CN118207288A - 一种唾液快速尿酸检测试纸、其制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种唾液快速尿酸检测试纸、其制备及检测方法，所述唾液快速尿酸检测试纸包括酶、酶稳定剂、液体扩散控制剂和显色物质。本发明能够无创，实时监测患者尿酸的浓度，有利于患者对自身健康状态及时把控并及早发现病情，选择最佳治疗时机。本产品在制作工艺上简单，且成本较低，能够进行大规模批量生产。本发明为辅助判断血清尿酸浓度，动态监测尿酸含量提供一个高效、便捷、经济的方法。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种唾液快速尿酸检测试纸、其制备及检测方法。
背景技术
尿酸是一种含有碳、氮、氧、氢的杂环化合物，分子式为C5H4N4O3，分子量为168.1103g/mol。尿酸是嘌呤代谢的终产物，体内尿酸的生成量和***量不平衡，会导致血尿酸升高，引起高尿酸血症，以及由此所引发的痛风、高血压、心血管和肾脏疾病等症状。高尿酸血症在早期阶段无明显症状，因此需要早期预警和诊断高尿酸血症和痛风等，尤其是对于高风险人群，临床建议终生监测、定期筛查。目前，临床对于尿酸浓度的检测方法主要是通过有创采血，存在患者依从性较差的问题，特别是对需要动态检测尿酸的患者更是难以实现。
唾液作为口腔腺体分泌的一种重要的生物流体物质，唾液的成份与其它器官存在互相作用关系，当机体发生某种疾病时，唾液中某些成分会随之发生变化。因此，唾液作为一种诊断性体液，已经被引起重视。唾液具有无创、采取方便等优点，且成年人每日能够产生1～1.5L的唾液量，满足患者频繁检测的要求。实验数据表明，唾液中的尿酸与血液中的尿酸浓度显著正相关。因此，唾液尿酸可以作为临床诊断高尿酸血症和痛风的标志物。
现有技术中提供了血尿酸检测试纸，该血尿酸检测试纸需微量指尖血，即可在几分钟内检测出血液中尿酸浓度，但血尿酸检测试纸需与微型手持式仪器联用，操作较为不便，且是有创操作；还有部分现有技术提供了一种检测唾液中尿酸水平的生物传感***，相比与市售的常规传感器，该传感器显示出高选择性、高灵敏性和稳定性，但传感器检测平台操作较为复杂，同时也不利于适用人群的便携式检测；另一部分现有技术提供一种用于快速检测唾液尿酸的检测试纸，但显色稳定性以及显色时效性有待探究。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种唾液快速尿酸检测试纸、其制备及检测方法。为了克服现有技术中有创的血尿酸含量检测，本发明意在提供一种检测唾液尿酸的试纸，从而克服现有方法中有创、操作复杂、价格昂贵等缺点，同时满足高尿酸血症患者实时监测尿酸浓度的需求。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“Britton-Robinson缓冲溶液”是指：由磷酸、硼酸和醋酸混合合成的广域缓冲溶液。
术语“Tetronic 1307”是指：聚氧乙烯型两性离子表面活性。
术语“Triton X-100”是指：聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子型表面活性剂。
术语“Tween-20”是指：聚氧乙烯山梨醇酯，一种非离子型去污剂。
术语“Tween-80”是指：失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，由失水山梨醇单油酸酯与环氧乙烷聚合而成，是一种亲水性的表面活性剂。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种唾液快速尿酸检测试纸，所述唾液快速尿酸检测试纸包括酶、酶稳定剂、液体扩散控制剂和显色物质；其中，
所述酶包括尿酸酶、过氧化物酶和维生素C氧化酶；和/或
所述显色物质包括显色剂和显色辅助剂。
根据本发明第一方面的唾液快速尿酸检测试纸，其中，
所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶或过氧化氢酶；
所述显色剂选自以下两种或多种：3，3，5，5-四甲基联苯胺、4-氨基安替比林、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、邻苯二胺盐酸盐，优选选自以下两种或多种：4-氨基安替比林、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠；最优选为4-氨基安替比林和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐；和/或
