CN118207322A - 胆汁cfDNA中的HDR信号通路突变在胆管癌预后评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了胆汁cfDNA中的HDR信号通路突变在胆管癌预后评估中的应用。胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的标志物选自SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1、RTEL1中的一种或多种。所述检测胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的试剂包括胆汁cfDNA抽提试剂、胆汁cfDNA文库构建试剂、靶向测序试剂。本发明基于恶性胆管肿瘤患者胆汁为研究样本，采用WGS测序技术分析胆汁cfDNA突变特征与临床预后的相关性，发现HDR信号通路突变是可用于CCA预后评估的液体活检检测手段，SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1和RTEL1这5个HDR信号通路突变基因可作为CCA预后评估的生物标志物。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及胆汁cfDNA中的HDR信号通路突变在胆管癌预后评估中的应用。
背景技术
胆管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是第二大最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，占所有胃肠道癌症的3％，特别是在中国、泰国和韩国等地区，每10万居民中CCA发病率＞6例。由于其早期症状不明显或无特异性临床表征，患者往往在CCA的晚期才被确诊，晚期患者已不适合手术，导致预后较差，5年生存率为7％-20％，即使部分患者能够通过手术干预治疗，肿瘤切除后也很容易复发。肿瘤TNM分期高、切缘阳性、***转移等是影响胆管癌术后生存的高危因素，但这些指标需要影像学或组织标本才能确认。血清癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)也被用于胆管癌的术后监测，但敏感性和特异性较低。尤其是，临床中尚缺乏用于胆管癌预后预测的生物标志物及其检测手段。因此，找到可靠的预后生物标志物对CCA的诊疗具有重要的临床应用价值。
目前影像学、活体刷检、穿刺活检和血清肿瘤标志物检测是诊断胆管癌的主要方法。其中影像学方法主要包括超声检查、CT(计算机断层扫描)、MRI(核磁共振成像)、PCT(经皮肝穿刺胆道造影)、ERCP(内镜下逆行胰胆管造影)等。超声检查是胆管癌的首选检测方法，但是不能区分恶性肿瘤的分期。CT和MRI是胆管癌诊断和分期的主要方式，MRI更能显示肝、胆管的解剖及肿瘤受累范围，但是检测直径小于5mm的肿瘤时效果不佳。ERCP的刷检脱落细胞检查是胆管癌首选的病理学诊断方法，但刷检的敏感性较低，当刷检结果阴性或不能确定时，可以考虑ERCP或超声内镜引导的细针穿刺活检，但容易导致腹腔的感染和肿瘤的扩散转移，目前临床指南不推荐该技术用于胆管癌首次诊断。CEA和CA19-9在胆管癌的诊断、疗效、转移复发监测有一定的意义，与超声检查相结合可以作为高危人群的初步检查手段，但是敏感度和特异度均比较低。
液体活检基于其微创或无创的取样方式、样本用量少、可重复采集等优势，被用于肿瘤疾病的辅助诊断、疗效评估、术后监测、指导临床用药等。血液是液体活检中应用最为广泛的体液类型，但是对于胆管癌来说，胆汁经肝细胞分泌后由胆管转入胆囊内浓缩储存参与整个肝肠循环，能够与肝胆和消化***直接接触，是比血液更优的体液类型。有研究显示胆道癌患者胆汁cfDNA检测体细胞基因突变的敏感性要显著性优于血液cfDNA(PMID：34653800)。对胆汁cfDNA进行靶向深度测序，与肿瘤组织的结果对比发现胆汁cfDNA检测的敏感性和特异性均大于90％(PMID：31173267)。然而，关于胆汁cfDNA全基因组测序的研究是及其缺乏的，限制了从基因组图谱角度揭示CCA疾病进展、早期诊断、术后监测等方面的应用。因此，迫切需要胆汁cfDNA全基因组测序的研究数据，助力CCA在早期诊断、疗效评估、术后检测等生物标志物的临床转化。
发明内容
本发明的目的是，提供胆汁cfDNA中的HDR信号通路突变在胆管癌预后评估中的应用。提供用于CCA预后的液体活检生物标志物，助力CCA的术后治疗，延长CCA患者的存活时间和生存质量。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
检测胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的试剂在制备胆管癌预后评估产品中的应用。
作为优选实施方案，胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的标志物选自SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1、RTEL1中的一种或多种。
