CN118207111A - 一株生物防治菌及其在制备植物病原菌防治剂方面的应用 - Google Patents
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Abstract
一株生物防治菌及其在制备植物病原菌防治剂方面的应用，属于农业微生物学技术领域。该菌株已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2023年6月29日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231143，分类命名为Klebsiella grimontii DR11。该菌株可用于制备植物病原菌防治剂，特别是用于制备大豆根腐病防治剂。DR11菌株发酵液对大豆根腐病病菌的抑制率为72.27％，对大豆根腐病预防试验中防治效果为70.84％，对大豆根腐病的治疗效果为62.71％，与目前使用化学合成农药防治相比，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景和良好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一株生物防治菌及其在制备植物病原菌防治剂方面的应用。
背景技术
大豆根腐病是一种分布广、危害重、致病的病原菌种类多、防治比较困难的世界性的大豆病害，该病害会导致大豆早期的缺苗断垄和后期的早衰，在整个大豆生长期均可发生，发病严重时可直接导致整个植株死亡，对大豆产量和品种危害严重。其中大豆根腐病主要是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)所引起的。
长期以来，防治大豆根腐病的主要方法是施用化学农药，然而长期使用化学农药会产生耐药性、农药残留、环境污染、抑制大豆的结瘤和氮的固定等问题。因此，为了防治大豆根腐病，迫切需要寻找一种环境友好、低毒的新方法。微生物农药与化学农药相比，具有选择性强、无污染、不易产生抗药性、不破坏生态环境和有效防治植物病害等优点，目前生防菌现已成为研究热点。
研究表明，防治大豆根腐病的生防菌株主要是芽孢杆菌菌属(Bacillus sp.)和木霉菌属(Trichoderma sp.)。因此，迫切需要探索和分离更多在土壤中广泛存在、生长迅速的有益微生物，以防治大豆根腐病(Fusarium oxysporum)。
克雷伯菌属(Klebsiella sp.)在农业上的应用比较广泛，主要有固氮、溶磷、解钾、产生铁载体和IAA等能力，具有作物增产、促进植物生长等作用，并且产生相关作用的菌株可发酵成绿色菌肥用于实际生产。因此，生物防治克雷伯菌属及其制剂在植物病害绿色防控中具有广阔的应用前景。现有研究报道克雷伯菌属可提高玉米植株的抗病能力，可用来防治植物的病害等。
目前，用于防治大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的克雷伯菌属(Klebsiellasp.)鲜有报道。因此，本发明为寻找新的菌株用于大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的防治提供了较大的理论和实践基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株生物防治菌，该生物防治菌的保藏编号为CCTCCNO：M 20231143，分类命名为：Klebsiella grimontii DR11。
本发明的另一个目的在于提供了上述生物防治菌在制备植物病原菌防治剂方面的应用，特别是在制备大豆根腐病(Fusarium oxysporum)防治剂方面的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明所述的生物防治菌Klebsiella grimontii DR11分离自吉林省长春市吉林农业大学教研基地大豆田根际土壤，该菌株已送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2023年6月29日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231143，分类命名为Klebsiellagrimontii DR11，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武汉大学(430072)。菌落特性：菌落呈乳白色、表面粘稠光滑、湿润、有轻微光泽，不透明(图1)。
进一步，可以利用Klebsiella grimontii DR11菌株制备植物病原菌防治剂，所述的植物病原菌包括但不限于：大豆根腐病(Fusarium oxysporum)、大豆菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、大豆拟茎点霉茎枯病(Phomopsis longicolla)、玉米茎腐病(Fusarium graminearum)、玉米炭疽病(Colletotrichum graminicola)、玉米小斑病(Bipolaris maydis)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea)。
