CN118203656A - 一种SARS-CoV-2广谱疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SARS‑CoV‑2广谱疫苗及其制备方法与应用。本发明提供了一种SARS‑CoV‑2亚单位疫苗，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：制备SpyCatcher‑2C融合蛋白(由SpyCatcher蛋白与肠道病毒的2C蛋白融合而成)；制备SpyTag‑抗原融合蛋白(由SpyTag蛋白与SARS‑CoV‑2的抗原融合而成)；将SpyCatcher‑2C融合蛋白和SpyTag‑抗原融合蛋白共价缀合，获得SARS‑CoV‑2亚单位疫苗，并可根据需求混合来自不同变种病毒的SpyTag‑抗原融合蛋白。本发明有益于对SARS‑CoV‑2多种不同抗原蛋白进行稳定高效的展示，从而制备新型纳米纤维疫苗。本发明对广谱、通用的冠状病毒亚单位疫苗研发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种SARS-CoV-2广谱疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
新型冠状病毒，也称COVID-19，是由SARS-CoV-2感染导致的一种急性呼吸道传染病。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β-冠状病毒属，具有囊膜，基因组为正链RNA。SARS-CoV-2是一种高传染性的新型冠状病毒，已导致全球范围内的急性呼吸***疾病的大流行，对人类健康和公共安全造成了严重威胁。
目前，研发SARS-CoV-2亚单位疫苗的主要策略为：抗原选择和的抗原聚集方式。现有SARS-CoV-2亚单位疫苗选择S蛋白RBD为抗原，聚集方式为二聚化(微生物所/智飞)或基于铁蛋白(ferritin)纳米颗粒表面的抗原展示(国家CDC/生物物理所)。然而，这些策略均存在缺陷：(1)SARS-CoV-2的变异主要发生在RBD，单一种类RBD疫苗失效快；(2)铁蛋白纳米颗粒自身分子量过大，免疫原性强；(3)抗原-铁蛋白复合体不稳定。
发明内容
本发明的目的是提供一种SARS-CoV-2广谱疫苗及其制备方法与应用。
第一方面，本发明要求保护一种SARS-CoV-2亚单位疫苗。
本发明所要求保护的SARS-CoV-2亚单位疫苗具体可按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(A1)制备SpyCatcher-2C融合蛋白；
所述SpyCatcher-2C融合蛋白由SpyCatcher蛋白与肠道病毒的2C蛋白融合而成；
(A2)制备SpyTag-抗原融合蛋白；
所述SpyTag-抗原融合蛋白由SpyTag蛋白与SARS-CoV-2的抗原融合而成；
(A3)将所述SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白混合，两者依靠SpyCatcher和SpyTag之间的共价连接以及肠道病毒的2C蛋白的自我寡聚作用，自发组成多抗原聚集体，获得SARS-CoV-2亚单位疫苗。
在本发明的具体实施方式中，步骤(A1)中，所述肠道病毒的2C蛋白可为脊髓灰质炎病毒(PV)的2C蛋白。当然，所述肠道病毒的2C蛋白也可以为其他肠道病毒如肠道病毒A71型(EV-A71)的2C蛋白等。
在本发明的具体实施方式中，步骤(A2)中，所述SARS-CoV-2的抗原可为SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。当然所述SARS-CoV-2的抗原也可以为SARS-CoV-2的其他抗原如M蛋白或N蛋白等。
进一步地，步骤(A3)中，将所述SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白混合具体可为：将所述SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白按照1:3的摩尔比在缓冲体系中混合。
更进一步地，混合后还可包括如下步骤：在冰上静置20h，从而依靠所述SpyCatcher蛋白和所述SpyTag蛋白之间的共价连接作用，完成所述SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白的组装。
在本发明的具体实施方式中，所述缓冲体系具体为GF缓冲液；所述GF缓冲液组成如下：10mM HEPES pH 7.4；150mM NaCl。
在本发明的具体实施方式中，所述SpyCatcher蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第16-132位。所述肠道病毒的2C蛋白为肠道病毒71型的2C蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第145-358位。所述SpyTag蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第21-33位(或SEQ IDNo.3的第21-33位或SEQ ID No.4的第21-33位)。
在所述SARS-CoV-2亚单位疫苗中，所述SpyTag-抗原融合蛋白可为如下(B1)-(B3)中任一种：
