CN118272256A - 一株卷曲乳杆菌ncu-13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株卷曲乳杆菌NCU‑13及其应用。该卷曲乳杆菌NCU‑13的名称为Lactobacillus crispatus NCU‑13，已于2023年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27918。本发明将冻干的卷曲乳杆菌菌粉均匀置于卫生巾的吸收层中，在使用时利用人体的适宜环境及月经期间形成的湿润环境，激活并促进附着在卫生巾上的益生菌的活化与增殖，使其进入***内部。该卷曲乳杆菌及其有益代谢产物，不仅能够促进***环境的健康，还能提高***粘膜屏障功能，并可能通过其抗炎和免疫调节作用帮助恢复***微生态平衡，同时优化女性生殖健康。

Description

一株卷曲乳杆菌NCU-13及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株卷曲乳杆菌NCU-13及其应用。

背景技术

本发明涉及妇科健康领域，尤其是一种用于治疗细菌性***炎（Bacterialvaginitis，BV）的益生菌卫生巾及其制备方法。BV是一种由***菌群失衡引起的常见疾病，表现为乳杆菌数量下降以及厌氧菌如***加德纳菌和***阿托比波菌等的增加。这种菌群失衡不仅影响女性的生殖健康，还可能导致多种并发症。

传统的BV治疗方法主要依靠抗生素，但这些方法往往导致高复发率和耐药性问题，且无法恢复***的正常微生态环境。而且近年来，益生元作为益生菌的补充和“高级替代品”，已在消化***的应用中展现出巨大的潜力，但在生殖***方面的研究相对较少。

因此，结合上述研究现状和意义，寻求一种安全、有效、并能维持***微生态平衡的方法成为研究的重点。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一株卷曲乳杆菌NCU-13及其应用，具体采用以下的技术方案：

本发明的第一方面，提供了一株卷曲乳杆菌NCU-13，该卷曲乳杆菌NCU-13的名称为Lactobacillus crispatus NCU-13，已于2023年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27918，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步地，卷曲乳杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID No：1所示：

GGGGGGGGCAGCTATACATGCAGTCGAGCGAGCGGAACTAACAGATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTTTAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGGAGGTTTCCGCCTCTCACTGCTGCAGCTAACGCATTACCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGTTGAAACTCAAAGAATTGACGGGGCCCGCACAACCGTGGAGCATGTGGTTTATTCAAGCAACACGAAGAACCTTACCAGTCTTGACATCTAGTGCATTTGTAGAGATACAAGT。

本发明的第二方面，还提供了上述曲乳杆菌NCU-13在制备用于预防或治疗由细菌或霉菌引发的***炎药品中的应用。其中细菌为沙门氏菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、单增李斯特菌***加德纳菌、大肠埃希菌、***阿托波菌和铜绿假单胞菌中的一种或多种；霉菌为白色念珠菌。卷曲乳杆菌能定植在***内，通过分泌过氧化氢、细菌素及其他抗微生物因子，抑制致病微生物的生长，是***自然菌群的重要组成部分。

本发明的第三方面，还提供了上述卷曲乳杆菌NCU-13在制备***益生菌卫生巾中的应用。

本发明的第四方面，还提供了一种含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾，该***益生菌卫生巾中包含上述的卷曲乳杆菌NCU-13；还包括后生元短链脂肪酸；该短链脂肪酸为卷曲乳杆菌的代谢产物。在卫生巾中添加卷曲乳杆菌的代谢产物短链脂肪酸可以调节***pH值并促进局部免疫平衡。

本发明的第五方面，还提供了上述含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾的制备方法，包括以下步骤：

先将卷曲乳杆菌置于液体培养基中培养，培养结束后与脱脂乳混合后存放于-80℃冰箱中24小时，然后在冷冻干燥机中制成冻干粉；然后将冻干粉均匀置于卫生巾的内吸收层，即得到含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾。

