CN118271279A - 一种近红外罗丹明染料及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN118271279A CN202410270298.1A CN202410270298A CN118271279A CN 118271279 A CN118271279 A CN 118271279A CN 202410270298 A CN202410270298 A CN 202410270298A CN 118271279 A CN118271279 A CN 118271279A
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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体为一种近红外罗丹明染料及其制备方法和应用。本发明的近红外罗丹明染料具有通式A所示结构，具有双原子(X和Y)桥接特征，其吸收和发射波长在700‑1300nm近红外区域。该类染料具有亮度高、水溶性好、合成简便和结构易修饰等特性。其中特定结构可显示出优异的荧光开启行为，可作为自标记蛋白HaloTag的特异性活化探针，可用于活细胞免洗成像、蛋白标记和钙离子检测、小动物成像和荧光手术导航。

Description

一种近红外罗丹明染料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及近红外罗丹明染料及其制备方法和应用。
背景技术
荧光成像技术在生命科学研究和临床医学领域具有重要应用价值。该技术主要依赖于具有荧光标记特性的分子工具，包括荧光蛋白和小分子染料。荧光蛋白能够通过基因编码精确定位目标蛋白或细胞，但其存在亮度较低、光稳定性差以及光谱调节范围有限等缺点。相比之下，小分子染料因其优异的光物理特性而受到关注，近年来出现了一种结合小分子染料和基因编码蛋白的化学遗传学荧光标记方法。该方法中，小分子染料被设计为与基因编码的自标记蛋白(如SNAP-tag、CLIP-tag和HaloTag等)共价结合的探针结构，且仅在结合后才发出荧光。通过开发这种“荧光开启”性质的罗丹明染料，化学遗传学荧光标记方法弥补了荧光蛋白在荧光特性方面的不足，满足了单分子成像、超分辨成像、活细胞动态成像与传感等先进成像应用的需求。然而，现有的化学遗传学荧光标记方法主要局限于可见光区域(400-700nm)，而该范围的光子在生物体内的散射衰减严重，从而无法满足活体应用需求。与可见光相比，近红外光(700-1700nm)在生物体内具有更佳的穿透性，因此基于近红外光的化学遗传学荧光标记方法在生物医学领域具有广阔的应用前景。
罗丹明类染料在化学遗传学荧光标记领域中有广泛应用。这类染料存在一个开闭环平衡，由无色螺环内酯和荧光两性离子组成(参见附图1)。该内酯-两性离子平衡常数(KL-Z)是决定其应用效果的关键因素。通常情况下，当KL-Z满足Log KL–Z>-3时，染料能够以内酯形式穿透细胞膜，并在与自标记蛋白结合后转变为荧光两性离子形式。此外，染料母体的光物理特性，如亮度和光稳定性等，也是影响其荧光成像综合性能的重要因素。
为满足应用需求，现有研究主要关注罗丹明类染料的波长和平衡常数KL-Z的调控。如专利US10018624B1、US20160230011A1所报道的罗丹明染料，虽然其平衡常数KL-Z符合要求，但光谱覆盖范围主要为蓝色至红色(400-650nm)。近期学术界的一些优化研究(J.Am.Chem.Soc.2023,145,23000-23013)也主要集中在500-700nm范围的罗丹明染料。开发激发和发射波长大于700nm且KL-Z参数符合要求的新型罗丹明染料仍面临巨大挑战。这主要是因为现有染料母核结构的取代基或杂原子工程难以同时满足理想的光物理特性和KL-Z参数的平衡要求。因此，迫切需要开发基于新型母核结构的近红外罗丹明染料，以满足活体内荧光标记与成像的应用需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一类吸收发射波长大于700nm、亮度高、具有理想的荧光开启性能(Log KL–Z>-3)的基于双原子桥接骨架的罗丹明染料及其制备方法和应用。
本发明提供的近红外罗丹明染料，具有双原子(通式A中的X和Y)桥接骨架，与传统的单原子桥接罗丹明骨架相比，本发明的新型骨架展现了更大的共轭特性。此外，通过替换桥接原子或基团类型，双桥接结构为调控染料的波长和平衡常数提供了更有效的手段，从而实现了近红外区域的吸收和发射特性，以及理想的平衡常数。
本发明得到的近红外罗丹明染料易于化学修饰，可通过氮取代基、meso位苯环取代基的调控获得一系列光物理性质(包括波长、量子产率、光稳定性等)和平衡常数可控的染料。
本发明展示了该类染料的几种用途对其亮度、标记特性和化学遗传学成像应用加以证明，包括在清醒小鼠体内进行高速荧光成像、肿瘤靶向成像、以及活细胞免洗成像和钙离子传感等。
本发明提供的近红外罗丹明染料，具有通式A所示的结构：
式中：X为杂原子，包括S、O、NH及其衍生物；
Y代表O、S、N、Se、Te、Te＝O、O＝S＝O、C＝O、C(CH3)2、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、P＝O(Ph)
和P＝O(CH3)；
Z-为阴离子，包括ClO4 -、PF6 -、BF4 -、Cl-、Br-、I-、CH3COO-、CF3COO-、CF3SO3 -和CH3SO3 -；
R1、R2、R3、R4各自独立选自H、Cl-C5烷基；
R5，R6各自独立选自H、C1-C5烷基、C1-C5全氟烷基，羧基；
R7独立选自H、C1-C6烷基、和式I-VIII所示基团中的任意一种：
曲线标记处为取代位。
通式A所示化合物中，典型的化合物结构如下式A1、A2、A3所示：
通式A所示化合物中，典型的化合物结构如下式B1、B2、B3、B4、B5、B6中所示：
通式A所示化合物中，典型的化合物结构如下式C1、C2、C3所示：
通式A所示化合物中，典型的化合物结构如下式D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8所示：
本发明中：
