CN118302446A - 新型抗lag3抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了抗LAG3抗体或其抗原结合片段、编码所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸、包括所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段的用途。

Description

新型抗LAG3抗体
技术领域
本公开总体上涉及新型抗LAG3抗体。
背景技术
淋巴细胞激活基因3(LAG-3)属于免疫球蛋白超家族，其由胞外区、跨膜区和胞质区组成。LAG-3的基因位于染色体12P13上，与CD4基因在染色体上的位置和结构相似。LAG-3在活化T细胞、耗竭T细胞、肿瘤浸润性T细胞和调节性T细胞(Treg)上表达。
LAG3为多配体阻断剂，其配体包括MHC II、FGL1、LSECtin等。LAG3的主要配体是MHC II类，LAG3以比CD4更高的亲和力与该主要配体结合。其蛋白质以与CTLA-4和PD-1相似的方式负调节T细胞的细胞增殖、活化和稳态，并且已经报道其在Treg抑制功能中发挥作用。FGL1(纤维蛋白原样蛋白1)，一种肝脏分泌蛋白，是独立于MHC-II的另一种(主要)LAG3功能配体。操纵FGL-1与T细胞结合已被提议用于癌症免疫疗法和抗炎治疗。LSECtin也是LAG3的配体，可以与LAG3上的聚糖相互作用。LSECtin属于C型凝集素，并且主要在肝脏中表达。此外，多种肿瘤细胞表达LSECtin，包括黑素瘤、膀胱癌和胰腺癌。
同时，抑制LAG-3也可以降低调节性T细胞对免疫应答的抑制。因此，LAG-3被认为是比其它免疫检查点蛋白更有吸引力的靶点。靶向LAG-3的抗体药物可能成为未来重要的抗肿瘤药物。然而，目前世界上被批准上市的靶向LAG-3的药物很少。
目前仍缺乏靶向LAG-3的高亲和力抗体，所述高亲和力抗体具有阻断LAG-3与多种配体相互作用的良好活性以及更好的疗效和药代动力学(PK)。
仍然需要新型抗LAG-3抗体。
发明内容
在整个本公开中，本文使用的冠词“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一种抗体”意指一种抗体或多于一种抗体。
一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够与LAG3特异性结合，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1包括SYGX1N(SEQ ID NO:226)的氨基酸序列，所述HCDR2包括EIYPRSGNTYYNEX2X3X4X5(SEQ ID NO:227)的氨基酸序列，所述HCDR3包括GGTYDGYYYAMDX6(SEQ ID NO:228)的氨基酸序列，所述LCDR1包括RASESVDNFGSSFX7H(SEQ ID NO:229)的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列，其中X1是I或V，X2是K或R，X3是F或L，X4是K或G，X5是D或G，X6是F或Y，X7是L或M；或者所述HCDR1包括DDYNX8N(SEQ ID NO:230)的氨基酸序列，所述HCDR2包括LVDPIYGTIRYNQX9FKX10(SEQ ID NO:231)的氨基酸序列，所述HCDR3包括IX11TX12VRYFDX13(SEQ ID NO:232)的氨基酸序列，所述LCDR1包括RSSX14NIVHX15DGNTYLE(SEQ ID NO:233)的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列，其中X8是L或M，X9是N或K，X10是D或G，X11是M或T，X12是A或S，X13是H或Y，X14是L或Q，X15是S或T；或者所述HCDR1包括SGYYWX16(SEQ ID NO:234)的氨基酸序列，所述HCDR2包括DISYX17X18GNNYNPSLKN(SEQ ID NO:235)的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ IDNO:11的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述LCDR2包括RASNX19EX20(SEQ ID NO:236)的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列，其中X16是N或T，X17是E或D，X18是G或A，X19是L或R，X20是T或S；或者所述HCDR1包括SEQ IDNO:40的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ IDNO:42的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ IDNO:21的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括QQHDX21SPWT(SEQ ID NO:237)的氨基酸序列，其中X21是S或Q；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列，所述HCDR2包括X22IYTDTGEPTYAEEFKG(SEQ ID NO:238)的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括QQHYNX23PPT(SEQ ID NO:239)的氨基酸序列，其中X22是M或I，X23是A或S；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ IDNO:29的氨基酸序列，或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQID NO:33的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQID NO:35的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述HCDR1包括SEQ ID NO:54或75的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:55、76或87的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:56或77的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:57或78的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述HCDR1包括SEQ ID NO:68或81的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:69或82的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:70或83的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:71或84的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述HCDR1包括SEQ ID NO:9或97的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:90、10或98的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:91、94或13的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述HCDR1包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:44或106的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列，所述HCDR2包括SEQ ID NO:18或108的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:22或109的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述HCDR1包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:75的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:69的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ IDNO:81的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ IDNO:83的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ IDNO:36的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:91的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:94的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:97的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:98的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ IDNO:41的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ IDNO:43的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQID NO:44的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:106的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括重链HFR1、HFR2、HFR3和HFR4中的一者或多者，和/或轻链LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的一者或多者。
在一些实施方式中，所述HFR1包括QX24QLQESGPGLVKPX25QTLSLTCTVSGYSIX26(SEQID NO:240)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR2包括SEQ ID NO:190的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR3包括RX27TISRDTSKNQFSLKLSSVTAX28DTAX29YYCAR(SEQ ID NO:241)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR4包括SEQ IDNO:192的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR1包括SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR2包括SEQ ID NO:194的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR3包括GIPARFSGSGSX30TDFTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:242)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，其中X24是V或I，X25是S或G，X26是S或T，X27是V或I，X28是A或E，X29是V或T，X30是R或G。
在一些实施方式中，所述HFR1包括SEQ ID NO:201的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR2包括WX31RQAPGKX32LEWVX33(SEQ IDNO:243)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR3包括RFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAX34YYCTR(SEQ ID NO:244)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR4包括WGQGX35LVTVSS(SEQ IDNO:245)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR1包括DIQMTQSPSSVSX36SVGDRVTITC(SEQ ID NO:246)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR3包括GVPSRFSGSGSGTDFTX37TISSX38QPEDFATYYC(SEQ ID NO:247)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，其中X31是V或I，X32是R或G，X33是A或S，X34是M或V，X35是A或T，X36是T或A，X37是L或F，X38是L或V。
在一些实施方式中，所述HFR1包括X39QLVQSGX40EX41KKPGASVKX42SCKASGYTFT(SEQID NO:248)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR3包括RX43X44X45X46X47DTSX48STX49YX50X51X52SSLX53X54EDTAVYFCX55S(SEQ IDNO:249)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR1包括DIQMTQSPSSLSX56SVGDRVTITC(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR2包括WYQQKPGKX57PKLLIY(SEQID NO:251)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR3包括GVPSRFSGSGSGTDFTX58TISSX59QPEDFATYYC(SEQ ID NO:252)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，其中X39是V或I，X40是A或P，X41是V或L，X42是V或I，X43是V或F，X44是T或V，X45是M或F，X46是T或S，X47是R或L，X48是T或V，X49是V或A，X50是M或L，X51是E或Q，X52是L或I，X53是R或K，X54是S或A，X55是A或V，X56是T或A，X57是A或S，X58是L或F，X59是L或V。
在一些实施方式中，所述HFR1包括SEQ ID NO:117、125、133、140、146、152、158、166、170、174、180或185的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR2包括SEQ ID NO:118、126、134、141、147、153、159、167、175或181的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR3包括SEQ ID NO:119、127、135、142、148、154、160、168、171、176、182或186的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述HFR4包括SEQ ID NO:120、128、136、155或161的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR1包括SEQ ID NO:121、129、137、143、149、162、172、177、183或187的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR2包括SEQ ID NO:122、130、138、144、150、156、163、169或178的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，所述LFR3包括SEQ ID NO:123、131、139、145、151、157、164、173、179、184或188的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:124、132或165的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括选自由SEQ ID NO:7、15、23、30、38、45、52、59、66、73、79、85或88组成的组的序列或其具有至少80％序列同一性但仍保留对人LAG3的特异性结合亲和力的同源序列。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括选自由SEQ ID NO:8、16、24、31、39、46、53、60、67、74、80、86或89组成的组的序列或其具有至少80％序列同一性但仍保留对人LAG3的特异性结合亲和力的同源序列。
在一些实施方式中，在本文所提供的抗体或其抗原结合片段中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:7的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:8的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:15的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:23的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:24的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:30的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:31的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:38的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:39的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:45的序列，并且所述轻链可变区包括SEQID NO:46的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:52的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:53的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:59的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:60的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:66的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:67的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:73的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:74的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:79的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:80的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:85的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:86的序列；或者所述重链可变区包括SEQID NO:88的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:89的序列。
在一些实施方式中，在本文所提供的抗体或其抗原结合片段中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:92的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:93的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:95的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:96的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:99的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:100的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:101的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:102的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:103的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ IDNO:104的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:105的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:104的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:105的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:107的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:110的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:111的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:110的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:112的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:110的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:113的序列；或者所述重链可变区包括SEQID NO:114的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:111的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:114的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:112的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:114的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:113的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:115的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:111的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:115的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ IDNO:112的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:115的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:113的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:116的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:111的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:116的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:112的序列；或者所述重链可变区包括SEQ ID NO:116的序列，并且所述轻链可变区包括SEQ ID NO:113的序列。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个氨基酸残基取代或修饰，且仍保留对人LAG3的特异性结合亲和力。在一些实施方式中，所述取代或修饰中的至少一个取代或修饰位于所述重链可变区或所述轻链可变区中的一个或多个CDR序列中和/或一个或多个非CDR序列中。在一些实施方式中，所述取代中的至少一个是保守取代。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括Fc区，任选地是人免疫球蛋白(Ig)的Fc区，或任选地是人IgG的Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区源自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM。在一些实施方式中，所述Fc区源自人IgG4。在一些实施方式中，所述Fc区源自包括S228P突变的人IgG4。在一些实施方式中，IgG4的S228P突变恒定区的氨基酸序列包括SEQ ID NO:259的序列。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、经标记的抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有一种或多种针对人LAG3的选自下组的结合特性：a)特异性结合人LAG3 D1-D2重组蛋白，其通过ELISA测定测量的EC50不超过0.25nM(优选地不超过0.1nM，更优选地不超过0.05nM)；b)对表达人LAG3的细胞具有结合亲和力，其通过FACS测定测量的EC50不超过5.5nM(优选地不超过2.0nM，更优选地不超过1.5nM，并且更优选地不超过0.5nM)；c)对人LAG3具有结合亲和力，其通过生物层干涉测量技术(Octet***)测量的Kd不超过8nM(优选地不超过1nM，更优选地不超过0.1nM)；d)对人LAG3具有结合亲和力，其通过表面等离子体共振技术(Biacore***)测量的Kd不超过0.2nM(优选地不超过0.1nM)。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有一种或多种选自下组的特性：a)以不超过8nM(优选地不超过5nM)的IC50阻断LAG3和MHC II相互作用的能力，如通过FACS测定使用所述抗体或其抗原结合片段、hFc标签化的人LAG3 ECD重组蛋白和内源性表达MHC II的Raji细胞测量；b)以不超过10nM(优选地不超过5nM)的IC50减少LAG/MHC II介导的抑制的能力，如通过基于细胞的NFAT报告基因测定测量的；c)以不小于90％(优选地不小于95％)的阻断率在不超过20nM的浓度下阻断LAG3和LSECtin相互作用的能力，如通过竞争性ELISA测定测量的；d)以不超过2nM(优选地不超过1.5nM)的IC50和/或以不小于80％的最高阻断率阻断LAG3和FGL1相互作用的能力，如通过竞争性ELISA测定测量的；e)阻断LAG/MHC II抑制的T细胞活化的能力，如通过IL-2的分泌水平测量的，其中当所述抗体或抗原结合片段的浓度不超过4nM时，IL-2的分泌水平大于200pg/ml(优选地大于400pg/ml)。
在一些实施方式中，在与人LAG3结合方面，所述抗体或其抗原结合片段相对于包括包含SEQ ID NO:253的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:254的序列的轻链可变区的抗体表现出超过30％的竞争。在一些实施方式中，在与人LAG3结合方面，所述抗体或其抗原结合片段相对于包括包含SEQ ID NO:255的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:256的序列的轻链可变区的抗体表现出超过30％的竞争。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段具有与BMS-986016的结合表位不同的结合表位，即LAG D1结构域额外环。
在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段连接于一个或多个缀合物部分。在一些实施方式中，所述缀合物部分包括清除改性剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶底物标记、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、纯化部分或其它抗癌药物。
另一方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本公开的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本公开提供了一种载体，所述载体包括本公开的分离的多核苷酸。
另一方面，本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本公开的载体。
另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)本公开的抗体或其抗原结合片段；以及(ii)一种或多种药学上可接受的载体。
另一方面，本公开提供了一种表达本公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达本公开的载体的条件下培养本公开的宿主细胞。
另一方面，本公开提供了一种在受试者中治疗、预防或减轻与抑制的免疫***相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段和/或本公开的药物组合物。在一些实施方式中，所述与抑制的免疫***相关的疾病是癌症或感染性疾病。
在一些实施方式中，所述癌症是LAG3相关癌症。在一些实施方式中，所述LAG3相关癌症选自下组：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体肿瘤、***、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促***增生性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、骨外粘液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维结构不良、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺***状癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、***癌、葡萄膜黑素瘤、罕见的血液学病症、肾转移癌、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌。