(B1)SpyTag-RBD WT融合蛋白；
所述SpyTag-RBD WT融合蛋白由所述SpyTag蛋白和RBD WT蛋白融合而成；所述RBDWT蛋白为SARS-CoV-2原始毒株的RBD蛋白；所述RBD WT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第45-243位；
(B2)SpyTag-RBD Delta融合蛋白；
所述SpyTag-RBD Delta融合蛋白由所述SpyTag蛋白和RBD Delta蛋白融合而成；所述RBD Delta蛋白为SARS-CoV-2的Delta型变异毒株的RBD蛋白；所述RBD Delta蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第27-225位；
(B3)SpyTag-RBD Omicron融合蛋白；
所述SpyTag-RBD Omicron融合蛋白由所述SpyTag蛋白和RBD Omicron蛋白融合而成；所述RBD Omicron蛋白为SARS-CoV-2的Omicron型变异毒株的RBD蛋白；所述RBDOmicron蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.4的第27-225位。
具体地，所述SpyTag-RBD WT融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2；所述SpyTag-RBD Delta融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3；所述SpyTag-RBD Omicron融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
进一步地，在所述SARS-CoV-2亚单位疫苗的制备方法中，还可包括将步骤(A3)中利用不同的所述SpyTag-抗原融合蛋白制备得到的不同所述SARS-CoV-2亚单位疫苗进行等摩尔混合的步骤。混合后得到混合亚单位疫苗，如本发明具体实施方式中的RBD mix 2C-Vac。
第二方面，本发明要求保护一种SARS-CoV-2亚单位疫苗的制备方法。
本发明要求保护的SARS-CoV-2亚单位疫苗的制备方法，可包括前文第一方面中所述步骤。
第三方面，本发明要求保护用于制备前文第一方面中所述SARS-CoV-2亚单位疫苗的成套产品。
本发明要求保护的用于制备前文第一方面中所述SARS-CoV-2亚单位疫苗的成套产品，可包括如下任一：
(C1)前文第一方面中所述的SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白。
(C2)核酸分子1和核酸分子2；所述核酸分子1为编码(C1)中所述的SpyCatcher-2C融合蛋白的核酸分子；所述核酸分子2为编码(C1)中所述SpyTag-抗原融合蛋白的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子1如SEQ ID No.5所示；所述核酸分子2如SEQ ID No.6(对应所述SpyTag-RBD WT融合蛋白)或SEQ ID No.7(对应所述SpyTag-RBD Delta融合蛋白)或SEQ ID No.8所示(对应所述SpyTag-RBD Omicron融合蛋白)。
(C3)表达盒1和表达盒2；所述表达盒1含有(C2)中的所述核酸分子1；所述表达盒2含有(C2)中的所述核酸分子2。
所述表达盒1是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述SpyCatcher-2C融合蛋白的DNA，该DNA不仅包括启动前文第一方面中所述SpyCatcher-2C融合蛋白的编码基因(即所述核酸分子1)转录的启动子，还可包括终止转录的终止子。所述表达盒2是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述SpyTag-抗原融合蛋白的DNA，该DNA不仅包括启动前文第一方面中所述SpyTag-抗原融合蛋白的编码基因(即所述核酸分子2)转录的启动子，还可包括终止转录的终止子。进一步，所述表达盒1和所述表达盒2还可包括增强子序列。
(C4)重组载体1和重组载体2；所述重组载体1含有(C2)中的所述核酸分子1；所述重组载体2含有(C2)中的所述核酸分子2。
所述重组载体1为将SEQ ID No.5所示DNA分子克隆到pET28a(+)载体的多克隆位点后得到的重组质粒。
所述重组载体2为将SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示DNA分子克隆到pFastBac1载体的多克隆位点后得到的重组质粒。
(C5)重组细胞1或重组细胞2；所述重组细胞1含有(C2)中的所述核酸分子1；所述重组细胞2含有(C2)中的所述核酸分子2。
所述重组细胞1为将所述重组载体1导入大肠杆菌后得到的重组大肠杆菌。本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述重组细胞2为将所述重组载体2导入昆虫细胞后得到重组昆虫细胞。在本发明的具体实施方式中，所述昆虫细胞具体为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)High Five细胞。