利用本发明提供的生物防治菌Klebsiella grimontii DR11可有效抑制大豆上重要病原菌的生长，且抑制效果较好，避免了化学防治对环境和作物安全的潜在不良影响。与目前使用化学合成农药防治相比，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景和良好的实际应用价值。
附图说明
图1为DR11菌株菌落特点示意图(LB，30℃，16h)；
图2为DR11菌株扫描电镜图(LB，30℃，16h)；
图3为DR11菌株***发育树(基于16S rDNA序列)；
图4为DR11菌株的生长曲线(LB，30℃，72h)，横坐标为培养时间(h)，纵坐标为OD600nm；
图5为DR11菌株与大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的对峙培养示意图(PDA，25℃,7d；A为对照组，B为实验组)；
图6为DR11菌株与多种病原菌的对峙培养示意图(PDA，25℃,7d；AB表示大豆菌核病、CD大豆拟茎点霉茎枯病、EF表示玉米茎腐病、GH玉米炭疽病、IJ表示玉米小斑病、KL番茄灰霉病；其中ACEGIK为对照组、BDFHJL为实验组)；
图7为不同浓度DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用曲线(PDA，25℃,7d)，横坐标为PDA培养基中生防菌DR11菌液浓度(cfu/mL)，纵坐标分别为大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌落直径(cm)和不同浓度DR11菌株对大豆根腐病(Fusariumoxysporum)的抑制率(％)；
图8为不同浓度DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌丝生长量的抑制作用曲线(PDA，25℃,7d)；横坐标为PDA培养基中的DR11菌液浓度(cfu/mL)，纵坐标分别为大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的菌丝干重(mg)和不同浓度生防菌DR11对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制率(％)；
图9为不同浓度DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌丝形态的影响结果照片(PDA，25℃,7d；A：正常生长下，大豆根腐(Fusarium oxysporum)病原菌菌丝生长的形态；BCD：利用不同浓度DR11菌株处理后的大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌丝生长的形态)；
图10为不同浓度DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)孢子产生量的抑制作用曲线(PDA，25℃,7d)，横坐标为PDA培养基中的生防菌DR11菌液浓度(cfu/mL)，纵坐标分别为大豆根腐病(Fusarium oxysporum)孢子产生数目和不同浓度生防菌DR11对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制率(％)；
图11为DR11菌株在不同温度下对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用曲线(PDA，25℃,7d)，横坐标为不同温度(℃)，纵坐标分别为不同温度下生防菌DR11的OD600nm值及不同温度下生防菌DR11对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制率(％)；
图12为DR11菌株在不同pH下对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用曲线(PDA，25℃,7d)，横坐标为不同温度(℃)，纵坐标分别为不同pH下，生防菌DR11的OD600nm值及生防菌DR11对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制率(％)。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明实施例所涉及的技术方案，如未特别说明，均为本领域常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：Klebsiella grimontii DR11(DR11菌株)的分离鉴定及生物学特性分析一、菌株的分离及其生物学特性分析
从吉林农业大学教研基地采集大豆根际土壤样品，将10g该土壤样品，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中置于30℃、155rpm摇床上震荡30min，使之充分混匀。将样品静置10min后，吸取1mL上清液，用无菌水将其逐级稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度浓度的悬浮液；每个浓度梯度悬浮液吸取100μL滴到NA固体培养基中央，用涂布器涂匀，每个梯度重复3次，平板倒置于30℃恒温培养箱培养2天。分离纯化方法如下：挑取上述实验所获得的形态不同的细菌菌落至LB固体培养基上进行平板划线，在30℃恒温培养箱培养2天获得菌落。重复上述操作直至LB固体培养基上出现形态相同的单一菌落，用接种环挑取单一菌落，接种于液体LB培养基中，30℃、155rpm培养12h，获得菌株发酵液，用无菌水将菌株发酵液浓度调节为1×109cfu/m。