在一些实施方式中，所述LAG3相关癌症选自下组：结直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤、肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直肠癌。在一些实施方式中，所述癌症是结肠癌或乳腺癌。
在一些实施方式中，所述与抑制的免疫***相关的疾病是病原体相关疾病。在一些实施方式中，所述病原体相关疾病选自下组：慢性病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染。在一些实施方式中，所述慢性病毒感染包括由以下引起的感染：爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、疱疹病毒(例如，HSV-1、HSV-2、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水疱性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、霍乱(Cholera)、白喉(Diphtheria)、肠杆菌属(Enterobacter)、***(Gonococci)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningococci)、分枝杆菌属(mycobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肺炎球菌(Pneumonococci)、立克次氏体细菌(rickettsia bacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、破伤风(Tetanus)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉菌(A.fumigatus)、黑曲霉菌(A.niger)等)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(C.albicans)、克柔念珠菌(C.krusei)、光滑念珠菌(C.glabrata)、热带念珠菌(C.tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、毛霉目(Genus Mucorales)(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、蠕虫寄生虫(helminth parasite)(钩虫(hookworm)、绦虫(tapeworms)、吸虫(flukes)、扁虫(flatworms)(例如，血吸虫(Schistosomia))、赞比亚贾第鞭毛虫(Giardia Zambia)、旋毛虫(trichinella)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba Fragilis)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)。
另一方面，本公开提供了一种检测样品中LAG3的存在或量的方法，所述方法包括：使所述样品与本公开的抗体或其抗原结合片段接触；以及确定所述样品中LAG3的所述存在或所述量。
另一方面，本公开提供了一种选择患有与抑制的免疫***相关的疾病、病症或病状的患者的方法，所述方法包括以下步骤：a)使从所述受试者获得的样品与本公开的抗体或其抗原结合片段接触；b)确定所述样品中LAG3的存在或量；以及c)将所述受试者中LAG3的所述存在或所述量与所述LAG3相关疾病、病症或病状的存在或状态相关联。
另一方面，本公开提供了本公开的抗体或其抗原结合片段和/或本公开的药物组合物在制备用于在受试者中治疗、预防或缓解癌症的药物中的用途。
附图简要说明
图1A、1B、1C和1D示出了针对293F-人LAG3细胞的抗LAG3抗体015c、023c、BMS-986016、BAP-050、TSR-033(图1A)、024c、029c、035c、048c、057c、047c(图1B)、027c、033c、039c(图1C)和021c、038c(图1D)的FACS结合曲线。
图2示出了针对293F-食蟹猴LAG3细胞的抗LAG3抗体的FACS结合。
图3示出了通过竞争性ELISA测定测量的抗LAG3抗体021c、023c、029c和BMS-986016的LAG3/LSECtin相互作用阻断活性。用所指示的抗体获得的平均阻断率列在每个柱状物的顶部。
图4A和4B示出了通过形式I的竞争性ELISA测定测量的抗LAG3抗体BMS-986016、BAP-050、047c、048c、057c(图4A)和015c、023c、024c、027c、029c、033c、035c、039c(图4B)的LAG3/FGL1相互作用阻断活性。
图5A和5B示出了通过形式II的竞争性ELISA测定测量的抗LAG3抗体BMS-986016、021c、023c、029c(图5A)和027c、047c(图5B)的LAG3/FGL1相互作用阻断活性。
图6示出了通过形式III的FACS测定测量的抗LAG3抗体BMS-986016、BAP-050、021c、023c和029c的LAG3/FGL1相互作用阻断活性。
图7A、7B、7C和7D示出了通过NFAT报告基因测定测量的抗LAG3抗体BMS-986016、BAP-050、015c、023c(图7A)、024c、027c、033c、035c(图7B)、039c、047c、048c、057c(图7C)和TSR-033、021c、029c、038c(图7D)的阻断活性。
图8A、8B、8C、8D、8E和8F示出了通过抗原特异性T细胞活化测定测量的抗LAG3抗体BMS-986016、BAP-050、015c(图8A)、024c、027c、033c、035c(图8B)、023c、038c(图8C)、021c、029c、057c(图8D)、039c、047c、048c(图8E)和TSR-033(图8F)的功能活性。
图9A和9B示出了通过形式I(图9A)或形式II(图9B)的ELISA测定测量的抗LAG3抗体与LAG3 D1结构域额外环肽的结合曲线。
图10A和10B示出了小鼠乳腺癌同基因模型评估抗LAG3治疗的体内活性的结果。图10A示出了每个研究组的平均肿瘤生长曲线，并且图10B示出了每只小鼠的个体肿瘤生长曲线。**p<0.01，****p<0.0001。
图11示出了针对293F-人LAG3细胞的衍生自023c的人源化抗体的FACS结合曲线。
图12示出了通过竞争性FACS测定测量的衍生自023c的人源化抗体的LAG3/MHC II相互作用阻断活性。
图13示出了通过竞争性ELISA测定测量的衍生自023c的人源化抗体的LAG3/FGL1相互作用阻断活性。
图14示出了通过NFAT报告基因测定测量的hu023.04以及hu023.11的阻断活性。
图15示出了通过抗原特异性T细胞活化测定测量的hu023.04以及hu023.11的功能活性。
图16示出了针对CHOK1-人LAG3细胞的衍生自021c的人源化抗体的FACS结合曲线。
图17示出了通过竞争性FACS测定测量的021c来源的人源化抗体的LAG3/MHC II相互作用阻断活性。用所指示的抗体获得的平均阻断率列在每个柱状物的顶部。
图18示出了通过NFAT报告基因测定测量的衍生自021c的人源化抗体的阻断活性。
图19示出了通过抗原特异性T细胞活化测定测量的衍生自021c的人源化抗体的功能活性。
图20A和20B示出了针对CHOK1-人LAG3细胞的hu029.40、hu029.53、hu029.55(图20A)和hu029.55.S93Q(图20B)的FACS结合曲线。
图21A和21B示出了通过竞争性FACS测定测量的hu029.40、hu029.53、hu029.55(图21A)以及hu029.55.S93Q(图21B)的LAG3/MHC II相互作用阻断活性。用所指示的抗体获得的平均阻断率列在每个柱状物的顶部。
图22A和22B示出了通过NFAT报告基因测定测量的hu029.40、hu029.53、hu029.55(图22A)以及hu029.55.S93Q(图22B)的阻断活性。
图23A和23B示出了通过抗原特异性T细胞活化测定测量的hu029.40、hu029.53、hu029.55(图23A)以及hu029.55.S93Q(图23B)的功能活性。
图24A、24B、24C、24D、24E和24F示出了小鼠乳腺癌同基因模型评估抗LAG3人源化抗体治疗的体内活性的结果。图24A至图24E示出了每个研究组的平均肿瘤生长曲线，并且图24F示出了所指示的组中每只小鼠的个体肿瘤生长曲线。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns代表不显著(p>0.05)。
具体实施方式
本公开的以下描述仅旨在说明本公开的各个实施方式。如此，所讨论的具体修改不应解释为对本公开的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以做出各种等同物、改变和修改，并且应当理解，此类等同实施方式将被包括在本文中。在本文中引用的所有文献，包括公开、专利和专利申请都以全文引用的方式并入本文。
定义
如本文所使用的，术语“抗体”包括与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然的完整抗体包括两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链被分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变区(VH)和第一、第二、第三以及任选地第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)组成；哺乳动物轻链被分类为λ或κ，而每条轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈“Y”型，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二恒定区和第三恒定区组成。Y的每个臂包括单条重链的与单个轻链的可变区和恒定区结合的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区通常包括三个高度可变环，称为互补性决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani规则来定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然(Nature)》12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of immunological Interest)》,第5版公共卫生署(PublicHealth Service),马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1991)；Marie-Paule Lefranc等人,《发育与比较免疫学(Developmentaland Comparative Immunology)》,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组研究(Immunome Research)》1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞分子生物学(Molecular Biology of B cells)》(第二版),第26章,481-514,(2015))。三个CDR由被称为框架区(FR)(轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4)的侧接段间隔开，所述框架区比CDR更加高度保守并形成支架以支撑高度可变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但表现出多种效应子功能。抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。主要抗体类别中的一些被分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指由包括一个或多个CDR的抗体的一部分形成的抗体片段，或与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。
关于抗体的“Fab”是指抗体的由单条轻链(可变区和恒定区两者)与单条重链的可变区和第一恒定区通过二硫键结合组成的部分。
“Fab'”是指包括铰链区的一部分的Fab片段。
“F(ab')2”是指Fab'的二聚体。
抗体(例如，IgG、IgA或IgD同种型)的“Fc”是指由第一重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域通过二硫键与第二重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域结合组成的抗体的部分。IgM和IgE同种型抗体的Fc进一步包括第四恒定结构域。抗体的Fc部分负责各种效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。
抗体的“Fv”是指携带完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由单条轻链的可变区与单条重链的可变区结合组成。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相互连接或通过肽连接子序列连接而成的工程化抗体(Huston JS等人《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》，85:5879(1988))。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由与抗体的Fc区连接的scFv组成的工程化抗体。
“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”是指包括两个VH结构域而不包括轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》12月10日；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志(J Biotechnol.)》6月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初源自骆驼科(Camelidae)(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。虽然缺失轻链，但骆驼化抗体具有真实的抗原结合谱(Hamers-Casterman C.等人,《自然》6月3日；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人《免疫遗传学(Immunogenetics)》.4月；54(1):39-47(2002)；NguyenVK.等人,《免疫学(Immunology)》.5月；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)表示由适应性免疫应答产生的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte F.等人,《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》11月；21(13):3490-8.电子版2007年6月15日(2007))。
“纳米抗体”是指由来自重链抗体的VHH结构域和两个恒定结构域CH2和CH3组成的抗体片段。
“双功能抗体”或“dAb”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包括在同一条多肽链中与VL结构域连接的VH结构域(VH-VL或VL-VH)(参见例如，Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊》7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，由此产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可以靶向相同或不同的抗原(或表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两种不同抗原(或表位)的双功能抗体。
“结构域抗体”是指仅包括重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个VH结构域通过肽连接子共价连接，以产生二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH结构域可以靶向相同或不同的抗原。
如本文所使用的，术语“价”是指给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。术语“单价”是指仅具有一个单抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；并且术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。如此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段是二价的。
如本文所使用的，“双特异性”抗体是指具有源自两个不同的单克隆抗体的片段并且能够与两个不同的表位结合的人工抗体。两个表位可以存在于同一抗原上，或其可以存在于两种不同抗原上。
在某些实施方式中，“scFv二聚体”是二价双功能抗体或双特异性scFv(BsFv)，其包括(通过肽连接子连接的)VH-VL，所述VH-VL与另一个VH-VL部分二聚化，使得一个部分的VH与另一个部分的VL配对并且形成可以靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位点。在其它实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，其包括与VL1-VH2(通过肽连接子连接)缔合的VH1-VL2(也通过肽连接子连接)，使得VH1与VL1配位并且VH2与VL2配位，并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方式中，“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv')”包括三条肽链：由肽连接子(例如，长柔性连接子)连接并且通过二硫桥分别与两个VL部分结合的两个VH部分。在一些实施方式中，dsFv-dsFv'是双特异性的，其中每对通过二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
如本文所使用的，术语“嵌合”意指具有源自一种物种的重链和/或轻链的一部分并且重链和/或轻链中的其余部分源自另一不同物种的抗体或抗原结合片段。在说明性实例中，嵌合抗体可以包括源自人的恒定区和源自非人动物，如源自小鼠的可变区。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
如本文所使用的，术语“人源化”意指抗体或抗原结合片段包括源自非人动物的CDR、源自人的FR区以及可适用的源自人的恒定区。
如本文所使用的，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即，抗体)或其片段与抗原之间非共价相互作用的强度。
如本文所使用的，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性地结合(specifically binds)”是指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。特异性结合的特征可以在于结合亲和力，例如由KD值表示，即，当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)。KD可以通过使用本领域中已知的任何常规方法确定，所述方法包括但不限于表面等离子体共振法、微量热泳法、HPLC-MS法和流式细胞术(如FACS)方法。≤10-6M(例如≤5x 10-7M、≤2x 10-7M、≤10-7M、≤5x 10-8M、≤2x10-8M、≤10-8M、≤5x 10-9M、≤4x 10-9M、≤3x 10-9M、≤2x 10-9M或≤10-9M)的KD值可以指示抗体或其抗原结合片段与LAG3(例如，人LAG3)之间的特异性结合。
如本文所使用的，“竞争与LAG3结合”的能力是指第一抗体或其抗原结合片段抑制人LAG3与第二抗体之间结合的相互作用到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，竞争与人LAG3结合的抗体或抗原结合片段将人LAG3和第二抗LAG3抗体之间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，此抑制可以大于95％或大于99％。
如本文所使用的，术语“表位”是指抗体所结合的抗原上的特定的一组原子或氨基酸。如果两种抗体展现出针对抗原的竞争性结合，则其可以与抗原内的相同或密切相关的表位结合。表位可以是线性的或构象的(即，包括间隔开的氨基酸残基)。例如，如果抗体或抗原结合片段阻断了参考抗体对抗原至少85％、或至少90％或至少95％的结合，那么所述抗体或抗原结合片段可以视为与参考抗体结合相同/紧密相关的表位。
如本文所使用的，术语“氨基酸”是指包括氨基(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每个氨基酸特有的侧链的有机化合物。氨基酸名称在本公开中也表示为标准单字母或三字母代码，总结如下。
关于氨基酸序列的“保守取代”是指将氨基酸残基用不同的具有类似理化特性的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、具有中性亲水侧链的氨基酸残基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、具有酸性侧链的氨基酸残基(例如，Asp、Glu)之间、具有碱性侧链的氨基酸残基(例如，His、Lys和Arg)之间或具有芳香族侧链的氨基酸残基(例如，Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域已知的，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可以保留蛋白质的生物学活性。
如本文所使用的，术语“同源”是指在最佳比对时与另一个序列具有至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列，并且必要时引入空位以实现最大数量的相同氨基酸(或核酸)后，在候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序列或参考序列中氨基酸残基(或碱基)的总数(以较短者为准)来计算。氨基酸残基的保守取代可以或可以不视为相同残基。可以例如使用公开可用的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center forBiotechnology Information，NCBI)的网站上获得，还参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志》215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)的网站上获得，还参见Higgins D.G.等人,《酶学方法(Methods inEnzymology)》,266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人《生物信息学(Bioinformatics)》(英国剑桥),23(21):2947-8(2007))以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现用于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的比对。本领域技术人员可以使用由所述工具提供的默认参数或可以根据比对的需要适当定制参数，例如通过选择合适的算法。
如本文所使用的，“效应子功能”是指由抗体的Fc区与其如C1复合物和Fc受体等效应子结合引起的生物活性。示例性效应子功能包括：由抗体和C1复合物上的C1q的相互作用介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)；由抗体的Fc区与效应子细胞上的Fc受体结合介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；以及吞噬作用。可以使用各种测定，如Fc受体结合测定、C1q结合测定和细胞裂解测定来评估效应子功能。
“分离”的物质已经通过人工由自然状态改变。如果自然界中出现“分离的”组合物或物质，则其已经被改变或脱离其原始环境，或二者均有发生。例如，活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果同一多核苷酸或多肽与其在天然状态下共存的材料充分分离以便以基本上纯的状态存在，则是可以认为是“分离的”。“分离的核酸序列”是指分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或其抗原结合片段，如通过电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱方法(如离子交换色谱法或反相HPLC)确定的。
如本文所使用的，术语“载体”是指可以将遗传元件可操作地***其中以使所述遗传元件产生表达，以便产生由遗传元件编码的蛋白质、RNA或DNA或复制遗传元件的媒剂。载体可以用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的遗传元件在宿主细胞内产生表达。载体的实例包括质粒、噬菌粒、粘粒、如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或源自P1的人工染色体(PAC)等人工染色体、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体和动物病毒。载体可以包括多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体可以包括复制起点。载体还可以包括辅助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质涂层。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供了载体(例如，表达载体)，所述载体包括本文所提供的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接于所述核酸序列的启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)以及至少一个选择标志物。
如本文所使用的，短语“宿主细胞”是指其中可以或已经引入有外源多核苷酸和/或载体的细胞。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猫、兔、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞增殖、活力或转移活性的降低。例如，与未使用疗法的对照相比，可以通过在疗法期间出现的异常细胞的生长率的减少或肿瘤大小稳定性或减少或由于疗法引起的更长的存活率来示出抗肿瘤活性。可以使用公认的体外或体内肿瘤模型来评估此类活性，所述模型包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)模型和本领域已知的其它已知的调查抗肿瘤活性的模型。
如本文所使用的，疾病、病症或病状的“治疗(treating/treatment)”包括预防或缓解疾病、病症或病状、减缓疾病、病症或病状的发作或发展速率、降低患上疾病、病症或病状的风险、预防或延缓与疾病、病症或病状相关的症状的发展、减少或结束与疾病、病症或病状相关的症状、使疾病、病症或病状完全或部分消退、治愈疾病、病症或病状或其一些组合。
术语“诊断(diagnosis/diagnose/diagnosing)”是指对病理状态、疾病或病状的鉴定，如对LAG3相关疾病的鉴定，或者指对可以受益于特定治疗方案的患有LAG3相关疾病的受试者的鉴定。在一些实施例中，诊断包括鉴定LAG3的异常量或活性。在一些实施方式中，诊断是指鉴定受试者的癌症或自身免疫性疾病。
如本文所使用的，术语“生物样品”或“样品”是指从所关注的受试者获得或源自所关注的受试者的生物组合物，所述生物组合物包含例如基于物理、生化、化学和/或生理特性待表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。生物样品包括但不限于受试者的通过本领域技术人员已知的任何方法获得的细胞、组织、器官和/或生物体液。在一些实施方式中，生物样品是体液样品。在一些实施方式中，体液样品是全血、血浆、血清、粘液(包括鼻腔引流物和痰)、腹膜液、胸膜液、胸液、唾液、尿液、滑液、脑脊液(CSF)、胸腔穿刺液、腹腔积液、腹水或心包液。在一些实施方式中，生物样品是从受试者的心脏、肝、脾、肺、肾、皮肤或血管获得的组织或细胞。
如本文所使用的，“LAG3”或“LAG-3”可互换使用，是指淋巴细胞活化基因3，一种由LAG3基因编码的人类蛋白质(基因ID：3902，在NCBI基因数据库中)。LAG3于1990年(TriebelF等人(1990年5月),与CD4密切相关的新型淋巴细胞活化基因LAG-3(LAG-3,a novellymphocyte activation gene closely related to CD4),《实验医学杂志(The Journalof experimental medicine)》171(5):1393-405)被发现，并在2000年第七届人类白细胞分化抗原研讨会(Seventh Human Leucocyte Differentiation Antigen Workshop in2000)(Mason D等人(2001年11月),CD抗原2001,《白细胞生物学杂志(Journal ofLeukocyte Biology)》70(5):685-90)后被命名为CD223(分化簇223)，是一种对T细胞功能具有多种生物学效应的细胞表面分子。LAG3是一种免疫检查点受体，并且如此是寻求开发癌症和自身免疫性病症的新治疗的制药公司的各种药物开发项目的目标。就其可溶形式而言，LAG3本身也正在被开发为抗癌药物(Syn,Nicholas L等人,(2017年12月),针对免疫检查点靶向的天然和获得性耐药性(De-novo and acquired resistance to immunecheckpoint targeting),《柳叶刀肿瘤学(The Lancet Oncology)》18(12):e731-e741)。
术语“抗LAG3抗体”是指能够与LAG3(例如，人或小鼠LAG3)特异性结合的抗体。术语“抗人LAG3抗体”是指能够与人LAG3特异性结合的抗体。
如本文所使用的，“与抑制的免疫***相关的疾病”是指LAG3相关疾病，尤其是癌症或感染。
术语“药学上可接受的”表示指定的载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与包括调配物的其它成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。
抗LAG3抗体
