CN118236514A - 抗体-糖皮质激素偶联物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体‑糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物及其用途。抗体‑糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，结构式如正文所示。本发明提供的抗体‑糖皮质激素偶联物(ADC)可以显著影响糖皮质激素介导的信号通路的激活水平，从而产生显著的抗炎活性；具有良好的血浆稳定性，可以避免糖皮质激素分子在体循环中的提前释放；具有良好的内吞能力和人溶酶体裂解能力，可以实现ADC的靶向吸收及糖皮质激素小分子的快速释放，从而提高疗效。在小鼠接触性超敏反应模型和大鼠类风湿关节炎模型中，显示出优异的抗炎活性，显著优于阿达木单抗及对照组。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种抗体-糖皮质激素偶联物及其用途，包括但不限于类风湿关节炎、炎性肠病、银屑病、强直性脊柱炎、大疱性天疱疮、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、干燥综合征和化脓性汗腺炎。
背景技术
肿瘤坏死因子α的是一种参与全身炎症的细胞信号蛋白(细胞因子)，主要作用是调节免疫细胞的功能。抗TNF-α生物制剂(例如，阿达木单抗、依那西普和英利昔单抗)在治疗自身免疫性障碍和炎性障碍(如类风湿性关节炎、银屑病和炎性肠病)中具有临床验证的治疗效果。尽管它们在临床上取得了成功，但抗TNF-α生物制剂仍然受限于它们在患者中可以达到的最大功效，用抗TNF-α生物制剂治疗的患者也可能对治疗剂产生免疫原性应答，从而限制其有效性，因此需要鉴定和开发更强力有效的治疗剂。
糖皮质激素具有抗炎性质，被广泛用于炎症性紊乱或炎症性疾病，如呼吸***疾病、风湿免疫性疾病、肾脏***疾病、皮肤***疾病等的治疗，可以控制疾病症状，减缓疾病进程，具有显著的临床效果，但同时也会产生许多不良反应，如肥胖、满月脸、水牛背、浮肿、自发性骨折、骨质疏松及股骨头坏死、溃疡病、急性消化道出血、失眠、多毛及抵抗力下降等，因此限制了糖皮质激素药物在临床上的应用。
目前，虽然有将抗体-糖皮质激素偶联物用于炎症等疾病或症状的治疗，但是仍然存在抗炎功效较低、持续时间短等问题。因此，需要开发具有增强的功效和更长的作用时间的治疗剂。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种抗体-糖皮质激素偶联物及其用途，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种具有式(I)所示的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述式(I)的结构式如下：
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段；
L1选自：
m为1-8的整数，p为1-8的整数，s为1-6的整数；
L2不存在，或选自
r为1-6的整数，q为1-8的整数；
D为具有式(II)所示的糖皮质激素衍生物：
糖皮质激素衍生物D以21位羟基的氧原子为连接部位，式(II)中，
R1选自H或F或Cl；
R2选自H、甲基或F；
R3、R4分别独立选自H、OH、含1-6个碳的烷基、OR6、OCOR7，或R3和R4共同形成即C16，C17位之间还通过氧桥相连；
其中，R6选自H或含1-6个碳的烷基或卤素取代的烷基；
R7选自含1-6个碳的烷基、含2-6个碳的烯基、含2-6个碳的炔基、含6-10个碳的芳基或含4-10个碳的杂芳基或杂环基；
R8、R9分别独立选自H、含1-6个碳的烷基、含3-10个碳的环烷基、含2-6个碳的烯基、含2-6个碳的炔基、含6-10个碳的芳基、含4-10个碳的杂芳基或杂环基；
卤素选自F或Cl；
R5选自H、F或Cl；
D不可选自，
n为1-8的整数或小数。
进一步的，所述L1-L2选自：
其中，m为1-8的整数，p为1-8的整数，s为1-6的整数，q为1-8的整数，r为1-6的整数。
进一步的，所述L1选自：
进一步的，所述L2不存在，或选自：
进一步的，所述L1-L2选自：
进一步的，所述糖皮质激素衍生物D中，
R1选自H或F；
R2选自H、甲基或F；
R3、R4分别独立选自H、OH、含1-6个碳的烷基、OCOR7，或R3和R4共同形成即C16，C17位之间还通过氧桥相连；
R7选自4-10个碳的杂环基；
R8、R9分别独立选自H、含1-6个碳的烷基；
R5选自H、F或Cl；
优选的，所述糖皮质激素衍生物D选自：
经过大量摸索和研究发现，当抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)结构中选择17-单丙酸倍氯米松、去异丁基环索奈德等糖皮质激素片段时，在稳定性、内吞作用或抗炎活性等方面无法达到本发明提供的ADC的效果。本发明提供的ADC是基于糖皮质激素、连接子、抗体或其抗原结合片段及偶联比等共同作用才能达到的效果，每一部分的微小变化可能直接影响ADC的性能，导致活性和药效发生较大变化。
进一步的，所述L1-L2-D选自：
进一步的，所述式(I)所示的化合物选自：
/>
/>
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段；
n为1-8的整数或小数，优选n为3-6的整数或小数。进一步的，所述式(I)所示的化合物选自：
/>
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段；
n为3-6的整数或小数，优选n为4-6的整数或小数。进一步的，所述式(I)所示的化合物选自：
/>
/>
/>
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段；
进一步的，所述式(I)所示的化合物选自：
/>
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段。
本发明还包括与抗TNF-α抗体基本上同源的变体和等同物。这些可以含有例如保守取代突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。例如，保守取代指的是一种氨基酸被同一大类中的另一种氨基酸取代，例如一种酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸取代，一种碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸取代，或者一种中性氨基酸被另一种中性氨基酸取代。保守氨基酸取代的意图在本领域中是众所周知的。
进一步的，所述抗体Ab选自抗TNF-α抗体。
进一步的，所述抗体Ab选自阿达木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗。还包含阿达木单抗、英利昔单抗、赛托珠单抗或戈利木单抗的序列，例如互补决定区、重链结构域和/或轻链结构域。
进一步的，所述抗体Ab选自阿达木单抗。抗TNF-α抗体或其抗原结合片段竞争性抑制阿达木单抗与TNF-α的结合，或与阿达木单抗结合相同的TNF-α表位；或是阿达木单抗或其抗原结合片段。
作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种药物组合物，包含上述抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物和任选的一种或多种惰性载体和/或稀释剂。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了上述抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或上述药物组合物在制备治疗糖皮质激素受体介导的相关疾病药物中的用途。
进一步的，所述疾病选自炎性疾病或自身免疫性疾病。
进一步的，所述疾病选自类风湿关节炎、炎性肠病、银屑病、强直性脊柱炎、大疱性天疱疮、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、干燥综合征和化脓性汗腺炎。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)可以显著影响糖皮质激素介导的信号通路的激活水平，从而产生显著的抗炎活性；具有良好的血浆稳定性，可以避免糖皮质激素分子在体循环中的提前释放；具有良好的内吞能力和人溶酶体裂解能力，可以实现ADC的靶向吸收及糖皮质激素小分子的快速释放，从而提高疗效。在小鼠接触性超敏反应模型和大鼠类风湿关节炎模型中，显示出优异的抗炎活性，显著优于阿达木单抗及对照组。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ADC-II-1的HIC-HPLC谱图；
图2为ADC-II-2的HIC-HPLC谱图；
图3为流式细胞仪平均荧光强度测定结果；
图4为接触性超敏反应模型中耳肿胀厚度变化；
图5为接触性超敏反应模型中耳重量变化；
图6为大鼠胶原抗体诱导的关节炎模型中足肿胀的变化。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
“术语”部分
除非另有限定，本发明所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本发明相似或等同的任何方法和材料测试本发明，但本发明描述了优选的方法和材料。描述和要求本发明时，依据以下定义使用下列术语。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条重链和两条轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。根据免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链根据恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
术语“抗TNF-α蛋白”是指能够(1)结合至TNF-α和(2)抑制可溶性TNF-α与细胞表面TNF-α受体的结合和/或在补体的存在下体外裂解表达表面TNF-α或TNF-α受体的细胞的蛋白。在一些实施例中，抗TNF抗体可以与细胞表面上的TNF-α受体结合并且被内化。抗TNF-α蛋白包括抗TNF-α抗体(例如，阿达木单抗、英利昔单抗、赛托珠单抗和戈利木单抗)。抗TNF-α抗体在与单核细胞来源的DC上的跨膜TNF受体结合时主动内化，并迅速进入溶酶体，并在溶酶体中降解。
术语“抗TNF-α抗体”或“与TNF-α结合的抗体”是指能够例如以足够的亲和力结合TNF-α的抗体，使得该抗体可用作靶向TNF-α的治疗剂。
术语“偶联物”、“抗体药物偶联物”或“ADC”是指与蛋白质如细胞结合剂(例如抗TNF-α抗体)缀合的化合物或其衍生物。
