CN118185886A - 一种用于活化co2的甲酸脱氢酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于活化CO2的甲酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变而来，在如下的一组或多组氨基酸残基发生突变：158位、235位、270位、274位。本发明提供了所述甲酸脱氢酶突变体的基因和蛋白序列、构建的表达载体和基因工程菌株以及在CO2活化中的应用。通过构建表达载体和基因工程菌，诱导表达甲酸脱氢酶突变体，以及体外纯酶催化CO2产甲酸。本发明开发的甲酸脱氢酶突变体具有优良的抗氧化性和催化活性，相对酶活最高为原始酶的743％，有利于CO2高效活化。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于活化CO2的甲酸脱氢酶突变体，包含该甲酸脱氢酶突变体氨基酸序列、核苷酸序列及其构建的表达载体和重组工程菌株，以及所述甲酸脱氢酶突变体、表达载体和重组工程菌株在活化CO2中的应用。
背景技术
生物催化将CO2转化为甲醇具有实现CO2活化和经济性转化的潜力，在这一反应过程中，甲酸脱氢酶FDH发挥了核心作用，这一过程的瓶颈问题是生物酶制剂的催化活性和稳定性。在CO2转化为甲醇的多酶级联反应中，利用来源于博伊丁假丝酵母的商品甲酸脱氢酶CbFDH催化甲酸→CO2的速率(Km＝3.3mM，Vmax＝0.02mM/min)远高于CO2→甲酸的速率(Km＝30-50mM，Vmax＝0.002mM/min)。因此，CO2定向高效转化为甲酸和其他产物存在挑战性。
目前，为改善甲酸脱氢酶FDH活性和稳定性，通过蛋白工程改造挖掘高效甲酸脱氢酶已成为提高CO2活化效率的重要途径。Kim等通过在Thiobacillus sp.KNK65MA表达甲酸脱氢酶基因，获得比Candida boidinii商品甲酸脱氢酶高5.8倍的甲酸产率(Plos One,2014,9,e103111)。Tishkov等通过比较9个不同来源甲酸脱氢酶氨基酸序列，并结合Pseudomonas sp.101生物酶制剂三级结构分析，对Pseudomonas sp.101甲酸脱氢酶的5个丝氨酸残基位置131、160、168、184和228进行诱变，获得比野生型甲酸脱氢酶热稳定性提高1.5倍的突变体(FEBS Letters,1999,445,183-188)。专利CN202011179775.1利用短肽识别模型PPR生物信息学平台，首次建立完整的甲酸脱氢酶数据库和短肽序列库(6987条蛋白序列、53个PPR组)，成功预测不同类型的甲酸脱氢酶的功能，自主创制来源于Paracoccussp.MKU1高效新型甲酸脱氢酶FDHPa，其对CO2亲和性和催化活性分别是商品甲酸脱氢酶CbFDH的1.6和22.8倍。
通过自主开发或改造甲酸脱氢酶，虽然改善了酶的催化活性和稳定性，提高了CO2活化效率，然而因CO2活化反应体系的复杂性，现有甲酸脱氢酶和/或其突变体在缓冲液中的结构稳定性和催化活性仍受到限制，甲酸产量远未达到规模化生物制造的需求，因此，进一步提高甲酸脱氢酶活化CO2的性能至关重要。基于以上背景和优势，本发明对前期自主创制的高效甲酸脱氢酶进行理性和非理性设计，获得对CO2活化还原效率进一步提升的甲酸脱氢酶突变体，为CO2经济性转化为甲醇提高技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于活化CO2的甲酸脱氢酶突变体，包括甲酸脱氢酶的氨基酸序列、编码其的核苷酸序列、基因表达载体以及重组工程菌株。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于活化CO2的甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体具有(I)或(II)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(I)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变而来，选自如下的一个或多个氨基酸残基发生突变：159位、235位、270位、274位，且氨基酸残基突变后为Ile、Gly、Leu、Met；
(II)所述甲酸脱氢酶突变体与(I)所述序列SEQ ID NO.1具有≥99％相同性的氨基酸序列；
本发明中优选的甲酸脱氢酶突变体，优选地，其特征在于，所述甲酸脱氢酶的氨基酸突变为以下所示氨基酸残基：在159位为Ile，和/或者在235位为Gly，和/或者在270为Leu，和/或者在274位为Met；和/或以上位点的两个或多个氨基酸残基突变。
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体为一组位点159Ile或274Met，两组位点159Ile和274Met，以及三组位点159Ile和235Gly和274Met。
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQID NO.4和SEQ ID NO.5。