结构式A1、A2、A3、B1、B2、B3、B4、B5、B6、C1、C2、C3化合物为近红外罗丹明染料，其吸收波长大于700nm，发射波长大于750nm，摩尔消光系数大于1×105M-1cm-1，荧光量子产率达到10～30％，亮度高，可作为抗体偶联荧光标记物使用；
结构式C1、C2、C3、D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8化合物为荧光开启型近红外罗丹明染料，在满足通式A结构所具有的光物理性能的基础上，在生物环境中还存在一个无色螺环内酯和荧光两性离子构建的平衡(附图1)，其平衡常数KL–Z满足应用需求(Log KL–Z>-3)，可实现优异的荧光开启性能：
结构式D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8所示化合物为荧光开启型近红外罗丹明染料，是自标记蛋白HaloTag、SNAP-tag、CLIP-tag的荧光配体，可通过其优异的荧光开启性能实现化学遗传学荧光标记和传感：
本发明提供的基于双原子桥接骨架的近红外罗丹明染料，还包括其盐，或其对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物。
本发明还提供通式A化合物的制备方法，其反应式为：
具体步骤为：
步骤一、式(1)所示化合物与氨基化合物经Buchwald-Hartwig碳氮偶联、甲酰化、还原得到式(2)所示化合物；
步骤二、式(2)所示化合物与溴代苯胺经缩合、偶联、经酸催化脱水，氧化剂氧化得到式(3)所示化合物；
步骤三、式(3)所示化合物在苯锂试剂或者苯基格氏试剂作用下经亲核加成反应，再脱水或脱保护得到通式A所示化合物。
步骤一中，式(1)所示化合物与氨基化合物经Buchwald-Hartwig碳氮偶联反应，甲酰化、还原得到式(2)所示化合物：其中，式(1)所示苯并五元杂环化合物选自如式IX-XI所示的一种：
式(1)所示化合物在有机溶剂环境下用钯催化剂和膦配体以及碱作为催化剂，在惰性气体保护下，与有机胺化合物加热搅拌，进一步甲酰化还原，得到式(2)所示化合物，其中，所述有机胺化合物选自如式XII-XV所示的一种或多种：
所述有机溶剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、***、1，4-二氧六环中的一种或多种；所述钯催化剂选自三(二亚苄基丙酮)二钯、双二亚苄基丙酮钯、醋酸钯中的一种或多种；所述碱选自叔丁醇钾、叔丁醇钠、碳酸钾、碳酸铯、磷酸钾中的一种或多种；所述膦配体选自三叔丁基膦、三苯基膦、三正丁基膦中的一种或多种；
步骤二中，式(2)所示化合物与在有机溶剂中与溴代苯胺经缩合、进一步与异丙烯基硼酸频哪醇酯在钯催化下偶联、经酸催化脱水，氧化剂氧化得到式(3)所示化合物；
其中，所述溴代苯胺选自如XVII-XXII所示中的任意一种：
所述有机溶剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、***、1，4-二氧六环中的一种或多种；所述钯催化剂选自三(二亚苄基丙酮)二钯、双二亚苄基丙酮钯、醋酸钯中的一种或多种；所述酸催化剂选自多聚磷酸、浓硫酸、乙酸酐、甲酸、醋酸、三溴化硼中的一种或多种；所述氧化剂为高锰酸钾、二氧化硒中的一种；
步骤三中，式(3)所示化合物在苯锂试剂或者苯基格氏试剂作用下经亲核加成反应，再经酸催化得到通式A所示化合物，包括：
式(3)所示化合物在苯锂试剂或者苯基格氏试剂作用下，以醚类作为反应溶剂，经亲核加成反应，经酸催化剂催化，在室温下反应，得到通式A所示化合物；其中，所述苯锂试剂如式XXII所示：
R5，R6各自独立选自H、C1-C6烷基、羧基；
R7独立选自H、C1-C6烷基、和式I-IV所示基团中的任意一种：
曲线标记处为取代位；所述苯基格氏试剂为苯锂试剂对应的格氏试剂；所述醚类溶剂为四氢呋喃或***；所述酸催化剂为高氯酸或三氟乙酸。
本发明还提出上述基于通式A所示化合物在近红外成像应用。
具体包括：
近红外罗丹明染料与抗体形成的共价偶联物，用于细胞和肿瘤荧光标记成像中。其中，抗体选自免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)中的任意一种。
以及，荧光开启型近红外罗丹明染料与自标记蛋白形成的共价偶联物，用于近红外荧光成像中。其中，自标记蛋白可独立选自HaloTag、SNAP-tag、CLIP-tag中的任意一种。
更进一步的，本发明还提供荧光开启型近红外罗丹明染料与自标记蛋白HaloTag形成的共价偶联物，用于活细胞成像与钙离子检测中。
尤其是：
式D1-D8中的任意一种与自标记蛋白形成的共价偶联物在近红外荧光成像中的应用。其中，自标记蛋白可独立选自HaloTag、SNAP-tag、CLIP-tag中的任意一种。
式D1所示化合物与自标记蛋白HaloTag形成的共价偶联物在细胞成像与钙离子检测中的应用。
式B3所示化合物与抗体形成的共价偶联物在细胞和肿瘤荧光标记成像中的应用。
本发明提供的如通式A所示的近红外罗丹明染料，普遍具有亮度高、水溶性好、合成简便和结构易修饰等特性。其中结构C1-C3、D1-D8可显示出优异的荧光开启行为，使其可作为自标记蛋白HaloTag的特异性活化探针，适用于活细胞的免洗成像、蛋白标记和钙离子检测、小动物成像和荧光手术导航等。
附图说明
图1为传统的可见光区单原子桥接罗丹明染料与本发明提供的近红外罗丹明染料在开闭环平衡上的区别。
图2为染料1a和2a的光谱表征。(详见实施例1-5)。其中，a为染料1a在不同溶剂(二氯甲烷、乙醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液)中的吸收光谱；b为染料1a在不同溶剂(二氯甲烷、乙醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液)中的荧光发射光谱；c为染料2a在不同介电常数溶剂体系中的吸收变化，用以展示内酯-两性离子平衡性质。
图3为染料3a-葡聚糖共价偶联物(详见实施例6)用于近红外活体动态成像。其中，a为注射染料3a-葡聚糖共价偶联物后的小鼠近红外二区活体成像图；b为小鼠心脏、肝脏以及膀胱区域的荧光信号随时间变化曲线；c为经傅里叶变换后的小鼠心跳和呼吸频率分布。