单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体(鼠源抗体)、嵌合性单克隆抗体(嵌合抗体)、人源化单克隆抗体(人源化抗体)和全人源单克隆抗体。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能用鼠制备的抗体。制备时用特定抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后***表达载体中，最后在真核***或原核***中表达嵌合抗体分子。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。
术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术、转基因小鼠抗体制备技术和单个B细胞抗体制备技术等。
术语“连接子”是指能够将抗TNF-α蛋白(例如抗体)连接至糖皮质激素的化学部分。连接基团可能易于裂解，从而促进糖皮质激素的释放。例如，在糖皮质激素和/或抗体保持活性的条件下，此类可裂解的连接基团可能易受肽酶诱导的裂解的影响。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。
术语“表达载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，表达载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，表达载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本发明的表达载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Streptococcuspneumoniae)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染宿主细胞。一种现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的N端位点。阳性的克隆在生物反应器的培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
术语“肽”是指介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成，是蛋白质的结构与功能片段。
术语“糖皮质激素”是指与糖皮质激素受体相互作用的天然存在的或合成的类固醇激素，并且本发明详细地公开了具体的糖皮质激素。“糖皮质激素的基团”是通过从母体糖皮质激素中去除一个或多个氢原子而得到的。氢原子的去除促进了母体糖皮质激素与连接基团的连接。
术语“异双功能基团”是指连接连接基团和抗TNF-α蛋白(例如抗体)的化学部分。异双官能基团被表征为在化学部分的任一端具有不同的反应性基团。
术语“药物/抗体比率”、“偶联比”或“DAR”是指与Ab(例如抗体)连接的D(例如糖皮质激素或其衍生物)的数目。因此，在具有通式(D-L-)n-Ab的偶联物中，DAR由每抗体药物偶联物的载药量定义，例如“n”。
当提及具有代表个体偶联物的式(D-L-)n-Ab的化合物时，术语“化合物DAR”是指与个体Ab连接的D的数目(例如，载药量或n为1至10的整数)。
当提及具有代表偶联物的群体的式(D-L-)n-Ab的化合物时，术语“群体DAR”是指与Ab连接的D的平均数目(例如，载药量或n为1至10±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1的整数或小数)。
术语“受试者”是指人类、非人灵长类动物等，它们将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本发明中参考人类受试者可互换使用。
偶联物的“有效量”是足以实现明确描述的目的的量。“有效量”可以相对于所述目的来确定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的偶联物的量。“预防有效量”是指有效达到期望的预防结果的量。
诸如“治疗(treating、treatment或to treat)”或“缓解(alleviating或toalleviate)”的术语是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理状况或病症的一种或多种症状和/或减缓或停止所诊断的病理状况或病症的进展的治疗措施(“治疗性治疗”)。因此，需要治疗性治疗的受试者包括已经被诊断患有或怀疑患有所述病症的受试者。预防或防止措施是指预防目标病理状况或病症的发展的措施(“预防性治疗”)。因此，需要预防性治疗的受试者包括易于患有病症的受试者和要防止所述病症的受试者。
阿达木单抗描述于美国专利号6258562中，将其通过引用以其整体并入本文。英利昔单抗描述于美国专利号5656272中，将其通过引用以其整体并入本文。赛托珠单抗在WO01/94585中进行了讨论，将其通过引用以其整体并入本文。戈利木单抗在WO2013/087912中进行了讨论，并且序列提供在GenBank：DI496971.1和GenBank：DI496970.1中，将其各自通过引用以其整体并入本文。
示例性抗TNF-α抗体或其抗原结合片段的序列提供在下中。
可变重链CDR氨基酸序列：
可变轻链CDR氨基酸序列：
重链氨基酸序列：
轻链氨基酸序列：
/>
为了完成本发明的合成目的，本发明采用了如下的合成技术方案：
实施例I
实施例1.1N-((10S)-10-苯基-1-((6aR,7S,8aS,8bS,11aR)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-酰基-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-6-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(L-01)的合成
第一步
将N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酸(4.3g,12.13mmol)，四氢呋喃150mL，甲苯40mL加入反应瓶中，加入吡啶(1.6mL,19.8mmol)，四醋酸铅(6.53g,14.7mmol)，加热至70℃，反应10小时。反应完毕，冷却至室温，抽滤，乙酸乙酯淋洗滤饼。减压浓缩有机相，粗品通过硅胶柱层析分离纯化(正己烷/乙酸乙酯＝1/1)得到(2-(9H-芴甲氧羰基氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯3.4g，收率：76.1％。MS m/z(ESI)：391.2[M+Na]+
第二步
将(2-(9H-芴甲氧羰基氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯(0.12g,0.33mmol)，布***(0.22g,0.5mmol)，二氯甲烷20mL加入到反应瓶中，加入吡啶对甲苯磺酸盐(42mg,0.17mmol)，加热至40℃，反应24小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物1a 0.1g，收率：40％。MS m/z(ESI)：739.6[M+H]+
第三步
将化合物1a(90mg,0.12mmol)，N,N-二甲基甲酰胺4mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(22μL,0.15mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物1b 53mg，收率：85％。MS m/z(ESI)：517.4[M+H]+
第四步
将N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酰-L-苯丙氨酸(73mg,0.15mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(17mg,0.15mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(37mg,0.19mmol)，N,N-二甲基甲酰胺5mL加入到反应瓶中，室温反应1小时。加入化合物1b(50mg,0.1mmol)，N,N-二异丙基乙胺(32μL,0.19mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmolNH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物1c53mg，收率：55％。MS m/z(ESI)：1000.7[M+H]+
第五步
将化合物1c(50mg,0.05mmol)，N,N-二甲基甲酰胺5mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(9μL,0.06mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物1d 33mg，收率：85％。MS m/z(ESI)：778.5[M+H]+
第六步
将6-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(12mg,0.058mmol)，N,N-二甲基甲酰胺2mL加入反应瓶中，加入化合物1d(30mg,0.039mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(15mg,0.077mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(6.6mg,0.058mmol)，N,N-二异丙基乙胺(12μL,0.077mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-01 24mg，收率：65％。MS m/z(ESI)：969.6[M-H]-
实施例1.2N-((10S)-10-苯基-1-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17R)-2-氯-6,9-二氟-11,17-二羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-6-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(L-02)的合成
第一步
将(2-(9H-芴甲氧羰基氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯(0.12g,0.33mmol)，卤米松(0.22g,0.5mmol)，二氯甲烷20mL加入到反应瓶中，加入吡啶对甲苯磺酸盐(42mg,0.17mmol)，加热至40℃，反应24小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物2a 0.12g，收率：48％。MS m/z(ESI)：775.2[M+Na]+