本公开提供了抗LAG3抗体以及其抗原结合片段。本文所提供的抗LAG3抗体和抗原结合片段能够与LAG3特异性结合。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段与人LAG3的结合可以用“半最大有效浓度”(EC50)值表示，其是指抗体的观察到其最大结合的50％的浓度。EC50值可以通过本领域已知的结合测定来测量，例如直接或间接结合测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术测定和其它结合测定。在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段通过ELISA以不超过1nM、不超过0.9nM、不超过0.8nM、不超过0.7nM、不超过0.6nM、不超过0.5nM、不超过0.4nM、不超过0.3nM、不超过0.2nM、不超过0.1nM、不超过0.09nM、不超过0.08nM、不超过0.07nM、不超过0.06nM或不超过0.05nM的EC50(即50％结合浓度)与人LAG3特异性结合。在某些实施方式中，所述EC50值是通过如在本公开的实施例3.2中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段以不超过1nM(例如，不超过5x 10-10M、不超过3x 10-10M、不超过1x 10-10M)的EC50与人LAG3 D1-D2重组蛋白特异性结合，如通过ELISA测定测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段以不超过50nM(例如，不超过40nM、不超过30nM、不超过20nM、不超过10nM、不超过1nM)的EC50与LAG3D1-D2重组蛋白结合，如通过ELISA测定测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段以不超过5.5nM(优选地不超过2.0nM，更优选地不超过1.5nM，并且更优选地不超过0.5nM)的EC50与表达人LAG3的细胞结合，如通过FACS测定测量的。在某些实施方式中，所述EC50值是通过如在本公开的实施例3.3中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段以不超过8nM(优选地不超过1nM，更优选地不超过0.1nM)的KD值与人LAG3特异性结合，如通过生物层干涉测量(BLI)技术测量的。BLI技术基于用于测量生物分子相互作用的无标记技术，参见例如Cooper,Matthew(2006年5月7日),当前药物研发中的生物传感器技术(Current biosensortechnologies in drug discovery),《药物发现世界(Drug Discovery World)》(夏季):68–82或Rich,Rebecca L等人(2007年2月1日),高通量、无标记、实时分子相互作用分析(Higher-throughput,label-free,real-time molecular interaction analysis),《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》361(1):1-6中描述的那些技术。在某些实施方式中，所述KD值是通过如在本公开的实施例4.2.8中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段以不超过0.2nM(优选地不超过0.1nM)的KD值与人LAG3特异性结合。Biacore测定基于表面等离子共振技术，参见例如Murphy,M.等人,《蛋白科学实验指南(Current protocols in protein science)》,第19章,单元19.14,2006。在某些实施方式中，所述KD值是通过如在本公开的实施例5.1.2.6中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段以不超过8nM(优选地不超过5nM)的IC50阻断LAG3和MHCII相互作用的能力，如通过FACS测定使用所述抗体或其抗原结合片段、hFc标签化的人LAG3 ECD重组蛋白和内源性表达MHCII的Raji细胞测量。在某些实施方式中，所述IC50值是通过如在本公开的实施例3.5中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段具有以不超过10nM(优选地不超过5nM)的IC50缓解LAG/MHC II介导的抑制的能力，如通过基于细胞的NFAT报告基因测定测量的。在某些实施方式中，所述IC50值是通过如在本公开的实施例3.6中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段具有以不小于90％(优选地不小于95％)的阻断率在不超过20nM的浓度下阻断LAG3和LSECtin相互作用的能力，如通过竞争性ELISA测定测量的。在某些实施方式中，所述阻断率是通过如在本公开的实施例4.2.3中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段具有以不超过2nM(优选地不超过1.5nM)的IC50和/或以不小于80％的最高阻断率阻断LAG3和LSECtin相互作用的能力，如通过竞争性ELISA测定测量的。在某些实施方式中，所述阻断率是通过如在本公开的实施例4.2.4中描述的方法来测量的。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段具有阻断LAG/MHC II抑制的T细胞活化的能力，如通过IL-2的分泌水平测量的，其中当所述抗体或抗原结合片段的浓度不超过4nM时，IL-2的分泌水平大于200pg/ml(优选地大于400pg/ml)。在某些实施方式中，阻断能力是通过如在本公开的实施例3.7中描述的方法来测量的。
说明性抗LAG3抗体
在某些实施方式中，本公开提供了包括一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)CDR的抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述CDR包括选自下组的序列：SYGX1N(SEQ IDNO:226)、EIYPRSGNTYYNEX2X3X4X5(SEQ ID NO:227)、GGTYDGYYYAMDX6(SEQ ID NO:228)、RASESVDNFGSSFX7H(SEQ ID NO:229)、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:58、DYNX8N(SEQ ID NO:230)、LVDPIYGTIRYNQX9FKX10(SEQ ID NO:231)、IX11TX12VRYFDX13(SEQ ID NO:232)、RSSX14NIVHX15DGNTYLE(SEQ ID NO:233)、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:72、SGYYWX16(SEQ IDNO:234)、DISYX17X18GNNYNPSLKN(SEQ ID NO:235)、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、RASNX19EX20(SEQ ID NO:236)、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:21、QQHDX21SPWT(SEQ ID NO:237)、SEQ ID NO:17、X22IYTDTGEPTYAEEFKG(SEQ ID NO:238)、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、QQHYNX23PPT(SEQ ID NO:239)、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65，其中X1是I或V，X2是K或R，X3是F或L，X4是K或G，X5是D或G，X6是F或Y，X7是L或M，X8是L或M，X9是N或K，X10是D或G，X11是M或T，X12是A或S，X13是H或Y，X14是L或Q，X15是S或T，X16是N或T，X17是E或D，X18是G或A，X19是L或R，X20是T或S，X21是S或Q，X22是M或I，X23是A或S。
如本文所使用的，“抗体015”是指包括具有SEQ ID NO:7的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:8的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体021”是指包括具有SEQ ID NO:15的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:16的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体023”是指包括具有SEQ ID NO:23的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:24的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体024”是指包括具有SEQ ID NO:30的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:31的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体027”是指包括具有SEQ ID NO:38的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:39的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体029”是指包括具有SEQ ID NO:45的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:46的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体033”是指包括具有SEQ ID NO:52的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:53的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体035”是指包括具有SEQ ID NO:59的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:60的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体038”是指包括具有SEQ ID NO:66的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:67的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体039”是指包括具有SEQ ID NO:73的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:74的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体047”是指包括具有SEQ ID NO:79的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:80的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体048”是指包括具有SEQ ID NO:85的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:86的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
如本文所使用的，“抗体057”是指包括具有SEQ ID NO:88的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:89的序列的轻链可变区的单克隆抗体。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048或057的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)CDR序列。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含选自由SEQ ID NO:1、9、17、1、32、40、47、54、9、68、75、81和54组成的组的序列的HCDR1、包含选自由SEQ ID NO:2、10、18、25、33、41、48、55、61、69、76、82和87组成的组的序列的HCDR2和包含选自由SEQ ID NO:3、11、19、26、34、42、49、56、62、70、77、83和77组成的组的序列的HCDR3，和/或包含选自由SEQ ID NO:4、12、20、27、35、43、50、57、63、71、78、84和78组成的组的序列的LCDR1、包含选自由SEQ ID NO:5、13、21、28、36、21、36、13、64、36、13、36和13组成的组的序列的LCDR2和包含选自由SEQ ID NO:6、14、22、29、37、44、51、58、65、72、58、72和58组成的组的序列的LCDR3。
在某些实施例方式，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:3的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:4的序列的LCDR1、包含SEQID NO:5的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:6的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:9的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:10的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:11的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:12的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:13的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:14的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:17的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:18的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:19的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:20的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:21的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:22的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:25的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:26的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:27的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:28的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:29的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:32的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:33的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:34的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:35的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:37的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:40的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:41的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:42的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:43的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:21的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:44的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:47的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:48的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:49的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:50的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:51的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:54的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:55的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:56的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:57的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:13的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:58的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:9的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:61的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:62的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:63的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:64的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:65的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:68的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:69的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:70的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:71的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:72的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:75的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:76的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:77的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:78的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:13的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:58的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:81的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:82的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:83的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:84的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:36的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:72的序列的LCDR3。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:54的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:87的序列的HCDR2、包含SEQ ID NO:77的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO:78的序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:13的序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:58的序列的LCDR3。
下表1示出了抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057的CDR氨基酸序列。CDR边界由Kabat规则来定义或鉴定。下表2示出了抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057的重链和轻链可变区氨基酸序列。下表3示出了抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057的框架区氨基酸序列。
表1.13个抗体的CDR氨基酸序列
表2.13个抗体的可变区氨基酸序列
表3.13个抗体的氨基酸序列的FR氨基酸序列
考虑到抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057中的每种抗体都可以与LAG3结合，并且主要由CDR1区、CDR2区和CDR3区提供抗原结合特异性，抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057的HCDR1序列、HCDR2序列和HCDR3序列以及LCDR1序列、LCDR2序列和LCDR3序列可以被“混合和匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合和匹配，但每种抗体必须包括HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3)以产生本公开的抗LAG3结合分子。此类“混合和匹配”的抗体的LAG3结合可以使用上述和实施例中的结合测定来测试。优选地，当VH CDR序列被混合和匹配时，来自特定VH序列的HCDR1序列、HCDR2序列和/或HCDR3序列被结构上类似的CDR序列替代。同样地，当VL CDR序列被混合和匹配时，来自特定VL序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列优选地用结构上类似的CDR序列替代。例如，抗体035、047和057的HCDR1共享一些结构相似性，并且因此易于混合和匹配。本领域技术人员将显而易见的是，可以通过用来自本文所公开的用于单克隆抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057的CDR序列的结构上类似的序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新型VH和VL序列。
已知CDR负责抗原结合。然而，已经发现并非所有6个CDR都是不可缺少或不可改变的。换句话说，可以替代或改变或修饰抗LAG3抗体015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057中的一个或多个CDR，但基本上保留对LAG3的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段包括合适的框架区(FR)序列，只要抗体和其抗原结合片段可以与LAG3特异性结合。上表1中提供的CDR序列是从小鼠抗体获得的，但所述序列可以使用如重组技术等本领域已知的合适方法移植到如小鼠、人、大鼠、兔等任何合适物种的任何合适FR序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段是人源化的。人源化抗体或抗原结合片段在其降低人的免疫原性方面是令人期待的。人源化抗体在其可变区中是嵌合的，因为非人CDR序列被移植到人或基本上人FR序列。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可以通过用非人(如鼠类)CDR基因取代人免疫球蛋白基因中的对应人CDR基因来进行(参见例如，Jones等人(1986)《自然》321:522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332:323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学(Science)》239:1534-1536)。
可以使用本领域中已知的方法选择合适的人重链和轻链可变结构域以实现此目的。在说明性实例中，可以使用“最佳拟合”方法，其中针对已知人可变结构域序列的数据库筛选或BLAST非人(例如，啮齿动物)抗体可变结构域序列，并且最接近非人查询序列的人序列被鉴定并用作用于移植非人CDR序列的人支架(参见例如Sims等人,(1993)《免疫学杂志(J.Immunol.)》151:2296；Chothia等人,(1987)《分子生物学杂志》196:901)。可替代地，来源于所有人抗体的共有序列的框架可以用于移植非人CDR(参见例如Carter等人(1992)《美国国家科学院院刊》,89:4285；Presta等人(1993)《免疫学杂志》,151:2623)。
下表4示出了抗体032的3个人源化抗体、抗体029的4个人源化抗体以及抗体023的12个人源化抗体的CDR氨基酸序列，所述人源化抗体被命名为hu021.212、hu021.269、hu021.279、hu029.40、hu029.53、hu029.55、hu029.55.S93Q、hu023.04、hu023.05、hu023.06、hu023.07、hu023.08、hu023.09、hu023.10、hu023.11、hu023.12、hu023.13、hu023.14以及hu023.15。CDR边界由Kabat规则来定义或鉴定。下表5示出了人源化抗体hu021.212、hu021.269、hu021.279、hu029.40、hu029.53、hu029.55、hu029.55.S93Q、hu023.04、hu023.05、hu023.06、hu023.07、hu023.08、hu023.09、hu023.10、hu023.11、hu023.12、hu023.13、hu023.14以及hu023.15的重链和轻链可变区氨基酸序列。下表6示出了人源化抗体hu021.212、hu021.269、hu021.279、hu029.40、hu029.53、hu029.55、hu029.55.S93Q、hu023.04、hu023.05、hu023.06、hu023.07、hu023.08、hu023.09、hu023.10、hu023.11、hu023.12、hu023.13、hu023.14以及hu023.15的FR氨基酸序列。
表4.人源化抗体的CDR氨基酸序列
表5.人源化抗体的可变区氨基酸序列
表6.人源化抗体的FR氨基酸序列
在某些实施方式中，除了非人的CDR序列之外，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段由基本上全人序列构成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在的话)完全或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列源自一种人抗体并且恒定区源自另一种人抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或其抗原结合片段包括人重链HFR1-4和/或轻链LFR1-4。
在一些实施方式中，源自人的FR区可以包括与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基被来自亲本非人抗体的对应残基取代。在某些实施方式中，使人源化抗体或其片段非常接近于非人亲本抗体结构是可以期待的，以便优化结合特性(例如，增加结合亲和力)。在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段在人FR序列中的每个人FR序列中包括不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基取代，或者在重链或轻链可变结构域的所有FR序列中包括不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，氨基酸残基的此类变化可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区或同时存在于两者中。在某些实施方式中，使人FR序列的一个或多个氨基酸随机突变以增加结合亲和力。在某些实施方式中，使人FR序列的一个或多个氨基酸回复突变为亲本非人抗体的对应氨基酸以增加结合亲和力。
在某些实施方式中，本公开还提供了人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括：重链HFR1，所述重链HFR1包括QX24QLQESGPGLVKPX25QTLSLTCTVSGYSIX26(SEQ ID NO:240)、SEQ ID NO:201、QX39QLVQSGX40EX41KKPGASVKX42SCKASGYTFT(SEQ ID NO:248)、SEQ ID NO:117、125、133、140、146、152、158、166、170、174、180或185的序列或与所述序列具有至少85％序列同一性的同源序列；重链HFR2，所述重链HFR2包括SEQ ID NO:190、WX31RQAPGKX32LEWVX33(SEQ ID NO:243)、SEQ ID NO:215、SEQ IDNO:118、126、134、141、147、153、159、167、175或181的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的同源序列；重链HFR3，所述重链HFR3包括RX27TISRDTSKNQFSLKLSSVTAX28DTAX29YYCAR(SEQ ID NO:241)、RFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAX34YYCTR(SEQ ID NO:244)、RX43X44X4 5X46X47DTSX48STX49YX50X51X52SSLX53X54EDTAVYFCX55S(SEQ ID NO:249)、SEQ ID NO:119、127、135、142、148、154、160、168、171、176、182或186的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的同源序列；以及重链HFR4，所述重链HFR4包括SEQ ID NO:192、WGQGX35LVTVSS(SEQ IDNO:245)、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:120、128、136、155或161的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的同源序列；其中X24是V或I，X25是S或G，X26是S或T，X27是V或I，X28是A或E，X29是V或T，X31是V或I，X32是R或G，X33是A或S，X34是M或V，X35是A或T，X39是V或I，X40是A或P，X41是V或L，X42是V或I，X43是V或F，X44是T或V，X45是M或F，X46是T或S，X47是R或L，X48是T或V，X49是V或A，X50是M或L，X51是E或Q，X52是L或I，X53是R或K，X54是S或A，X55是A或V。