对峙实验具体方法如下：取0.5mL上述浓度为1×109cfu/m的菌株发酵液加入到PDA培养基中(温度为40～45℃)，充分混合，然后于直径为90mm的培养皿中倒入10mL得到的混合培养基；待混合培养基凝固后，于混合培养基中央接种直径为5mm大豆根腐病(Fusarium oxysporum)病原菌菌饼为实验组，将不含菌株发酵液的PDA培养基中接种大豆根腐病(Fusarium oxysporum)病原菌菌饼为对照组，每个处理三次重复。在30℃培养箱中倒置培养7天，采用十字交叉法用游标卡尺对菌落直径进行测量，计算抑制率。抑制率(％)＝【(对照组菌落直径－实验组菌落直径)/对照组菌落直径】×100％。最后，筛选出一株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)抑制率较高的菌株，将其命名为Klebsiella grimontiiDR11(DR11菌株)，放于-80℃冰箱保存。
所述的NA固体培养基为：牛肉膏30.00g、蛋白胨50.00g、氯化钠30.00g、琼脂粉20.00g、蒸馏水1000mL。
所述的LB固体培养基为：胰蛋白胨10.00g、酵母浸粉5.00g、氯化钠10.00g、琼脂粉20.00g、蒸馏水1000mL。
所述的PDA培养基为：葡萄糖20.00g、琼脂粉20.00g、马铃薯200.00g、蒸馏水1000mL。
菌株活化、培养和发酵方法如下：
(1)菌株活化：将-80冰箱保存的DR11菌株斜面用无菌的接种针挑取菌落，接种于LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养16h。
(2)菌株培养：将步骤(1)中培养16h的DR11菌株转接至新鲜的LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养16h。
(3)菌株发酵：用接种环将步骤(2)中的DR11菌株接种于LB液体培养基中，30℃、155rpm振荡培养至对数期(OD600＝0.5)，制备DR11种子液。吸取0.5mL的种子液转入含有100mL LB液体培养基的三角瓶中，155rpm、30℃振荡培养18h，7000rpm离心5min，将离心得到的菌体用无菌水调至浓度为1×109cfu/mL，制得DR11发酵液。
所述的LB液体培养基为：胰蛋白胨10.00g、酵母浸粉5.00g、氯化钠10.00g、蒸馏水1000mL。
二、菌株的形态学特征
(1)菌落特征
将得到的菌株DR11接种于LB培养基上，在30℃恒温培养箱中培养16h，菌落呈乳白色、表面粘稠光滑、湿润、有轻微光泽，不透明(图1)。
(2)扫描电镜观察结果
该菌株电镜观察为表面不光滑，为棒状细菌(图2)。
三、生理生化特征分析
参考《微生物学实验》(沈萍、范秀容、李广武，微生物学实验(第三版)；北京：高等教育出版社，1999.)和《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠、蔡妙英，常见细菌***鉴定手册；北京：科学出版社，2011.)测定DR11菌株的生理生化特征。
测定结果显示，该菌株革兰氏、甲基红反应呈阴性，V-P反应、淀粉水解试验、糖酵解试验(果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖)、柠檬酸利用试验、过氧化氢酶试验、吲哚反应均呈阳性，说明该菌株能够利用柠檬酸盐酵解果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖，可产生吲哚。
四、菌株DR11的分类属性鉴定
采用TIANamp细菌DNA试剂盒提取全基因组DNA(天根生物科技有限公司，北京，中国)，使用该试剂盒中引物通过通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA基因，引物为27F(5‘-AGAGTTGATCCTGCTCAG-3’)，1492R(5‘-GTTACCTTTACGACTT-3’)。50μL扩增体系：Premixtaq 25μL，模版(DR11菌株DNA)500ng，1492R和27F各10μL，用无菌水补足50μL。PCR循环参数为：95℃预加热5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，72℃下延伸10min，经1％琼脂糖凝胶电泳纯化后，用EasyPure凝胶进行纯化。然后由生工生物技术有限公司进行测序(中国上海)。PCR产物用V-gene核酸纯化试剂盒(TIANGEN)纯化回收16S rDNA片段，将DNA洗脱至收集管中，4℃冷藏。测序委托上海生工工程有限公司完成。测序结果用Blast软件Genbank中的16SrDNA序列进行同源性比较，获得的DR11菌株的16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示，该菌株的16S rDNA序列已经提交到GenBank数据库，并构建生物防治菌的***发育树，确定DR11为格氏克雷伯菌属，并命名为Klebsiella grimontii DR11(图3)。