第二步
将化合物2a(0.1g,0.13mmol)，N,N-二甲基甲酰胺4mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(24μL,0.16mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物2b 60mg，收率：85％。MS m/z(ESI)：531.2[M+H]+
第三步
将N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酰-L-苯丙氨酸(71mg,0.14mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(16mg,0.14mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(37mg,0.19mmol)，N,N-二甲基甲酰胺5mL加入到反应瓶中，室温反应1小时。加入化合物2b(50mg,0.094mmol)，N,N-二异丙基乙胺(32μL,0.19mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmolNH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物2c40mg，收率：42％。MS m/z(ESI)：1036.3[M+Na]+
第四步
将化合物2c(50mg,0.05mmol)，N,N-二甲基甲酰胺5mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(9μL,0.06mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物2d 33mg，收率：85％。MS m/z(ESI)：814.5[M+Na]+
第五步
将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(13mg,0.062mmol)，N,N-二甲基甲酰胺2mL加入反应瓶中，加入化合物2d(33mg,0.04mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(16mg,0.083mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(7.2mg,0.062mmol)，N,N-二异丙基乙胺(14μL,0.083mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-02 18mg，收率：45％。MS m/z(ESI)：983.5[M-H]-
实施例1.3N-((10S)-10-苯基-1-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-酰基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d]][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-03)的合成
第一步
将(2-(9H-芴甲氧羰基氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯(0.1g,0.27mmol)，氟轻松(0.14g,0.31mmol)，二氯甲烷5mL加入到反应瓶中，加入吡啶对甲苯磺酸盐(35mg,0.14mmol)，加热至40℃，反应24小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物3a 100mg，收率：48.7％。MS m/z(ESI)：783.7[M+Na]+
第二步
将化合物3a(0.1g,0.13mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(26μL,0.17mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物3b 65mg，收率：92.8％。MS m/z(ESI)：561.1[M+Na]+
第三步
将N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酰-L-苯丙氨酸(0.12g,0.24mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(21mg,0.18mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(35mg,0.18mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，室温反应1小时。加入化合物3b(65mg,0.12mmol)，N,N-二异丙基乙胺(60μL,0.36mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmolNH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物3c43mg，收率：35％。MS m/z(ESI)：1044.3[M+Na]+
第四步
将化合物3c(43mg,0.042mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(10μL,0.066mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物3d 30mg，收率：89.3％。MS m/z(ESI)：800.3[M+H]+
第五步
将化合物3d(30mg,0.038mmol)，2,5-二酰基吡咯烷基1-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-酰基-7,10,13,16-四氧杂-4-氮杂十九酸酯(35mg,0.068mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入N,N-二异丙基乙胺(20μL,0.12mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-03 18.2mg，收率：40％。MS m/z(ESI)：1196.4[M-H]-
实施例1.4N-((10S)-10-苯基-1-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-二氟-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基-1-(6-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-04)的合成
第一步
将6-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(0.79g,3.73mmol)，叔丁基1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酸酯(1g,3.11mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.8g,4.7mmol)，N,N-二异丙基乙胺(1mL,6.22mmol)，二氯甲烷30mL加入反应瓶中。降温至0℃，反应2小时，升至室温反应过夜。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到叔丁基22-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-酰基-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二酸酯1.0g，收率：65％。MS m/z(ESI)：515.4[M+H]+
第二步
将叔丁基22-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-酰基-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二酸酯(0.8g,1.55mmol)，二氯甲烷10mL加入反应瓶中，降温至0℃，缓慢滴加5mL三氟乙酸，升至室温，反应过夜。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到22-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-酰基-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二酸0.52g，收率：73％。MS m/z(ESI)：459.4[M+H]+
第三步
将22-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-酰基-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二酸(0.5g,1mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(0.14g,1.2mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(0.29g,1.5mmol)，4-二甲氨基吡啶(12mg,0.1mmol)，二氯甲烷20mL加入到反应瓶中，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到2,5-二酰基吡咯-1-基22-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-酰基-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二酸酯0.34g，收率：62％。MS m/z(ESI)：556.4[M+H]+
第四步
将(2-(9H-芴甲氧羰基氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯(0.37g,1mmol)，二氟可龙(0.59g,1.5mmol)，二氯甲烷20mL加入到反应瓶中，加入吡啶对甲苯磺酸盐(0.12g,0.5mmol)，加热至40℃，反应24小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物4a 0.24g，收率：35％。MSm/z(ESI)：725.4[M+Na]+
第五步
将化合物4a(0.24g,0.34mmol)，N,N-二甲基甲酰胺4mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(62μL,0.41mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物4b 0.14g，收率：88％。MS m/z(ESI)：481.3[M+H]+