图4为染料3a标记的抗体(anti-PDL1 mAb，详见实施例7)用于近红外小鼠肿瘤成像。其中，a为染料3a标记的抗体用于小鼠结肠癌肿瘤的近红外二区活体成像图；b为离体器官和肿瘤的近红外二区荧光成像图；c为离体器官和肿瘤的荧光强度统计图。
图5为染料5a对HaloTag自标记蛋白的特异性荧光开启型响应(详见实施例8)。其中，a为染料5a加入HaloTag自标记蛋白前后的吸收和荧光光谱；b为染料5a在HaloTag自标记蛋白、牛血清蛋白、人血清蛋白和不含蛋白的溶液中的吸收光谱。
图6为使用染料5a标记表达HaloTag-histone H2B融合蛋白的HEK293T细胞的转盘共聚焦显微成像结果(详见实施例9)。其中，a为细胞核共聚焦成像图；b为洗涤前后细胞核荧光强度与核外信号的比值；c为染料5a标记的细胞核信号与DAPI的荧光共定位图像。
图7为使用染料5a标记表达HaloCaMP1a蛋白的HEK293T细胞的转盘共聚焦显微成像结果(a)，以及近红外显微成像显示在ATP诱导下，细胞内钙离子变化引起的荧光变化(b,c)(详见实施例10)。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步介绍本发明。应当指出的是，凡是本发明的精神和原则之内所做的任何修改、替代或改进均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：
染料1a的制备，化合物结构式和具体合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)中间体1的合成
无水无氧操作，将6-溴苯并噻吩(化合物1)、二甲胺、三(二亚苄基丙酮)二钯、三叔丁基膦、叔丁醇钠，按摩尔比1：4：0.025：0.075：6投料，溶于甲苯中，在100℃下反应4小时，冷却后用二氯甲烷稀释，过滤除去不溶物，然后旋蒸除去溶剂，硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝9：1)，得到中间体1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(d,J＝8.8Hz,1H),7.18(d,J＝6.1Hz,2H),7.12(d,J＝5.3Hz,1H),6.92(d,J＝8.8Hz,1H),3.01(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ148.72,142.07,131.07,123.86,123.53,121.85,112.80,104.89,41.46.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C10H11NS[M]+177.0612,found177.0506。
(2)中间体2的合成
无水无氧操作，将中间体1a((3.54克，20毫摩尔)溶于50毫升无水THF中，在-78℃下搅拌10分钟。然后，逐滴加入正丁基锂的正己烷溶液(8.8毫升,1.1当量)，然后继续在-78℃下搅拌30分钟。最后，在反应体系中缓慢滴加无水二甲基甲酰胺，恢复至室温继续反应30分钟，反应后的混合物经旋蒸除去溶剂，用硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)，得到中间体2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.94(s,1H),7.85(s,1H),7.73(d,J＝9.0Hz,1H),7.01(s,1H),6.90(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),3.09(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ184.04,135.65,127.06,113.14,103.49,40.84.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C11H12NOS[M+H]+206.0561,found 206.0708。
(3)中间体3的合成
将含中间体2a(3克,15毫摩尔)溶解于100毫升甲醇中，冰水浴搅拌条件下，加入1.52克硼氢化钠，继续搅拌30分钟。随后，反应混合物经旋蒸除去溶剂，残渣用二氯甲烷稀释，收集滤液，真空浓缩。用硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，得到中间体3。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝8.8Hz,1H),7.10(s,1H),7.02(s,1H),6.88(d,J＝8.7Hz,1H),4.82(s,2H),2.99(s,6H),2.33(s,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ148.69,142.54,140.13,130.87,123.98,121.70,112.80,105.12,61.12,41.47.MALDI-TOF/TOF-MS calcdfor C11H13NOS[M]+207.0718,found 207.0701。
(4)中间体4的合成