在某些实施方式中，本公开还提供了人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括：轻链LFR1，所述轻链LFR1包括SEQ ID NO:193、DIQMTQSPSSVSX36SVGDRVTITC(SEQ ID NO:246)、DIQMTQSPSSLSX56SVGDRVTITC(SEQ ID NO:250)、SEQ ID NO:121、129、137、143、149、162、172、177、183或187的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的同源序列；轻链LFR2，所述轻链LFR2包括SEQ ID NO:194、SEQ IDNO:206、WYQQKPGKX57PKLLIY(SEQ ID NO:251)、SEQ ID NO:122、130、138、144、150、156、163、169或178的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的同源序列；轻链LFR3，所述轻链LFR3包括GIPARFSGSGSX30TDFTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:242)、GVPSRFSGSGSGTDFTX37TISSX38QPEDFATYYC(SEQ ID NO:247)、GVPSRFSGSGSGTDFTX58TISSX59QPEDFATYYC(SEQ IDNO:252)、SEQ ID NO:123、131、139、145、151、157、164、173、179、184或188的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的同源序列；以及轻链LFR4，所述轻链LFR4包括SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:124、132或165的序列或与所述序列具有至少80％序列同一性的同源序列；其中X30是R或G，X36是T或A，X37是L或F，X38是L或V，X56是T或A，X57是A或S，X58是L或F，X59是L或V。
在一些实施方式中，所述HFR1包括SEQ ID NO:189的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:190的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:191的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:192的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:193的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:194的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:195的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:197的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:190的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:191的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:192的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:193的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:194的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:195的氨基酸序列；并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:198的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:190的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:199的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:192的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:193的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:194的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:200的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:201的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:202的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:203的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:204的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:205的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:207的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ IDNO:201的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:208的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ IDNO:203的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:204的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ IDNO:209的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ IDNO:210的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:201的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:211的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:212的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:209的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:214的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:216的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:214的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:216的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:219的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:214的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:216的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:220的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:207的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:221的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ IDNO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:222的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ IDNO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ IDNO:206的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:221的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:222的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:219的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:221的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:222的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:220的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:207的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:223的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:224的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:223的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:224的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:219的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ IDNO:223的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ IDNO:224的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ IDNO:220的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ IDNO:207的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:225的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:224的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:225的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:224的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:217的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:219的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:225的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:224的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:220的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:218的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:207的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:117的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:118的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:119的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:120的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:121的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:122的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:123的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:124的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:125的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ IDNO:126的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:127的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ IDNO:128的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:129的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ IDNO:130的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:133的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:134的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:135的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:136的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:137的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:138的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:139的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:124的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:140的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:141的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:142的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:136的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:143的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:144的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:145的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:146的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:147的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:148的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:128的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:149的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:150的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:151的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:152的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:153的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:154的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:155的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:137的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:156的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:157的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ IDNO:158的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:159的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ IDNO:160的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:161的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ IDNO:162的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:163的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ IDNO:164的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:165的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:166的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:167的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:168的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:128的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:129的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:169的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:170的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:126的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:171的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:128的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:172的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:156的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:173的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:174的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:175的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:176的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:120的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:177的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:178的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:179的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:166的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:167的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:168的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:128的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:129的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:169的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:131的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:180的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ IDNO:181的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:182的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ IDNO:120的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:183的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ IDNO:178的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:184的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQID NO:132的氨基酸序列；或者所述HFR1包括SEQ ID NO:185的氨基酸序列；所述HFR2包括SEQ ID NO:167的氨基酸序列；所述HFR3包括SEQ ID NO:186的氨基酸序列；所述HFR4包括SEQ ID NO:128的氨基酸序列；所述LFR1包括SEQ ID NO:187的氨基酸序列；所述LFR2包括SEQ ID NO:169的氨基酸序列；所述LFR3包括SEQ ID NO:188的氨基酸序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开还提供了人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括重链可变区中所包括的HFR1、HFR2、HFR3和/或HFR4序列，所述重链可变区选自下组：hu021.212-VH(SEQ ID NO:92)、hu021.269-VH(SEQID NO:95)、hu021.279-VH(SEQ ID NO:99)、hu029.40-VH(SEQ ID NO:101)、hu029.53-VH(SEQ ID NO:103)、hu029.55-VH/hu029.55.S93Q-VH(SEQ ID NO:105)、hu023.04-VH/hu023.05-VH/hu023.06-VH(SEQ ID NO:110)、hu023.07-VH/hu023.08-VH/hu023.09-VH(SEQ ID NO:114)、hu023.10-VH/hu023.11-VH/hu023.12-VH(SEQ ID NO:115)以及hu023.13-VH/hu023.14-VH/hu023.15-VH(SEQ ID NO:116)。
在某些实施方式中，本公开还提供了人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段，所述人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括轻链可变区中所包括的LFR1、LFR2、LFR3和/或LFR4序列，所述轻链可变区选自下组：hu021.212-VL(SEQ ID NO:93)、hu021.269-VL(SEQID NO:96)、hu021.279-VL(SEQ ID NO:100)、hu029.40-VL(SEQ ID NO:102)、hu029.53-VL/hu029.55-VL(SEQ ID NO:104)、hu029.55.S93Q-VL(SEQ ID NO:107)、hu023.04-VL/hu023.07-VL/hu023.10-VL/hu023.13-VL(SEQ ID NO:111)、hu023.05-VL/hu023.08-VL/hu023.11-VL/hu023.14-VL(SEQ ID NO:112)以及hu023.06-VL/hu023.09-VL/hu023.12-VL/hu023.15-VL(SEQ ID NO:113)。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括重链可变结构域序列和/或轻链可变结构域序列，所述重链可变结构域序列选自下组：SEQ IDNO:99(hu021.279)、SEQ ID NO:105(hu029.55或hu029.55.S93Q)、SEQ ID NO:115(hu023.11)，所述轻链可变结构域序列选自下组：SEQ ID NO:100(hu021.279)、SEQ ID NO:107(hu029.55.S93Q)、SEQ ID NO:112(hu023.11)。
本公开还分别提供了抗体021、抗体029和抗体023的示例性人源化抗体，所述示例性人源化抗体包括：
包含hu021.212-VH(SEQ ID NO:92)的重链可变区和hu021.212-VL(SEQ ID NO:93)的轻链可变区的“hu021.212”；
包含hu021.269-VH(SEQ ID NO:95)的重链可变区和hu021.269-VL(SEQ ID NO:96)的轻链可变区的“hu021.269”；
包含hu021.279-VH(SEQ ID NO:99)的重链可变区和hu021.279-VL(SEQ ID NO:100)的轻链可变区的“hu021.279”；
包含hu029.40-VH(SEQ ID NO:101)的重链可变区和hu029.40-VL(SEQ ID NO:102)的轻链可变区的“hu029.40”；
包含hu029.53-VH(SEQ ID NO:103)的重链可变区和hu029.53-VL(SEQ ID NO:104)的轻链可变区的“hu029.53”；
包含hu029.55-VH(SEQ ID NO:105)的重链可变区和hu029.55-VL(SEQ ID NO:104)的轻链可变区的“hu029.55”；
包含hu029.55.S93Q-VH(SEQ ID NO:105)的重链可变区和hu029.55.S93Q-VL(SEQID NO:107)的轻链可变区的“hu029.55.S93Q”；
包含hu023.04-VH(SEQ ID NO:110)的重链可变区和hu023.04-VL(SEQ ID NO:111)的轻链可变区的“hu023.04”；
包含hu023.05-VH(SEQ ID NO:110)的重链可变区和hu023.05-VL(SEQ ID NO:112)的轻链可变区的“hu023.05”；
包含hu023.06-VH(SEQ ID NO:110)的重链可变区和hu023.06-VL(SEQ ID NO:113)的轻链可变区的“hu023.06”；
包含hu023.07-VH(SEQ ID NO:114)的重链可变区和hu023.07-VL(SEQ ID NO:111)的轻链可变区的“hu023.07”；
包含hu023.08-VH(SEQ ID NO:114)的重链可变区和hu023.08-VL(SEQ ID NO:112)的轻链可变区的“hu023.08”；
包含hu023.09-VH(SEQ ID NO:114)的重链可变区和hu023.09-VL(SEQ ID NO:113)的轻链可变区的“hu023.09”；
包含hu023.10-VH(SEQ ID NO:115)的重链可变区和hu023.10-VL(SEQ ID NO:111)的轻链可变区的“hu023.10”；
包含hu023.11-VH(SEQ ID NO:115)的重链可变区和hu023.11-VL(SEQ ID NO:112)的轻链可变区的“hu023.11”；
包含hu023.12-VH(SEQ ID NO:115)的重链可变区和hu023.12-VL(SEQ ID NO:113)的轻链可变区的“hu023.12”；
包含hu023.13-VH(SEQ ID NO:116)的重链可变区和hu023.13-VL(SEQ ID NO:111)的轻链可变区的“hu023.13”；
包含hu023.14-VH(SEQ ID NO:116)的重链可变区和hu023.14-VL(SEQ ID NO:112)的轻链可变区的“hu023.14”；
包含hu023.15-VH(SEQ ID NO:116)的重链可变区和hu023.15-VL(SEQ ID NO:113)的轻链可变区的“hu023.15”；
这些示例性人源化抗LAG3抗体保留了对LAG3的特异性结合能力或亲和力，并且在所述方面至少相当于或者甚至优于亲本小鼠抗体021、029或023。例如，实施例5中提供了数据。