第六步
将N-芴甲氧羰基-甘氨酰-甘氨酰-L-苯丙氨酸(0.22g,0.44mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(50mg,0.44mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(0.11g,0.58mmol)，N,N-二甲基甲酰胺5mL加入到反应瓶中，室温反应1小时。加入化合物4b(0.14g,0.29mmol)，N,N-二异丙基乙胺(96μL,0.58mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物4c 0.15g，收率：55％。MS m/z(ESI)：986.4[M+Na]+
第七步
将化合物4c(0.15g,0.15mmol)，N,N-二甲基甲酰胺5mL加入到反应瓶中，加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(28μL,0.19mmol)，降温至0℃，反应1小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物4d 0.1g，收率：88％。MS m/z(ESI)：764.3[M+Na]+
第八步
将化合物4d(0.1g,0.13mmol)，2,5-二酰基吡咯-1-基22-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-酰基-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二酸酯(0.11g,0.2mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入N,N-二异丙基乙胺(67μL,0.4mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-04 51mg，收率：32％。MS m/z(ESI)：1180.6[M-H]-
实施例1.5N-((10S)-10-苯基-1-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-酰基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d]][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(6-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-05)的合成
第一步
参照实施例1.3中第一步的制备方法制备化合物3a。
第二步
参照实施例1.3中第二步的制备方法制备化合物3b。
第三步
参照实施例1.3中第三步的制备方法制备化合物3c。
第四步
参照实施例1.3中第四步的制备方法制备化合物3d。
第五步
将化合物3d(30mg,0.038mmol)，2,5-二酰基吡咯-1-基22-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-酰基-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二酸酯(31mg,0.056mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入N,N-二异丙基乙胺(19μL,0.11mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：PhenomenexC18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-05 21mg，收率：45％。MS m/z(ESI)：1238.7[M-H]-
实施例1.6N-((10S)-10-苯基-1-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17R)-2-氯-6,9-二氟-11,17-二羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-06)的合成
第一步
参照实施例1.2中第一步的制备方法制备化合物2a。
第二步
参照实施例1.2中第二步的制备方法制备化合物2b。
第三步
参照实施例1.2中第三步的制备方法制备化合物2c。
第四步
参照实施例1.2中第四步的制备方法制备化合物2d。
第五步
将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(21mg,0.061mmol)，N,N-二甲基甲酰胺2mL加入反应瓶中，加入化合物2d(24mg,0.03mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(18mg,0.094mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(7mg,0.061mmol)，N,N-二异丙基乙胺(15μL,0.093mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-06 21.4mg，收率：63.7％。MS m/z(ESI)：1117.3[M-H]-
实施例1.7N-((10S)-10-苯基-1-((6aR,7S,8aS,8bS,11aR)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-酰基-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-07)的合成
第一步
参照实施例1.1中第二步的制备方法制备化合物1a。
第二步
参照实施例1.1中第三步的制备方法制备化合物1b。
第三步
参照实施例1.1中第四步的制备方法制备化合物1c。
第四步
参照实施例1.1中第五步的制备方法制备化合物1d。
第五步
将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(0.14g,0.4mmol)，N,N-二甲基甲酰胺6mL加入反应瓶中，加入化合物1d(0.15g,0.19mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(0.12g,0.6mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(46mg,0.4mmol)，N,N-二异丙基乙胺(0.1mL,0.6mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-07 46mg，收率：10.4％。MS m/z(ESI)：1105.5[M+H]+
实施例1.8N-((10S)-10-苯基-1-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17S)-6,9-二氟-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-08)的合成
第一步
参照实施例1.4中第四步的制备方法制备化合物4a。
第二步
参照实施例1.4中第五步的制备方法制备化合物4b。
第三步
参照实施例1.4中第六步的制备方法制备化合物4c。
第四步
参照实施例1.4中第七步的制备方法制备化合物4d。
第五步
将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(90mg,0.26mmol)，N,N-二甲基甲酰胺4mL加入反应瓶中，加入化合物4d(0.1g,0.13mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(77mg,0.4mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(30mg,0.26mmol)，N,N-二异丙基乙胺(40μL,0.4mmol)，室温反应5小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-08 50mg，收率：36％。MS m/z(ESI)：1067.6[M-H]-
实施例1.9(2S)-2-(2-(2-(2-溴乙酰胺)乙酰胺)乙酰胺)-N-(2-(((2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-酰基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d]][1,3]二氧戊环-8b-基)-2-酰基乙氧基)甲基)氨基)-2-酰基乙基)-3-苯基丙酰胺(L-09)的合成
第一步
参照实施例1.3中第三步的制备方法制备化合物3c。
第二步
参照实施例1.3中第四步的制备方法制备化合物3d。
第三步
将化合物3d(25mg,0.031mmol)，全氟苯基2-溴乙酯(14mg,0.047mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入N,N-二异丙基乙胺(15μL,0.09mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-09 8.9mg，收率：31％。MS m/z(ESI)：920.3[M+H]+
实施例1.10(2S)-2-(2-(2-(2-(2-溴乙酰胺)乙酰胺)乙酰胺)乙酰胺)-N-(2-(((2-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17R)-2-氯-6,9-二氟-11,17-二羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-2-酰基乙氧基)甲基)氨基)-2-酰基乙基)-3-苯基丙酰胺(L-10)的合成
第一步
将甘氨酸(63mg,0.85mmol)，溴乙酸2,5-二酰基吡咯烷-1-基酯(0.2g,0.85mmol)，二氯甲烷20mL加入到反应瓶中，室温反应一小时，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(0.2mL,1.3mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到2,5-二酰基吡咯烷-1-基(2-溴乙酰基)甘氨酸酯0.16g，收率：65％。MS m/z(ESI)：293.1[M+H]+
第二步
参照实施例1.2中第三步的制备方法制备化合物2c。
第三步
参照实施例1.2中第四步的制备方法制备化合物2d。
第四步