该菌株已送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M20231143，分类命名为：Klebsiella grimontii DR11；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072，电话：(027)68754052。在本发明中，将Klebsiella grimontii DR11简写为DR11菌株。
实施例2：DR11菌株活化、发酵培养以及生长曲线的绘制
(1)菌株活化：将-8℃冰箱保存的DR11菌株用无菌的接种针挑取菌落，接种于LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养16h。
(2)菌株培养：将步骤(1)中培养16h的DR11菌株转接至新鲜的LB固体培养基上，30℃恒温箱中培养16h。
(3)菌株发酵：用接种环将步骤(2)中的DR11菌株接种于LB液体培养基中，30℃、155rpm振荡培养至对数期(OD600＝0.5)，制备DR11种子液。吸取0.5mL的种子液转入含有100mL LB液体培养基的三角瓶中，155rpm、30℃振荡培养18h，7000rpm离心5min，将离心得到的菌体用无菌水调至浓度为1×109cfu/mL，制得DR11发酵液。用于以下实施例。
所述的LB液体培养基为：胰蛋白胨10.00g、酵母浸粉5.00g、氯化钠10.00g、蒸馏水1000mL。
所述的LB固体培养基为：胰蛋白胨10.00g、酵母浸粉5.00g、氯化钠10.00g、琼脂粉20.00g、蒸馏水1000mL。
(4)生长曲线的绘制
用接种环挑取4℃保存的菌株DR11接种于含有100mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃、155rpm下培养至对数期(OD600＝0.5)，制备DR11种子液。吸取0.5mL种子液转接于100mL的LB液体培养基中，每隔2、4或6小时测定菌液的OD600值，连续测定72h，绘制生长曲线(图4)。
(5)无菌水制备：无菌水为在121℃、15psi压强条件下，用灭菌锅高温高压灭菌蒸馏水30min所得。
实施例3：DR11菌株大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的对峙试验及抑菌谱的测定
对峙实验：将生防菌DR11种子液用无菌水制备成1×109cfu/mL的DR11发酵液。按照100mL PDA培养基中加入0.5mL DR11发酵液的比例制备含DR11发酵液的混合培养基；在直径为90mm的培养皿中倒入10mL混合培养基，凝固后在培养基中央接种直径为5mm大豆根腐病(Fusarium oxysporum)病原菌菌饼(经PDA培养基预先培养)，以只接种大豆根腐病(Fusarium oxysporum)病原菌菌饼的培养基为对照，每个处理三次重复。在26℃培养箱中倒置培养，7天后，观察其有无抑菌带出现，采用十字交叉法用游标卡尺对菌落直径进行测量，计算抑制率。抑制率(％)＝【(对照组菌落直径－实验组菌落直径)/对照组菌落直径】×100％。
抑菌谱的测定：将生防菌DR11种子液用无菌水制备成1×109cfu/mL的DR11发酵液。采用划线法进行抑菌谱测定，方法如下：在PDA培养基中央分别接种直径为5mm的大豆菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、大豆拟茎点霉茎枯病(Phomopsis longicolla)、玉米茎腐病(Fusarium graminearum)、玉米炭疽病(Colletotrichum graminicola)、玉米小斑病(Bipolaris maydis)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea)病原菌菌饼(经PDA培养基预先培养)，在距离病原菌菌饼两侧25mm处，用接菌环蘸取适量DR11发酵液进行划线；以只在PDA培养基上接种所述病原菌菌饼为对照组。每个处理三次重复。在26℃培养箱中倒置培养7天，观察其有无抑菌带出现，采用十字交叉法用游标卡尺对菌落直径进行测量，计算抑制率。抑制率(％)＝【(对照组菌落直径－实验组菌落直径)/对照组菌落直径】×100％。
图5为DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用，计算其抑制率为72.27％。图6为DR11菌株对多种病原菌的抑制作用，其中，A与B为大豆菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)。A为对照组，B为实验组，DR11菌株对其抑制率为54.55％；C与D为大豆拟茎点霉茎枯病(Phomopsis longicolla)，C为对照组，D为实验组，DR11菌株对其抑制率为59.77％；E与F为玉米茎腐病(Fusarium graminearum)，E为对照组，F为实验组，DR11菌株对其抑制率为69.38％；G与H为玉米炭疽病(Colletotrichum graminicola)，G为对照组，H为实验组，DR11菌株对其抑制率为65.73％；I与J为玉米小斑病(Bipolarismaydis)，I为对照组，J为实验组，DR11菌株对其抑制率为48.65％；K与L为番茄灰霉病(Botrytis cinerea)，K为对照组，L为实验组，DR11菌株对其抑制率为53.06％。抑制率(％)＝【(对照组的菌落直径-实验组的菌落直径)/对照组的菌落直径】×100％。