所述显色辅助剂为2，3-二氯-5-三氟甲基吡啶。
根据本发明第一方面的唾液快速尿酸检测试纸，其中，
所述酶稳定剂为牛血清白蛋白；和/或
所述液体扩散控制剂选自以下一种或多种：聚乙二醇200、Tetronic 1307、TritonX-100、Tween-20、Tween-80、聚乙烯吡咯烷酮，优选为聚乙二醇200、Triton X-100、Tween-20、Tween-80、聚乙烯吡咯烷酮，最优选为聚乙二醇200。
根据本发明第一方面的唾液快速尿酸检测试纸，其中，所述唾液快速尿酸检测试纸还包括缓冲底液、明胶和聚乙烯醇溶液；
优选地，所述缓冲底液选自以下一种或多种：Britton-Robinson缓冲溶液、PBS、Tirs-HCl，最优选为Britton-Robinson缓冲溶液。
本发明的第二方面提供了制备第一方面所述的唾液快速尿酸检测试纸的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将缓冲底液注入培养皿中，在依次加入各原料，混匀；
(2)向步骤(1)中加入明胶溶液，浸泡试纸并烘干；
(3)将步骤(2)中烘干的试纸浸泡到聚乙烯醇溶液中，烘干裁剪即得所述唾液快速尿酸检测试纸。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中：所述原料包括尿酸酶、过氧化物酶、维生素C氧化酶、显色剂、显色辅助剂、酶稳定剂和/或液体扩散控制剂；
优选地，所述缓冲底液的用量为3～15mL，更优选为3～10mL，进一步优选为5～8mL，最优选为5mL；
优选地，所述尿酸酶的浓度为10～500U，更优选为20～300U，进一步优选为30～100U，最优选为50U；
优选地，所述过氧化物酶的浓度为1000～3000U，更优选为1000～2500U，进一步优选为1500～2000U，最优选为1800U；
优选地，所述维生素C氧化酶的浓度为5～50U，更优选为5～30U，进一步优选为5～20U，最优选为10U；
优选地，当显色剂为4-氨基安替比林和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐时，所述4-氨基安替比林的用量为2～10mg，更优选为2～8mg，进一步优选为2～6mg，最优选为4.06mg；所述N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的用量为5～20mg，更优选为5～15mg，进一步优选为8～13mg，最优选为11.8mg；和/或
优选地，所述显色辅助剂的用量为5～15mg，更优选为7.5～15mg，进一步优选为7.5～10mg，最优选为9mg。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(2)中还包括：制备明胶溶液，使用前将明胶溶液煮沸；
优选地，所述滤纸的浸泡时间为20～30小时，更优选为20～25小时，最优选为24小时；
优选地，所述烘干的温度为20～35℃，更优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或
优选地，所述烘干的时间为10～50分钟，更优选为20～40分钟，最优选为30分钟。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(3)中：
所述聚乙烯醇溶液的浓度为5～50mg/mL，优选为5～30mg/mL，更优选为5～20mg/mL，最优选为10mg/mL；
所述浸泡到聚乙烯醇溶液中的时间为1～10分钟，优选为1-8分钟，更优选为2～5分钟，最优选为2分钟；
所述烘干的温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或
所述烘干的时间为10～50分钟，优选为20～40分钟，最优选为30分钟。
本发明的第三方面提供了一种唾液快速尿酸检测的方法，所述方法使用第一方面所述的唾液快速尿酸检测试纸或根据第二方面所述的方法制备的唾液快速尿酸检测试纸进行唾液尿酸检测。
根据本发明第三方面的唾液快速尿酸检测的方法，其中，所述唾液快速尿酸检测的方法具体包括以下步骤：
(a)将唾液滴加到试纸的检测区域，静置；
(b)待颜色稳定后肉眼观察试纸颜色，并将试纸颜色与标准比色卡对照，得出唾液尿酸含量范围。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明的唾液快速尿酸检测试纸的制备方法如下：