将化合物2d(35mg,0.04mmol)，2,5-二酰基吡咯烷-1-基(2-溴乙酰基)甘氨酸酯(19mg,0.066mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入N,N-二异丙基乙胺(15μL,0.09mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-10 14mg，收率：32％。MS m/z(ESI)：967.2[M-H]-
实施例1.11N-((10S)-10-苯基-1-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-酰基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d]][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-6-(2-溴乙酰胺)己酰胺(L-11)的合成
第一步
参照实施例1.3中第三步的制备方法制备化合物3c。
第二步
参照实施例1.3中第四步的制备方法制备化合物3d。
第三步
将化合物3d(25mg,0.031mmol)，全氟苯基6-(2-溴乙酰胺)己酸酯(20mg,0.047mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入N,N-二异丙基乙胺(15μL,0.09mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmol NH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-11 11mg，收率：35％。MS m/z(ESI)：1033.4[M+H]+
实施例1.12N-((10S)-10-苯基-1-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR)-2,6b-二氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-酰基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d]][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(2-溴乙酰胺)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-12)的合成
第一步
将1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷酸(0.22g,0.85mmol)，溴乙酸2,5-二酰基吡咯烷-1-基酯(0.2g,0.85mmol)，二氯甲烷20mL加入到反应瓶中，室温反应一小时，加入N,N-二异丙基碳二亚胺(0.2mL,1.3mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmolNH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到2,5-二酰基吡咯烷-1-基1-溴-2-酰基-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷酸酯0.22g，收率：54％。MS m/z(ESI)：483.1[M+H]+
第二步
参照实施例1.3中第三步的制备方法制备化合物3c。
第三步
参照实施例1.3中第四步的制备方法制备化合物3d。
第四步
将化合物3d(50mg,0.06mmol)，2,5-二酰基吡咯烷-1-基1-溴-2-酰基-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷酸酯(45mg,0.09mmol)，N,N-二甲基甲酰胺3mL加入到反应瓶中，加入N,N-二异丙基乙胺(31μL,0.19mmol)，室温反应3小时。反应完毕，反应液减压浓缩，粗品通过高效液相色谱法纯化(色谱柱：Phenomenex C18 5μm 21.2×250mm，流动相：A-水(10mmolNH4OAc)；B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集相应组分，减压浓缩，得到化合物L-1217mg，收率：24％。MS m/z(ESI)：1165.4[M-H]-
实施例1.13N-((10S)-10-苯基-1-((6aR,7S,8aS,8bR)-7-羟基-6a,8a-二甲基-4-酰基-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d]][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-13)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为布***，制备得到化合物L-13MSm/z(ESI)：1174.4[M-H]-。
实施例1.14N-((10S)-10-苯基-1-((6aS,6bR,7S,8aS,8bR)-6b-氟-7-羟基-6a,8a,10,10-四甲基-4-酰基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氢-8bH-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d]][1,3]二氧戊环-8b-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-14)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为曲安奈德，制备得到化合物L-14MSm/z(ESI)：1178.4[M-H]-。
实施例1.15N-((10S)-10-苯基-1-((9R,10S,11S,13S,16R,17R)-9-氟-11,17-二羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-15)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为***，制备得到化合物L-15MSm/z(ESI)：1136.4[M-H]-。
实施例1.16N-((10S)-10-苯基-1-((9R,10S,11S,13S,16S,17R)-9-氟-11,17-二羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基))-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-16)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为倍他米松，制备得到化合物L-16MSm/z(ESI)：1136.4[M-H]-。
实施例1.17N-((10S)-10-苯基-1-((6S,10R,11S,13S,17R)-11,17-二羟基-6,10,13-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基))-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-17)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为甲泼尼龙，制备得到化合物L-17MSm/z(ESI)：1118.4[M-H]-。
实施例1.18N-((10S)-10-苯基-1-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17R)-2-氯-6,9-二氟-11,17-二羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-18)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为卤米松，制备得到化合物L-18MSm/z(ESI)：1188.3[M-H]-。
实施例1.19N-((10S)-10-苯基-1-((6S,9R,10S,11S,13S,16R,17R)-6,9-二氟-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基)-1,6,9,12,15-五酰基-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六烷基)-1-(3-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基酰胺(L-19)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为二氟可龙，制备得到化合物L-19MSm/z(ESI)：1138.4[M-H]-。
实施例1.20(6S,9R,10S,11S,13S,16R,17R)-17-((S)-10-苯基-36-(2,5-二酰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,9,12,15,18,34-六氧杂-3,21,24,27,30-五氧杂-5,8,11,14,17,33-六氮杂三十六烷基)-6,9-二氟-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-酰基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊基[a]菲-17-基呋喃-2-羧酸酯(L-20)的合成
参考实施例1.3中的制备方法，将氟轻松替换为17-糠酸酯双氟美松，制备得到化合物L-20MS m/z(ESI)：1248.4[M-H]-。
实施例II∶ADC偶联方法
通用方法1：马来酰亚胺偶联制备ADC
向阿达木单抗(40mM磷酸盐，2mM EDTA缓冲液pH7.0±0.1，10mg/mL)中加入2～2.5摩尔当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)溶液(10mM)，充分混匀后于37℃反应120min。还原反应产物直接进入偶联反应，不进行TCEP的去除。向反应液中加入8摩尔当量含马来酰亚胺偶联基团的L-D溶液(DMSO，10mg/mL，D是糖皮质激素药物，L是连接子)，25℃反应120min后，加入12摩尔当量L-半胱氨酸溶液(10mM)终止反应。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去未反应的小分子和潜在的聚集体，并使用30kDa超滤管将缓冲体系置换为20mM磷酸缓冲液(pH6.5)。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，pH6.5，-80℃保存备用。
通用方法2：硫代琥珀酰亚胺水解制备ADC