实施例4：DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用
用接种环挑取DR11菌株单菌落，接种于100mL的LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养至对数期(OD600nm＝0.5)，制备DR11种子液。吸取0.5mL种子液转接于100mL LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养16h，离心，弃上清液，用无菌水洗菌3次，获得菌体，将菌液的浓度用无菌水调为1×105cfu/mL、1×106cfu/mL、1×107cfu/mL、1×108cfu/mL、1×109cfu/mL备用。按照100mL PDA培养基中添加0.5mL菌液的比例，制备含有DR11菌液的PDA培养基。将生长良好的5mm的大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌饼接种于含有不同浓度菌液的培养基中心，以不含DR11菌液只接种病原菌菌饼的培养基为对照；25℃培养7天，观察抑菌情况，测定对照组与实验组的菌丝重量，计算抑制率。处理重复3次，实验进行两次。
如图7所示(横坐标为PDA培养基中的菌液浓度，即PDA培养基中菌液浓度(cfu/mL)＝(加入菌液的浓度×在PDA培养基中加入菌液的体积)/PDA培养基体积)，随着菌液浓度的升高，大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的菌落直径不断下降。当菌液浓度为5×102cfu/mL时，抑制率为41.48％；当菌液浓度为5×103cfu/mL时，抑制率为51.59％；当菌液浓度为5×104cfu/mL时，抑制率为70.23％；当菌液浓度为5×105cfu/mL时，抑制率为81.25％；当菌液浓度为5×106cfu/mL时，抑制为87.39％。抑制率(％)＝【(对照组菌落直径-实验组菌落直径)/对照组菌落直径】×100％。
实施例5：DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌丝生长量的抑制作用
用接种环挑取DR11菌株单菌落，接种于100mL的LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养至对数期(OD600nm＝0.5)，制备DR11种子液。吸取0.5mL种子液转接于100mL LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养16h，离心，弃上清液，用无菌水洗菌3次，获得菌体，将菌液的浓度用无菌水调为1×105cfu/mL、1×106cfu/mL、1×107cfu/mL、1×108cfu/mL、1×109cfu/mL备用。按照100mL PDA培养基中添加0.5mL菌液的比例，制备含有DR11菌液的PDA培养基。将生长良好的5mm的大豆根腐病(Fusarium oxysporum)病原菌菌饼接种于PDA培养基的中央，以不含DR11菌液只接种病原菌菌饼的培养基为对照；25℃培养7天，将菌丝用无菌的刀片刮下，在60℃烘箱中干燥6h称重，测定对照组与实验组的菌丝重量。计算抑制率，处理重复3次，实验进行两次。
如图8所示，随着菌液浓度的升高，大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌丝干重不断下降。当菌液浓度为5×102cfu/mL时，抑制率为82.35％；当菌液浓度为5×103cfu/mL时，抑制率为84.82％；当菌液浓度为5×104cfu/mL时，抑制率为86.97％；当菌液浓度为5×105cfu/mL时，抑制率为89.16％；当菌液浓度为5×106cfu/mL时，抑制为93.27％。抑制率(％)＝【(对照组菌丝的干重-实验组菌丝的干重)/对照组菌丝的干重】×100％。
实施例6：DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌丝形态的影响
用接种环挑取DR11菌株单菌落，接种于100mL的LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养至对数期(OD600nm＝0.5)，制备DR11种子液。吸取0.5mL种子液转接于100mL LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养16h，离心，弃上清液，用无菌水洗菌3次，获得菌体，将菌液的浓度用无菌水调为1×105cfu/mL、1×107cfu/mL、1×109cfu/mL备用。按照100mL PDA培养基中添加0.5mL菌液的比例，制备含有DR11菌液的PDA培养基。将生长良好的5mm的大豆根腐病(Fusarium oxysporum)病原菌菌饼接种于PDA培养基的中央，以不含DR11菌液只接种病原菌菌饼的培养基为对照；25℃培养7天后，将菌落用载破片刮取下来，放置于光学显微镜下进行观察，观察菌丝形态上的变化。处理重复三次，实验进行两次。