卷曲乳杆菌在生长过程中会产生多种代谢产物，包括有益的酸类（如乳酸）、抗菌物质、酶类等。当这些菌株在液体培养基中生长时，它们的代谢产物会积累在培养基中。当菌株与脱脂乳混合并进行冷冻干燥处理时，这些代谢产物也会被包含在最终的冻干粉中。

在上述方法制备的***益生菌卫生巾在使用时，利用人体适宜的环境及月经时的湿润环境激活并增殖益生菌，以达到预防和治疗妇科疾病的效果。该方法旨在利用卷曲乳杆菌的活菌及其代谢产物的双重益生特性，不仅可以直接抑制致病菌的生长，而且还可以通过***菌群移植（Vaginal microbiome transplant，VMT）的方式，长期维持***的健康状态。此外，本发明的卫生巾还可以通过卷曲乳杆菌的代谢产物，如短链脂肪酸，来恢复BV患者的***微生态平衡，提供一种安全、有效且便于使用的治疗方案。

本发明的第六方面，还提供了一种用于***的药物组合物，该***的药物组合物包含上述卷曲乳杆菌NCU-13活菌、灭活菌体或其发酵产物。

本发明的有益效果为：本发明提供了一株卷曲乳杆菌NCU-13和卷曲乳杆菌NCU-13的应用。本发明还提供了一种***益生菌卫生巾和制备方法，将冻干的卷曲乳杆菌菌粉均匀置于卫生巾的吸收层中，在使用时利用人体的适宜环境及月经期间形成的湿润环境，激活并促进附着在卫生巾上的益生菌的活化与增殖，使其进入***内部。卷曲乳杆菌及其有益代谢产物，如短链脂肪酸，不仅能够促进***环境的健康，还能提高***粘膜屏障功能，并可能通过其抗炎和免疫调节作用帮助恢复***微生态平衡，此外，本发明在卫生巾中添加了后生元，包括短链脂肪酸和益生菌的代谢产物，如乳酸、细胞表面成分和生物活性肽等，对人体健康具有多种益处，且相比活的微生物，具有更高的安全性和稳定性。

本发明明通过“以菌治菌”的理念，使益生菌在卫生巾使用过程中激活并大量繁殖，进而抑制***内外的致病菌，有效预防和治疗细菌性***炎、霉菌性***炎以及滴虫性***炎。与传统的药物治疗相比，这种益生菌治疗是一种绿色疗法，没有药物副作用。此外，该卫生巾的使用方便、高效且经济，适合广泛应用，旨在提供一种有效的预防和治疗***微生态失衡相关疾病的方法，同时优化女性生殖健康。

附图说明

图1所示为本发明实施例2中卷曲乳杆菌与嗜酸乳杆菌的生长曲线图；

图2所示为本发明实施例3中耐酸实验下卷曲乳杆菌与嗜酸乳杆菌在不同pH下的数量图；

图3所示为本发明实施例4中抗氧化性实验下卷曲乳杆菌与嗜酸乳杆菌的羟基自由基清除率；

图4所示为本发明实施例4中抗氧化性实验下卷曲乳杆菌与嗜酸乳杆菌的超氧自由基清除率；

图5所示为本发明实施例5中卷曲乳杆菌与嗜酸乳杆菌对沙门氏菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、单增李斯特菌、白色念珠菌、***加德纳菌、大肠埃希菌、***阿托波菌和铜绿假单胞菌的抑菌实验结果；

图6所示为本发明实施例7中使用qRT-PCR方法检测本产品与传统产品和市售某益生菌产品的疗效对比图，具体表现为对于沙门氏菌、白色念珠菌、***加德纳菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、***阿托波菌这六种***常见致病菌的转录水平检测。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在以下实施例中，健康女性为于2022年10月20日始，从南昌大学第二附属医院门诊体检正常的15例育龄女性（健康组）收集***分泌物样本。健康女性的纳入标准为：***（LH）2-7U/L、年龄20岁-40岁、***正常、子宫腔正常。排除标准包括：（1） 认知功能障碍或精神疾病；（2） 心、肝、肾脏器功能障碍；（3） 手术禁忌证；（4）药物禁忌证；（5）无法满足随访条件。

