减少，过敏性坏死显著增加(图3中a)。接菌后，对产孢叶片生物量进行分析，发现TaHRP1OE转基因植株叶片上条锈菌的相对生物量与对照相比显著减少(图3中b)。
为进一步明确TaHRP1基因在条锈菌侵染过程中寄主小麦的免疫反应，参照实施例1，在接种条锈菌后24h取小麦叶片，通过qRT-PCR检测抗病相关基因转录水平变化。定量分析抗病相关基因TaPR1和TaPR2相关程序，检测步骤等参考上述生物量检测方法。所用到定量引物为：TaPR1-F：GAGAATGCAGACGCCCAAGC；TaPR1-R：CTGGAGCTTGCAGTCGTTGATC；TaPR2-F：AGGATGTTGCTTCCATGTTTGCCG；TaPR2-R:AAGTAGATGCGCATGCCGTTGATG。结果如图3中c和d所示，与对照相比，TaHRP1OE转基因植株中TaPR1和TaPR2的表达量均显著上升，表明过表达TaHRP1基因增强了小麦抗条锈病能力。进一步明确TaHRP1基因在小麦抗条锈菌过程中的重要性。综合上述，试验结果证实TaHRP1正调控小麦抗条锈病能力，可作为目的基因用于提高植物抗病性的分子育种。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.小麦转录因子TaHRP1在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用；
所述小麦转录因子TaHRP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述小麦转录因子TaHRP1的编码基因在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用；
所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.包含权利要求2所述编码基因的重组载体在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用。
4.包含权利要求3所述重组载体的工程菌在如下任一项中的应用：
(1)在提高小麦条锈病抗性中的应用；
(2)在调控小麦条锈病抗性中的应用；
(3)在小麦抗条锈病品种培育中的应用；
(4)在小麦抗病育种中的应用。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，通过上调所述小麦转录因子TaHRP1或所述编码基因的表达量，提高小麦条锈病抗性。
6.一种创制抗条锈病转基因小麦品种的方法，其特征在于，包括将包含小麦转录因子TaHRP1编码基因的生物材料导入受体植株中的步骤；所述小麦转录因子TaHRP1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生物材料包含重组载体、表达盒和工程菌。
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