在一些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体和抗原结合片段包括重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段是由本文所提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。此类单结构域抗体的更多信息可在本领域中获得(参见例如美国专利第6,248,516号)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段进一步包括免疫球蛋白(Ig)恒定区，所述恒定区任选地进一步包括重链和/或轻链恒定区。在某些实施方式中，重链恒定区包括CH1区、铰链区和/或CH2-CH3区(或任选地是CH2-CH3-CH4区)。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在某些实施方式中，轻链恒定区包括Cκ或Cλ。本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段的恒定区可以与野生型恒定区序列相同或在一个或多个突变中不同。
在某些实施方式中，重链恒定区包括Fc区。已知Fc区介导效应子功能，如抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。不同Ig同种型的Fc区具有不同的诱导效应子功能的能力。例如，IgG1和IgG3的Fc区已被公认为比IgG2和IgG4的Fc区更有效地诱导ADCC和CDC两者。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体和其抗原结合片段包括：IgG1或IgG3同种型的Fc区，所述Fc区可以诱导ADCC或CDC；或可替代地，IgG4或IgG2同种型的恒定区，所述恒定区降低或耗竭效应子功能。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段包括野生型人IgG4 Fc区或其它野生型人IgG4等位基因。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段包括包含S228P突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方式中，IgG4的S228P突变恒定区的氨基酸序列包括SEQ ID NO:259的序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段对人LAG3具有特异性结合亲和力，其足以提供诊断和/或治疗用途。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、经标记的抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。重组抗体是使用重组方法在体外而非在动物体内制备的抗体。
在某些实施方式中，本公开提供了抗LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段与本文所提供的抗体或其抗原结合片段竞争与LAG3结合。在某些实施方式中，本公开提供了一种抗LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段与包括包含SEQ ID NO:253的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:254(BMS-986016)的序列的轻链可变区的抗体竞争与人LAG3结合。在某些实施方式中，本公开提供了一种抗LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段与包括包含SEQ ID NO:255的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:256(BAP-050)的序列的轻链可变区的抗体竞争与人LAG3结合。
在某些实施方式中，本公开提供了一种抗LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段与选自下组的抗体竞争与人LAG3结合：a)包括包含SEQ ID NO:253的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:254的序列的轻链可变区的抗体；b)包括包含SEQ ID NO:255的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:256的序列的轻链可变区的抗体，并且其中所述抗体或其抗原结合片段不是BMS-986016和BAP-050中的任何一种。
如本文所使用的，“BMS-986016”是指包括具有SEQ ID NO:253的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:254的氨基酸序列的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。
如本文所使用的，“BAP-050”是指包括具有SEQ ID NO:255的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。
抗体变体
本文所提供的抗体和其抗原结合片段还涵盖本文所提供的抗体序列的各种变体。
在某些实施方式中，抗体变体包括在如上表1和3所提供的一个或多个CDR序列中、上表2和4所提供的重链可变区或轻链可变区中的一个或多个非CDR序列中和/或恒定区(例如，Fc区)中的一个或多个修饰或取代。此类变体保留了其亲本抗体对LAG3的结合特异性，但具有一种或多种由修饰或取代赋予的期望特性。例如，抗体变体可以具有改善的抗原结合亲和力、改善的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱酰胺化、减少或耗竭的效应子功能、改善的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和/或与缀合(例如，一个或多个引入的半胱氨酸残基)的相容性。
可以使用本领域已知的方法(例如“丙氨酸扫描诱变”)筛选亲本抗体序列以鉴定合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见例如Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085)。简要地说，可以鉴定靶残基(例如，带电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并将其由中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，并且产生经修饰的抗体，并且针对所关注特性进行筛选。如果在特定的氨基酸位置处的取代表现出所关注的功能改变，则所述位置可以被鉴定为潜在的用于修饰或取代的残基。可以通过用不同类型的残基(例如，半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估潜在残基。
亲和力变体
抗体的亲和力变体可以包括如上表1和3中提供的一个或多个CDR序列、如上表6中提供的一个或多个FR序列或上表2和4中提供的重链或轻链可变区序列中的修饰或取代。本领域技术人员可以基于上表1和3中的CDR序列和上表2和4中的可变区序列容易地鉴定FR序列，因为本领域公知在可变区中，CDR区侧接有两个FR区。亲和力变体保留了亲本抗体对LAG3的特异性结合亲和力，或者相较于亲本抗体甚至具有改进的LAG3特异性结合亲和力。在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包括保守取代。
本领域技术人员将理解，在上表1和3中提供的CDR序列以及上表2和4中提供的可变区序列中，一个或多个氨基酸残基可以被取代，但所得抗体或抗原结合片段仍保留对LAG3的结合亲和力或结合能力或者甚至具有改进的结合亲和力或结合能力。本领域中已知的各种方法可以用于实现此目的。例如，可以产生抗体变体(如Fab或scFv变体)的文库，并用噬菌体展示技术表达，并且然后对与人LAG3的结合亲和力进行筛选。再例如，计算机软件可以用于虚拟模拟抗体与人LAG3的结合，并且鉴定抗体上形成结合界面的氨基酸残基。在取代中可以避开此类残基以防止结合亲和力降低，或者可以作为取代的靶标以获得更强的结合。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段包括CDR序列中的一个或多个CDR序列和/或FR序列中的一个或多个FR序列中的一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体包括CDR序列和/或FR序列中总共不超过20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个取代。
在某些实施方式中，抗LAG3抗体或其抗原结合片段包括与上表1和3中所列出的一个(或多个)序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的1个、2个或3个CDR序列，但仍以相对于其亲本抗体而言相似或甚至更高的水平保留了对LAG3的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，抗LAG3抗体或其抗原结合片段包括与上表2和4中所列出的一个(或多个)序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的一个或多个可变区序列，但仍以类似于其亲本抗体或甚至更高的水平保留了对LAG3的特异性结合亲和力。在一些实施方式中，上表2和4中所列出的可变区序列中总共1至10个氨基酸已被取代、***或缺失。在一些实施方式中，取代、***或缺失发生在CDR之外的区中(例如，在FR中)。
糖基化变体
本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段还涵盖糖基化变体，可以获得所述糖基化变体以增加或减少所述抗体或其抗原结合片段的糖基化程度。
抗体或其抗原结合片段可以包括引入或去除糖基化位点的一个或多个修饰。糖基化位点是具有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如，寡糖结构)可以连接到所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接是指将碳水化合物部分与天冬酰胺残基(例如，如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸等三肽序列中的天冬酰胺残基)连接的侧链，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接，最常见的是与丝氨酸或苏氨酸连接。可以很方便地去除天然糖基化位点，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于所述序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一者被取代。可以通过引入此类三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基以类似的方式产生新的糖基化位点。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体和抗原结合片段包括N297(例如，N297A、N297Q或N297G)处的突变以去除糖基化位点。
半胱氨酸工程化变体
本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化变体，所述变体包括一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基是非二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤代乙酰基在经工程化的半胱氨酸的位点处与例如细胞毒性化合物和/或成像化合物、标记或放射性同位素等缀合。用于工程化抗体或其抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域已知的，参见例如WO2006/034488。
Fc变体
本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段还涵盖Fc变体，所述Fc变体在Fc区和/或铰链区处包括一个或多个氨基酸残基修饰或取代，例如以提供改变的效应子功能，如ADCC和CDC。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法在本领域已有描述，参见例如ShieldsRL.等人,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》2001.276(9):6591-604；Idusogie EE.等人,《免疫学杂志》2000.164(8):4178-84；Steurer W.等人,《免疫学杂志》1995,155(3):1165-74；Idusogie EE.等人,《免疫学杂志》2001,166(4):2571-5；Lazar GA.等人,《美国国家科学院院刊》,2006,103(11):4005-4010；Ryan MC.等人,《分子癌症疗法(Mol.Cancer Ther.)》,2007,6:3009-3018；Richards JO等人,《分子癌症疗法》2008,7(8):2517-27；Shields R.L.等人《生物化学杂志》,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.等人,《生物化学杂志》,2003,278:3466-3473。
本文所提供的抗体或抗原结合片段的CDC活性也可以例如通过改善或减少C1q结合和/或CDC来改变(参见例如WO99/51642；Duncan和Winter《自然》322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及关于Fc区变体的其它实例的WO94/29351)。可以用不同的氨基酸残基替代选自Fc区的氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，以改变C1q结合和/或减少或消除补体依赖细胞毒性(CDC)(参见Idusogie等人的美国专利第6,194,551号)。也可以引入一个或多个氨基酸取代以改变抗体固定补体的能力(参见Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段具有降低的效应子功能，并且在IgG1中在选自下组的位置处包括一个或多个氨基酸取代：234、235、237和238、268、297、309、330和331。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段具有IgG1同种型，并且包括选自下组的一个或多个氨基酸取代：N297A、N297Q、N297G、L235E、L234A、L235A、L234F、L235E、P331S和其任何组合。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段具有IgG2同种型，并且包括选自下组的一个或多个氨基酸取代：H268Q、V309L、A330S、P331S、V234A、G237A、P238S、H268A和其任何组合(例如，H268Q/V309L/A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S)。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段具有IgG4同种型，并且包括选自下组的一个或多个氨基酸取代：N297A、N297Q、N297G、L235E、L234A、L235A和其任何组合。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段具有IgG2/IgG4交叉同种型。IgG2/IgG4交叉同种型的实例描述于Rother RP等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol)》25:1256–1264(2007)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体和抗原结合片段具有IgG4同种型，并且包括228和235的一个或多个点处的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体和抗原结合片段具有IgG4同种型，并且包括Fc区中的S228P突变。在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体和抗原结合片段具有IgG4同种型，并且包括Fc区中的L235E突变。在一些实施方式中，S228P突变的IgG4恒定区的氨基酸序列包括SEQ IDNO:259的序列。
在某些实施方式中，抗LAG3抗体或其抗原结合片段包括改善与新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合的一个或多个氨基酸取代。此类变体可以具有延长的药代动力学半衰期，因为它在酸性pH下与FcRn结合，使其免于在溶酶体中降解，并且随后被易位并释放到细胞外。工程化抗体或其抗原结合片段以改善与FcRn的结合亲和力的方法是本领域熟知的，参见例如Vaughn,D.等人,《结构(Structure)》,6(1):63-73,1998；Kontermann,R.等人,《抗体工程化(Antibody Engineering)》,第1卷,第27章:工程化Fc区以改善PK(Engineering of the Fc region for improved PK),由施普林格(Springer)出版,2010；Yeung,Y.等人,《癌症研究(Cancer Research)》,70:3269-3277(2010)；以及Hinton,P.等人,《免疫学杂志》,176:346-356(2006)。
在某些实施方式中，抗LAG3抗体或其抗原结合片段包括Fc区的界面中的一个或多个氨基酸取代以便于和/或促进异二聚体化。这些修饰包括将突起引入到第一Fc多肽中并且将空腔引入到第二Fc多肽中，其中突起可以定位于空腔中，以便促进第一Fc多肽与第二Fc多肽的相互作用以形成异二聚体或复合物。产生具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如，如美国专利第5,731,168号中所述。
抗原结合片段
本文还提供了抗LAG3抗原结合片段。各种类型的抗原结合片段是本领域已知的并且可以基于本文所提供的抗LAG3抗体开发，所述抗体包括例如在上表1和3中示出的CDR以及在上表2和4中示出的可变区序列的示例性抗体和其不同变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化的变体等)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗原结合片段是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
各种技术可以用于产生此类抗原结合片段。说明性方法包括完整抗体的酶促消化(参见例如Morimoto等人,《生化和生物物理方法杂志(Journal of Biochemical andBiophysical Methods)》24:107-117(1992)；以及Brennan等人,《科学》229:81(1985))、通过如大肠杆菌(E.Coli)等宿主细胞进行的重组表达(例如，对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上文所讨论的从噬菌体展示文库筛选(例如，对于ScFv)以及两个Fab'-SH片段的化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,《生物/技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992))。用于产生抗体片段的其它技术对本领域技术人员来说是显而易见的。
在某些实施方式中，抗原结合片段是scFv。scFv的产生描述于例如WO 93/16185；美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。ScFv可以在氨基末端或羧基末端与效应蛋白融合以提供融合蛋白(参见例如《抗体工程化》,Borrebaeck编辑)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段是二价的、四价的、六价的或多价的。任何超过二价的分子被认为是多价的，涵盖例如三价、四价、六价等。
如果两个结合位点都与同一抗原或同一表位特异性结合，则二价分子可以是单特异性的。在某些实施方式中，这提供了比单价对应物更强的与抗原或表位的结合。类似地，多价分子也可以是单特异性的。在某些实施方式中，在二价或多价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上相同(即，具有相同的序列)或在结构上不同(即，具有不同的序列，但具有相同的特异性)。
如果两个结合位点对不同的抗原或表位具有特异性，则二价也可以是双特异性的。这也适用于多价分子。例如，当两个结合位点对第一抗原(或表位)是单特异性的并且第三结合位点对第二抗原(或表位)是特异性的时，三价分子可以是双特异性的。
双特异性抗体
在某些实施方式中，抗LAG3抗体或其抗原结合片段是双特异性的。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步连接于具有与所述LAG3抗体不同的结合特异性的第二功能部分或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段能够与除LAG3以外的第二抗原或LAG3上的第二表位特异性结合。在某些实施方式中，第二抗原选自下组：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、GPC-3、B7-H3、B7-H4、TROP2、CLDN18.2、EGFR、HER2、CD117、C-Met、PTHR2和HAVCR2(TIM3)。
缀合物
在一些实施方式中，抗LAG3抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个缀合物部分。缀合物部分可以连接于抗体或其抗原结合片段。缀合物部分是可以与抗体或其抗原结合片段连接的部分。可以预期，多种缀合物部分可以连接于本文所提供的抗体或其抗原结合片段(参见例如“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”,《对微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编辑),纽约Carger出版社(Carger Press,New York),(1989))。这些缀合物部分可以通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、复合、缔合、共混或添加以及其它方法连接于抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以通过连接子连接于一种或多种缀合物。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以被工程化以包括表位结合部分之外的可以用于与一个或多个缀合物部分结合的特异性位点。例如，此类位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以促进与缀合物部分的共价连接。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以连接于缀合物部分间接或通过另一缀合物部分连接于缀合物部分。例如，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以与生物素缀合，然后与和亲和素缀合的第二缀合物间接缀合。在一些实施方式中，缀合物部分包括清除改性剂(例如，如PEG等延长半衰期的聚合物)、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、可检测标记(例如，发光标记、荧光标记、酶底物标记)、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、纯化部分或其它抗癌药物。
“毒素”可以是对细胞有害或可以损伤或杀伤细胞的任何药剂。毒素的实例包括但不限于紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、MMAE、MMAF、DM1、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羧基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、***(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)和其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和二氯二胺铂(II)(DDP顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素(daunomycin))和阿霉素(doxorubicin))、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(以前的放线菌素)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin)(AMC))、抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白结合剂。
可检测标记的实例可以包括荧光标记(例如，荧光素、罗丹明、丹酰、藻赤素或德克萨斯红)、酶底物标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如，123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其它镧系元素)、发光标记、发色团部分、地高辛(digoxigenin)、生物素/亲和素、DNA分子或金以供检测。
在某些实施方式中，缀合物部分可以是帮助增加抗体的半衰期的清除改性剂。说明性实例包括水溶性聚合物，如PEG、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化或非支化的。与抗体连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，则聚合物可以是相同或不同的分子。
在某些实施方式中，缀合物部分可以是纯化部分，如磁珠。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段用作缀合物的基础。
多核苷酸和重组方法
本公开提供了编码本文所提供的抗LAG3抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸。如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非另外说明，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补性序列以及明确指出的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，在所述序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等人,《核酸研究》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志》260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,《分子与细胞探测(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。
编码单克隆抗体的DNA可使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。编码DNA也可以通过合成方法获得。
可以使用本领域已知的重组技术将编码抗LAG3抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸***到载体中以供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
本公开提供了包括本文所提供的分离的多核苷酸的载体。在某些实施方式中，本文所提供的多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段、可操作地连接于核酸序列的至少一种启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)以及至少一种选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
包括编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的载体可以被引入到宿主细胞中以供克隆或基因表达。用于克隆或表达本文中的载体中的DNA的合适的宿主细胞是上述原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌纲，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。
除了原核细胞之外，如丝状真菌或酵母等的真核微生物也是编码抗LAG3抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、物种和菌株都比较常用且在本文中适用，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属宿主(Kluyveromyceshost)，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，例如，脉孢菌(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉菌属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉菌。
用于表达本文所提供的糖基化抗体或其抗原结合片段的合适宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定多种杆状病毒株和变体以及对应的许可(permissive)昆虫宿主细胞，所述许可昆虫宿主细胞来自于如以下等宿主：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori)。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体以及家蚕NPV的Bm-5株变体，并且此类病毒都可以根据本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，最关注的是脊椎动物细胞，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7，ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(针对悬浮培养物中的生长亚克隆的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》36:59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4,Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCCCRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；鼠类乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年鉴(AnnalsN.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌系(Hep G2)。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物培养的细胞系，如CHO、BHK、NS0、293和其衍生物。