将中间体3a、3-溴-N,N-二甲基苯胺溶于150毫升二氧六环中，冰水浴搅拌下，缓慢加入三氟化硼***，摩尔比分别为1：2：5。上述体系在室温下反应1.5h，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭，盐水洗涤，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤并收集滤液，经旋蒸除去溶剂后，用硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到中间体4。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(d,J＝8.6Hz,1H),7.15(d,J＝8.4Hz,1H),7.08(s,1H),6.94(s,1H),6.86(d,J＝12.3Hz,2H),6.63(d,J＝8.3Hz,1H),4.21(s,2H),2.98(s,6H),2.94(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ150.54,148.24,142.04,140.31,131.15,126.88,125.44,123.30,121.23,116.39,112.61,112.08,105.28,41.62,40.72,36.22.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C19H21BrN2S[M]+388.0609,found 388.0984。
(5)中间体5的合成
无氧操作，氮气保护条件下，将中间体4a、异丙烯基硼酸频哪醇酯、四三苯基膦钯、碳酸钾，按摩尔比1：1.5：0.5：2投料，溶于二氧六环、水混合溶剂中(体积比6：1)，在85℃下搅拌4小时。随后，反应混合物经旋蒸除去溶剂，残渣用二氯甲烷稀释，收集滤液，旋蒸除去溶剂。用硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到中间体5。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(d,J＝8.8Hz,1H),7.21(d,J＝8.5Hz,1H),7.10(s,1H),6.92–6.85(m,1H),6.79(s,1H),6.69(dd,J＝8.5,2.7Hz,1H),6.60(d,J＝2.5Hz,1H),5.23(s,1H),4.95(s,1H),4.15(s,2H),3.00(s,6H),2.99(s,6H),2.08(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ150.54,148.24,142.04,140.30,131.15,126.88,125.44,123.30,121.22,116.39,112.61,112.08,105.28,41.62,40.71,36.22.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C22H26N2S[M]+350.1817,found350.2124。
(6)中间体6的合成
中间体5与多聚磷酸(质量比1：10)在85℃下剧烈搅拌15min，得到深红色混合物。经水稀释后，用饱和碳酸氢钠溶液中和，二氯甲烷萃取。收集的有机相用无水硫酸镁干燥后，过滤，所得滤液经旋蒸除去溶剂后继续溶解30毫升丙酮中，冰水浴搅拌下，依次加入高锰酸钾继续反应2小时。最后，反应得到的棕色悬浮液经硅藻土过滤，收集滤液并旋蒸除去溶剂，用硅胶柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝100：2)，得中间体6。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(s,1H),8.00(s,1H),7.14(s,1H),6.94(s,1H),6.80(s,2H),3.13(s,6H),3.07(s,6H),1.87(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.96,153.33,150.98,149.60,146.14,128.47,128.24,126.27,119.65,111.87,111.19,108.10,104.81,40.82,40.48,30.76.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C22H24N2OS[M]+364.1609,found 364.2009。
(7)染料1a的合成
无水无氧操作，邻溴甲苯溶于四氢呋喃中，冷却至-78℃约10分钟后，缓慢加入正丁基锂的正己烷溶液，继续搅拌30分钟。加入中间体5a的四氢呋喃溶液中，并升至室温搅拌1小时，然后加入稀盐酸淬灭反应，再搅拌30分钟，然后用水稀释，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得油状物，用柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得染料1a。其中邻溴甲苯、正丁基锂、中间体5a的投料摩尔比为3：3：1。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.36(d,J＝9.6Hz,1H),7.49(t,J＝7.3Hz,1H),7.42(d,J＝2.4Hz,1H),7.40(s,1H),7.39(d,J＝2.3Hz,1H),7.27(d,J＝7.4Hz,1H),7.19(d,J＝9.4Hz,1H),7.16(dd,J＝9.6,2.2Hz,1H),6.92(d,J＝1.7Hz,1H),6.82(dd,J＝9.4,2.4Hz,1H),3.49(s,6H),3.25(s,6H),2.12(s,3H),2.10(s,3H),2.06(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.07,159.50,159.15,156.41,152.95,152.32,135.53,130.90,130.39,129.30,128.60,126.22,121.05,115.04,114.05,112.78,103.31,44.04,42.10,41.17,33.98,33.25,19.96.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C29H31N2S+[M]+439.2203,found 439.2723。
实施例2：
染料2a的制备，化合物结构式和具体合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)中间体1-6的合成
中间体1-6的合成参照实施例1。
(2)中间体7的合成