在以下实施例中，细菌性***炎患者为自2022年10月20日至2023年10月20日在南昌大学第二附属医院接受治疗的15例患者（病患组）。细菌性***炎患者的纳入标准为：（1）符合细菌性***炎诊断标准；（2）排除其他明显的妇科疾病；（3）年龄20-45岁；（4）未使用抗生素或激素类药物治疗***炎。排除标准包括：（1）认知功能障碍或精神疾病；（2）心、肝、肾脏器功能障碍；（3）手术禁忌证；（4）药物禁忌证；（5）无法满足随访条件。

健康组和病患组妇女均在月经黄体中期（***后的7-9天）采集***分泌物。将收集的***分泌物标本放入4℃无菌PBS中，1小时内带回实验室，并放入-80 ℃冻存。

在参与之前，所有预期的参与者均得到了详细的参与者信息表，并向其解释了研究的基本原理。所有参与者提供了书面知情同意书。所有生物样本都被赋予匿名的参与者身份号码，这些号码与参与者的个人信息在一个安全存储的链接文件中进行匹配，记录了参与者的姓名、年龄、性别、联系方式、病理诊断、组织学类型、手术时间、手术名称、原发或复发等信息。

实施例1

卷曲乳杆菌NCU-13的培养、分离，筛选、纯化、鉴定及保存

（1）卷曲乳杆菌NCU-13的培养和分离：

与南昌大学附属医院妇产科合作，采集健康女性***分泌物，利用规范化妇科检查及***分泌物采集方法，于月经干净后3至7天内取材；用无菌棉签收集***分泌物于含有5毫升50%的甘油的无菌离心管中后立即测定pH值，常规检查白带，健康女性***分泌物样品保存于-80℃冰柜中，并筛选出健康女性***分泌物用于后续实验；

取适量***分泌物于无菌1.5 mL的EP管中，用无菌PBS按照10¹~10⁶进行倍比稀释，MRS、LB、BSM按10²、10⁴稀释；BHI、BHI+DMS按10³、10⁵倍稀释；取稀释液30 µL涂布于固体培养基中，厌氧和需氧条件下培养72 h；记录并分析所有的菌株，对每种菌株进行计数和分类，其结果如表1所示：