作为优选实施方案，所述检测胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的试剂包括胆汁cfDNA抽提试剂、胆汁cfDNA文库构建试剂、靶向测序试剂。关于胆汁cfDNA抽提试剂，本发明采用上海思路迪生物医学科技有限公司建立的适用于胆汁cfDNA的抽提方法3D-BCF，还可采用其他商品化的体液cfDNA抽提试剂盒。关于胆汁cfDNA文库构建试剂，本发明实施例中采用TruSeq Nano DNA Library Prep Kit进行胆汁cfDNA全基因组文库构建，另外还可采用：a.Scale ssDNA-seq lib prer kit for illumina(RK20222,ABclonal)；b.UltraTMII DNA Library Prep Kit for Illumina(#E7645S/#E7103S,NEB)；c.KAPA DNA HyperPrep kit(KK8504，Roche,Switzerland)。靶向测序试剂是针对HDR信号通路的基因进行靶向测序，然后通过与参考序列进行比对，对突变基因进行筛选。常用的靶向测序平台及试剂为：Illumina MiSeqDx仪器搭配MiSeq Reagent Kit v2(MS-102-2003)；ThermoFisher scientific Ion GeneStudio S5System测序仪器搭配Ion 540Chip Kit(A27766)；华大基因MGISEQ-2000测序仪器搭配MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装(1000013857)。
本发明还提供一种胆管癌预后评估试剂盒，该试剂盒包括检测胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的试剂。
作为优选实施方案，所述试剂盒包括cfDNA抽提试剂、胆汁cfDNA文库构建试剂、靶向测序试剂。
作为优选实施方案，所述试剂盒还包括胆汁样本采集试剂，用于采集待测样本的胆汁并进行保存。
作为优选实施方案，所述cfDNA抽提试剂包括胆汁样本前处理试剂、胆汁cfDNA提取试剂。胆汁样本前处理试剂对胆汁样本进行前处理的方法为：将胆汁在4℃条件下1,600g离心10min去除细胞碎片，离心完成后转移胆汁上清至新的1.5mL的离心管中。胆汁上清再次在4℃条件下16,000g离心15min，最后转移上清液，按每管1mL分装于1.5mL离心管中置于-80℃冰箱中保存。
本发明中涉及的英文缩写注释如下：
cfDNA：游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA
CCA：胆管癌
HDR：同源重组(homologous dependent recombination，HDR)通路
SMC5：编码染色体结构维持蛋白SMC5/6复合体中SMC5蛋白的基因
RAD51D：编码DNA修复蛋白Rad51蛋白家族成员的基因
BRCA2：人乳腺癌易感基因2(breast cancer 2,early onset)
TP53BP1：编码肿瘤蛋白p53结合蛋白1的基因
RTEL1：编码DNA解旋酶RTEL1的基因
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1，本发明基于恶性胆管肿瘤患者胆汁为研究样本，抽提胆汁cfDNA，采用Whole-genome sequence二代测序技术检测胆汁cfDNA的单核苷酸变异(SNV)和***缺失突变(Indel)，通过将体细胞突变与来自外部队列(n＝239)的肿瘤组织全外显子组测序结果进行比较，分析胆汁cfDNA突变特征与临床预后的相关性，发现HDR信号通路突变是可用于CCA预后评估的液体活检检测手段。
2，本发明利用Illumina NovaSeq 6000测序平台对胆汁cfDNA文库进行测序，然后先通过与人类参考基因组序列进行比对再以自身白细胞的基因图谱做标椎化，最后对突变基因进行筛选。首次发现胆管癌患者胆汁cfDNA中SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1和RTEL1这5个HDR信号通路突变基因可作为CCA预后评估的液体活检生物标志物。
附图说明
图1是本发明实施例中胆汁cfDNA片段分布特征图。
图2是本发明实施例中胆汁cfDNA全基因组突变特征分析示意图。
图3是本发明实施例中为胆汁cfDNA全基因组突变特征与肿瘤组织对比分析结果示意图。
图4是本发明实施例中10个DNA损伤反应核心通路突变分析结果示意图。
图5是本发明实施例中10个致癌信号通路突变分析结果示意图。
图6是本发明实施例中Cox比例风险模型分析结果示意图。
图7是本发明实施例中HDR通路突变患者的Kaplan-Meier生存曲线分析结果示意图。
图8是本发明实施例中CA19-9蛋白水平与HDR通路突变的分析结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
1)样本来源