用上述用于抗LAG3抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将所述宿主细胞在常规营养培养基中培养，所述常规营养培养基被改性成适于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因。在另一个实施方式中，抗体可以通过本领域中已知的同源重组产生。在某些实施方式中，宿主细胞能够产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段。
本公开还提供了一种表达本文所提供的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达本公开的载体的条件下培养本文所提供的宿主细胞。用于产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可以在各种培养基中培养。可商购获得的培养基如Ham'sF10(西格玛公司(Sigma))、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)(西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)(西格玛公司)适于培养宿主细胞。另外，在以下文献中描述的培养基中的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham等人,《酶学方法》58:44(1979)；Barnes等人,《分析生物化学》102:255(1980)；美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国复审专利30,985。这些培养基中的任何培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充物。如温度、pH等培养条件是先前与被选定用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在胞内、周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果在胞内产生抗体，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的微粒状碎片。Carter等人,《生物/技术》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简而言之，将细胞糊剂在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下经约30分钟解冻。细胞碎片可以通过离心去除。当抗体被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)对来自此类表达***的上清液进行浓缩。如PMSF等的蛋白酶抑制剂可以包括在上述步骤中的任何步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗LAG3抗体或其抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定在固相上的蛋白A用于抗体和其抗原结合片段的免疫亲和纯化。蛋白A是否合适作为亲和配体取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》5:1567 1575(1986))。亲和配体附着的基质最常为琼脂糖，但其它基质也是可用的。与可以用琼脂糖实现的流速和处理时间相比，机械稳定的基质(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)可实现更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(新泽西州菲利普斯堡的马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其它技术也是可用的，如在离子交换柱上进行分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素SEPHAROSETM上进行色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液使包括所关注抗体和污染物的混合物经受低pH疏水相互作用色谱法，优选地在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
药物组合物
本公开进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包含抗LAG3抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的载体。
本公开进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包含编码抗LAG3抗体或其抗原结合片段的多核苷酸以及一种或多种药学上可接受的载体。本文所提供的抗体也可以通过递送编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸(例如，体外转录的mRNA或表达载体)而在体内产生。用于体内抗体表达的多核苷酸递送的方法是本领域已知的，参见例如Rybakova,Y.等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》,第27卷(8),第1415-1423页(2019)；Deal,C.E.等人,《疫苗(Vaccines)》,2021,9,108。
本公开进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包括包含编码抗LAG3抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的表达载体以及一种或多种药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，所述表达载体包括病毒载体或非病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体。非病毒载体的实例包括但不限于裸DNA、质粒、外来体(exosome)、mRNA等。在某些实施方式中，所述表达载体适用于人类的基因疗法。用于基因疗法的合适载体包括例如腺相关病毒(AAV)或腺病毒载体。在某些实施方式中，所述表达载体包括DNA载体或RNA载体。在某些实施方式中，所述药学上可接受的载体是聚合物赋形剂，如但不限于微球、微胶囊、聚合物胶束和树枝状聚合物。本公开的多核苷酸和/或多核苷酸载体可以通过本领域已知的方法包封、粘附或涂覆在基于聚合物的组分上(参见例如W.Heiser,《非病毒基因转移技术(Nonviral genetransfer technologies)》,由胡玛纳出版社(Humana Press)出版,2004；美国专利6025337；《先进药物递送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)》,57(15):2177-2202(2005))。
用于本文所公开的药物组合物的药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固相载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分配剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域已知的其它组分或其各种组合。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填料、粘结剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚(butylated hydroxanisol)、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯(propyl gallate)。如本文所公开的，在包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和缀合物的组合物中包括一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂降低了抗体或其抗原结合片段的氧化。这种氧化降低可防止或减少结合亲和力的丧失，从而提高抗体稳定性并最大化保质期。因此，在某些实施方式中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所公开的一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂。进一步提供了用于通过将抗体或抗原结合片段与一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂混合来防止本文所提供的抗体或抗原结合片段的氧化、延长保质期和/或提高疗效的方法。
为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如：水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因；悬浮和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；多价螯合剂或螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)；乙醇；聚乙二醇；丙二醇；氢氧化钠；盐酸；柠檬酸或乳酸。可以将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精等药剂。
药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释调配物或粉末。口服制剂可以包括标准载体，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，将药物组合物调配成可注射组合物。可注射药物组合物可以以任何常规形式制备，所述常规形式例如液体溶液、悬浮液、乳液或适用于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射制剂可以包括准备注射的无菌和/或无热原溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉末，包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与媒剂组合的无菌干燥的不溶性产品以及无菌和/或无热原乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
在某些实施方式中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带有针头的注射器中。正如本领域已知的和实践的一样，所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原的。
在某些实施方式中，通过将如本文公开的抗体或其抗原结合片段溶解在合适的溶剂中来制备无菌冻干粉末。所述溶剂可以包括赋形剂，所述赋形剂可改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于水、葡聚糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的药剂。溶剂可以包括缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾、或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施方式中，所述缓冲剂为约中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供期望的调配物。在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中以冻干。每个小瓶可以包括单剂量或多剂量的抗LAG3抗体或其抗原结合片段或其组合物。用略微高于每次剂量所需或多次剂量所需的量(例如约10％)过填充小瓶是可接受的，以便促进取样精确和给药精确。可以在适当的条件下(如在约4℃至室温下)储存冻干粉末。
用注射用水将冻干粉末重构，从而提供用于肠胃外施用的制剂。在一个实施方式中，为了重构，将无菌和/或无热原水或其它合适的液体载体添加到冻干粉末中。精确的量取决于给予的所选疗法并且可以根据经验确定。
试剂盒
在某些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本公开提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和第二治疗剂。在某些实施方式中，第二治疗剂选自下组：化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法、激素疗法、抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、抗氧化剂、金属螯合剂和细胞因子。
如将对本领域的技术人员显而易见的是，如果需要，此类试剂盒可以进一步包括各种常规药物试剂盒组件中的一个或多个，例如具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、另外的容器等。试剂盒中还可以包括指示待施用的组分的量的说明书(作为***物或作为标签)、施用指南和/或用于混合组分的指南。
使用方法
另一方面，本公开还提供了治疗受试者的LAG3相关疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗体或其抗原结合片段、或本文所提供的编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸和/或本文所提供的药物组合物。在某些实施方式中，所述受试者是人。
在一些实施方式中，所述LAG3相关疾病、病症或病状的特征在于与受试者的抑制的免疫***相关。
在一些实施方式中，所述与抑制的免疫***相关的疾病是癌症或感染性疾病。
在一些实施方式中，所述癌症选自下组：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体肿瘤、***、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促***增生性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维结构不良、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺***状癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、***癌、葡萄膜黑素瘤、罕见的血液学病症、肾转移癌、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌。
在一些实施方式中，所述癌症选自下组：结直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤、肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直肠癌。
在一些实施方式中，所述癌症是结肠癌或乳腺癌。
在一些实施方式中，所述与抑制的免疫***相关的疾病是病原体相关疾病。在一些实施方式中，所述病原体相关疾病选自下组：慢性病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染。
在一些实施方式中，所述慢性病毒感染包括由以下引起的感染：爱泼斯坦-巴尔病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、疱疹病毒(例如，HSV-1、HSV-2、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水疱性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、霍乱(Cholera)、白喉(Diphtheria)、肠杆菌属、***(Gonococci)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningococci)、分枝杆菌属(mycobacteria)、假单胞菌属、肺炎球菌(Pneumonococci)、立克次氏体细菌(rickettsia bacteria)、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌、破伤风(Tetanus)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉菌(A.fumigatus)、黑曲霉菌(A.niger)等)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、念珠菌属(白色念珠菌(C.albicans)、克柔念珠菌(C.krusei)、光滑念珠菌(C.glabrata)、热带念珠菌(C.tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、毛霉目(Genus Mucorales)(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、蠕虫寄生虫(helminth parasite)(钩虫(hookworm)、绦虫(tapeworms)、吸虫(flukes)、扁虫(flatworms)(例如，血吸虫(Schistosomia))、赞比亚贾第鞭毛虫(Giardia Zambia)、旋毛虫(trichinella)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba Fragilis)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)。
在某些实施方式中，LAG3相关疾病、病症或病状的特征在于受试者的LAG3的上调，其中受试者细胞中LAG3的表达水平显著高于正常细胞的预期水平。所关注生物样品中LAG3的存在和/或量可以指示生物样品所源自的受试者是否可能对抗LAG3抗体做出应答。可以使用各种方法来确定受试者的测试生物样品中LAG3的存在和/或量。例如，测试生物样品可以暴露于抗LAG3抗体或其抗原结合片段，所述抗LAG3抗体或其抗原结合片段与所表达的LAG3蛋白结合并检测所述蛋白。或者，也可以使用如qPCR、逆转录酶PCR、微阵列、SAGE、FISH等方法在核酸表达水平上检测LAG3。在一些实施方式中，测试样品源自癌细胞或组织、或肿瘤浸润免疫细胞。在某些实施方式中，测试生物样品中LAG3的存在或上调水平指示应答的可能性。如本文所使用的，术语“上调”是指与使用相同方法检测的参考样品中的LAG3表达水平相比，测试样品中LAG3表达水平总体增加不少于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。参考样品可以是从健康或非患病个体获得的对照样品，或者是从测试样品所获自的同一个体获得的健康或非患病样品。例如，参考样品可以是与测试样品(例如，肿瘤)相邻或在测试样品附近的非患病样品。
另一方面，提供了用于治疗受试者的疾病、病症或病状的方法，所述受试者将受益于调节LAG3活性，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的药物组合物。在某些实施方式中，所述疾病或病状是LAG3相关疾病、病症或病状。
本文所提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量将取决于本领域已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、受试者的健康状况和交叉反应的潜力、过敏、敏感性和不良副作用以及施用途径和疾病发展的程度。本领域技术人员(例如，医师或兽医)可以根据这些和其它情况或要求所指示的按比例减少或增加剂量。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg的治疗有效剂量施用。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中根据受试者的反应而变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单剂量，或可以随时间推移施用若干分次剂量。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的任何途径施用，例如，肠胃外(例如，皮下、腹膜内、静脉内，包括静脉内输注、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如，口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以单独施用或与治疗有效量的第二治疗剂组合施用。例如，本文所公开的抗体或其抗原结合片段可以与第二治疗剂组合施用，例如化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法、激素疗法、抗病毒剂、抗生素、镇痛药、抗氧化剂、金属螯合剂或细胞因子。
如本文所使用的，术语“免疫疗法”是指刺激免疫***对抗如癌症等疾病或以一般方式增强免疫***的疗法类型。免疫疗法的实例包括但不限于检查点调节剂、过继性细胞转移、细胞因子、溶瘤病毒和治疗性疫苗。
“靶向疗法”是作用于与癌症相关的特定分子的疗法类型，所述特定分子如存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中或在癌细胞中更丰富的特定蛋白质，或有助于癌症生长和存活的癌症微环境中的靶分子。靶向疗法将治疗剂靶向肿瘤，由此使正常组织免受治疗剂的影响。
在这些实施方式中的某些中，可以与一种或多种另外的治疗剂同时施用与一或多种另外的治疗剂组合施用的本文所提供的抗体或其抗原结合片段，并且在这些实施方式中的某些中，抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的抗体或其抗原结合片段不是必须与所述药剂同时施用或在相同的组合物中施用。在另一种药剂之前或之后施用的抗体或其抗原结合片段被认为与所述药剂“组合”施用，如本文中所使用的短语，即使抗体或抗原结合片段和第二药剂是通过不同途径施用的。在可能的情况下，与本文所公开的抗体或其抗原结合片段组合施用的另外的治疗剂根据另外的治疗剂的产品信息表中列出的时间表或根据美国医师用药手册2003(《美国医师用药手册(Physicians'Desk Reference)》,第57版；医疗经济学公司(Medical Economics Company)；ISBN:1563634457第57版(2002年11月))或本领域众所周知的方案施用。
在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是化学治疗剂，所述化学治疗剂可以与本文所述的抗LAG3抗体一起施用，并且包括但不限于抗赘生物药剂，包括烷化剂，所述烷化剂包括：氮芥，如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；亚硝基脲，如卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU)；TemodalTM(替莫唑胺(temozolamide))、亚乙基亚胺(ethylenimines)/亚甲基胺类(methylmel amine)，如三亚甲基胺(thriethylenemel amine)(TEM)、三乙烯(triethylene)、硫代磷酰胺(thiophosphoramide)(噻替哌(thiotepa))、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)(HMM，(altretamine(六甲蜜胺))；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)；三嗪(triazines)，如达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物，如甲氨蝶呤和三甲曲沙(trimetrexate)；嘧啶类似物，如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟脱氧尿苷(fluorodeoxyuridine)、吉西他滨(gemcitabine)、胞嘧啶***糖苷(cytosine arabinoside)(AraC，阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷(5-azacytidine)、2,2'-二氟脱氧胞苷(2,2'-difluorodeoxycytidine)；嘌呤类似物，如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、T-脱氧助间型霉素(T-deoxycoformycin)(喷司他丁(pentostatin))、赤型羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)(EHNA)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)和2-氯脱氧腺苷(2-chlorodeoxyadenosine)(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA)；天然产物，包括抗有丝***药物，如紫杉醇(paclitaxel)、包括长春碱(VLB)、长春新碱和长春瑞滨的长春花生物碱、泰索帝(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)和雌莫司汀磷酸盐(estramustinephosphate)；鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，如依托泊苷和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，如放线菌素D、道诺霉素(红比霉素(rubidomycin))、阿霉素、米托蒽醌、伊达比星(idarubicin)、博来霉素、普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))、丝裂霉素C和放线菌素；酶，如L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)；生物应答调节剂，如干扰素α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；其它药剂，包括铂配位络合物，如奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂和卡铂(carboplatin)；蒽二酮类，如米托蒽醌；经取代的尿素，如羟基脲；甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼；肾上腺皮质抑制剂，如米托坦(o,p-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，如***(prednisone)和等效物、***(dexamethasone)和氨鲁米特；GemzarTM(吉西他滨(gemcitabine))；孕酮，如己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)和乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)；***，如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和乙炔***等效物；抗***，如他莫昔芬(tamoxifen)；雄激素，包括丙酸***和氟***/等效物；抗雄激素，如氟他米特(flutamide)、***释放激素类似物和亮丙瑞林(leuprolide)；以及非甾体类抗雄激素，如氟他米特。靶向表观遗传机制的疗法，包括但不限于组蛋白去乙酰化酶抑制剂、去甲基化剂(例如，维达扎(Vidaza))和转录抑制释放(ATRA)疗法，也可以与抗原结合蛋白组合。在一个实施方式中，所述化学治疗剂选自下组：紫杉烷类(如紫杉醇、多西他赛(docetaxel)(泰素帝)、经修饰的紫杉醇(如亚伯杉(Abraxane)和Opaxio)、阿霉素、舒尼替尼(sunitinib)(索坦(Sutent))、索拉非尼(sorafenib)(蕾莎瓦(Nexavar))和其它多激酶抑制剂、奥沙利铂、顺铂和卡铂、依托泊苷、吉西他滨和长春碱。在一个实施方式中，所述化学治疗剂选自下组：紫杉烷类(如紫杉醇、多西他赛(泰素帝)、经修饰的紫杉醇(如亚伯杉和Opaxio)。在一个实施例中，另外的化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan)或奥沙利铂。在一个实施方式中，所述化学治疗剂是5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和伊立替康(FOLFIRI)。在一个实施方式中，所述化学治疗剂是5-氟尿嘧啶和奥沙利铂(FOLFOX)。
另一方面，本公开提供了检测样品中LAG3的存在或量的方法，所述方法包括：使所述样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；以及确定所述样品中LAG3的所述存在或所述量。
另一方面，本公开提供了一种选择患有与抑制的免疫***相关的疾病、病症或病状的患者的方法，所述方法包括以下步骤：a)使从所述受试者获得的样品与本公开的抗体或其抗原结合片段接触；b)确定所述样品中LAG3的存在或量；以及c)将所述受试者中LAG3的所述存在或所述量与所述LAG3相关疾病、病症或病状的存在或状态相关联。
另一方面，本公开提供了包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段的试剂盒，任选地与可检测部分缀合，所述试剂盒可用于检测LAG3相关疾病、病症或病状。试剂盒可以进一步包括使用说明书。
另一方面，本公开还提供了本文所提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于在受试者中治疗、预防或缓解LAG3相关疾病、病症或病状的药物、在制备用于诊断LAG3相关疾病、病症或病状的诊断试剂中的用途。
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明并且不应将所述实施例解释为限制本发明的范围。下文描述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、材料和方法不旨在限制本发明，而仅用于说明落入本发明范围内的具体实施方式。本领域技术人员可以在不运用发明能力和不脱离本发明范围的情况下开发出等效的组合物、材料和方法。将理解，可以在本文描述的程序中作出许多变化，同时仍然保持在本发明的范围内。本发明的发明人的意图是此类变化都包括在本发明的范围内。
实施例：
实施例1：试剂产生
1.1.参考抗体产生
将编码抗LAG3参考抗体BMS-986016(参见WO 2015/116539 A1，SEQ ID NO:3和5)、BAP-050(参见US20150259420A1，SEQ ID NO:6和16)和TSR-033(参见WO 2018/201096Al，SEQ ID NO:21和22)的可变区的DNA序列克隆到表达人IgG恒定区的载体中。下表7中示出了参考抗体BMS-986016、BAP-050和TSR-033的可变区氨基酸序列。将转染Expi293细胞的表达质粒(英杰公司(Invitrogen))在37℃下培养5天。然后收集培养基并离心以去除细胞沉淀物。使用蛋白A亲和色谱柱纯化所采集的上清液。
表7.3种参考抗体的可变区氨基酸序列
1.2.LAG3稳定表达细胞系产生