向由马来酰亚胺偶联制得的ADC PBS缓冲液中缓慢加入0.7M精氨酸(pH 9.0)溶液，使总精氨酸浓度达到50mM。然后将混合物在25℃下孵育72小时，通过添加0.1M乙酸溶液来猝灭水解。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去潜在的聚集体，并使用30kDa超滤管将缓冲体系置换为20mM磷酸缓冲液(pH6.5)。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，pH6.5，-80℃保存备用。
通用方法3：通过卤代烷偶联制备ADC
向阿达木单抗(40mM磷酸盐，2mM EDTA缓冲液pH7.0±0.1，10mg/mL)中加入2摩尔当量的TCEP·HCl溶液(10mM)，充分混匀后于37℃反应120min。还原反应产物直接进入偶联反应，不进行TCEP的去除。向反应液中加入8摩尔当量含卤代烷偶联基团的D-L溶液(DMSO，10mg/mL，D是糖皮质激素药物，L是连接子)，25℃反应120min后，加入12摩尔当量L-半胱氨酸溶液(10mM)终止反应。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去未反应的小分子和潜在的聚集体，并使用30kDa超滤管将缓冲体系置换为20mM磷酸缓冲液(pH6.5)。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，pH6.5，-80℃保存备用。
实施例II-1:
按照通用方法1所述方法，向6.0mL阿达木单抗(40mM磷酸盐，2mM EDTA缓冲液pH7.0±0.1，10mg/mL，405nmol)中加入90μL TCEP·HCl溶液(10mM，900nmol)，充分混匀后于37℃反应120min。向反应液中加入实施例1.1中的化合物L-01的DMSO溶液314μL(10mg/mL，3.24μM)，25℃反应120min后，加入L-半胱氨酸溶液486μL(10mM，4.86μM)终止反应。
使用HITRAP CM FF阳离子色谱柱除去未反应的小分子和潜在的聚集体，色谱纯化条件如下：
色谱柱：HITRAP CM FF色谱柱(品牌：GE)；
Buffer A：20mM pH6.5磷酸盐缓冲液；
Buffer B：20mM pH6.5磷酸盐缓冲液+500mM NaCl溶液；
洗脱方法：先用Buffer A冲洗色谱柱，将样品用40mM L-组氨酸盐酸盐(pH5.5)稀释至3倍体积进样；以0～100％的Buffer B溶液线性梯度洗脱，收集紫外吸收大于50mAU的洗脱液，最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，制得实施例ADC-II-1(2mg/ml，21mL)，-80℃保存备用。
抗体-糖皮质激素偶联物的偶联比(DAR)是采用疏水作用色谱(HIC-HPLC)检测而得的。ADC-II-1的HIC-HPLC谱图见图1，该异质混合物含有附接有零个D-L分子(“E0”峰)、附接有两个D-L分子(“E2”峰)、附接有四个D-L分子(“E4”峰)、附接有六个D-L分子(“E6”峰)和附接有八个D-L分子(“E8”峰)的抗体)，根据该图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.3。计算公式为：通过将每个峰百分比面积的总和乘以其相应的药物负荷并加和除以100来确定n值，即n＝(0*AE0+2*AE2+4*AE4+6*AE6+8*AE8)/100，其他实施例参照同样的计算方法，不再赘述。
实施例II-2:
按照通用方法1所述方法，向12.0mL阿达木单抗(40mM磷酸盐，2mM EDTA缓冲液pH7.0±0.1，10mg/mL，810nmol)中加入180μL TCEP·HCl溶液(10mM，1800nmol)，充分混匀后于37℃反应120min。向反应液中加入化合物L-03的DMSO溶液778μL(10mg/mL，7.78μM)，25℃反应120min后，加入L-半胱氨酸溶液972μL(10mM，9.72μM)终止反应。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去未反应的小分子和潜在的聚集体，色谱条件见实施例II-1的纯化条件。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，制得实施例ADC-II-2(2mg/mL，48mL)，-80℃保存备用。
ADC-II-2的HIC-HPLC谱图见图2，根据该图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为5.5。
实施例II-3:
按照通用方法1所述方法，向12.0mL阿达木单抗(40mM磷酸盐，2mM EDTA缓冲液pH7.0±0.1，10mg/mL，810nmol)中加入180μL TCEP·HCl溶液(10mM，1800nmol)，充分混匀后于37℃反应120min。向反应液中加入实施例1.8中的化合物L-08的DMSO溶液692μL(10mg/mL，6.48μM)，25℃反应120min后，加入L-半胱氨酸溶液972μL(10mM，9.72μM)终止反应。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去未反应的小分子和潜在的聚集体，色谱条件见实施例II-1的纯化条件。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，制得实施例ADC-II-3(2mg/ml，44mL)，-80℃保存备用。
根据ADC-II-3的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.3。
实施例II-4:
按照通用方法2所述方法，向实施例ADC-II-2 20mL(2mg/mL)中缓慢加入1.4mL0.7M精氨酸溶液，使总精氨酸浓度达到50mM，然后将混合物在25℃下孵育72小时，通过添加1.0mL0.1M乙酸溶液来猝灭水解反应。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去潜在的聚集体，色谱条件见实施例II-1的纯化条件。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，制得ADC-II-4(2mg/ml，16.5mL)，-80℃保存备用。
根据ADC-II-4的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为5.3。
实施例II-5:
按照通用方法3所述方法，向6.0mL阿达木单抗(40mM磷酸盐，2mM EDTA缓冲液pH7.0±0.1，10mg/mL，405nmol)中加入90μL TCEP·HCl溶液(10mM，900nmol)，充分混匀后于37℃反应120min。向反应液中加入实施例1.12中的化合物L-12的DMSO溶液378μL(10mg/mL，3.24μM)，25℃反应120min后，加入L-半胱氨酸溶液486μL(10mM，4.86μM)终止反应。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去未反应的小分子和潜在的聚集体，色谱条件见实施例II-1的纯化条件。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，制得ADC-II-5(2mg/ml，25.5mL)，-80℃保存备用。
根据ADC-II-5的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.9。
实施例II-6:
按照通用方法3所述方法，向8.0mL阿达木单抗(40mM磷酸盐，2mM EDTA缓冲液pH7.0±0.1，10mg/mL，538nmol)中加入120μL TCEP·HCl溶液(10mM，1200nmol)，充分混匀后于37℃反应120min。向反应液中加入实施例1.11中的化合物L-11的DMSO溶液444μL(10mg/mL，4.31μM)，25℃反应120min后，加入L-半胱氨酸溶液646μL(10mM，6.46μM)终止反应。使用HITRAP CM FF阳离子柱除去未反应的小分子和潜在的聚集体，色谱条件见实施例II-1的纯化条件。最后将超滤收集液体系调整为20mM磷酸缓冲液，制得ADC-II-6(2mg/ml，32.0mL)，-80℃保存备用。
根据ADC-II-6的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.0。
实施例II-7:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-13，制备得到化合物ADC-II-7(2mg/mL，42.5mL)。
根据ADC-II-7的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为5.1。
实施例II-8:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-14，制备得到化合物ADC-II-8(2mg/mL，45.0mL)。
根据ADC-II-8的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为5.5。
实施例II-9:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-15，制备得到化合物ADC-II-9(2mg/mL，41.3mL)。
根据ADC-II-9的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.9。
实施例II-10:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-16，制备得到化合物ADC-II-10(2mg/mL，39.6mL)。
根据ADC-II-10的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为5.0。
实施例II-11:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-17，制备得到化合物ADC-II-11(2mg/mL，42.0mL)。
根据ADC-II-11的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.7。
实施例II-12:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-18，制备得到化合物ADC-II-12(2mg/mL，46.2mL)。
根据ADC-II-12的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.9。
实施例II-13:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-19，制备得到化合物ADC-II-13(2mg/mL，42.0mL)。
根据ADC-II-13的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为5.3。