原材料：whatman试纸，尿酸，尿酸酶，辣根过氧化物酶，胆红素氧化酶，碳酸锂，4-氨基安替比林，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，2，3-二氯-5-三氟甲基吡啶购自Macklin，维生素C氧化酶，聚乙二醇-200购自上海源叶生物科技有限公司，牛血清白蛋白，明胶购自sigma，聚乙烯醇购自上海迈瑞尔化学技术有限公司，Britton-Robinson pH＝8.0购自青岛捷世康生物科技有限公司。
所述显色物质4-氨基安替比林与N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐能够通过氧化偶合反应，形成非常稳定的紫色染料。
用移液枪取5mL Britton-Robinson缓冲溶液加入培养皿中，依次向培养皿中添加50U尿酸酶，1800U辣根过氧化物酶，10U维生素C氧化酶，50mg牛血清白蛋白，500μL聚乙二醇-200，4.06mg4-氨基安替比林，11.8mgN-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，9mg 2，3-二氯-5-三氟甲基吡啶，然后加入375μL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)，之后将试纸正面朝下浸泡在溶液中，30℃水浴24h后，用烘箱30℃烘干。将上述烘干的试纸再浸泡到50mL 10mg/mL聚乙烯醇溶液中，再次30℃烘箱干燥完全后，将试纸剪切成1cm×1.5cm的试纸后用于唾液尿酸的检测。未使用的试纸真空封装后避光保存于-20℃冰箱中。
本产品的工作原理：唾液样本中的尿酸能够在尿酸酶的作用下催化氧化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢；过氧化氢进一步在辣根过氧化物酶的作用下，与显色物质4-氨基安替比林(4-AAP)和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)生成紫色醌亚胺化合物，该产物色度和唾液中的尿酸含量成正比，因此，可以通过颜色的深浅反映唾液尿酸的浓度。
本产品的使用方法：将新鲜唾液直接滴加到试纸的检测区域，静置待颜色稳定后通过肉眼直接观测试纸颜色，并将试纸颜色与标准比色卡对照，得出唾液尿酸含量范围。
本发明提供了一种唾液快速尿酸检测试纸、其制备及检测方法，所述唾液快速尿酸检测试纸包括酶、酶稳定剂、液体扩散控制剂和显色物质。本发明能够无创，实时监测患者尿酸的浓度，有利于患者对自身健康状态及时把控并及早发现病情，选择最佳治疗时机。本产品在制作工艺上简单，且成本较低，能够进行大规模批量生产。本发明为辅助判断血清尿酸浓度，动态监测尿酸含量提供一个高效、便捷、经济的方法。
本发明的唾液快速尿酸检测试纸便于实时监测尿酸含量的高低，对患者的健康检查提供一定的指导意义。作为临床了解患者尿酸浓度的实用性产品。作为临床评价患者尿酸浓度的辅助性工具。作为大规模乡镇居民的疾病筛查和检测。
本发明的唾液快速尿酸检测试纸可以具有但不限于以下有益效果：
1、本发明的唾液快速尿酸检测试纸能够无创，实时监测患者尿酸的浓度，有利于患者对自身健康状态及时把控并及早发现病情，选择最佳治疗时机。
2、本发明的唾液快速尿酸检测试纸操作流程简单，节省了工序，可大规模制备。
3、本发明为辅助判断血清尿酸浓度，动态监测尿酸含量提供一个高效、便捷、经济的方法。可用于实时监测尿酸浓度，并能够在临床上作为快速了解患者尿酸浓度的辅助产品。
4.所述显色物质4-氨基安替比林与N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐能够通过氧化偶合反应，形成非常稳定的紫色染料，进而满足试纸稳定显色的需求。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例2中唾液快速尿酸检测试纸有效性的测试结果图。
图2示出了实施例2中唾液快速尿酸检测试纸色度(RGB-R)与尿酸浓度的关系图。
图3示出了实施例3中唾液快速尿酸检测试纸的效果图。
图4示出了实施例3中唾液快速尿酸检测试纸色度(RGB-R)与尿酸浓度的关系图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
材料：
滤纸Whatman 3号，购自Whatman公司。
试剂：
尿酸，尿酸酶，辣根过氧化物酶，胆红素氧化酶，碳酸锂，4-氨基安替比林，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，2，3-二氯-5-三氟甲基吡啶均购自Macklin公司。
维生素C氧化酶，聚乙二醇-200，均购自上海源叶生物科技有限公司。
牛血清白蛋白，明胶，均购自sigma公司。