第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述SARS-CoV-2亚单位疫苗或前文第三方面中所述的成套产品在如下任一中的应用：
(C1)制备能够中和SARS-CoV-2的产品；
(C2)制备用于治疗和/或预防由于SARS-CoV-2感染所致疾病的产品；
(C3)制备用于改善由于SARS-CoV-2感染所致症状的产品。
其中，所述SARS-CoV-2可为原始毒株或变异毒株。
进一步地，所述变异毒株可为Delta株和/或Omicron株。
本发明的有益效果：
本发明有益于对SARS-CoV-2多种不同抗原蛋白进行稳定高效的展示，从而制备新型纳米纤维疫苗。
本发明对广谱、通用的冠状病毒亚单位疫苗研发具有重要意义。
附图说明
图1为以2C为骨架的多价疫苗构建设计思路。图中，PBD表示2C蛋白的口袋结合结构域(pocket binding domain)，用来介导2C的寡聚。
图2为分子筛纯化后的SpyCatcher-2C蛋白。
图3为分子筛纯化后的SpyTag-RBD WT蛋白。
图4为分子筛纯化后的SpyTag-RBD Delta蛋白。
图5为分子筛纯化后的SpyTag-RBD Omicron蛋白。
图6为RBD WT 2C-Vac的组装和后续纯化。
图7为RBD Delta 2C-Vac的组装和后续纯化。
图8为RBD Omicron 2C-Vac的组装和后续纯化。
图9为抗血清中SARS-CoV-2原始毒株RBD、Delta型变异毒株RBD、Omicron型变异毒株RBD的特异性抗体滴度。图中，标注“PBS”的为表1对照组中的“PBS”；标注“2C”的为表1对照组中的“2C骨架”；标注“RBD”的为表1对照组中的“RBD WT单体”；标注“RBD WT 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD WT”；标注“RBD Delta 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD Delta”；标注“RBD Omicron 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD Omicron”；标注“RBD mix 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD WT+Delta+Omicron”。
图10为抗血清对SARS-CoV-2假病毒中和效果评价。图中，标注“PBS”的为表1对照组中的“PBS”；标注“2C”的为表1对照组中的“2C骨架”；标注“RBD”的为表1对照组中的“RBDWT单体”；标注“RBD WT 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD WT”；标注“RBD Delta 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD Delta”；标注“RBD Omicron 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD Omicron”；标注“RBD mix 2C-Vac”的为表1实验组2C-Vac中的“RBD WT+Delta+Omicron”。
在图9和图10中，ns表示差异不显著，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
具体实施方式
本发明设计了一套能够快速应变的SARS-CoV-2亚单位疫苗制备体系，称为“2C-Vac”。在肠道病毒研究中发现，各种肠道病毒2C均发生稳定的自我寡聚现象，根据蛋白浓度，2C聚集度大于4-8聚体。因此，本发明利用2C寡聚体作为聚集抗原的载体(或称骨架)。
为了快速装载抗原，本发明采用SpyCatcher技术。SpyCatcher是一种小蛋白(12kDa)，能够与伴侣肽SpyTag(13-aa)自发形成共价连接，形成稳定的共价化合物，该反应条件温和(如在TBS pH 8.0中4℃孵育16h)，无需酶和其他催化剂，已被证实能够用于多种抗原蛋白的组装和展示(SpyCatcher和SpyTag序列专利：UK Intellectual PropertyOffice 1706430.4，SpyCatcher和SpyTag形成异构肽键专利：EP2534484)。
本发明首先设计了SpyCatcher-2C融合蛋白，通过2C自组装形成多价抗原骨架。然后制备SpyTag-抗原，将其与SpyCatcher-2C骨架混合，即可形成稳定的抗原聚集体(图1)。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、SpyCatcher-2C的表达和纯化
利用大肠杆菌表达***表达融合蛋白SpyCatcher-PV 2CΔN115(简称SpyCatcher-2C)，其会自发形成寡聚体。
一、质粒构建
SpyCatcher-2C氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：从N端至C端分别为His-Tag(SEQID No.1的第1-8位)，TEV蛋白酶酶切位点(SEQ ID No.1的第9-15位)，SpyCatcher(SEQ IDNo.1的第16-132位)，“GGS”重复序列Spacer(SEQ ID No.1的第133-144位)，PV 2CΔN115(SEQ ID No.1的第145-358位)。