将2-溴苯甲酸、二碳酸二甲酯和4-二甲氨基吡啶，按摩尔比1：2.5：0.2溶于二甲基甲酰胺中，100℃回流过夜。冷却至室温，旋蒸除去溶剂后，将残渣溶解于***中，用盐水洗涤，收集有机相在无水硫酸钠上干燥，过滤，滤液旋蒸除去溶剂。残渣用硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝20：1)，得到中间体7。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(d,J＝7.6Hz,1H),7.61(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(t,J＝7.5Hz,1H),7.27(s,1H),1.61(d,J＝1.2Hz,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.93,134.51,134.24,132.08,131.02,127.31,121.19,82.78,28.37。
(3)染料2a的合成
无水无氧操作，中间体7溶于四氢呋喃中，冷却至-78℃约10分钟后，缓慢加入正丁基锂的正己烷溶液，继续搅拌30分钟。加入中间体6的四氢呋喃溶液中，并升至室温搅拌1小时，然后加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，再搅拌30分钟，然后用水稀释，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得油状物，用柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得染料2a。其中中间体7、正丁基锂、中间体5a的投料摩尔比为5：5：1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03–7.96(m,2H),7.59–7.55(m,2H),7.09(dd,J＝5.5,3.0Hz,1H),6.93(s,3H),6.69(d,J＝8.8Hz,1H),6.62(s,1H),3.01(d,J＝8.2Hz,12H),1.98(d,J＝14.5Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.04,154.93,150.77,148.28,148.12,143.26,140.70,134.66,129.41,128.31,125.83,125.06,124.67,123.54,112.08,111.49,109.25,105.05,40.88,40.48,39.03,31.42,30.51.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C29H29N2O2S[M+H]+469.1871,found469.2556。
实施例3：
染料3a的制备，化合物结构式和具体合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)中间体1-6的合成
中间体1-6的合成参照实施例1。
(2)中间体8的合成
将3-甲基-4-溴苯甲酸、二碳酸二甲酯和4-二甲氨基吡啶，按摩尔比1：2.5：0.2溶于二甲基甲酰胺中，100℃回流过夜。冷却至室温，旋蒸除去溶剂后，将残渣溶解于***中，用盐水洗涤，收集有机相在无水硫酸钠上干燥，过滤，滤液旋蒸除去溶剂。残渣用硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到中间体8。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00(d,J＝1.5Hz,1H),7.67(dd,J＝8.2,1.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.2Hz,1H),1.59(d,J＝1.3Hz,9H),1.47(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.44,138.15,132.48,131.76,131.29,130.03,128.39,81.52,28.38,23.11。
(3)染料3a的合成
无水无氧操作，中间体8溶于四氢呋喃中，冷却至-78℃约10分钟后，缓慢加入正丁基锂的正己烷溶液，继续搅拌30分钟。加入中间体6的四氢呋喃溶液中，并升至室温搅拌1小时，然后加入稀盐酸淬灭反应，再搅拌30分钟，然后用水稀释，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得油状物，最后经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，得染料3a。其中中间体8、正丁基锂、中间体5a的投料摩尔比为5：5：1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.42(d,J＝9.4Hz,1H),8.05(s,1H),7.97(d,J＝7.7Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.45(s,1H),7.30(s,1H),7.18(d,J＝9.7Hz,1H),7.03(s,2H),3.38(s,6H),3.19(s,6H),2.14(s,3H),1.97(d,J＝10.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.89,159.88,157.86,156.25,155.83,152.07,151.24,139.52,135.89,134.17,132.65,132.12,131.22,128.94,128.77,128.34,126.92,119.77,114.79,114.54,112.56,103.57,43.25,40.99,40.28,32.92,32.33,19.05.MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C30H31N2O2S+[M]+483.2101,found 483.2733。