第二方面，一种编码权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸，优选地，如编码SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列；更优选地，如SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明还提供了一种基因表达载体。所述基因表达载体包括：编码如第一方面所述的氨基酸序列的核苷酸序列或如第二方面所述的核苷酸序列。
所述表达载体可以是大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体。优选地，所述基因表达载体为pET质粒，优选为pETDuet质粒。
第四方面，本发明还提供一种如第三方面所述的基因表达载体的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
通过基因合成将SEQ ID NO.1序列构建于pETDuet质粒的BamHI/SacI酶切位点之间，构建质粒pETDuet-FDH。基于第一方面所述的单位点设计引物，以pETDuet-FDH为模板，通过PCR扩增序列，获得到单位点表达载体；多位点表达载体构建方法相同，以单位点表达载体为模板构建依次构建。
示例性的，所述构建方法具体包括如下步骤：
基于第一方面所述的单位点设计引物，即以第二方面所述如SEQ ID NO.6或SEQID NO.7突变位点为中心，设计17-25bp长度的引物，以pETDuet-FDH为模板，通过PCR扩增整个质粒序列，获得到单位点表达载体。两个位点表达载体构建：以含有SEQ ID NO.6序列的表达载体为模板，以SEQ ID NO.7突变位点为中心，设计17-25bp长度的引物，通过PCR扩增构建。三位点表达载体：以含有SEQ ID NO.8序列的表达载体为模板，以SEQ ID NO.9突变位点为中心，设计17-25bp长度的引物，通过PCR扩增构建。
第五方面，一种用于活化CO2的重组工程菌，包含如第三方面所述的基因表达载体和/或编码第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸和/或第二方面所述的核苷酸。所述工程菌可以是E.coli BL21(DE3)。
第六方面，本发明还提供一种利用如第五方面所述的重组工程菌制备甲酸的方法，所述方法包括如下步骤：
将所述重组工程菌培养、诱导后的得到的菌液离心并重悬，得到菌悬液，经超声破碎后进行蛋白纯化，得到游离的甲酸脱氢酶突变体，所述游离酶与含辅酶NADH的缓冲液混合，通入CO2反应，经8M尿素终止反应后，检测NADH消耗量和甲酸浓度。
作为本发明优选的技术方案，所述反应的温度为25～40℃，例如可以是25℃、30℃、35℃或40℃等，时间为0.5～3h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h或3h等，优选为0.5～1h。
优选地，所述混合液中NADH的浓度为0.001～5mM，例如可以是0.001mM、0.002mM、0.005mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.8mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mM、5mM等，优选为0.5～1mM。
优选地，所述混合液中甲酸脱氢酶的浓度为0.20mg/mL；；
优选地，所述缓冲液为100mM磷酸缓冲液，pH为7.0；
优选地，所述催化反应的温度为25℃；
优选地，所述催化反应在静置的条件下进行；
优选地，所述诱导后的菌液离心后，还包括在冻存操作，所述冻存为：在-80℃下冻存1h以上。
本发明中，在活化CO2后，检测NADH消耗的方法为：
用100mM pH 7.0的缓冲液中配制浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00mM的NADH标准溶液，通过多功能微孔板检测仪检测其在340nm波长处的OD值来制作NADH标准曲线，并依据标准曲线确定反应液中NADH的消耗量。
第七方面，本发明还提供一种利用如第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体、如第二方面所述的核苷酸、如第三方面基因表达载体或如第五方面所述的重组工程菌株在活化CO2中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种能够高效活化CO2的型甲酸脱氢酶突变体，所述该甲酸脱氢酶突变体同时可以通过构建表达载体、基因工程菌后诱导表达得到，甲酸脱氢酶突变体游离酶催化活化CO2时，催化效率较最高为原始酶的743％；
(2)本发明提供的甲酸脱氢酶突变体在150mM H2O2中放置1h后剩余酶活>50％，具有优良的抗氧化性；甲酸脱氢酶突变体氧化方向催化活性均低于原始酶，尤其是突变体SEQID NO.9，其氧化方向的初始反应速率和活性最低，有利于高效活化CO2，有潜在的应用前景。
附图说明
图1为甲酸脱氢酶突变体酶活比较。
图2为甲酸脱氢酶突变体抗氧化性。
图3为甲酸脱氢酶突变体氧化方向催化活性。