实施例II-14:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-20，制备得到化合物ADC-II-14(2mg/mL，36.50mL)。
根据ADC-II-14的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.5。
实施例II-15:
参照实施例II-1的制备方法，将化合物L-01替换为化合物L-02，制备得到化合物ADC-II-15(2mg/mL，40.3mL)。
根据ADC-II-15的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.3。
实施例II-16:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-04，制备得到化合物ADC-II-16(2mg/mL，40.3mL)。
根据ADC-II-16的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.6。
实施例II-17:
参照实施例II-2的制备方法，将化合物L-03替换为化合物L-05，制备得到化合物ADC-II-17(2mg/mL，38.7mL)。
根据ADC-II-17的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为5.1。
实施例II-18:
参照实施例II-3的制备方法，将化合物L-08替换为化合物L-06，制备得到化合物ADC-II-18(2mg/mL，44.0mL)。
根据ADC-II-18的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.7。
实施例II-19:
参照实施例II-3的制备方法，将化合物L-08替换为化合物L-07，制备得到化合物ADC-II-19(2mg/mL，44.3mL)。
根据ADC-II-19的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为3.9。
实施例II-20:
参照实施例II-4的制备方法，将ADC-II-2替换为ADC-II-3，制备得到化合物ADC-II-20(2mg/mL，20.6mL)。
根据ADC-II-20的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.0。
实施例II-21:
参照实施例II-6的制备方法，将化合物L-11替换为化合物L-09，制备得到化合物ADC-II-21(2mg/mL，45.8mL)。
根据ADC-II-21的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.5。
实施例II-22:
参照实施例II-6的制备方法，将化合物L-11替换为化合物L-10，制备得到化合物ADC-II-22(2mg/mL，37.3mL)。
根据ADC-II-22的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.4。
对照实施例:
对照实施例1.1
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参考WO2019106609实施例7的制备方法制备对照ADC4。
根据ADC4的HIC-HPLC图谱峰面积计算得到平均抗体偶联比n为4.2。
实施例III∶生物学评价
ADC-II-1～ADC-II-22磷酸缓冲液：20mM磷酸缓冲溶液，2mg/ml，-80℃保存备用。
对照ADC4：20mM磷酸缓冲溶液，2mg/ml，-80℃保存备用。
阿达木单抗注射液：修美乐，40mg/0.8ml，艾伯维，批号15107XH23。
实施例3-1：抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)在膜结合型TNF-α介导的GRE报告基因***中的活性
3.1.1供试品
ADC-II-1～ADC-II-14组磷酸缓冲液和对照ADC4磷酸缓冲液。
3.1.2分组及剂量设置
分别设置ADC-II-1～ADC-II-14组和对照ADC4组，各ADC组的给药剂量设置为1000.0，200.0，40.0，8.0，1.6，0.32，0.064，0.013nM。
3.1.3试验方法
使用慢病毒稳定转染MMTV-Luc报告基因的Hela细胞购自ECACC公司(货号：HeLa/MMTV-Luc)。为了产生跨膜TNF-α报告细胞，将稳转Hela-MMTV-Luc细胞种于96孔板，每孔种30000个细胞，使用Lipo3000按试剂说明书的方法，转染人TNF-α突变质粒(TNF-αΔ1～12，去除TACE的酶切位点)。12小时后与不同浓度的ADC孵育，24h后按照荧光素酶检测试剂盒说明，用多功能酶标仪读发光信号值，对数据进行处理，拟合得到EC50值。
3.1.4试验结果
表1在膜结合型TNF-α介导的GRE报告基因***中的活性
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结果显示：ADC-II-1～ADC-II-14组均具有影响细胞GRE激活水平的能力，可以影响糖皮质激素介导的信号通路的激活水平。
本发明其他ADC化合物(ADC-II-15～ADC-II-22)在相同试验条件下，均具有影响细胞GRE激活水平的能力(EC50在0.1-3nM之间)，在此不再赘述。
实施例3-2：抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)在脂多糖(LPS)诱导细胞因子释放中的活性
3.2.1供试品
ADC-II-1～ADC-II-14磷酸缓冲液、对照ADC4磷酸缓冲液、阿达木单抗注射液(修美乐，40mg/0.8ml，艾伯维，批号15107XH23)。
3.2.2分组及剂量设置
分别设置培养基空白组、PBMC细胞对照组、ADC-II-1～ADC-II-14组、对照ADC4组和阿达木单抗组，各ADC组及阿达木单抗组的给药剂量设置为1000.0，333.3，111.1，37.0，12.4，4.1，1.4ng/mL。
3.2.3试验方法
原代人外周血单核细胞(PBMC)(购自Lonza)在50ml磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤，重悬于5％DMSO的胎牛血清(FBS)中，等分并在液氮中冷冻保存。将PBMC解冻，重悬于有2％FBS和1％青霉素链霉素的细胞培养基(如RPMI细胞培养基)中，并且接种于96孔板中。然后细胞在37℃和5％CO2条件下与50μL不同浓度ADC及阿达木单抗共同孵育4小时。加入100ng/mL脂多糖(LPS)，培养箱中培养24h后收集上清液，1000rpm离心5分钟，将离心得到的上清液直接转移到另一个96孔板中，用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Immunoway公司)按照制造商的说明测定培养液上清中IL-1β含量，对数据进行处理，拟合得到IC50值。抑制LPS刺激PBMC细胞因子释放活性见表2。
3.2.4试验结果
表2抑制LPS刺激PBMC细胞因子释放活性
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结果显示：ADC-II-1～ADC-II-14组均具有影响PBMC细胞释放细胞因子的能力，如IL-1β等。
本发明其他ADC化合物(ADC-II-15～ADC-II-22)在相同试验条件下，均具有影响PBMC细胞释放细胞因子的能力(IC50(IL-1β)在10-300ng/ml之间)。
实施例3-3：抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)在膜结合型TNF-α高表达细胞中的内吞能力测定
3.3.1供试品
ADC-II-1～ADC-II-6磷酸缓冲液、对照ADC4磷酸缓冲液、阿达木单抗注射液(修美乐，40mg/0.8ml，艾伯维，批号15107XH23)。
3.3.2分组及剂量设置
分别设置空白组(未转染hTNF基因的K562细胞株)、ADC-II-1～ADC-II-6组、对照ADC4组和阿达木单抗组，各ADC组及阿达木单抗组的给药剂量设置为3μg/mL。
3.3.3试验方法
本试验采用hTNF基因过表达的稳转K562细胞株(购自cyagen公司)。使用RPMIMedium1640培养基稀释各ADC组至浓度为12μg/mL作为抗体工作液，将ZenonTM(Invitrogen，批号2365674)稀释25倍作为ZenonTM工作液；各取25μL抗体工作液和ZenonTM工作液，混合，室温孵育5min，形成带标记的复合物。调整K562细胞数量为2×106cells/mL，接种于96孔板，每孔50μL，同时加入50μL带标记的复合物。将96孔板置于37℃培养箱中孵育6-48h，于6h、16h、24h、30h和48h进行流式检测，应用FlowJo软件对平均荧光强度(MFI)进行分析。
3.3.4试验结果
流式细胞仪平均荧光强度测定结果如图3所示。
结果显示：由图3可知，ADC-II-1～ADC-II-6组、对照ADC4组和阿达木单抗组在6h、16h、24h、30h平均荧光强度(MFI)均高于空白组，表明其在K562细胞中具有内吞作用；其中ADC-II-2～ADC-II-6组(24h时平均荧光强度是空白组的1.9～2.2倍)显著强于ADC-II-1组和对照ADC4组(24h时平均荧光强度是空白组的1.3～1.5倍)。
本发明其他ADC化合物(ADC-II-7～ADC-II-22)在相同试验条件下，在K562细胞中孵育24h时平均荧光强度是空白组的1.9～2.2倍，优于对照ADC4组和ADC-II-1组的1.3～1.5倍。
实施例3-4：抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)在血浆中的稳定性
3.4.1供试品
分别取2mg/mL的ADC-II-1～ADC-II-6磷酸缓冲液作为工作液，冰上放置使用。
3.4.2试验方法
分别取人、大鼠(肝素钠抗凝)980μL(n＝2)于37℃预孵育5min，加入25μL各供试品，涡旋混匀(化合物终浓度50μg/mL)，于37℃孵育。分别于1天、3天、7天、14天、21天、28天取50μL孵育样品置于已加入100μL冰甲醇的EP管，涡旋灭活，采集后的样品于-60～-90℃冰箱保存，采用LC-MS/MS方法检测糖皮质激素的释放。
3.4.3试验结果
表3在不同血浆中的释放
结果表明：在50μg/mL的浓度下，ADC-II-2～ADC-II-6组在人、大鼠血浆中孵育28天显示出良好的稳定性，游离糖皮质激素均小于检测下限。ADC-II-1组在人、大鼠血浆中孵育14天后有明显的游离糖皮质激素释放。
本发明其他ADC化合物(ADC-II-7～ADC-II-22)在相同试验条件下，在人、大鼠血浆中孵育28天均显示出良好的稳定性，游离糖皮质激素均小于检测下限。