聚乙烯醇，购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。
Britton-Robinson pH＝8.0，购自青岛捷世康生物科技有限公司。
实施例1
本实施例用于说明本发明的唾液快速尿酸检测试纸的制备方法。
(1)用移液枪取5mL Britton-Robinson缓冲溶液加入培养皿中，依次向培养皿中添加50U尿酸酶，1800U辣根过氧化物酶，10U维生素C氧化酶，50mg牛血清白蛋白，500μL聚乙二醇-200，4.06mg4-氨基安替比林，11.8mgN-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，9mg 2，3-二氯-5-三氟甲基吡啶混匀混匀。
(2)再加入375μL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)，之后将试纸正面朝下浸泡在溶液中，30℃水浴24h后，用30℃烘箱烘30分钟至完全干燥。
(3)将上述烘干的试纸再浸泡2分钟到50mL 10mg/mL聚乙烯醇溶液中，再次30℃烘箱烘30分钟干燥完全后，将试纸剪切成1cm×1.5cm的试纸后用于唾液尿酸的检测。未使用的试纸真空封装后避光保存于-20℃冰箱中。
实施例2
本实施例用于说明本发明的唾液快速尿酸检测试纸的有效性。
配制浓度依次为0，100，325，750μM的尿酸溶液用以测试试纸条的有效性。(1600μmol/L尿酸标准贮备液：取60mg碳酸锂，溶解在40mL蒸馏水中，在60℃水浴箱中加热使其完全溶解。精确称取尿酸26.9mg，溶解于热碳酸锂溶液中，冷却至室温，转入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，之后稀释至相应浓度进行检测，其于溶液保存于棕色瓶中备用)。
将试纸条显色区域浸泡在尿酸溶液中5s后，拿出并静置，等待试纸颜色变化稳定后读取结果。通过图1可以看出，随着尿酸浓度的逐渐增加，试纸条显色区域的颜色逐渐由白色变为紫色，且紫色越来越重。说明本发明的唾液快速尿酸检测试纸有效。
实施例3
本实施例用于说明本发明的唾液快速尿酸检测试纸的效果。
1600μmol/L尿酸标准贮备液：取60mg碳酸锂，溶解在40mL蒸馏水中，在60℃水浴箱中加热使其完全溶解。精确称取尿酸26.9mg，溶解于热碳酸锂溶液中，冷却至室温，转入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，之后稀释至相应浓度进行检测，其于溶液保存于棕色瓶中备用。
将上述尿酸标准贮备液放入唾液中，并用唾液分别稀释至0，100，325，750μM。取试纸条将显色区域浸泡在唾液尿酸中5s，拿出并静置，等待试纸颜色变化稳定后读取结果。通过图3可以看出，当唾液尿酸浓度逐渐升高时，试纸条显色区域的紫色越来越重。说明本发明的唾液快速尿酸检测试纸有效。
对比例1
本实施例用于对比本发明的唾液快速尿酸检测试纸和其他尿酸检测试纸。
表1本发明的唾液快速尿酸检测试纸和其他尿酸检测试纸的对比
由表1可知，本发明选择颜色响应非常稳定的显色剂4-氨基安替比林和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，维生素C氧化酶以及胆红素氧化酶的加入克服假阳性结果，PEG-200增加酶的稳定和均一度以及体系的，极大的提高了试纸的准确度和显色时间，实现了适用人群实时检测尿酸含量的需求。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (10)
1.一种唾液快速尿酸检测试纸，其特征在于，所述唾液快速尿酸检测试纸包括酶、酶稳定剂、液体扩散控制剂和显色物质；其中，
所述酶包括尿酸酶、过氧化物酶和维生素C氧化酶；和/或
所述显色物质包括显色剂和显色辅助剂。
2.根据权利要求1所述的唾液快速尿酸检测试纸，其特征在于：
所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶或过氧化氢酶；
所述显色剂选自以下两种或多种：3，3，5，5-四甲基联苯胺、4-氨基安替比林、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、邻苯二胺盐酸盐，优选选自以下两种或多种：4-氨基安替比林、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠；最优选为4-氨基安替比林和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐；和/或