将编码全长人LAG3(NP_002277.4)、食蟹猴LAG3(XP_005570011.1)和小鼠LAG3(NP_032505.1)的DNA序列分别克隆到pIRES载体(克隆技术公司(Clontech))中。将用人LAG3或食蟹猴LAG3表达质粒转染的293F细胞(英杰公司)在含有0.5μg/ml嘌呤霉素的培养基中选择性培养2周。将用人LAG3表达质粒转染的BW5147小鼠T淋巴瘤细胞在含有1μg/ml嘌呤霉素的培养基中选择性培养2周。将用人LAG3或小鼠LAG3表达质粒转染的CHOK1细胞(英杰公司)在含有6μg/ml嘌呤霉素的培养基中选择性培养2周。然后，通过限制性稀释法分离稳定表达人LAG3、食蟹猴LAG3或小鼠LAG3的单细胞克隆，并通过FACS进行筛选。
用pCMV3载体克隆的另一个人LAG3(NP_002277.4)表达质粒购自义翘神州生物公司(Sino Biological)(HG16498-UT)。以类似的方式，将用来自义翘神州生物公司的用人LAG3表达质粒转染的293F细胞和CHOK1细胞在含有400μg/ml或800μg/ml潮霉素(hygromycin)的培养基中选择性培养2周。然后，通过限制性稀释法分离稳定表达人LAG3的单细胞克隆，并通过FACS进行筛选。
1.3.重组蛋白产生
人IgG Fc(hFc)标签化的人LAG3胞外结构域(ECD，L23-L450)和人LAG3 D1-D2(L23-G261)的重组蛋白由睿智化学公司(Chempartner)产生。6xHis标签化的和小鼠人IgGFc(mFc)标签化的人LAG3 ECD的重组蛋白购自百英生物公司(Biointron)。6xHis标签化的LSEctin ECD(S54-C293，NP_940894)重组蛋白购自R&D***公司(R&D system)(2947-CL)。6xHis标签化的FGL1重组蛋白购自义翘神州生物公司。
实施例2：抗体产生
2.1.用于蛋白质免疫的免疫原的制备
使用hFc标签化的人LAG3 D1-D2重组蛋白用作免疫原以进行蛋白质免疫(参见实施例1.3)。
2.2.用于细胞免疫的免疫原的制备
稳定表达人LAG3的BW5147小鼠T淋巴瘤细胞用作免疫原以进行细胞免疫(参见实施例1.2)。
2.3.免疫
通过使用人LAG3 D1-D2重组蛋白进行蛋白质免疫和使用稳定表达人LAG3的BW5147小鼠T淋巴瘤细胞进行细胞免疫的两种不同策略对SJL/J小鼠(SLAC)进行免疫。ELISA测定和FACS测定被用于分别用于检测免疫小鼠的血清滴度，两者分别用于使用人LAG3 ECD重组蛋白和使用稳定表达人LAG3的293F细胞。选择具有高血清滴度的小鼠进行杂交瘤融合。
2.4.杂交瘤产生
在最后一次加强之后5天，处死小鼠并收集脾细胞。添加1％(v/v)NH4OH以使红细胞裂解。然后通过高效电融合或PEG方法将经洗涤的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞(ATCC)融合。在细胞融合之后，将融合的细胞以2x 104个细胞/孔的密度接种到96孔板中，所述板具有包括20％ FBS和1％ HAT的200μl DMEM培养基。
2.5.杂交瘤筛选
在融合之后10-12天，通过使用人LAG3 D1-D2重组蛋白的ELISA测定或使用稳定表达人LAG3的CHOK1细胞的Acumen测定(TTP Labtech)对融合板进行初步筛选。将来自阳性孔的杂交瘤细胞扩增到24孔板以进行第2次筛选。在第2次筛选中，通过ELISA测定和FACS测定评估结合活性，两者分别用于使用人LAG3 D1-D2重组蛋白和使用稳定表达人LAG3的293F细胞。另外，在杂交瘤表征的第2次筛选中也检测到物种交叉反应性、LAG3和MHC II相互作用阻断活性(表征测定方法参见实施例3)。然后选择具有最高结合和阻断活性的杂交瘤细胞的孔进行亚克隆。
2.6.杂交瘤亚克隆
将来自所选孔的杂交瘤细胞有限稀释到96孔板中，随后进行与如实施例2.5中所述相同的筛选。然后将具有最高结合和阻断活性的单克隆杂交瘤细胞系冷冻保存为命中克隆(hit clones)。
总共13个克隆被鉴定为命中克隆，并且从这些克隆中纯化的杂交瘤抗体分别命名为015、021、023、024、027、029、033、035、038、039、047、048和057。
实施例3：抗体表征
3.1.杂交瘤抗体产生和纯化
在培养约14天之后，收集杂交瘤细胞培养基并离心以去除细胞。在通过0.22μmPES膜过滤并将pH调整到7.4之后，将所采集的上清液上样到蛋白A亲和色谱柱(GE)。将抗体用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱，随后立即使用Tris缓冲液(pH 8.0)中和。在用PBS缓冲液透析之后，通过Nano Drop(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))确定抗体浓度。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC(安捷伦公司(Agilent))评估蛋白质的纯度。用Endochrome-K试剂盒(查尔斯河实验室(Charles River))检测内毒素水平。
3.2.结合活性检测
使用hFc标签化的人LAG3 D1-D2重组蛋白，通过ELISA测定检测经纯化的针对人LAG3的杂交瘤抗体的结合活性。简而言之，将抗体与ELISA微孔板涂覆的抗原在37℃下一起温育1小时。在洗涤之后，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG第2Ab(西格玛公司)并在37℃下温育1小时。然后，添加100微升/孔的TMB溶液(生物技术公司(Biotechnology))。在室温下温育15分钟后，通过添加50μl 1N HCl来终止反应。读取OD450nm并使用GraphPadPrism9.0计算EC50。如表8所总结的，被测的所有抗体都与人LAG3具有强结合。
表8.抗LAG3杂交瘤抗体表征总结
加号代表被测抗体可以阻断LAG3/MHC II介导的报告基因活性抑制或抗原特异性T细胞活化。加号数量用于指示相对活性水平(+++>++>+)
3.3.物种交叉反应性检测
使用稳定表达人LAG3、食蟹猴LAG3的293F细胞、稳定表达小鼠LAG3的CHOK1细胞，通过FACS测定确定经纯化的针对人、食蟹猴和小鼠LAG3的杂交瘤抗体的物种交叉反应性。简而言之，将抗体与2x105个靶细胞在4℃下一起温育1小时。在洗涤之后，添加荧光标记的抗小鼠IgG第2抗体(生命技术公司(Life Technologies))并且在4℃下温育1小时。检测几何中值荧光强度(MFI)并使用GraphPad Prism9.0计算EC50。13种功能性抗体的物种交叉反应性特性总结在表8中。除了015、039和048之外，被测的所有抗体都可以与食蟹猴LAG3结合。被测的抗体都不可以与小鼠LAG3结合。
3.5.LAG3/MHC II相互作用阻断活性检测
竞争性FACS测定用于确定经纯化的杂交瘤抗体是否可以阻断LAG3与MHC II的相互作用。简而言之，将抗体和hFc标签化的人LAG3 ECD重组蛋白与内源性表达MHC II的Raji细胞共温育。洗涤后，添加染料标记的抗人Fc第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。检测荧光强度。通过阻断人LAG3 ECD重组蛋白与Raji细胞结合来确定阻断率。使用GraphPad Prism9.0计算的IC50和最高阻断率总结在表8中。被测的所有抗体都可以阻断LAG3和MHC II的相互作用。
3.6.NFAT报告基因测定
通过基于细胞的NFAT报告基因测定评估经纯化的杂交瘤抗体缓解LAG3/MHC II介导的抑制的阻断活性。简而言之，将每种被测抗体与稳定表达人LAG3和NFAT报告基因的25ul Jurkat细胞(4x 106/ml)混合。同时用100ng/ml SED毒素制备Raji细胞悬浮液(1x106/ml)。将悬浮于25ul SED的Raji细胞添加到Jurkat细胞和被测抗体的混合物中，随后在37℃下温育24小时。使用One Glo Promega试剂和酶标仪测量荧光素酶活性。与同种型对照相比，通过报告基因活性变化倍数确定阻断活性。如表8所总结的，被测的所有抗体都可以以不同水平阻断LAG3/MHC II介导的对报告基因活性的抑制。
3.7.抗原特异性T细胞活化测定
通过使用抗原特异性小鼠T细胞杂交瘤(3E4)的T细胞活化测定评估经纯化的杂交瘤抗体缓解LAG3/MHC II介导的抑制的功能活性。杂交瘤3E4表达对来自OVA(323-339)的肽具有特异性的T细胞受体(TCR)，并在与肽脉冲的、MHC匹配的抗原呈递细胞共培养时分泌IL-2。由于人LAG3能够与小鼠MHC II类结合，因此人LAG3在3E4中的表达可能通过与MHC II类结合而对鼠类脾细胞产生抑制作用。此抑制作用可以通过LAG3阻断抗体而逆转。简而言之，将每种被测抗体与稳定表达人LAG3的50ul 3E4细胞(2x106/ml)混合。同时用10ug/mlOVA肽制备小鼠脾细胞悬浮液(4x 106/ml)。将悬浮于50ul OVA肽的小鼠脾细胞添加到3E4细胞和被测抗体的混合物中，随后在37℃下温育40小时。通过小鼠IL-2DuoSet ELISA(R&D***公司)和酶标仪测量mIL-2。通过IL-2分泌的增加来确定功能活性。如表8所总结的，被测的所有抗体都可以以不同水平阻断LAG3/MHC II抑制的T细胞的抗原脉冲IL-2分泌。
3.8.根据表位分类
竞争性ELISA测定用于对经纯化的杂交瘤抗体进行根据表位分类。简而言之，将过量的竞争者抗体和生物素标记的hFc标签化的人LAG3 ECD重组蛋白与ELISA微孔板涂覆的BMS-986016或BAP-050共温育。洗涤后，添加HRP标记的抗链霉亲和素(SA)第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。然后，添加100微升/孔的TMB溶液(生物技术公司)。在室温下温育15分钟后，通过添加50μl 1N HCl来终止反应。读取OD 450nm。计算竞争比率。可以彼此竞争与LAG3结合的抗体可以具有相关结合表位。如表8和表9所示，基于竞争特性将总共13种抗LAG3抗体分为3个表位组。033、024、023、048和038示出与BMS-986016的竞争超过30％，但与BAP-050的竞争低于30％，其被分到表位组I。029、039和015示出与BMS-986016和BAP-050两者的竞争低于30％，其被分到表位组III。021、027、047、057和035示出与BMS-986016的竞争低于30％，但与BAP-050的竞争超过30％，其被分到表位组II。
表9.抗LAG3杂交瘤抗体表位分类总结
3.9.杂交瘤测序
按照SMARTScribe逆转录酶的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将从单克隆杂交瘤细胞中分离的总RNA逆转录为cDNA。然后使用cDNA作为模板，以根据金斯瑞(GenScript)的cDNA末端快速扩增(RACE)标准操作程序(SOP)扩增抗体重链和轻链片段。将经扩增的抗体片段单独克隆到标准克隆载体中。进行克隆PCR以筛选具有正确大小的***物的克隆，并通过DNA测序分析***物片段。最后，共有序列被鉴定为抗体重链和轻链可变区。
实施例4：嵌合抗体产生和表征
4.1.嵌合抗体生成与产生
根据杂交瘤测序结果，将小鼠抗LAG3功能性命中抗体转化为具有S228P突变的人IgG4嵌合抗体以进行表征。简而言之，将编码重链可变区的DNA序列克隆到携带具有S228P突变的人IgG4重链恒定区的pcDNA3.4-hIgG4P载体(百英生物公司)中，其中所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:259所示。
具有S228P突变的人IgG4重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO:259)：ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
将编码轻链可变区的DNA序列克隆到携带人κ轻链恒定区的pcDNA3.4-hIgGk载体(百英生物公司)中。用抗体重链和轻链表达质粒共转染的Expi293细胞(生命技术公司)在37℃下扩增5天。然后收集培养基并离心以去除细胞。将所采集的上清液上样到蛋白A亲和色谱柱上。将抗体用0.04M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.1)洗脱，随后立即使用Tris缓冲液(pH8.0)中和。在用PBS缓冲液透析之后，通过Nano Drop(赛默飞世尔公司)确定抗体浓度。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC(岛津(Shimadzu))评估蛋白质的纯度。采用动态比浊LAL测定检测内毒素水平。所得嵌合抗体在本文中被称为015c、021c、023c、024c、027c、029c、033c、035c、038c、039c、047c、048c和057c，其中后缀“c”代表嵌合。
4.2.嵌合抗体表征
4.2.1.结合活性和物种交叉反应性检测
使用稳定表达人LAG3(图1A、1B、1C和1D)或食蟹猴LAG3(图2)的293F细胞，通过FACS测定(参考实施例3.3)确定经纯化的针对人和食蟹猴LAG3的嵌合抗体的结合活性和物种交叉反应性。检测MFI并使用GraphPad Prism9.0计算EC50。如图1A、1B、1C和1D所总结的，被测的所有抗体都与人LAG3具有强结合。如图2所示，除015c、039c和048c外，被测的所有抗体均可以与食蟹猴LAG3结合，这与通过杂交瘤抗体获得的结果一致。
4.2.2.LAG3/MHC II相互作用阻断活性检测
通过竞争性FACS测定确定经纯化的嵌合抗体阻断LAG3和MHC II相互作用的活性。简而言之，将抗体和mFc标签化的人LAG3 ECD重组蛋白与内源性表达MHC II的Raji细胞共温育。洗涤后，添加染料标记的抗小鼠Fc第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。检测荧光强度。通过阻断人LAG3 ECD重组蛋白与Raji细胞结合来确定阻断率。使用GraphPadPrism9.0计算的IC50和最高阻断率总结在表10中。被测的所有抗体都可以阻断LAG3和MHCII的相互作用。
表10.抗LAG3嵌合抗体的LAG3/MHC II阻断活性总结
4.2.3.LAG3/LSECtin相互作用阻断活性检测
通过竞争性ELISA测定确定经纯化的嵌合抗体阻断LAG3和LSECtin相互作用的活性。简而言之，将抗体和mFc标签化的人LAG3 ECD重组蛋白与ELISA微孔板涂覆的人LSECtinECD重组蛋白共温育。洗涤后，添加HRP标记的抗小鼠Fc第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。然后，添加100微升/孔的TMB溶液(生物技术公司)。在室温下温育15分钟后，通过添加50μl 1N HCl来终止反应。读取OD450 nm。通过阻断人LAG3 ECD重组蛋白与ELISA微孔板涂覆的人LSECtin ECD重组蛋白的结合来确定阻断率。如图3所示，021c、023c、029c和BMS-986016可以有效地阻断LAG3和LSECtin相互作用。
4.2.4.LAG3/FGL1相互作用阻断活性检测
通过使用3种不同形式的竞争测定确定经纯化的嵌合抗体阻断LAG3和FGL1相互作用的活性。在形式I中，抗体和His标签化的人FGL1重组蛋白与ELISA微孔板涂覆的人LAG3ECD重组蛋白共温育。洗涤后，添加HRP标记的抗His第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。然后，添加100微升/孔的TMB溶液(生物技术公司)。在室温下温育15分钟后，通过添加50μl 1N HCl来终止反应。读取OD450 nm。通过阻断人FGL1重组蛋白与ELISA微孔板涂覆的人LAG3 ECD重组蛋白的结合来确定阻断率。如图4A和4B以及表11所示，除了047c之外，被测的所有其它抗体可以在形式I条件下以不同水平阻断LAG3和FGL1的相互作用。在形式II中，将抗体和生物素标记的hFc标签化的LAG3ECD重组蛋白与ELISA微孔板涂覆的His标签化的人FGL1重组蛋白共温育。洗涤后，添加HRP标记的抗SA第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。然后，添加100微升/孔的TMB溶液(生物技术公司)。在室温下温育15分钟后，通过添加50μl 1N HCl来终止反应。读取OD450 nm。通过阻断人LAG3 ECD重组蛋白与ELISA微孔板涂覆的人FGL1重组蛋白的结合来确定阻断率。使用GraphPad Prism9.0计算的IC50和最高阻断率总结于表11中。在形式II条件下，021c、023c、029c和BMS-986016能够以相当的效力阻断LAG3和FGL1的相互作用(图5A)，而027c表现出的活性较弱，并且047c几乎不起作用(图5B)。该排序与在形式I条件下得到的排序一致。形式III的竞争测定是竞争性FACS测定。简而言之，将抗体和His标签化的人FGL1重组蛋白与稳定表达人LAG3的293F细胞共温育。洗涤后，添加染料标记的抗His第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。检测荧光强度。通过阻断人FGL1重组蛋白与LAG3表达的293F细胞结合来确定阻断率。如图6和表11所示，只有023c在形式III条件下起作用，指示其可能具有更好的阻断LAG3和FGL1相互作用的效力。
表11.抗LAG3嵌合抗体的LAG3/FGL1阻断活性总结
N/A代表没有可用数据
4.2.5.NFAT报告基因测定
通过基于细胞的NFAT报告基因测定评估经纯化的嵌合抗体缓解LAG3/MHC II介导的抑制的阻断活性(参见实施例3.6中描述的方法)。如图7A、7B、7C和7D所示，被测的所有抗体都可以以不同水平阻断LAG3/MHC II介导的对报告基因活性的抑制。
4.2.6.抗原特异性T细胞活化测定
通过抗原特异性T细胞活化测定评估经纯化的嵌合抗体缓解LAG3/MHC II介导的抑制的功能活性(参见实施例3.7中描述的方法)。如图8A、8B、8C、8D、8E和8F所示，被测的所有抗体都可以以不同水平阻断LAG3/MHC II抑制的T细胞的抗原脉冲IL-2分泌。
4.2.7.表位分析
竞争性ELISA测定用于对经纯化的嵌合抗体进行根据表位分类(表12，参见实施例3.8中描述的方法)。在与人LAG3结合方面，BMS-986016不能与BAP-050竞争，指示它们与不同的表位结合。在与人LAG3结合方面，023c可以与BMS-986016相互竞争，但不与BAP-050竞争，指示023c可能具有与BMS-986016相关的结合表位。在与人LAG3结合方面，021c可以与BAP-050相互竞争，但不与BMS-986016竞争，指示其可能具有与BAP-50相关的结合表位。在与人LAG3结合方面，029c可以与BAP-050和BMS-986016两者竞争(部分地)，这与使用小鼠杂交瘤抗体029获得的结果不完全一致(表9)。虽然023c、029c和021c对BMS-986016和BAP-050的竞争特性不同，但其可以相互竞争与人LAG3结合，指示其结合表位不相同但密切相关。
表12.抗LAG3嵌合抗体表位分类总结
根据专利WO2010/019570A2，BMS-986016与具有氨基酸序列GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY的LAG3 D1结构域额外环结合。为了检测021c、023c和029c与LAG3的该区的结合，使用2种不同的形式进行ELISA结合实验。在形式I的ELISA结合测定中(图9A)，将生物素标记的LAG3 D1结构域额外环肽与ELISA微孔板涂覆的抗LAG3抗体一起温育。洗涤后，添加HRP标记的抗SA第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。然后，添加100微升/孔的TMB溶液(生物技术公司)。在室温下温育15分钟后，通过添加50μl 1NHCl来终止反应。读取OD450 nm。在形式II的ELISA结合测定中(图9B)，将生物素标记的LAG3D1结构域额外环肽和抗LAG3抗体在涂覆有SA的ELISA微孔板中共温育。洗涤后，添加HRP标记的抗人Fc第2抗体(西格玛公司)并且在37℃下温育1小时。然后，添加100微升/孔的TMB溶液(生物技术公司)。在室温下温育15分钟后，通过添加50μl 1N HCl来终止反应。读取OD450nm。如图9A和9B所示出，仅BMS-986016与LAG3 D1结构域额外环结合，指示被测的所有其它抗体具有与BMS-986016不同的结合表位，即使023c在竞争性ELISA测定中与BMS-986016竞争。
4.2.8.亲和力检测
使用生物层干涉测量技术(Octet***)表征经纯化的嵌合抗体对人LAG3的结合亲和力。用1:1结合模型拟合缔合和解离曲线，并且计算每种抗体的Ka/Kd/KD值。每种抗体的Ka/Kd/KD值的亲和力数据总结在表13中。
表13.抗LAG3嵌合抗体亲和力总结
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
021c 1.39E+05 9.05E-04 6.52E-09
023c 3.59E+05 2.33E-04 6.48E-10
029c 3.89E+05 1.39E-03 3.58E-09
BMS-986016 2.11E+05 3.38E-04 1.61E-09
TSR-033 2.48E+05 6.74E-04 2.72E-09
4.2.9.体内抗肿瘤活性
用EMT-6细胞接种人PD-1/人LAG3双敲入BALB/c小鼠。处理组包括媒剂(PBS)、同种型对照、10mg/kg(mpk)可瑞达(Keytruda)(帕博利珠单抗(pembrolizumab))、10mpk 023c和10mpk可瑞达加10mpk 023c的组合。当肿瘤达到70-75mm3的平均体积时，开始处理。处理开始时，可瑞达仅腹膜内(IP)施用一次。每周两次IP施用023c，持续6次。每周测量三次肿瘤体积。通过双向方差分析将不同处理组的平均肿瘤体积与同种型对照组的平均肿瘤体积进行比较来进行统计。不同处理组的平均肿瘤生长曲线(图10A)示出，10mpk 023c单一疗法和10可瑞达加10mpk 023c的组合两者显著均抑制EMT-6肿瘤生长。个体肿瘤生长曲线(图10B)示出，023c处理组中的7个肿瘤中的4个肿瘤和组合处理组中的7个肿瘤中的5个肿瘤缩小。
实施例5：抗体人源化
5.1. 023c的人源化
5.1.1人源化设计
CDR移植方法用于023c的人源化。简而言之，基于IGHV1-46*01、IGHV7-4-1*02和IGKV3-11*01与原始小鼠抗体序列的同源性，首先选择它们分别作为重链和轻链的人源化 模板。然后使用Kabat定义对CDR进行定义。对于移植，潜在热点去除的CDR和来自023c的典型残基的不同组合移植到模板上，并且表达15个变体(具有S228P突变的人IgG4)。将人源化抗体命名为hu023.01至hu023.15，其中前缀“hu”指示“人源化”，并且后缀中的数字表示人源化抗体的序列号。使用生物层干涉测量技术(Octet***)表征所产生的所有变体针对人LAG3的结合亲和力。如表14所示，与人LAG3强结合的人源化抗体被进一步鉴定。
表14.衍生自023c的人源化抗体的亲和力总结
N/A代表没有可用数据
5.1.2.衍生自023c的人源化抗体的表征
5.1.2.1.结合活性检测
使用稳定表达人LAG3的293F细胞，通过FACS测定确定源自023c的人源化抗体的结合活性(参见实施例3.3)。检测MFI并使用GraphPad Prism9.0计算EC50。如图11所示，证实在与人LAG3结合方面，被测的所有人源化抗体保留与亲本抗体023c相似的活性。
5.1.2.2.LAG3/MHC II相互作用阻断活性检测
通过竞争性FACS测定确定衍生自023c的人源化抗体阻断LAG3和MHC II相互作用的活性(图12，参见实施例4.2.2)。使用GraphPad Prism9.0计算的IC50和最高阻断率总结于表15中。证实在阻断LAG3和MHC II相互作用方面，被测的所有人源化抗体保留与亲本抗体023c相似的活性。
表15.衍生自023c的人源化抗体的LAG3/MHC II和LAG3/FGL1相互作用阻断活性
5.1.2.3.LAG3/FGL1相互作用阻断活性检测
通过形式II的竞争性ELISA测定确定衍生自023c的人源化抗体阻断LAG3和FGL1相互作用的活性(图13，参见实施例4.2.4中的形式条件)。使用GraphPad Prism9.0计算的IC50和最高阻断率总结在表15中。证实在阻断LAG3和FGL1相互作用方面，被测的所有人源化抗体保留与亲本抗体023c相似的活性。
5.1.2.4.NFAT报告基因测定
通过基于细胞的NFAT报告基因测定评估hu023.04和hu023.11缓解LAG3/MHC II介导的抑制的阻断活性(图14，参见实施例3.6中描述的方法)。使用GraphPad Prism9.0计算IC50和最高活性变化倍数。证实在缓解LAG3/MHC II介导的NFAT报告基因活性的抑制方面，hu023.11保留与亲本抗体023c相似的活性，而hu023.04显示出稍弱的效力。
5.1.2.5.抗原特异性T细胞活化测定
通过抗原特异性T细胞活化测定(参见实施例3.7中描述的方法)评估hu023.04和hu023.11缓解LAG3/MHC II介导的抑制的功能活性。如图15所示，证实在阻断LAG3/MHC II抑制T细胞的抗原脉冲IL-2分泌方面，hu023.04和hu023.11具有与BMS-986016和亲本抗体023c相似的活性。
5.1.2.6.亲和力检测
使用表面等离子体共振技术(Biacore***)进一步表征hu023.04和hu023.11针对人LAG3的结合亲和力。用1:1结合模型拟合缔合和解离曲线，并且计算每种抗体的Ka/Kd/KD值。如表14中总结的，证实hu023.04保留与亲本抗体023c相似的人LAG3结合亲和力，而hu023.11显示出比ES005-023c略高的亲和力。
5.1.2.7.表位分析
使用氢氘交换质谱(HDX-MS)进一步绘制LAG3上hu023.11的结合表位。hu023.11的结合使肽“AAVHLRDRALSCRL”中氢氘交换减少，指示LAG3上的该区可能对hu023.11的结合至关重要。
5.2.021c的人源化
5.2.1人源化设计
CDR移植方法用于021c的人源化。简而言之，基于与原始小鼠序列的同源性，IGHV4-31*01首先被选为重链的人源化模板，而IGKV3-11*01和IGKV4-1*01被选为轻链的人源化模板。然后使用Kabat定义对CDR进行定义。对于移植，使用两种方法来鉴定具有典型残基的最佳组合的变体，以在人源化后保留原始抗体的功能特性。在第一种方法中，潜在热点去除的CDR序列和来自021c的不同计算设计的典型残基组合被移植到模板上，并在96孔高通量蛋白质表达***中表达。然后在多个体外测定中测试所产生的所有变体，以选择保留021c功能特性的最佳变体。在第二种方法中，除了将去除潜在热点的CDR序列直接移植到模板上之外，在基因合成过程中，移植序列的所有典型位置被给予小鼠或模板氨基酸。所得的理论上包括所有可能的典型氨基酸组合的文库展示在酵母细胞表面上，并且基于其与LAG3抗原的结合选择最佳变体。以这种方式鉴定的变体以与第一种方法类似的方式表达和测定。对于某些变体，将通过两种方法获得的回复突变进行组合。
5.2.2.源自021c的人源化抗体的表征
5.2.2.1.结合活性检测
使用稳定表达人LAG3的CHOK1细胞，通过FACS测定确定衍生自021c的人源化抗体的结合活性(图16，参见实施例3.3)，其中前缀“hu”表示“人源化”，并且后缀中的数字表示人源化抗体的序列号。检测MFI并使用GraphPad Prism9.0计算EC50。证实在与人LAG3结合方面，hu021.212和hu021.269保留与亲本抗体021c类似的活性，而hu021.279显示出比021c更好的活性。
5.2.2.2.LAG3/MHC II相互作用阻断活性检测
通过竞争性FACS测定确定衍生自021c的人源化抗体阻断LAG3和MHC II相互作用的活性(参见实施例4.2.2)。如图17所示，证实在阻断LAG3和MHC II相互作用方面，hu021.212和hu021.269保留与亲本抗体021c相似的活性，而hu021.279显示出比021c更好的活性。
5.2.2.3.NFAT报告基因测定
通过基于细胞的NFAT报告基因测定评估衍生自021c的人源化抗体缓解LAG3/MHCII介导的抑制的阻断活性(参见实施例3.6中描述的方法)。使用GraphPad Prism9.0计算IC50和最高活性变化倍数。如图18所示，证实在阻断LAG3/MHC II介导的报告基因活性抑制方面，与亲本抗体021c相比，hu021.212、hu021.269和hu021.279具有相似或更好的活性。
5.2.2.4.抗原特异性T细胞活化测定
通过抗原特异性T细胞活化测定评估衍生自021c的人源化抗体缓解LAG3/MHC II介导的抑制的功能活性(参见实施例3.7中描述的方法)。如图19所示，证实在阻断LAG3/MHCII抑制T细胞的抗原脉冲IL-2分泌方面，hu021.212、hu021.269和hu021.279具有与BMS-986016和亲本抗体021c相似的活性。
5.2.2.5.亲和力检测
使用生物层干涉测量技术(Octet***)表征hu021.269和hu021.279针对人LAG3的结合亲和力。用1:1结合模型拟合缔合和解离曲线，并且计算每种抗体的Ka/Kd/KD值。如表16所概述的，证实在与人LAG3结合方面，hu021.269和hu021.279保留与亲本抗体021c相似的亲和力。
表16.021c和衍生自029c的人源化抗体的亲和力概述
5.3.029c的人源化
5.3.1.人源化设计
CDR移植方法用于029c的人源化。简而言之，基于与原始小鼠序列的同源性，IGHV3-11*01首先被选为重链的人源化模板，而IGKV1-12*01被首先被选为轻链的人源化模板。然后使用Kabat定义对CDR进行定义。对于移植，使用两种方法来鉴定具有典型残基的最佳组合的变体，以在人源化后保留原始抗体的功能特性。在第一种方法中，CDR序列和来自029c的不同计算设计的典型残基组合被移植到模板上，并在96孔高通量蛋白质表达***中表达。然后在多个体外测定中测试所产生的所有变体，以选择保留029c功能特性的最佳变体。在第二种方法中，除了将CDR序列直接移植到模板上之外，在基因合成过程中，移植序列的所有典型位置被给予小鼠或模板氨基酸。所得的理论上包括所有可能的典型氨基酸组合的文库展示在酵母细胞表面上，并且基于其与LAG3抗原的结合选择最佳变体。以这种方式鉴定的变体以与第一种方法类似的方式表达和测定。对于某些变体，将通过两种方法获得的回复突变进行组合。
5.3.2.源自029c的人源化抗体的表征
5.3.2.1.结合活性检测
使用稳定表达人LAG3的CHOK1细胞，通过FACS测定确定衍生自029c的人源化抗体的结合活性(图20，参见实施例3.3)，其中前缀“hu”表示“人源化”，后缀中的数字表示人源化抗体的序列号，并且后缀S93Q表示用谷氨酰胺替换93位处的丝氨酸以去除潜在的热点。如图20A和20B所示，证实在与人LAG3结合方面，hu029.40、hu029.53、hu029.55和hu029.55.S93Q保留与亲本抗体029c相似的亲和力。
5.3.2.2.LAG3/MHC II相互作用阻断活性检测
通过竞争性FACS测定确定衍生自029c的人源化抗体阻断LAG3和MHC II相互作用的活性(参见实施例4.2.2)。如图21A和21B所示，证实在阻断LAG3和MHC II相互作用方面，hu029.40、hu029.53、hu029.55和hu029.55.S93Q保留与亲本抗体029c相似的亲和力。
5.3.2.3.NFAT报告基因测定
通过基于细胞的NFAT报告基因测定评估衍生自029c的人源化抗体缓解LAG3/MHCII介导的抑制的阻断活性(参见实施例3.6中描述的方法)。使用GraphPad Prism9.0计算IC50和最高活性变化倍数。如图22A和22B所示，证实在阻断LAG3/MHC II介导的报告基因活性抑制方面，与亲本抗体029c相比，hu029.40、hu029.53、hu029.55和hu029.55.S93Q具有相似或更好的活性。
5.3.2.4.抗原特异性T细胞活化测定
通过抗原特异性T细胞活化测定评估衍生自029c的人源化抗体缓解LAG3/MHC II介导的抑制的功能活性(参见实施例3.7中描述的方法)。如图23A和23B所示，证实在阻断LAG3/MHC II抑制T细胞的抗原脉冲IL-2分泌方面，hu029.40、hu029.53、hu029.55和hu029.55.S93Q具有与BMS-986016和亲本抗体029c相似的活性。