上述氨基酸序列对应的核苷酸序列为SEQ ID No.5。将SEQ ID No.5所示DNA片段克隆到pET-28a(+)载体的酶切位点NcoI和XhoI之间，经测序验证正确后的重组质粒命为SpyCatcher-2C表达质粒。
SpyCatcher-2C表达质粒上携带的SEQ ID No.5所示DNA片段表达SEQ ID No.1所示SpyCatcher-2C融合蛋白。
二、在大肠杆菌中的诱导表达
将步骤一构建的SpyCatcher-2C表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，接种于含有Kan的LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导表达20h，然后收集菌体。
三、纯化
将步骤二收集的菌体超声破碎，2000g离心后取上清，第一步使用Ni-NTA亲和层析纯化。结合缓冲液：20mM HEPES pH 7.4,300mM NaCl。洗涤缓冲液：20mM HEPES pH 7.4,300mM NaCl,20mM咪唑。洗脱缓冲液：20mM HEPES pH 7.4,300mM NaCl,300mM咪唑。第二步透析至结合缓冲液中，并加入TEV酶切过夜，之后再Ni-NTA柱除去His-tag；第三步使用分子筛Superdex200纯化(GF缓冲液：10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl)。收集全部洗脱峰用于SDS-PAGE检测。
纯化后的SpyCatcher-2C蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示。由图可见SpyCatcher-2C蛋白的分子筛洗脱峰单一，蛋白质纯度较高。
实施例2、SpyTag-RBD的表达和纯化
制备SpyTag-RBD库，根据疫情变化持续更新库变种病毒RBD库。我们构建了3种SpyTag-RBD蛋白(原始株和2株VOC)：WT、Delta以及Omicron。SpyTag-RBD蛋白需要通过杆状病毒-昆虫表达***分泌表达。
下面以原始毒株为例详细阐述SpyTag-RBD蛋白的表达纯化步骤。我们将SARS-CoV-2原始毒株的SpyTag-RBD蛋白命名为SpyTag-RBD WT。
一、质粒构建
SpyTag-RBD WT氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，从N端至C端分别为Hemo分泌信号肽(SEQ ID No.2的第1-20位)，SpyTag(SEQ ID No.2的第21-33位)，“GSG”重复序列Spacer(SEQ ID No.2的第34-44位)，SARS-CoV-2原始毒株的RBD蛋白(简称RBD WT蛋白)(SEQ IDNo.2的第45-243位)，His-tag(SEQ ID No.2的第244-249位)。
上述氨基酸序列对应的核苷酸序列为SEQ ID No.6。将SEQ ID No.6所示DNA片段克隆到pFastBac1载体的酶切位点BamHI和XhoI之间，经测序验证正确后的重组质粒为SpyTag-RBD WT表达质粒。
SpyTag-RBD WT表达质粒上携带的SEQ ID No.6所示DNA片段表达SEQ ID No.2所示SpyTag-RBD WT融合蛋白。
二、表达
将步骤一构建得到的SpyTag-RBD WT表达质粒转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，涂布于卡那霉素/庆大霉素/四环素三种抗性的LB固体培养基上，进行蓝白斑筛选，37℃培养48h后进行挑取白色单菌落，接种至三抗LB液体培养基中培养18h后提取杆粒。在6孔板中将杆粒转染入昆虫细胞Sf21中，4d后收取培养基上清得到P1病毒；在T75细胞培养瓶中将P1病毒按3％的比例接种至SF21细胞中，4d后收取培养基上清得到P2病毒；同样的方式将P2病毒扩大培养得到足量的P3病毒。P3病毒可用于感染昆虫细胞High Five进行蛋白表达，比例同样为3％，P3感染后悬浮培养High5细胞，28℃120rpm，SpyTag-RBD WT分泌表达进入培养基，4d后收集培养基上清完成SpyTag-RBD WT蛋白表达。
三、纯化
第一步使用Ni-NTA亲和层析纯化培养基上清。培养基上清结合Ni-NTA亲和层析柱后，用10倍以上柱体积洗涤缓冲液洗涤层析柱。洗涤缓冲液：20mM HEPES pH 7.4,300mMNaCl,20mM咪唑。使用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱蛋白。洗脱缓冲液：20mM HEPES pH 7.4,300mM NaCl,300mM咪唑。第二步使用分子筛Superdex200纯化(GF缓冲液：10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl)。收集全部洗脱峰用于SDS-PAGE检测。