在低倍镜下，就可以观察到实验组和对照组的菌丝有明显的差异。对照组的菌丝密度低，菌丝较长，且向各个方向生长(图9A)；当菌液浓度为5×102cfu/mL时，菌丝出现分枝，菌丝室变短，菌丝长度变短(图9B)；当菌液浓度为5×104cfu/mL时，菌丝出现肿胀、脱水和断裂(图9C)；当菌液浓度为5×106cfu/mL时，大多数菌丝扩增和断裂(图9D)。
实施例7：DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)孢子产生量的抑制作用
用接种环挑取DR11菌株单菌落，接种于100mL的LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养至对数期(OD600nm＝0.5)，制备DR11种子液。吸取0.5mL种子液转接于100mL LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养16h，离心，弃上清液，用无菌水洗菌3次，获得菌体，将菌液的浓度用无菌水调为1×105cfu/mL、1×106cfu/mL、1×107cfu/mL、1×108cfu/mL、1×109cfu/mL备用。按照100mL PDA培养基中添加0.5mL菌液的比例，制备含有DR11菌液的PDA培养基。将生长良好的5mm的大豆根腐病(Fusarium oxysporum)病原菌菌饼接种于PDA培养基的中央，以不含DR11菌液只接种病原菌菌饼的培养基为对照；25℃培养至菌落生长至直径4cm时，用无菌水清洗菌丝体，并用载玻片刮去菌丝。用三层无菌纱布过滤菌丝悬浮液，将过滤后的悬浮液置于试管中，25℃培养96h后用血球计数板计数法确定孢子的数量，计算抑制率。
随着DR11菌株浓度的增加，对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)孢子的产生量，也具有较大的影响。如图10所示，随着菌液浓度的升高，抑制作用增大。当菌液浓度为5×102cfu/mL时，抑制率为54.79％；当菌液浓度为5×103cfu/mL时，抑制率为72.08％；当菌液浓度为5×104cfu/mL时，抑制率为78.96％；当菌液浓度为5×105cfu/mL时，抑制率为83.96％；当菌液浓度为5×106cfu/mL时，大豆根腐病(Fusarium oxysporum)孢子数目仅为40820个，此时的抑制为95.83％。抑制率(％)＝【(对照组孢子的数目-实验组孢子的数目)/对照组孢子的数目】×100％。
实施例8：DR11菌株在不同温度下对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用
用接种环挑取DR11菌株单菌落，接种于在100mL LB液体培养基中，过夜培养16h，将菌液的浓度用无菌水调整为1.0×109cfu/mL，吸取菌液0.5mL，分别加入100mL LB液体培养基(pH 7)中将其分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，155rpm下培养12h，得到DR11菌悬液，用紫外分光光度计测定菌液的OD600 nm数值，以确定生物防治菌的生长情况；在PDA培养基中央接种5mm大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌饼，在距离病原菌菌饼2.5cm的4个位置接种5μL的DR11菌悬液(OD600＝0.5)。以不含细菌溶液的PDA培养基为对照。培养皿在25℃恒温培养箱中培养7天，测定对照组与实验组的菌落直径。观察抑菌情况，计算DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制率。每个处理重复三次。
如图11所示，随着温度的升高，DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用呈现先上升后下降的趋势，在20～40℃条件下，DR11对大豆根腐病(Fusariumoxysporum)的抑制率为69.86～76.67％，当温度为30℃时，DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用达到最大，抑制率为76.67％。抑制率(％)＝【(对照组菌落直径-实验组菌落直径)/对照组菌落直径】×100％。
实施例9：DR11菌株在不同pH下对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用
用接种环挑取DR11菌株单菌落，接种于100mL LB液体培养基中，过夜培养16h，将菌液浓度用无菌水调整为1.0×109cfu/mL，吸取菌液0.5mL，加入到pH分别为5、6、7、8、9的100mL LB液体培养基中，30℃、155rpm下培养12h，得到DR11菌悬液，用紫外分光光度计测定菌液的OD600 nm数值，以确定生物防治菌的生长情况；在PDA培养基中央接种5mm大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌饼，在距离病原菌饼2.5cm的4个位置接种5μL的DR11菌悬液(OD600＝0.5)。以不含细菌溶液的PDA培养基为对照。培养皿在25℃恒温培养箱中培养7天，测定对照组与实验组的菌落直径。观察抑菌情况，计算DR11菌株对大豆根腐病(Fusariumoxysporum)的抑制率。每个处理重复三次。