实施例4：
染料4a的制备，化合物结构式和具体合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)中间体1-6的合成
中间体1-6的合成参照实施例1。
(2)中间体9的合成
将2-溴-5-碘苯甲酸、二碳酸二甲酯和4-二甲氨基吡啶，按摩尔比1：2.5：0.2溶于二甲基甲酰胺中，100℃回流过夜。冷却至室温，旋蒸除去溶剂后，将残渣溶解于***中，用盐水洗涤，收集有机相在无水硫酸钠上干燥，过滤，滤液旋蒸除去溶剂。残渣用硅胶柱纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到中间体8。
(3)中间体10的合成
将得到的中间体8、乙基三异丙基硅烷、二(三苯基膦)二氯化钯、碘化亚铜和N,N-二异丙基乙胺，按摩尔比(1：1.2：0.03：0.06：10)溶于甲苯中，室温反应4h。旋蒸除掉溶剂后，用乙酸乙酯提取，盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，再一次旋蒸除掉溶剂。最后经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得中间体10。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(s,1H),7.63(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(d,J＝8.0Hz,1H),1.60(s,9H),1.12(s,18H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.33,137.32,133.76,130.83,130.68,127.62,121.01,104.71,95.07,83.03,28.36,18.85,11.45。
(4)染料4a的合成
无水无氧操作，中间体8溶于四氢呋喃中，冷却至-78℃约10分钟后，缓慢加入正丁基锂的正己烷溶液，继续搅拌30分钟。加入中间体6的四氢呋喃溶液中，并升至室温搅拌1小时，然后加入饱和氯化铵淬灭反应，继续搅拌30分钟，然后用水稀释，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，用柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得染料4a。其中中间体8、正丁基锂、中间体5a的投料摩尔比为5：5：1。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.96(dd,J＝13.9,8.5Hz,2H),7.64(dd,J＝8.0,1.0Hz,1H),7.17(s,1H),7.05–6.84(m,3H),6.68(d,J＝8.8Hz,1H),6.61(s,1H),3.16(s,1H),3.02(s,6H),2.99(s,6H),2.00(s,3H),1.96(s,3H).MALDI-TOF/TOF-MS calcd for C31H29N2O2S[M+H]+493.1871found 493.2738。
实施例5：
染料1a的吸收和发射光谱测试，以及染料2a的荧光开启行为研究。
染料1a是常亮型分子，以此分子为代表，首先研究了染料的吸收和发射光谱性质。具体步骤如下：将染料1a配置成10毫摩尔的二甲亚砜母液，分别在二氯甲烷、乙醇、乙腈以及磷酸盐缓冲溶液中稀释至10微摩尔进行紫外吸收和荧光光谱测试，在乙醇和磷酸盐缓冲溶液中测试荧光绝对量子产率。
染料2a为不带电的螺环结构，我们重点研究它的两性离子-内酯平衡状态，是否有合适的KL-Z和荧光开启行为，具体步骤为：将染料2a配置成10毫摩尔的二甲亚砜母液，并将其稀释在15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％二氧六环-水混合溶剂(10微摩尔)进行吸收光谱测试(～25℃)。将吸光度归一化并绘制与二氧六环-水混合物的介电常数关系图，并计算KL-Z值(KL-Z＝(εdw/εmax)/(1-εdw/εmax)。εdw为染料2a在体积比1:1二氧六烷:水溶剂混合物中的消光系数，εmax为染料2a在0.1％v/v三氟乙酸乙醇中测得的最大消光系数。如图2所示，染料1a最大吸收在725纳米，最大荧光发射峰在765纳米，并具有较大的摩尔消光系数(110500M-1cm-1)，在乙醇和水中的绝对荧光量子产率分别为27％和11％，亮度优异。染料2a在酸性溶液中(0.1％三氟乙酸乙醇溶液)表现出与染料1a类似的吸收发射特性(最大吸收、发射：715/765纳米)，在二氧六烷-水混合物中，染料的吸收随介电常数的变化而变化，呈现荧光开启行为。KL-Z为0.016，具有非常适中的两性离子-内酯平衡常数，利于构建基于化学遗传的探针。
实施例6：
通过近红外活体成像研究染料在小鼠体内的动态清除过程。染料3a保持了染料1a的基本光物理性质，有着较高的亮度，允许用拖尾的近红外发射(荧光发射>1000纳米)进行视频帧率的活体成像观察。同时，3a还有一个羧基位点可与多种带氨基的物质连接，实现功能化修饰。因此，以染料4a为例，制备了葡聚糖-染料3a，即Dextran-2XR，使用近红外发射拖尾来检测其在体内的清除情况。具体步骤如下：
首先，染料3a用1,1,3,3-四甲基溴四氟硼酸铵(TSTU)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)对其进行活化制成琥珀酰亚胺酯(NHS酯)形式，方便进一步酰胺缩合反应。将NHS酯活化的染料3a(100微升，10毫克/毫升溶液)加入0.2摩尔浓度碳酸氢钠溶液的氨基葡聚糖中。反应混合物在室温下搅拌1小时。最后用PBS作为洗脱缓冲液，在PD-10柱上通过凝胶过滤分离得到Dextran-2XR偶联物。