5.3.2.5.亲和力检测
使用生物层干涉测量技术(Octet***)表征衍生自029c的人源化抗体针对人LAG3的结合亲和力。用1:1结合模型拟合缔合和解离曲线，并且计算每种抗体的Ka/Kd/KD值。如表16所概述的，证实在与人LAG3结合方面，衍生自029c的人源化抗体保留与亲本抗体029c相似的亲和力。
5.4.体外疗效评估
用EMT-6细胞接种人PD-1/人LAG3双敲入BALB/c小鼠。处理组包括媒剂(PBS)、同种型对照、2或10mpk hu21.279、hu029.55.S93Q、hu023.11、023c和BMS-986016。当肿瘤达到70-75mm3的平均体积时，开始处理。每周两次IP施用抗LAG3，持续6次。每周测量三次肿瘤体积。通过双向方差分析将不同处理组的平均肿瘤体积与媒剂组的平均肿瘤体积进行比较来进行统计。10mpk的hu021.279(图24A)、hu029.55.S93Q(图24B)、hu023.11(图24C)、023c(图24D)和BMS-986016在不同水平上抑制EMT-6肿瘤体内生长。hu023.11显示出与023c相似的抗肿瘤作用。在研究结束时，10mpk hu021.279处理组中的7只小鼠中的1只小鼠、10mpkhu029.55.S93Q处理组中的7只小鼠中的1只小鼠、10mpk BMS-986016处理组中的7只小鼠中的1只小鼠、10mpk 023c处理组中的7只小鼠中的2只小鼠和hu023.11处理组中的7只小鼠中的3只小鼠无肿瘤(图24F)。

Claims (49)

1.一种抗LAG3抗体或其抗原结合片段，其包括重链HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(a)所述HCDR1包括SYGX1N(SEQ ID NO:226)的氨基酸序列，
所述HCDR2包括EIYPRSGNTYYNEX2X3X4X5(SEQ ID NO:227)的氨基酸序列，
所述HCDR3包括GGTYDGYYYAMDX6(SEQ ID NO:228)的氨基酸序列，所述LCDR1包括RASESVDNFGSSFX7H(SEQ ID NO:229)的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列，
其中X1是I或V，X2是K或R，X3是F或L，X4是K或G，X5是D或G，X6是F或Y，X7是L或M；
(b)所述HCDR1包括DYNX8N(SEQ ID NO:230)的氨基酸序列，所述HCDR2包括LVDPIYGTIRYNQX9FKX10(SEQ ID NO:231)的氨基酸序列，所述HCDR3包括IX11TX12VRYFDX13(SEQ ID NO:232)的氨基酸序列，所述LCDR1包括RSSX14NIVHX15DGNTYLE(SEQ ID NO:233)的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列，
其中X8是L或M，X9是N或K，X10是D或G，X11是M或T，X12是A或S，X13是H或Y，X14是L或Q，X15是S或T；
(c)所述HCDR1包括SGYYWX16(SEQ ID NO:234)的氨基酸序列，所述HCDR2包括DISYX17X18GNNYNPSLKN(SEQ ID NO:235)的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列，
所述LCDR2包括RASNX19EX20(SEQ ID NO:236)的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列，
其中X16是N或T，X17是E或D，X18是G或A，X19是L或R，X20是T或S；(d)所述HCDR1包括SEQ IDNO:40的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括QQHDX21SPWT(SEQ ID NO:237)的氨基酸序列，
其中X21是S或Q；
(e)所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列，
所述HCDR2包括X22IYTDTGEPTYAEEFKG(SEQ ID NO:238)的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括QQHYNX23PPT(SEQ ID NO:239)的氨基酸序列，
其中X22是M或I，X23是A或S；
(f)所述HCDR1包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列，
(g)所述HCDR1包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列，
(h)所述HCDR1包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列，
(i)所述HCDR1包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或者(j)所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述LCDR2包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCDR1包括SEQ ID NO:54或75的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:55、76或87的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:56或77的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:57或78的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCDR1包括SEQ ID NO:68或81的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:69或82的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:70或83的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:71或84的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCDR1包括SEQ ID NO:9或97的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:90、10或98的氨基酸序列，所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:91、94或13的氨基酸序列，并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCDR1包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:44或106的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中
所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列，
所述HCDR2包括SEQ ID NO:18或108的氨基酸序列，
所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列，
所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且
所述LCDR3包括SEQ ID NO:22或109的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中
(a)所述HCDR1包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(b)所述HCDR1包括SEQ ID NO:75的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(c)所述HCDR1包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)所述HCDR1包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:69的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列；
(e)所述HCDR1包括SEQ ID NO:81的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列；
(f)所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(g)所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:91的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(h)所述HCDR1包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:94的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(i)所述HCDR1包括SEQ ID NO:97的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:98的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(j)所述HCDR1包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(k)所述HCDR1包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:106的氨基酸序列；
(l)所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者
(m)所述HCDR1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；所述HCDR2包括SEQ ID NO:108的氨基酸序列；所述HCDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；所述LCDR1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；所述LCDR2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
并且所述LCDR3包括SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括重链HFR1、HFR2、HFR3和HFR4中的一者或多者，和/或轻链LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的一者或多者，其中
(a)所述HFR1包括QX24QLQESGPGLVKPX25QTLSLTCTVSGYSIX26(SEQ ID NO:240)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR2包括SEQ ID NO:190的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR3包括RX27TISRDTSKNQFSLKLSSVTAX28DTAX29YYCAR(SEQ ID NO:241)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR4包括SEQ ID NO:192的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR1包括SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR2包括SEQ ID NO:194的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR3包括GIPARFSGSGSX30TDFTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:242)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
其中X24是V或I，X25是S或G，X26是S或T，X27是V或I，X28是A或E，X29是V或T，X30是R或G；
(b)所述HFR1包括SEQ ID NO:201的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR2包括WX31RQAPGKX32LEWVX33(SEQ ID NO:243)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR3包括RFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAX34YYCTR(SEQ ID NO:244)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR4包括WGQGX35LVTVSS(SEQ ID NO:245)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR1包括DIQMTQSPSSVSX36SVGDRVTITC(SEQ ID NO:246)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR2包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR3包括GVPSRFSGSGSGTDFTX37TISSX38QPEDFATYYC(SEQ ID NO:247)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且
所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
其中X31是V或I，X32是R或G，X33是A或S，X34是M或V，X35是A或T，X36是T或A，X37是L或F，X38是L或V；
(c)所述HFR1包括QX39QLVQSGX40EX41KKPGASVKX42SCKASGYTFT(SEQ ID NO:248)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR2包括SEQ ID NO:215的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR3包括RX43X44X45X46X47DTSX48STX49YX50X51X52SSLX53X54EDTAVYF CX55S(SEQ ID NO:249)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR4包括SEQ ID NO:213的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR1包括DIQMTQSPSSLSX56SVGDRVTITC(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR2包括WYQQKPGKX57PKLLIY(SEQ ID NO:251)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR3包括GVPSRFSGSGSGTDFTX58TISSX59QPEDFATYYC(SEQ ID NO:252)的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且
所述LFR4包括SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
其中X39是V或I，X40是A或P，X41是V或L，X42是V或I，X43是V或F，X44是T或V，X45是M或F，X46是T或S，X47是R或L，X48是T或V，X49是V或A，X50是M或L，X51是E或Q，X52是L或I，X53是R或K，X54是S或A，X55是A或V，X56是T或A，X57是A或S，X58是L或F，X59是L或V；
(d)所述HFR1包括SEQ ID NO:117、125、133、140、146、152、158、166、170、174、180或185的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR2包括SEQ ID NO:118、126、134、141、147、153、159、167、175或181的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR3包括SEQ ID NO:119、127、135、142、148、154、160、168、171、176、182或186的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述HFR4包括SEQ ID NO:120、128、136、155或161的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR1包括SEQ ID NO:121、129、137、143、149、162、172、177、183或187的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR2包括SEQ ID NO:122、130、138、144、150、156、163、169或178的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，
所述LFR3包括SEQ ID NO:123、131、139、145、151、157、164、173、179、184或188的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列，并且
所述LFR4包括SEQ ID NO:124、132或165的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性的同源序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:7、15、23、30、38、45、52、59、66、73、79、85或88的序列或其与SEQ ID NO:7、15、23、30、38、45、52、59、66、73、79、85或88具有至少80％序列同一性的同源序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:8、16、24、31、39、46、53、60、67、74、80、86或89的序列或其与SEQ ID NO:8、16、24、31、39、46、53、60、67、74、80、86或89具有至少80％序列同一性的同源序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括一个或多个氨基酸残基取代或修饰，且仍保留对人LAG3的特异性结合亲和力。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述取代或修饰中的至少一个位于所述重链可变区或所述轻链可变区中的一个或多个CDR序列中。
13.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述取代或修饰中的至少一个位于所述重链可变区或所述轻链可变区中的一个或多个非CDR序列中。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括Fc区，任选地是人免疫球蛋白(Ig)的Fc区，或任选地是人IgG的Fc区。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区源自人IgG4。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述源自人IgG4的Fc区包括S228P突变。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、经标记的抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其具有针对人LAG3的一种或多种选自由以下组成的组的结合特性：
a)特异性结合人LAG3 D1-D2重组蛋白，其通过ELISA测定测量的EC50不超过0.25nM(优选地不超过0.1nM，更优选地不超过0.05nM)；
b)对表达人LAG3的细胞具有结合亲和力，其通过FACS测定测量的EC50不超过5.5nM(优选地不超过2.0nM，更优选地不超过1.5nM，并且更优选地不超过0.5nM)；
c)对人LAG3具有结合亲和力，其通过生物层干涉测量技术(Octet***)测量的Kd不超过8nM(优选地不超过1nM，更优选地不超过0.1nM)；
d)对人LAG3具有结合亲和力，其通过表面等离子体共振技术(Biacore***)测量的Kd不超过0.2nM(优选地不超过0.1nM)。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其具有一种或多种选自下组的特性：
a)以不超过8nM(优选地不超过5nM)的IC50阻断LAG3和MHCII相互作用的能力，如通过FACS测定使用所述抗体或其抗原结合片段、hFc标签化的人LAG3ECD重组蛋白和内源性表达MHCII的Raji细胞测量；
b)以不超过10nM(优选地不超过5nM)的IC50缓解LAG/MHCII介导的抑制的能力，如通过基于细胞的NFAT报告基因测定测量的；
c)在不超过20nM的浓度下以不小于90％(优选地不小于95％)的阻断率阻断LAG3和LSECtin相互作用的能力，如通过竞争性ELISA测定测量的；
d)以不超过2nM(优选地不超过1.5nM)的IC50和/或以不小于80％的最高阻断率阻断LAG3和FGL1相互作用的能力，如通过竞争性ELISA测定测量的；
e)阻断LAG/MHCII抑制的T细胞活化的能力，如通过IL-2的分泌水平测量的，其中当所述抗体或抗原结合片段的浓度不超过4nM时，IL-2的分泌水平大于200pg/ml(优选地大于400pg/ml)。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，在与人LAG3结合方面，其相对于包括包含SEQ ID NO:253的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:254的序列的轻链可变区的抗体表现出超过30％的竞争。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，在与人LAG3结合方面，其相对于包括包含SEQ ID NO:255的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:256的序列的轻链可变区的抗体表现出超过30％的竞争。
24.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有与BMS-986016的结合表位不同的结合表位，即LAG D1结构域额外环。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其连接于一个或多个缀合物部分。
26.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物部分包括清除改性剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶底物标记、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、纯化部分或其它抗癌药物。
27.一种分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
28.一种载体，其包括根据权利要求27所述的分离的多核苷酸。
29.一种宿主细胞，其包括根据权利要求28所述的载体。
30.一种药物组合物，其包含：
(i)根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或编码根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗体结合片段的多核苷酸；以及
(ii)一种或多种药学上可接受的载体。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其进一步包括另外的治疗剂。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂是用于治疗癌症的药剂。
33.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂能够阻断检查点抑制(优选地，PD-1激活通路或TIM3激活通路)。
34.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂是帕博利珠单抗(pembrolizumab)。
35.一种表达根据权利要求1至31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达根据权利要求33所述的载体的条件下培养根据权利要求34所述的宿主细胞。
36.一种在受试者中治疗、预防或减轻与抑制的免疫***相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或编码根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或根据权利要求30至34中任一项所述的药物组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述与受抑制的免疫***相关的疾病是癌症或感染性疾病。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症是LAG3相关癌症。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述LAG3相关癌症选自下组：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体肿瘤、***、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促***增生性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维结构不良、胆囊癌或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺***状癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、***癌、葡萄膜黑素瘤、罕见的血液学病症、肾转移癌、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述LAG3相关癌症选自下组：结直肠癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、成神经细胞瘤、肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直肠癌。
41.根据权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
42.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述与抑制的免疫***相关的疾病是病原体相关疾病。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述病原体相关疾病选自下组：慢性病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述慢性病毒感染包括由以下引起的感染：爱泼斯坦-巴尔病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、疱疹病毒(例如，HSV-1、HSV-2、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水疱性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、霍乱(Cholera)、白喉杆菌(Diphtheria)、肠杆菌属(Enterobacter)、***(Gonococci)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningococci)、分枝杆菌属(mycobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肺炎球菌(Pneumonococci)、立克次氏体细菌(rickettsia bacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、破伤风(Tetanus)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉菌(A.fumigatus)、黑曲霉菌(A.niger)等)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(C.albicans)、克柔念珠菌(C.krusei)、光滑念珠菌(C.glabrata)、热带念珠菌(C.tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、毛霉目(Genus Mucorales)(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、蠕虫寄生虫(helminth parasite)(钩虫(hookworm)、绦虫(tapeworms)、吸虫(flukes)、扁虫(flatworms)(例如，血吸虫(Schistosomia))、赞比亚贾第鞭毛虫(Giardia Zambia)、旋毛虫(trichinella)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba Fragilis)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)。
45.根据权利要求36至44中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的方法，其中所述施用经口、经鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内施用进行。
47.一种检测样品中LAG3的存在或量的方法，所述方法包括：使所述样品与根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及确定所述样品中LAG3的所述存在或所述量。
48.一种选择患有与抑制的免疫***相关的疾病、病症或病状的患者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使从受试者获得的样品与根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；b)确定所述样品中LAG3的存在或量；以及c)将所述受试者中LAG3的所述存在或所述量与所述LAG3相关疾病、病症或病状的存在或状态相关联。
49.根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或根据权利要求30至34中任一项所述的药物组合物在制备用于在受试者中治疗、预防或缓解癌症的药物中的用途。
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