所述显色辅助剂为2，3-二氯-5-三氟甲基吡啶。
3.根据权利要求1或2所述的唾液快速尿酸检测试纸，其特征在于：
所述酶稳定剂为牛血清白蛋白；和/或
所述液体扩散控制剂选自以下一种或多种：聚乙二醇200、Tetronic 1307、Triton X-100、Tween-20、Tween-80、聚乙烯吡咯烷酮，优选为聚乙二醇200、Triton X-100、Tween-20、Tween-80、聚乙烯吡咯烷酮，最优选为聚乙二醇200。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的唾液快速尿酸检测试纸，其特征在于，所述唾液快速尿酸检测试纸还包括缓冲底液、明胶和聚乙烯醇溶液；
优选地，所述缓冲底液选自以下一种或多种：Britton-Robinson缓冲溶液、PBS、Tirs-HCl，最优选为Britton-Robinson缓冲溶液。
5.制备权利要求1至4中任一项所述的唾液快速尿酸检测试纸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将缓冲底液注入培养皿中，在依次加入各原料，混匀；
(2)向步骤(1)中加入明胶溶液，浸泡试纸并烘干；
(3)将步骤(2)中烘干的试纸浸泡到聚乙烯醇溶液中，烘干裁剪即得所述唾液快速尿酸检测试纸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中：所述原料包括尿酸酶、过氧化物酶、维生素C氧化酶、显色物质、显色辅助剂、酶稳定剂和/或液体扩散控制剂；
优选地，所述缓冲底液的用量为3～15mL，更优选为3～10mL，进一步优选为5～8mL，最优选为5mL；
优选地，所述尿酸酶的浓度为10～500U，更优选为20～300U，进一步优选为30～100U，最优选为50U；
优选地，所述过氧化物酶的浓度为1000～3000U，更优选为1000～2500U，进一步优选为1500～2000U，最优选为1800U；
优选地，所述维生素C氧化酶的浓度为5～50U，更优选为5～30U，进一步优选为5～20U，最优选为10U；
优选地，当显色剂为4-氨基安替比林和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐时，所述4-氨基安替比林的用量为2～10mg，更优选为2～8mg，进一步优选为2～6mg，最优选为4.06mg；所述N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的用量为5～20mg，更优选为5～15mg，进一步优选为8～13mg，最优选为11.8mg；和/或
优选地，所述显色辅助剂的用量为5～15mg，更优选为7.5～15mg，进一步优选为7.5～10mg，最优选为9mg。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括：制备明胶溶液，使用前将明胶溶液煮沸；
优选地，所述滤纸的浸泡时间为20～30小时，更优选为20～25小时，最优选为24小时；
优选地，所述烘干的温度为20～35℃，更优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或
优选地，所述烘干的时间为10～50分钟，更优选为20～40分钟，最优选为30分钟。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中：
所述聚乙烯醇溶液的浓度为5～50mg/mL，优选为5～30mg/mL，更优选为5～20mg/mL，最优选为10mg/mL；
所述浸泡到聚乙烯醇溶液中的时间为1～10分钟，优选为1-8分钟，更优选为2～5分钟，最优选为2分钟；
所述烘干的温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或
所述烘干的时间为10～50分钟，优选为20～40分钟，最优选为30分钟。
9.一种唾液快速尿酸检测的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1至4中任一项所述的唾液快速尿酸检测试纸或根据权利要求5至8中任一项所述的方法制备的唾液快速尿酸检测试纸进行唾液尿酸检测。
10.根据权利要求9所述的唾液快速尿酸检测的方法，其特征在于，所述唾液快速尿酸检测的方法具体包括以下步骤：
(a)将唾液滴加到试纸的检测区域，静置；
(b)待颜色稳定后肉眼观察试纸颜色，并将试纸颜色与标准比色卡对照，得出唾液尿酸含量范围。
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