之后在不麻醉的清醒小鼠中对Dextran-2XR偶联物进行视频速率动态追踪。将Dextran-2XR偶联物(0.5毫克每毫升，200微升)注射到小鼠尾静脉，立即用730nm激光照射(20mW cm-2)。在10毫秒曝光时间下，通过1000nm长通滤光片从清醒小鼠腹侧视图获取图像，帧速率为52.6帧/秒。结果如附图3所示，可观察到来自心脏、肝脏和膀胱的依次点亮。清醒小鼠的心率和呼吸频率通过傅里叶变换为6.4Hz和4.0Hz。这些结果表明，染料4a可以作为一种明亮的荧光标记试剂，用于近红外动态成像观察。
实施例7：
染料用于抗体标记并用于抗体靶向的近红外肿瘤成像应用。染料3a保持了染料1a的基本光物理性质，有着较高的亮度，允许用拖尾的近红外发射(荧光发射>1000纳米)进行活体成像观察。同时，3a还有一个羧基位点可与多种抗体相连，实现抗体的近红外荧光标记和近红外成像。以染料3a为例，将其与抗PD-L1单克隆抗体(anti-PD-L1 mAb)通过酰胺缩合反应连接，制备得荧光标记的anti-PD-L1 mAb，最终用于近红外肿瘤成像。具体步骤为：
首先，染料3a用1,1,3,3-四甲基溴四氟硼酸铵(TSTU)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)对其进行活化制成琥珀酰亚胺酯(NHS酯)形式，方便进一步酰胺缩合反应。随后，将NHS酯活化的染料3a(20微升，10毫克每毫升溶液)与1毫克anti-PD-L1 mAb，加入0.2M碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(pH＝9.0)中，使pH升至～8.5。得到的混合物在4℃下放置过夜以完成反应，并以磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)作为洗脱液通过脱盐柱(Sephadex G-25)进行纯化，得到染料标记的抗体，即aPDL1-2XR。
在建立荷皮下瘤(鼠结肠癌CT-26，PD-L1高表达)小鼠模型后，静脉注射aPDL1-2XR(0.5毫克每毫升，200微升)，然后用730纳米近红外激光照射(50mW cm-2)，对CT-26荷瘤小鼠体内的PD-L1的表达进行近红外活体成像。在注射后4、8、12、24和48小时的不同时间点，通过1000nm长通滤光片，100ms曝光时间采集图像。结果如附图4所示，注射后观察到显著的肿瘤成像效果，肿瘤与正常组织荧光强度比很高，在注射后24小时达到峰值(18±3.7)。这些结果证明了染料对抗体的有效标记，以及用于近红外活体肿瘤、免疫相关成像的潜力。
实施例8：
染料5a，即HaloTag蛋白配体染料的制备和HaloTag自标记蛋白响应情况研究，化合物结构式和具体合成路线如下：
(1)中间体1-6的合成
中间体1-6的合成参照实施例1。
(2)中间体9，10，以及染料4a的合成
中间体1-6以及染料4a的合成参照实例4。
(3)染料5a的合成
HaloTag HTL-N3、染料4a、碘化亚铜、抗坏血酸钠以及三乙胺，按摩尔比1.5：1：0.1：0.1：0.1加入含有四氢呋喃和水的混合溶剂中(体积比9：1)，室温反应1h。旋蒸除去溶剂后，残渣用二氯甲烷萃取，所得有机相用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂。用硅胶柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇20：1)。得染料5a，即HaloTag蛋白配体染料2XR715-HTL。用UPLC-HRMS对其进行纯度鉴定。
染料5a即HaloTag蛋白配体染料2XR715-HTL可特异性结合HaloTag自标记蛋白，染料本身无近红外吸收和荧光发射，在结合HaloTag自标记蛋白后具有明显的近红外吸收和荧光生成。
对于染料5a的HaloTag自标记蛋白的标记和响应情况，染料5a配置成10微摩尔的HEPES溶液(含0.0002％质量分数的F127助溶)。分别加入20微摩尔浓度的HaloTag蛋白或等量的Tris盐酸-甘油、牛血清白蛋白及人血清白蛋白作为空白对照，在4℃下孵育，并用紫外-可见分光光度计收集染料的吸收光谱变化，荧光光谱仪记录荧光光谱变化。结果如附图5所示，染料5a与HaloTag蛋白孵育1小时后，吸光度显著增加105倍，荧光显著增加163倍，而与牛血清白蛋白、人白蛋白或不含HaloTag的水溶液孵育时未见变化，表明染料5a对HaloTag自标记蛋白有优异的荧光特异性生成效果。
实施例9：
染料5a即HaloTag自标记蛋白配体染料2XR715-HTL免洗标记成像活细胞内HaloTag蛋白实验。具体步骤如下：
首先，为了在活细胞的细胞核或细胞质中表达HaloTag自标记蛋白，使用脂质体瞬时转染法(lipo3000)将LZ10 prebrebac-H2B-Halo质粒瞬时转染到HEK293T细胞中，使细胞核表达H2B-Halo融合蛋白。
随后，将染料5a配置成1毫摩尔浓度的二甲亚砜母液。用不含酚红的细胞培养基将其稀释至1微摩尔浓度，在35mm培养皿中培养瞬时表达Halo-H2B蛋白的活HEK293T细胞，加入含0.0002％质量分数的F127的1微摩尔浓度染料5a，并在37℃、5％ CO2气氛下孵育1小时。染色后无需洗涤步骤，直接在转盘共聚焦下进行成像，激发波长为730纳米，收集发射波段为810±45纳米的近红外带通光，曝光时间200毫秒。
结果如附图6所示，在近红外通道观察到具有高核-细胞质信号比(～45倍)的特异性核标记，并与商业核标记染料DAPI表现出良好的共定位。这些结果表明，染料5a可以有效地穿过活细胞膜，选择性地标记细胞器靶向的HaloTag蛋白，并具有高度的荧光特异性生成行为。
实施例10：
染料5a即HaloTag自标记蛋白配体染料2XR715-HTL结合活细胞内HaloTag蛋白并作为化学遗传工具，在近红外成像监测胞内钙离子变化实验。具体步骤如下：
首先，为了在活细胞的细胞核或细胞质中表达可响应钙离子变化的HaloCaMP1a-EGFP蛋白，使用脂质体瞬时转染法(lipo3000)将pAAV-synapsin-HaloCaMP1a-EGFP质粒瞬时转染到HEK293T细胞中，使细胞核表达HaloCaMP1a-EGFP融合蛋白。