选择22例恶性CCA患者，包括4例肝内胆管癌患者、13例肝门部胆管癌患者和5例远端胆管癌患者。患者确诊时的平均年龄是60.5岁(年龄范围是34-75岁)，其中17名患者接受了根治性切除手术，4名患者接受了R1切除术，1名患者接受了R2切除术。其他的临床特征如性别、AJCC肿瘤分期、***转移情况、血清肿瘤标志物浓度见表1。
表1
2)胆汁cfDNA的抽提
22例恶性CCA患者均于术前采集胆汁和血液样本。每位入组的患者于术后给予准确的病理诊断。每个CCA患者胆汁样本在预处理后进行胆汁cfDNA的抽提。
2.1)胆管癌患者胆汁和血液样本前处理
CCA患者胆汁和血液样本在手术前分别收集于10mL游离核酸保存管中(BEAVERCell Free DNA Tubes，43803，China)，室温运送。收到样本后，首先将胆汁和血液在4℃条件下1,600g离心10min去除细胞碎片，离心完成后转移胆汁上清至新的1.5mL的离心管中，离心后血液样本吸取白细胞到1.5mL的离心管中置于-80℃冰箱中保存。胆汁上清再次在4℃条件下16,000g离心15min，最后转移上清液，按每管1mL分装于1.5mL离心管中置于-80℃冰箱中保存。
2.2)胆管癌患者胆汁cfDNA和白细胞gDNA抽提
采用上海思路迪生物医学科技有限公司建立的3D-BCF方法对胆汁cfDNA进行抽提，具体过程为：将胆汁样本从-80℃中取出后，置于37℃水浴锅中至完全融化，随后4℃，16,000g离心5min，吸取0.99mL胆汁上清至新的1.5mL离心管。向792μL商品化裂解液BufferACL(939017，Qiagen，Shanghai，China)中加入5.55μL Carrier RNA(1017647，Qiagen，Shanghai，China)，混匀后取792μL混合液加入到胆汁中，随后加入99μL蛋白酶K(19133，Qiagen，Shanghai，China)，颠倒混匀后，金属浴60℃孵育30min。孵育完成后加入1.782mL沉降试剂Buffer ACB(1069275，Qiagen，Shanghai，China)于-20℃冰箱放置5min促进cfDNA的沉降，得到胆汁混合物。取700μL胆汁混合物加入到QIA-quick吸附柱中(28115，Qiagen，Shanghai，China)，在第一次上样后首先在室温静置5min，随后重复离心操作至所有样本通过吸附柱。向吸附柱中加入500μL Buffer PE(19065，Qiagen，Shanghai，China)，离心洗涤两次。将吸附柱放于新的1.5mL离心管中高速离心去除吸附柱残存的液体。向吸附柱中加入30μL elution buffer(19086，Qiagen，Shanghai，China)，室温孵育3min后，离心洗脱并收集胆汁cfDNA，随后置于-20℃或-80℃冰箱长期保存。
白细胞gDNA的抽提采用DNA Mini kit(51304，Qiagen，Shanghai，China)试剂盒，具体的操作流程参考产品说明书。
3)胆汁cfDNA和白细胞gDNA浓度及片段分布检测
通过Qubit 3.0荧光定量仪及配套的试剂(Q32854，Thermo Fisher，USA)检测胆汁cfDNA和白细胞gDNA的浓度。利用2100分析仪及配套的芯片和试剂(5067-4626，Agilent，USA)分析抽提得到的胆汁cfDNA和白细胞gDNA片段分布，检测具体流程参考试剂盒说明书。参见图1，为胆汁cfDNA片段分布特征图，结果显示，胆汁cfDNA以大片段为主，与已发表文章(PMID：31173267)中胆汁cfDNA的片段分布特征一致。
4)胆汁cfDNA和白细胞gDNA WGS测序和生物信息学分析
胆汁cfDNA和白细胞gDNA先用M220超声打断仪打断成主峰350bp大小，随后文库构建采用TruSeq Nano DNA Library Prep Kit(20015964，Illumina，USA)试剂盒，每个胆汁cfDNA和白细胞gDNA的投入量为400ng，具体的操作流程参考产品说明书。构建好的文库采用Illumina NovaSeq 6000进行双端测序，胆汁cfDNA测序深度为50X，白细胞gDNA测序深度为20X。
使用软件BWA-MEM(Version:0.7.17-r1188)将原始测序数据比对到人类参考基因组(UCSC hg19)，并使用Sentieon Dedup算法(Sentieon-genomics-201911)标记去除重复数据，使用Samtools stats(版本:1.3)对测序数据进行质控分析。以白细胞gDNA样本作为对照组去除假阳性的突变。使用软件Strelka2(版本:2.9.10)检测每个肿瘤/白细胞样本对中体细胞SNVs和INDELs。为了提高INDEL的检测性能，使用Manta(版本:1.6.0)生成的INDEL候选对象运行Strelka2，并使用ANNOVAR(版本日期:2018-04-16)进行注释。最终体细胞变异的筛选依据标准如下：(1)去除白细胞样本(1000Genome Project,ExAC,ESP6500和gnomAD)中等位基因频率(Allele Frequencys，AFs)不小于0.01的位点；(2)总覆盖度≥8，备选等位基因reads≥3；(3)等位基因突变频率≥0.05。