纯化后的SpyTag-RBD WT蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示。由图可见存在两个分子筛洗脱峰，经SDS-PAGE检测并与目标蛋白预期分子量比对，可知第一个洗脱峰为分子量较大的非目标蛋白，第二个洗脱峰为纯化后的SpyTag-RBD WT蛋白。
同样的，按照上述方法构建质粒并表达纯化得到SARS-CoV-2的Delta型变异毒株的SpyTag-RBD蛋白(命名为SpyTag-RBD Delta)和SARS-CoV-2的Omicron型变异毒株的SpyTag-RBD蛋白(命名为SpyTag-RBD Omicron)。
SpyTag-RBD Delta表达质粒为将SEQ ID No.7所示DNA片段克隆到pFastBac1载体的酶切位点BamHI和XhoI之间后得到的重组质粒。SEQ ID No.7编码SEQ ID No.3所示的SpyTag-RBD Delta融合蛋白。SEQ ID No.3从N端至C端分别为Hemo分泌信号肽(SEQ IDNo.2的第1-20位)，SpyTag(SEQ ID No.3的第21-33位),“GSG”重复序列Spacer(SEQ IDNo.3的第34-44位)，SARS-CoV-2的Delta型变异毒株的RBD蛋白(简称RBD Delta蛋白)(SEQID No.3的第45-243位)，His-tag(SEQ ID No.3的第244-249位)。
SpyTag-RBD Omicron表达质粒为将SEQ ID No.8所示DNA片段克隆到pFastBac1载体的酶切位点BamHI和XhoI之间后得到的重组质粒。SEQ ID No.8编码SEQ ID No.4所示的SpyTag-RBD Omicron融合蛋白。SEQ ID No.4从N端至C端分别为Hemo分泌信号肽(SEQ IDNo.2的第1-20位)，SpyTag(SEQ ID No.4的第21-33位),“GSG”重复序列Spacer(SEQ IDNo.4的第34-44位)，SARS-CoV-2的Omicron型变异毒株的RBD蛋白(简称RBD Omicron蛋白)(SEQ ID No.4的第45-243位)，His-tag(SEQ ID No.4的第244-249位)。
纯化后的SpyTag-RBD Delta蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示。纯化后的SpyTag-RBD Omicron蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图5所示。
实施例3、2C-Vac的组装
完成SpyCatcher-2C蛋白(参见实施例1)和SpyTag-RBD蛋白(参见实施例2)的纯化后，将两者按照摩尔比1:3的比例进行混合，于冰上静置20h即可完成组装，溶液保持GF缓冲液(配方参见实施例2)成分不变。组装后，用分子筛Superdex200分离混合物，由于融合蛋白分子量较大，多余未组装的SpyTag-RBD蛋白分子量较小，经过分子筛层析后根据不同洗脱峰位置可将二者分离，得到SpyCatcher-2C蛋白和SpyTag-RBD蛋白的融合蛋白。
SpyCatcher-2C蛋白和SpyTag-RBD WT蛋白按照1:3的摩尔比混合组装抗原聚集体(称作RBD WT 2C-Vac)，检测结果如图6所示。
SpyCatcher-2C蛋白和SpyTag-RBD Delta蛋白按照1:3的摩尔比混合组装抗原聚集体(称作RBD Delta 2C-Vac)，检测结果如图7所示。
SpyCatcher-2C蛋白和SpyTag-RBD Omicron蛋白按照1:3的摩尔比混合组装抗原聚集体(称作RBD Omicron 2C-Vac)，检测结果如图8所示。
将上述组装好的RBD WT 2C-Vac、RBD Delta 2C-Vac和Omicron 2C-Vac按照等摩尔混合后得到RBD mix 2C-Vac。
实施例4、抗血清的制备
本实验采用6到8周龄BALB/c雌性小鼠，设置7组，每组6只小鼠。每组小鼠免疫抗原的物质的量均相同(为0.196nmol)，具体的组别及每只小鼠免疫剂量设置如表1所示。
表1、小鼠免疫分组及单次免疫剂量
注：对照组中，“2C骨架”是指仅免疫SpyCatcher-2C蛋白(SEQ ID No.1)；“RBD WT单体”是指仅免疫SpyTag-RBD WT蛋白(SEQ ID No.2)。实验组2C-Vac中，“RBD WT”是指免疫实施例3制备的RBD WT 2C-Vac；“RBD Delta”是指免疫实施例3制备的RBD Delta 2C-Vac；“RBD Omicron”是指免疫实施例3制备的RBD Omicron 2C-Vac；“RBD WT+Delta+Omicron”是指免疫实施例3制备的RBD mix 2C-Vac。
将抗原使用PBS稀释，向其中加入等体积AddaVax佐剂，混合均匀后使用注射器乳化。采用肌肉注射的方法进行免疫，接种体积50μL/只。初次免疫后的第21天和第42天进行第二次和第三次免疫，并于初次免疫后的第56天收集小鼠血清。
实施例5、酶联免疫评价抗血清中的特异性抗体水平
包被：向ELISA板中分别加入50μL的RBD WT蛋白(SEQ ID No.2的第45-249位)、RBDDelta蛋白(SEQ ID No.3的第45-249位)、RBD Omicron蛋白(SEQ ID No.4的第45-249位)(溶剂为0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH值9.6)，蛋白使用浓度为3μg/mL，4℃包被过夜。