随后，将染料5a配置成1毫摩尔浓度的二甲亚砜母液。用不含酚红的细胞培养基将其稀释至1微摩尔浓度，在35mm培养皿中培养瞬时表达HaloCaMP1a-EGFP蛋白的活HEK293T细胞，加入含0.0002％质量分数的F127的1微摩尔浓度染料5a，并在37℃、5％ CO2气氛下孵育1小时。染色后无需洗涤步骤，直接在转盘共聚焦下进行成像，激发波长为730纳米，收集发射波段为810±45纳米的近红外带通光，曝光时间200毫秒。
如附图7所示，来自2XR715-HTL的明亮信号与细胞质中EGFP荧光之间存在良好的共定位，表明细胞内HaloCaMP蛋白的有效标记。且在近红外荧光显微镜下(730纳米激发，收集1000纳米以上波长光)依然能观察到较高的细胞/胞外信号比(～10.3倍)，表明染料5a在近红外依然保持着较高的亮度和优异的荧光生成性质。
随后，对染料5a标记的瞬时表达HaloCaMP1a-EGFP的HEK293T细胞内钙离子变化进行近红外成像监测，用100微摩尔浓度三磷酸腺苷(ATP)对标记细胞进行滴注以诱导胞内钙离子水平升高，同时用730nm激光照射，1000nm长通滤光片和830nm二项色镜以0.762帧每秒的速度连续获取45秒的图像。如附图所示，细胞质荧光短暂增加，随后持续下降。荧光响应(ΔF/F0)值较高，在0.2～4之间，说明染料5a与HaloCaMP1a蛋白匹配程度较好，并实现了基于化学遗传的近红外钙离子成像。

Claims (10)

1.一种近红外罗丹明染料，其特征在于，具有通式A所示的结构：
式中：
X为杂原子，包括S、O、NH及其衍生物；
Y代表O、S、N、Se、Te、Te＝O、O＝S＝O、C＝O、C(CH3)2、Si(CH3)2、Ge(CH3)2、P＝O(Ph)或P＝O(CH3)；
R1、R2、R3、R4各自独立选自H、Cl-C5烷基；
R5，R6各自独立选自H、C1-C5烷基、C1-C5全氟烷基，羧基；
R7独立选自H、C1-C6烷基、和式I-VIII所示基团中的任意一种：
曲线标记处为取代位。
2.如权利要求1所述的近红外罗丹明染料，其特征在于，结构式如下式A1、A2、A3中的任意一种：
3.如权利要求1所述的近红外罗丹明染料，其特征在于，结构式如下式B1、B2、B3、B4、B5、B6中的任意一种：
4.如权利要求1所述的近红外罗丹明染料，其特征在于，结构式如下式C1、C2、C3中的任意一种：
5.如权利要求1所述的近红外罗丹明染料，其特征在于，结构式如下式D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8中的任意一种：
6.如权利要求1所述的近红外罗丹明染料的盐，或其对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物。
7.如权利要求1所述的近红外罗丹明染料的制备方法，其特征在于，其反应式为：
具体步骤为：
步骤一、式(1)所示化合物与氨基化合物经Buchwald-Hartwig碳氮偶联、甲酰化、还原得到式(2)所示化合物；
步骤二、式(2)所示化合物与溴代苯胺经缩合、偶联、经酸催化脱水，氧化剂氧化得到式(3)所示化合物；
步骤三、式(3)所示化合物在苯锂试剂或者苯基格氏试剂作用下经亲核加成反应，再脱水或脱保护得到通式A所示化合物。
8.如权利要求7所述的近红外罗丹明染料的制备方法，其特征在于：
步骤一中，式(1)所示化合物与氨基化合物经Buchwald-Hartwig碳氮偶联反应，甲酰化、还原得到式(2)所示化合物：其中，式(1)所示苯并五元杂环化合物选自如式IX-XI所示的一种：
式(1)所示化合物在有机溶剂环境下用钯催化剂和膦配体以及碱作为催化剂，在惰性气体保护下，与有机胺化合物加热搅拌，进一步甲酰化还原，得到式(2)所示化合物，其中，所述有机胺化合物选自如式XII-XV所示的一种或多种：
所述有机溶剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、***、1，4-二氧六环中的一种或多种；所述钯催化剂选自三(二亚苄基丙酮)二钯、双二亚苄基丙酮钯、醋酸钯中的一种或多种；所述碱选自叔丁醇钾、叔丁醇钠、碳酸钾、碳酸铯、磷酸钾中的一种或多种；所述膦配体选自三叔丁基膦、三苯基膦、三正丁基膦中的一种或多种；
步骤二中，式(2)所示化合物与在有机溶剂中与溴代苯胺经缩合、进一步与异丙烯基硼酸频哪醇酯在钯催化下偶联、经酸催化脱水，氧化剂氧化得到式(3)所示化合物；
其中，所述溴代苯胺选自如XVII-XXII所示中的任意一种：
所述有机溶剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、***、1，4-二氧六环；所述钯催化剂选自三(二亚苄基丙酮)二钯、双二亚苄基丙酮钯、醋酸钯；所述酸催化剂选自多聚磷酸、浓硫酸、乙酸酐、甲酸、醋酸、三溴化硼中的一种或多种；所述氧化剂为高锰酸钾、二氧化硒；
步骤三中，式(3)所示化合物在苯锂试剂或者苯基格氏试剂作用下经亲核加成反应，再经酸催化得到通式A所示化合物，包括：
式(3)所示化合物在苯锂试剂或者苯基格氏试剂作用下，以醚类作为反应溶剂，经亲核加成反应，经酸催化剂催化，在室温下反应，得到通式A所示化合物；其中，所述苯锂试剂如式XXII所示：
R5，R6各自独立选自H、C1-C6烷基、羧基；
R7独立选自H、C1-C6烷基、和式I-IV所示基团中的任意一种：
曲线标记处为取代位；所述苯基格氏试剂为苯锂试剂对应的格氏试剂；所述醚类溶剂为四氢呋喃或***；所述酸催化剂为高氯酸或三氟乙酸。
9.如权利要求1-5任一所述的近红外罗丹明染料在近红外荧光成像中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，具体包括：
(1)近红外罗丹明染料与抗体形成的共价偶联物，用于细胞和肿瘤荧光标记成像中；其中，抗体选自免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)中的任意一种；
(2)荧光开启型近红外罗丹明染料与自标记蛋白形成的共价偶联物，用于近红外荧光成像；其中，自标记蛋白可独立选自HaloTag、SNAP-tag、CLIP-tag中的任意一种；
(3)荧光开启型近红外罗丹明染料与自标记蛋白HaloTag形成的共价偶联物，用于活细胞成像与钙离子检测。
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