表1

（2）卷曲乳杆菌NCU-13的筛选和纯化

初步筛选：

从样本中接种到选择性培养基中，这种培养基能够促进目标菌株的生长同时抑制其他微生物的生长。对于卷曲乳杆菌，可以使用MRS培养基（适用于乳酸菌的培养）。

在无菌超净工作台中，观察平板上的菌落形态，包括大小、颜色、边缘是否整齐、是否***等特征，根据这些特征挑选出看起来与卷曲乳杆菌相似的单菌落。

纯化培养：

选取的单菌落接种到新的MRS固体培养基上，进行纯化培养，重复几次，以确保得到的是单一的菌种；纯化后的菌株再次接种于MRS液体培养基中，进行增殖。

形态学和生化特性鉴定：

使用显微镜观察纯化菌株的形态学特征，如细胞形状、排列等。

进行一系列生化试验（如催化酶试验、糖发酵试验等），以确定菌株的生化特性，这有助于进一步确认其为卷曲乳杆菌。

分子生物学鉴定：

提取菌株的基因组DNA，进行PCR扩增特定基因（如16S rRNA基因）。

对PCR产物进行测序，与已知的卷曲乳杆菌序列进行比对，以确认其身份。

菌株存储：

一旦确认纯化的菌株是卷曲乳杆菌NCU-13，就可以通过低温保存（如-80℃冰箱中）或冻干保存等方法进行长期存储。

（3）卷曲乳杆菌NCU-13的形态学特征及生理生化特征：

形态学特征

形状：卷曲乳杆菌通常表现为杆状，长度比宽度长，两端圆滑。

排列：这些细菌通常单独出现或成对出现，不常见链状排列。

革兰氏染色：革兰氏阳性，这意味着它们在革兰氏染色时会保持紫色。

生理生化特征

发酵类型：卷曲乳杆菌是一种乳酸发酵菌，通过发酵糖类产生乳酸。

氧气需求：这些菌株通常为兼性厌氧菌，意味着它们可以在有氧和无氧条件下生长，但在无氧条件下生长更好。

温度范围：卷曲乳杆菌的生长温度范围一般在30 ℃到40 ℃之间，最适生长温度约为37 ℃。

pH范围：它们能在较宽的pH范围内生长，但最适pH值通常在5.5到6.2之间。

耐盐性：某些卷曲乳杆菌表现出对盐的耐受性，能在较高盐浓度的环境中生存。

糖发酵：能够发酵多种糖类，如葡萄糖、果糖、半乳糖等，产生乳酸。一些菌株还可能产生少量乙酸或其他次级代谢产物。

生物化学测试

催化酶试验：通常为阴性。

VP（Voges-Proskauer）试验：一般为阴性，不产生丙二醇。

产气：不产生气体。

耐受性：对于抗生素和其他生长抑制因子的耐受性可以根据不同的菌株而有所不同。

（4）卷曲乳杆菌NCU-13的分子生物学鉴定

取1 mL接种到100 mL的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养，使用分子生物学方法（如16S rRNA基因测序）对特定菌株进行精确鉴定，根据16S的测定结果，菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，然后根据菌株的形态特征和测序结果将菌株明明为卷曲乳杆菌NCU-13菌株，该菌株于2023年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27918。

SEQ ID NO：1：

GGGGGGGGCAGCTATACATGCAGTCGAGCGAGCGGAACTAACAGATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTTTAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGGAGGTTTCCGCCTCTCACTGCTGCAGCTAACGCATTACCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGTTGAAACTCAAAGAATTGACGGGGCCCGCACAACCGTGGAGCATGTGGTTTATTCAAGCAACACGAAGAACCTTACCAGTCTTGACATCTAGTGCATTTGTAGAGATACAAGT。

实施例2

卷曲乳杆菌NCU-13生长曲线探究

（1）将实施例1中分离得到的卷曲乳杆菌和对照菌株嗜酸乳杆菌分别活化过夜；

（2）取1 mL接种到100 mL的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养，分别在0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h在波长600 nm测其光密度；

（3）按照横坐标为时间，纵坐标为光密度值作生长曲线图，其结果如图1所示，且由图1可知，本发明提供的卷曲乳杆菌的生长能力强于嗜酸乳杆菌。

实施例3

卷曲乳杆菌NCU-13的耐酸实验

（1）将实施例1中分离得到的卷曲乳杆菌和对照菌株嗜酸乳杆菌分别于液体培养基37 ℃恒温培养箱中培养72 h，保留菌株备用；

（2）取出100 µL步骤（1）中培养后的菌株用PBS缓冲液稀释10¹、10³、10⁵倍，4000rpm离心3 min弃掉上清；加入pH=3、4、5、7的PBS缓冲液，放置4 h后，混匀取10 μL涂板，在37℃恒温培养箱或者厌氧培养箱中培养72 h，活菌计数；

（3）用含有0.0%~0.3%牛胆盐的培养基在37℃恒温培养箱中培养48 h，混匀取10 μL涂板，在37 ℃恒温培养箱或者厌氧培养箱中培养48 h，活菌计数，结果见图2所示，且由图2可知，卷曲乳杆菌的耐酸能力强于嗜酸乳杆菌。

实施例4

卷曲乳杆菌NCU-13的抗氧化性实验评价

（1）DPPH自由基清除能力的测定：取2 mL卷曲乳杆菌培养液上清加2 mL（0.2mmol/L）DPPH甲醇溶液，黑暗下室温反映30 min，取上清517 nm测OD，对照为 2mL去离子水加DPPH甲醇溶液：