洗板：将ELISA板中的溶液吸弃，于水平摇床上用PBST室温下洗涤3次，每次5min。
封闭：使用PBST配制5％的脱脂奶粉作为封闭液，每孔加入100μL，37℃封闭1h。
孵育一抗：将实施例4制备的抗血清梯度稀释后，每孔加入50μL，阴性对照孔中加入50μL PBS，37℃孵育1h。
洗板：将ELISA板中的溶液吸弃，于水平摇床上用PBST室温下洗涤3次，每次5min。
孵育二抗：向其中加入偶联辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体孵育，充分洗涤后，加入TMB显色液(碧云天P0209)。反应30min后加入TMB显色终止液(碧云天P0215)，使用酶标仪读取450nm波长处的吸光度值。
数据处理：阴性对照孔的吸光度值即为背景值，吸光度值大于等于背景值的2.5倍对应的抗血清的最大稀释倍数即为抗体滴度，读取每种抗血清的抗体滴度，使用GraphPadPrism绘制柱状图并进行非配对T检验进行差异性分析。
结果如图9所示，由图可见相比于RBD WT单体对照组(表1)，RBD WT 2C-Vac可以诱导产生的野生型RBD和Delta株RBD的特异性抗体水平更高，且RBD mix 2C-Vac相比于2C骨架对照组(表1)，可以显著诱导出野生型RBD、Delta株RBD、Omicron株RBD的特异性抗体。此结果说明2C-Vac能够在小鼠模型中诱导出特异性抗体。
实施例6、抗血清的SARS-CoV-2假病毒中和效果评价
铺板：将Huh7细胞铺于96孔板，置于培养箱培养，次日其汇合度达到90％。
中和：将实施例4制备的抗血清热灭活(56℃，30min)后，将其梯度稀释，与等体积的含有100TCID50的假病毒(原始株SARS-CoV-2、Delta株SARS-CoV-2以及Omicron株SARS-CoV-2假病毒，记载于“Xiaojing Chi,et al.An ultrapotent RBD-targeted biparatopicnanobody neutralizes broad SARS-CoV-2variants.Signal Transduction andTargeted Therapy(2022)7:44”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)于37℃共同孵育1h。SARS-CoV-2假病毒含有荧光素酶报告基因，假型病毒具有感染目标靶细胞的能力，通过检测荧光素酶报告基因的方法可以测定假型病毒的感染能力与水平。设置阴性对照组：与抗血清等量的培养基与假病毒孵育。
感染：将96孔板中的培养基吸弃，向其中加入100μL的血清与假病毒的混合物。
检测：将96孔板中的培养基吸弃，用PBS洗涤细胞两次。使用Promega公司的luciferase荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：E4550)，按产品说明书裂解细胞并检测其中的荧光信号。
数据处理：荧光信号反应了细胞裂解液中的荧光素酶报告基因的含量，从而反映了假病毒的含量。通过以下公式计算抗血清对病毒的中和百分比。中和百分比＝(阴性对照孔的荧光值-试验孔的荧光值)/阴性对照孔的荧光值×100％。以中和百分比对稀释倍数作图，并按非线性拟合曲线，根据曲线求出中和百分比为50％时的血清稀释倍数，即为NT50。
结果如图10所示，由图可见对于原始株SARS-CoV-2(图中标注Prototype)、Delta株SARS-CoV-2以及Omicron株SARS-CoV-2假病毒，RBD WT 2C-Vac组、RBD Delta2C-Vac组以及RBD mix 2C-Vac组均比RBD WT单体对照组(表1)表现出更高的中和能力。此结果说明2C-Vac对SARS-CoV-2及其变种病毒具有良好的保护效果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种SARS-CoV-2亚单位疫苗，是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(A1)制备SpyCatcher-2C融合蛋白；
所述SpyCatcher-2C融合蛋白由SpyCatcher蛋白与肠道病毒的2C蛋白融合而成；
(A2)制备SpyTag-抗原融合蛋白；
所述SpyTag-抗原融合蛋白由SpyTag蛋白与SARS-CoV-2的抗原融合而成；
(A3)将所述SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白混合，获得SARS-CoV-2亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：步骤(A1)中，所述肠道病毒的2C蛋白为脊髓灰质炎病毒的2C蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：步骤(A2)中，所述SARS-CoV-2的抗原为SARS-CoV-2的RBD。