22例恶性CCA患者分离得到的胆汁cfDNA，采用WGS二代测序技术检测胆汁cfDNA的单核苷酸变异(SNV)、***缺失突变(Indel)等突变特征。在22例恶性CCA患者中共检测到46528个突变，在所有突变中，2.19％(1019/46528)发生在外显子区域，这与人类基因组的外显子百分比一致。参见图2，为胆汁cfDNA全基因组突变特征分析示意图。由图2可以看到：TP53是突变频率最高的基因，其次是KRAS，这些突变基因主要发生在TP53信号通路(TP53)、RTK/RAS信号通路(KRAS、ERBB3、SCRIB、RASGRP2、PDGFRA、RASGRF2、NRAS、EGFR和KSR2)、HDR(SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1和RTEL1)、HIPPO(CRB1、FAT1、NF2、LLGL2和WWTR1)、WNT、BER和FA信号通路。参见图3，为胆汁cfDNA全基因组突变特征与肿瘤组织对比分析结果示意图，其中，肿瘤组织样本的数据来自已发表文章(doi:10.1038/ng.3375)的数据，数据被收录在EGA数据库(accession number：EGA00001000950)中。与来自外部队列(n＝239)的肿瘤组织全外显子组测序结果进行比较发现，在两项研究中都发现了10个非沉默突变基因(TP53、KRAS、ARID1B、BRCA2、CACNA1A、ELF3、ERBB3、FLNA、NRAS和SPTA1)。
5)胆汁cfDNA全基因组突变特征和临床预后的相关性分析
将胆汁cfDNA的突变特征采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，并采用log-rank检验比较胆汁cfDNA不同信号通路突变组与临床预后的相关性。
为了确定促进CCA肿瘤发生的相关通路，研究了10个DNA损伤反应核心通路和10个致癌信号通路中的突变基因(SNVs和INDELs)。参见图4和5，图4为10个DNA损伤反应核心通路突变分析结果示意图，图5为10个致癌信号通路突变分析结果示意图。分析结果表明：RTK/RAS是最常见的突变通路(n＝8)，其次是TP53信号通路(n＝6，均为TP53突变)和HDR信号通路(n＝5)。随后通过Cox比例风险模型用于确定与预后相关的临床或遗传特征，参见图6，为Cox比例风险模型分析结果示意图。结果表明：HDR信号通路突变具有较高的危险比(HR＝15.77,95％CI:1.571-158.4)。进一步采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，参见图7，为HDR通路突变患者的Kaplan-Meier生存曲线分析结果示意图。参见图8，为CA19-9蛋白水平与HDR通路突变的分析结果示意图。结果显示，HDR通路突变患者总生存期(OverallSurvival，OS)较差，并且CA19-9蛋白水平较高。
以上分析结果表明：HDR通路突变患者总生存期较差，胆汁cfDNA中HDR信号通路突变可用于胆管癌预后评估。通过检测胆汁cfDNA中SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1和RTEL1的5个HDR信号通路突变基因，可预测胆管癌患者的预后情况。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (8)
1.检测胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的试剂在制备胆管癌预后评估产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的标志物选自SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1、RTEL1中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的试剂包括胆汁cfDNA抽提试剂、胆汁cfDNA文库构建试剂、靶向测序试剂。
4.一种胆管癌预后评估试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括检测胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的试剂。
5.根据权利要求4所述的胆管癌预后评估试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括cfDNA抽提试剂、胆汁cfDNA文库构建试剂、靶向测序试剂。
6.根据权利要求5所述的胆管癌预后评估试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括胆汁样本采集试剂。
7.根据权利要求5所述的胆管癌预后评估试剂盒，其特征在于：所述cfDNA抽提试剂包括胆汁样本前处理试剂、胆汁cfDNA提取试剂。
8.胆汁cfDNA中HDR信号通路突变的标志物SMC5、RAD51D、BRCA2、TP53BP1、RTEL1中的一种或多种在胆管癌预后评估中的应用。
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