DPPH自由基清除率=[1-A517（样品）/A517（空白）]×100%

样品：卷曲乳杆菌和DPPH甲醇溶液

空白：去离子水和DPPH甲醇溶液

（2）羟基自由基清除能力的测定:取2 mmol/L的FeSO₄溶液1 mL，6 mmol/L H₂O₂1mL，6 mmol/L水杨酸1 mL，加入卷曲乳杆菌培养液上清1 mL，室温条件下静置30 min，以去离子水为空白对照，测定510 nm处吸光度，计算羟自由基的清除率：

羟基自由基清除率=[1-A510（样品）/A510（空白）]×100%

（3）超氧自由基清除能力的测定：在0.5 mL卷曲乳杆菌培养液中依次加入150mmol/L pH=8.0的Tris-Hcl溶液2 mL，1.2 mmol/L邻苯三酚溶液1 mL，室温反应30 min，测定330 nm处吸光度：

超氧自由基清除率=[1-（A11-A10）/（A01-A00）×100%

A00：不含样品和邻苯三酚；A01：不含样品含邻苯三酚

A10：含样品不含邻苯三酚；A11：含样品和邻苯三酚

（4）对Fe²⁺的螯合能力的测定：取0.5 mL样品溶液中加入0.4%的硫酸亚铁溶液0.1mL，上下轻轻颠倒混合均匀后，再加入0.1 mL 1%的VC和0.2 mol/L NaOH溶液1 mL，室温条件，下反应20 min，然后加1ml 10%的三氯乙酸，4℃离心机6 000 rpm，10 min以去除蛋白，取0.4 mL上述溶液并加入0.1%邻二氮菲4 mL，室温条件下反应10 min，测定536 nm处吸光度：

Fe²⁺的螯合能力=[A空白-A样/A空白]×100%

（5）总还原力的测定：取1 mL的卷曲乳杆菌培养液，加入磷酸缓冲液1 mL （pH为6.6）和1% K₃[Fe(CN)₆]溶液1 mL，上下颠倒充分混匀，在恒温箱中50 °C保温2 min，加入10%的三氯乙酸溶液1 mL，振荡混匀，取混合液1 mL，加入去离子水4 mL和0.1%的FeCl₃溶液0.4mL，静置10 min。然后用去离子水为空白，测定700 nm处吸光度，吸光度值越大，说明待测物的还原力越强。

本实验将嗜酸乳杆菌作为对比菌株，其抗氧化性实验与卷曲乳杆菌的实验过程相同，其结果见图3和图4所示，且由图3和图4可知，卷曲乳杆菌的抗氧化能力强于嗜酸乳杆菌

实施例5

卷曲乳杆菌NCU-13的抑菌实验

（1）将卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌接种于相应的液体培养基中，37℃下在二氧化碳培养箱中培养72 h，6000 g，离心5 min。

（2）将沙门氏菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、单增李斯特菌、白色念珠菌、***加德纳菌、大肠埃希菌、***阿托波菌和铜绿假单胞菌分别涂布于LB固体培养基中，将牛津杯轻轻放于平板上，吸取卷曲乳杆菌NCU-13培养上清250 μL于牛津杯中（每组做三个重复实验），37℃恒温培养，每隔2 h观察抑菌圈大小，8 h后测量抑菌圈直径；

（3）将测量出的抑菌圈直径作表，进行卷曲乳杆菌和嗜酸乳杆菌二者抑菌能力的对比，其结果如图5所示，且由图5可知，卷曲乳杆菌对于各类机会致病菌的抑菌能力普遍强于嗜酸乳杆菌。

实施例6

一种含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾，其制备方法包括以下步骤：

（1）将实施例1中分离得到的卷曲乳杆菌在液体培养基中进行培养，然后与脱脂乳混合后存放于-80℃冰箱中24小时，然后在冷冻干燥机中制成冻干粉；

（2）将经过检验的原料包括表层材料、吸收层材料和底层材料按照卫生巾的设计尺寸进行切割，然后将步骤（1）中制得的冻干粉均匀置于卫生巾的吸收层，使用胶水将表层、吸收层和底层合并到一起，即得到含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾。