实施例3-5：抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)在人溶酶体中糖皮质激素分子的释放
3.5.1供试品
分别取2mg/mL的ADC-II-1～ADC-II-6磷酸缓冲液、对照ADC4磷酸缓冲液作为工作液，冰上放置使用。
50mM醋酸钠缓冲液：称取409mg醋酸钠加入100mL超纯水中溶解混匀，使用浓盐酸调节pH值至5.18，混匀，2～8℃保存。
2mM TCEP 50mM醋酸钠缓冲液：称取5.93mg TCEP·HCl(购自TCI公司，批号：5TJLE-QP)溶解于10.37mL 50mM醋酸钠缓冲液中，现用现配。
3.5.2试验方法
2mM TCEP 50mM醋酸钠缓冲液中加入人溶酶体(购自XENOTECH，批号：2010245)配制0.125mg/mL的人溶酶体溶液，37℃预孵育5min后，加入50μg/mL的供试品，继续孵育，在0、1、2、4、8、24h时，分别从反应体系中取50μL反应液加至已提前加入100μL冰甲醇的EP管中立即涡旋终止反应。应用LC-MS/MS法检测糖皮质激素的释放。
阴性对照组为ADC孵育体系中不加入人溶酶体，用等体积缓冲液代替，分别于0、1、2、4、8、24h取样分析。
3.5.3试验结果
表4在人溶酶体中的释放
结果显示：在50μg/mL的浓度下，ADC-II-2～ADC-II-6组在人溶酶体中孵育24h，可以释放50～95％的游离糖皮质激素，而ADC-II-1组和对照ADC4组在同等孵育条件下仅能释放10～30％的游离糖皮质激素。
本发明其他ADC化合物(ADC-II-7～ADC-II-22)在相同试验条件下，均可以释放50～95％的游离糖皮质激素。
实施例3-6：抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)在接触性超敏反应模型中的生物活性测定
3.6.1实验动物
雄性balb/c小鼠，6周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养环境∶SPF。
3.6.2供试品
ADC-II-1～ADC-II-5磷酸缓冲液、对照ADC4磷酸缓冲液、阿达木单抗注射液(修美乐，40mg/0.8ml，艾伯维，批号15107XH23)。
3.6.3试验方法
试验动物到达后适应性饲养7天，随机分组(10只/组)。实验开始前1天，小鼠腹部去毛约3×3cm2，在第0天和第1天于去毛部位涂抹0.5％DNFB(2，4二硝基氟苯，以4:1丙酮橄榄油配制)溶液50μL对小鼠进行致敏。各组小鼠分别于第0天和第4天进行腹腔注射给药，给药剂量为10mg/kg。第5天时，于鼠右耳内外侧涂抹0.2％DNFB溶液20μL进行激发。第6天颈椎脱臼处死小鼠，使用打孔器在相同部位取下双侧直径8mm耳片，游标卡尺测厚度，电子天平称重，以左右耳片厚度、重量之差为肿胀度，用于评估抗体-糖皮质激素偶联物的抗炎活性。
以SPSS软件进行统计学分析，计量资料表示为组间比较用One-WayANOVA，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett-t检验，P<0.05差异有统计学意义。
3.6.4试验结果
接触性超敏反应模型中耳肿胀厚度变化及耳重量变化分别见图4和图5。
结果显示：由图4和图5可知，与模型组相比，ADC-II-1～ADC-II-5组均可以显著降低小鼠耳肿胀及耳重量的变化值(P＜0.001)；其中ADC-II-2～ADC-II-5的抑制效果优于ADC-II-1组、阿达木单抗组和对照ADC4组。
本发明其他ADC化合物(ADC-II-6～ADC-II-22)在相同试验条件下，与模型组相比，均可以显著降低小鼠耳肿胀及耳重量的变化值，具有显著性差异(P＜0.01)。
实施例3-7：抗体-糖皮质激素偶联物(ADC)在大鼠胶原抗体诱导的关节炎模型中的生物活性测定
3.7.1实验动物
SD大鼠，雄性，80-100g，动物合格证号：SCXK(京)2019-0010，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养环境∶SPF。
3.7.2供试品
ADC-II-1～ADC-II-5磷酸缓冲液、对照ADC4磷酸缓冲液、阿达木单抗注射液(修美乐，40mg/0.8ml，艾伯维，批号15107XH23)。
3.7.3试验方法
胶原-佐剂乳化液配制：将鸡II型胶原与弗氏完全佐剂等体积混合，在冰水浴中吹打，使溶液彻底乳化，成为稳定的乳化液，最终乳化液中胶原浓度为1.0mg/kg。
将100只大鼠随机分为正常对照组，造模组。正常对照组含10只大鼠，造模组大鼠于左侧后足皮内注射约0.2mL胶原-佐剂乳化液，造模21天后，测量大鼠足肿胀值，待足肿胀体积大于2.50mL时，按照足肿胀值进行随机分组，分为8组，每组10只，分别为模型组、阿达木单抗组、对照ADC4组、ADC-II-1～ADC-II-5组，各给药组单次腹腔注射给药，剂量为10mg/kg。腹腔给药后，每3天利用足肿胀仪按照排水体积法测量各组大鼠左后足及对侧足的足肿胀值，连续观察28天。
足肿胀的变化值计算公式如下：
足肿胀变化值(ΔmL)＝模型组平均足肿胀值-各给药组平均足肿胀值。
以SPSS软件进行统计学分析，计量资料表示为组间比较用One-Way ANOVA，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett-t检验，P<0.05差异有统计学意义。
3.7.4试验结果
大鼠胶原抗体诱导的关节炎模型中足肿胀的变化值见图6。
结果显示：由图6可知，与模型组相比，ADC-II-2～ADC-II-5组可以显著降低大鼠足肿胀，药效可持续28天(P＜0.001)；阿达木单抗组、ADC-II-1组和对照ADC4组在0-12天之内可以降低大鼠足肿胀，12天之后抑制活性逐渐减弱；ADC-II-2～ADC-II-5组的足肿胀抑制活性显著优于阿达木单抗组、ADC-II-1组和对照ADC4组。
本发明其他ADC化合物(ADC-II-6～ADC-II-22)在相同试验条件下，与模型组相比，均可以显著降低大鼠足肿胀，药效可持续28天，具有统计学差异(P＜0.05)。
本发明ADC化合物在整个研究过程中动物耐受性良好，安全性可控，展示出正常的体重增加。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.具有式(I)所示的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述式(I)的结构式如下：
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段；
L1选自：
m为1-8的整数，p为1-8的整数，s为1-6的整数；
L2不存在，或选自
r为1-6的整数，q为1-8的整数；
D为具有式(II)所示的糖皮质激素衍生物：
糖皮质激素衍生物D以21位羟基的氧原子为连接部位，式(II)中，
R1选自H或F或Cl；
R2选自H、甲基或F；
R3、R4分别独立选自H、OH、含1-6个碳的烷基、OR6、OCOR7，或R3和R4共同形成即C16，C17位之间还通过氧桥相连；
其中，R6选自H或含1-6个碳的烷基或卤素取代的烷基；
R7选自含1-6个碳的烷基、含2-6个碳的烯基、含2-6个碳的炔基、含6-10个碳的芳基或含4-10个碳的杂芳基或杂环基；
R8、R9分别独立选自H、含1-6个碳的烷基、含3-10个碳的环烷基、含2-6个碳的烯基、含2-6个碳的炔基、含6-10个碳的芳基、含4-10个碳的杂芳基或杂环基；
卤素选自F或Cl；
R5选自H、F或Cl；
D不可选自，
n为1-8的整数或小数。
2.权利要求1所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述L1-L2选自：
其中，m为1-8的整数，p为1-8的整数，s为1-6的整数，q为1-8的整数，r为1-6的整数。
3.权利要求1或2所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述L1选自：
所述L2不存在，或选自：
4.权利要求1-3任一项所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述L1-L2选自：
5.权利要求1-4任一项所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述糖皮质激素衍生物D中，
R1选自H或F；
R2选自H、甲基或F；
R3、R4分别独立选自H、OH、含1-6个碳的烷基、OCOR7，或R3和R4共同形成即C16，C17位之间还通过氧桥相连；
R7选自4-10个碳的杂环基；
R8、R9分别独立选自H、含1-6个碳的烷基；
R5选自H、F或Cl；
优选的，所述糖皮质激素衍生物D选自：
6.权利要求1-5任一项所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述L1-L2-D选自：
7.权利要求1-6任一项所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述式(I)所示的化合物选自：
/>
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段；
n为1-8的整数或小数，优选n为3-6的整数或小数；
进一步优选的，所述式(I)所示的化合物选自：
/>
/>
/>
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段；
进一步优选的，所述式(I)所示的化合物选自：
/>
其中，Ab为抗TNF-α抗体或其抗原结合片段。
8.权利要求1-7任一项所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述抗体Ab选自抗TNF-α抗体；
优选的，所述抗体Ab选自阿达木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗或戈利木单抗；
进一步优选的，所述抗体Ab选自阿达木单抗。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～8任一项所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物和任选的一种或多种惰性载体和/或稀释剂。
10.根据权利要求1-8任一项所述的抗体-糖皮质激素偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗糖皮质激素受体介导的相关疾病药物中的用途；
优选的，所述疾病选自炎性疾病或自身免疫性疾病；
进一步优选的，所述疾病选自类风湿关节炎、炎性肠病、银屑病、强直性脊柱炎、大疱性天疱疮、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、干燥综合征和化脓性汗腺炎。
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