4.根据权利要求1-3中任一所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：步骤(A3)中，将所述SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白混合为：将所述SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白按照1:3的摩尔比在缓冲体系中混合；
进一步地，混合后还包括如下步骤：在冰上静置20h。
5.根据权利要求1-4中任一所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：所述SpyCatcher蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第16-132位；和/或
所述肠道病毒的2C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第145-358位；
和/或
所述SpyTag蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第21-33位；
和/或
所述SpyTag-抗原融合蛋白为如下(B1)-(B3)中任一种：
(B1)SpyTag-RBD WT融合蛋白；
所述SpyTag-RBD WT融合蛋白由所述SpyTag蛋白和RBD WT蛋白融合而成；所述RBD WT蛋白为SARS-CoV-2原始毒株的RBD蛋白；所述RBD WT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2的第45-243位；
(B2)SpyTag-RBD Delta融合蛋白；
所述SpyTag-RBD Delta融合蛋白由所述SpyTag蛋白和RBD Delta蛋白融合而成；所述RBD Delta蛋白为SARS-CoV-2的Delta型变异毒株的RBD蛋白；所述RBD Delta蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第27-225位；
(B3)SpyTag-RBD Omicron融合蛋白；
所述SpyTag-RBD Omicron融合蛋白由所述SpyTag蛋白和RBD Omicron蛋白融合而成；所述RBD Omicron蛋白为SARS-CoV-2的Omicron型变异毒株的RBD蛋白；所述RBD Omicron蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.4的第27-225位；
进一步地，所述SpyTag-RBD WT融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2；或
进一步地，所述SpyTag-RBD Delta融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3；或
进一步地，所述SpyTag-RBD Omicron融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
6.根据权利要求1-5中任一所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：在所述SARS-CoV-2亚单位疫苗的制备方法中，还包括将步骤(A3)中利用不同的所述SpyTag-抗原融合蛋白制备得到的不同所述SARS-CoV-2亚单位疫苗进行等摩尔混合的步骤。
7.一种SARS-CoV-2亚单位疫苗的制备方法，包括权利要求2-6任一中所述步骤。
8.用于制备权利要求1-6中任一所述SARS-CoV-2亚单位疫苗的成套产品，包括如下任一：
(C1)权利要求1-6任一中所述的SpyCatcher-2C融合蛋白和所述SpyTag-抗原融合蛋白；
(C2)核酸分子1和核酸分子2；所述核酸分子1为编码(C1)中所述的SpyCatcher-2C融合蛋白的核酸分子；所述核酸分子2为编码(C1)中所述SpyTag-抗原融合蛋白的核酸分子；
进一步地，所述核酸分子1如SEQ ID No.5所示；和/或，所述核酸分子2如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示；
(C3)表达盒1和表达盒2；所述表达盒1含有(C2)中的所述核酸分子1；所述表达盒2含有(C2)中的所述核酸分子2；
(C4)重组载体1和重组载体2；所述重组载体1含有(C2)中的所述核酸分子1；所述重组载体2含有(C2)中的所述核酸分子2；
(C5)重组细胞1或重组细胞2；所述重组细胞1含有(C2)中的所述核酸分子1；所述重组细胞2含有(C2)中的所述核酸分子2。
9.权利要求1-6中任一所述SARS-CoV-2亚单位疫苗或权利要求8所述的成套产品在如下任一中的应用：
(C1)制备能够中和SARS-CoV-2的产品；
(C2)制备用于治疗和/或预防由于SARS-CoV-2感染所致疾病的产品；
(C3)制备用于改善由于SARS-CoV-2感染所致症状的产品。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述SARS-CoV-2为原始毒株或变异毒株；
进一步地，所述变异毒株为Delta株和/或Omicron株。
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