由图12所示，随着pH的升高，DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用呈现先上升后下降的趋势，pH为5～9时，DR11对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制率为62.49％～71.58％，当pH为7时，DR11菌株对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的抑制作用达到最大，抑制率为71.58％。抑制率(％)＝【(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径】×100％。
实施例10：DR11菌株发酵液对大豆根腐病(Fusarium oxysporum)的盆栽防治效果
采用高粱粒接种法，以大豆根腐病(Fusarium oxysporum)测定生防DR11菌株对其预防效果和治疗效果。每处理30株，重复三次。
盆栽处理：花盆(直径9cm×高8cm)装入灭菌土(134℃、0.1MPa下灭菌30min)200g，将带有病原菌培养物的高粱米以2％的重量比与灭菌土充分混合均匀，加水保持含水量40％～60％，温度25±2℃。大豆种子(吉育47号)经表面消毒后播种，每盆播5粒，出苗后，间苗保留每盆3株。
DR11菌株发酵液的制备：将-80℃冰箱中保存的DR11菌株在冰上融化后，将其接入LB液体培养基上中，过夜培养12h后接种在LB固体培养基上，30℃活化培养24h。用接种环挑取菌株菌落，接入100mL(250mL三角瓶)的LB培养液中，30℃、155rpm振荡培养18h，制备DR11菌株发酵液，用无菌水调整DR11菌株发酵液的最终浓度为1×109cfu/mL。
病原菌接种体的制备：将高粱粒煮熟后装入250mL锥形瓶内，115℃灭菌15min，待其冷却后，分别接入由PDA培养基培养7天的大豆根腐病(Fusarium oxysporum)菌饼，25℃黑暗条件下培养14天，待高粱粒表面长满病原菌的菌丝时，可做病原菌接种体用于接菌拌土处理。以备后续试验使用。
预防效果的测定方法：将DR11菌株发酵液以每盆30mL的施用量浇灌于未处理的土壤中，于25℃下保湿24h后，再进行病原菌拌土处理，再于25℃下保湿24h后，将大豆种子播种于处理后的土壤中，此后，每周每盆以20mL DR11菌株发酵液进行浇灌，直至试验结束。每个处理重复三次。同时设置对照(CK)试验，处理后第30天调查发病情况，根据大豆根腐病分级标准调查根部发病情况，记录总株数、病株数，并计算病情指数和防治效果。
分级标准：
0级：主根须根健全，无病斑，根瘤多；
1级：主根上有零星病斑，但不连片,须根上无病斑；
2级：主根病斑连片，但小于根部周长1/4，须根略有发病；
3级：主根病斑大于根部周长的1/4，但小于1/2，须根病斑较多，但不连成片；
4级：主根病斑大于1/2，但小于3/4，须根病斑成片部分须根脱落；
5级：整个根部均有病斑包围，根部腐烂，须根近无。
治疗效果的测定方法：先将大豆种子播种于处理后的土壤中，于25℃下保湿24h后，将DR11菌株发酵液以每盆30mL的施用量浇灌于处理后的土壤中，此后，每周每盆以20mLDR11菌株发酵液进行浇灌，直至试验结束。每个处理重复三次作为实验组。同时设置对照组(CK)试验，处理后第30天调查发病情况并计算病情指数和防治效果。
表1：DR11菌株对大豆根腐病的预防和防治效果试验数据
注：表中数据为平均数±标准差。
病情指数＝【∑(各级病株数×病级数)/(调查总株数×最高病级数)】×100％
防治效果＝【(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数】×100％
处理30天后，可调查病情指数和防治效果。如表1所述，在预防试验中，防治效果可达到70.84％。在治疗试验中，防治效果可达到62.71％。所以，DR11菌株可以较好的防治大豆根腐病(Fusarium oxysporum)。
Claims (3)
1.一株生物防治菌Klebsiella grimontiiDR11，该菌株已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2023年6月29日，保藏编号为CCTCC NO：M 20231143，分类命名为Klebsiella grimontii DR11。
2.权利要求1所述的一株生物防治菌Klebsiella grimontii DR11在制备植物病原菌防治剂方面的应用。
3.如权利要求1所述的一株生物防治菌Klebsiella grimontii DR11在制备植物病原菌防治剂方面的应用，其特征在于：植物病原菌为大豆根腐病(Fusariumoxysporum)、大豆菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、大豆拟茎点霉茎枯病(Phomopsis longicolla)、玉米茎腐病(Fusarium graminearum)、玉米炭疽病(Colletotrichum graminicola)、玉米小斑病(Bipolaris maydis)或番茄灰霉病(Botrytis cinerea)。
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