实施例7

qRT-PCR实验

（1）实验设计：从南昌大学二附院选择9名患有BV的志愿者，确保他们在实验开始前没有使用抗生素或其他可能影响实验结果的药物。将其随机分配参与者至三个实验组：使用普通卫生巾、市售某含***益生菌（嗜酸乳杆菌）的卫生巾、本发明产品所用含卷曲乳杆菌的卫生巾。

（2）样品收集与储存：在志愿者***结束后的48小时内采集***分泌物样本。之后使用标准化的无菌采样套件，并记录采样时间以保证结果的可重复性。并立即将样品冷冻储存于-80 ℃，直到进行DNA提取。

（3）DNA提取：采用适用于粘稠样本的DNA提取试剂盒，比如针对***分泌物优化的试剂盒。按照制造商的指导手册操作，使用量化标准曲线来评估提取DNA的纯度和浓度。

（4）qPCR引物和探针设计：针对以下致病菌设计特异性引物和探针：沙门氏菌、白色念珠菌、***加德纳菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、***阿托波菌。对每个引物和探针进行验证，以确保扩增效率和特异性。

（5）qPCR实验：设置内参基因，如人类GAPDH，以标准化样本间的表达量。对所有样本进行三次技术重复，以确保数据的可靠性。包括正负对照，正对照使用已知量的细菌DNA，负对照为无模板对照；

（6）数据分析：使用ΔΔCT方法比较各组之间的相对表达量。对于绝对量计算，使用已知拷贝数的标准曲线来确定每个病原体的精确拷贝数。进行统计分析，比如ANOVA，以确定不同组间的显著性差异。

结果如图6所示，相较于使用传统卫生巾的组别，选用含有***益生菌的卫生巾的参与者***中机会性致病菌的水平有了显著的降低。更值得注意的是，与市面上现有***益生菌卫生巾相比，使用本发明产品的组别显示出更低的机会性致病菌水平。这一结果强有力地表明，本产品（蕴含卷曲乳杆菌及其后生元的益生菌配方）对于改善BV患者的***微生态环境具有显著效果，从而突显了其在调节***健康方面的独特治疗潜力。此外，这一发现也为本产品在女性个人卫生领域提供了有力的科学支持，彰显了其在促进***健康和预防细菌性***炎方面的优越性。

尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。

Claims (10)

1.一株卷曲乳杆菌NCU-13，其特征在于，所述卷曲乳杆菌NCU-13的名称为Lactobacillus crispatus NCU-13，已于2023年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27918。

2.根据权利要求1所述的卷曲乳杆菌，其特征在于，其卷曲乳杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1-2任一项所述的卷曲乳杆菌NCU-13在制备用于预防或治疗由细菌或霉菌引发的***炎药品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌为沙门氏菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、单增李斯特菌***加德纳菌、大肠埃希菌、***阿托波菌和铜绿假单胞菌中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述霉菌为白色念珠菌。

6.权利要求1-2任一项所述的卷曲乳杆菌NCU-13在制备***益生菌卫生巾中的应用。

7.一种含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾，其特征在于，包含权利要求1所述的卷曲乳杆菌NCU-13。

8.根据权利要求7所述的含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾，其特征在于，还包括后生元；所述后生元为短链脂肪酸；所述短链脂肪酸为卷曲乳杆菌的代谢产物。

9.一种含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

先将卷曲乳杆菌置于液体培养基中培养，培养结束后与脱脂乳混合后存放于-80℃冰箱中24小时，然后在冷冻干燥机中制成冻干粉；然后将冻干粉均匀置于卫生巾的内吸收层，即得到含有卷曲乳杆菌的***益生菌卫生巾。

10.一种用于***的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的卷曲乳杆菌NCU-13活菌、灭活菌体或其发酵产物。