图4为甲酸脱氢酶突变体甲酸产量。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，本领域技术人员应该明了，下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
实施例1
本实施例提供一种基因工程菌株构建方法。
基于甲酸脱氢酶突变体基因ΔFDH(SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8或SEQID NO.9)，以SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7突变位点为中心设计引物，以pETDuet-FDH为模板，通过PCR扩增整个质粒，获得点突变体1、2，并依次以点突变质粒为模板构建两点和多点突变体3、4。并分别转入E.coli BL21(DE3)底盘细胞，构建用于甲酸合成的基因工程菌株，仍命名为ΔFDH1、ΔFDH2、ΔFDH3、ΔFDH4。
实施例2
本实施例提供一种游离的甲酸脱氢酶突变体的制备方法。
将实施例1中获得的工程菌株ΔFDH1、ΔFDH2、ΔFDH3、ΔFDH4在5mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，过夜培养，获得种子液。
将种子液按1％体积的转接量转接入50mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养，当OD600为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃继续培养20h后，4000rpm离心，收集菌体，置于-80℃冻存。
在4℃预冷缓冲液A(20mM磷酸钾缓冲液，500mM NaCl，20mM咪唑，调节pH 7.4)，缓冲液B(20mM磷酸钾缓冲液，500mM NaCl，500mM咪唑，调节pH 7.4)，保藏液(50mM磷酸钾缓冲液，10％甘油，调节pH 7.4)。利用预冷后的Binding buffer对-80℃冻存的菌体进行重悬，采用超声进行破碎，功率55％，超声2s，暂停3s，破碎液经4℃、12000rpm离心20min后获取上清液，上清液经0.22μm滤膜过滤后，使用5mL的Histrap纯化柱AKTA蛋白纯化仪上进行蛋白纯化，再用5mL HiTrap Desalting脱盐柱置换保藏液，最终获得溶于保藏液中的纯酶，利用BCA蛋白定量方法测定纯化得到的甲酸脱氢酶突变体的浓度并保存于-80℃。
实施例3
本实施例中对实施例2纯化所得突变体催化活性进行比较。
在1000μL催化体系中，底物为CO2，辅酶NADH浓度为1mM，甲酸脱氢酶突变体的添加量为0.2mg/mL，体系所用缓冲液为100mM磷酸缓冲液(pH7.0)。在25℃下反应1h，加10％8M尿素终止反应，12000rpm离心2min，取上清检测NADH消耗量。突变体的催化结果如图1所示，其中突变体ΔFDH1、ΔFDH2、ΔFDH3、ΔFDH4的酶活分别为初始酶活性的121.63％、143.85％、743.04％、358.88％，其中ΔFDH3的酶活最高。
实施例4
本实施例中比较甲酸脱氢酶突变体ΔFDH3和ΔFDH4的抗氧化性。
使用实施例2纯化所得突变体进行实验，将ΔFDH3和ΔFDH4放置于150mM H2O2溶液中，25℃放置0、1和3h后，取0.2mg突变酶加入1000μL反应体系中，反应体系还包括5mM辅酶NADH和100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，底物为50mM NaHCO3，在25℃下反应1h，加10％8M尿素终止反应，12000rpm离心2min，取上清检测NADH剩余量。由于H2O2对辅酶NADH有一定的氧化作用，因此，对照组1000μL反应体系中包括与实验组等量的H2O2，0.2mg突变酶，5mM辅酶NADH和100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，对照组不添加底物。通过计算对照组与实验组NADH剩余量的差值获得NADH消耗量，与放置0h的NADH消耗量进行比较计算出剩余相对酶活来表示突变酶的抗氧化性，结果如图2所示，突变体ΔFDH4在150mM H2O2溶液中放置1h后剩余酶活仍>50％，为54.2％，而原始酶FDH已完全失活；放置3h后，ΔFDH3和ΔFDH4剩余酶活仍有30％和44％。
实施例6
本实施例中比较甲酸脱氢酶突变体ΔFDH3和ΔFDH4氧化方向的催化活性。
使用实施例2纯化所得突变体进行实验，在500μL催化体系中，加入5mM HCOOH为底物，辅酶NAD+浓度为1mM，甲酸脱氢酶的添加量为0.2mg/mL，体系所用缓冲液为100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。混匀体系后迅速分装至96孔板200μL/孔，使用动力学方法检测NADH产量，340nm每分钟扫描一次，连续扫描10min。另外，相同反应体系，使用动力学方法检测NADH产量，340nm每2min扫描一次，再次检测连续扫描1h直至反应平衡。结果如图3所示，甲酸脱氢酶突变体的HCOOH氧化活性排序为FDH>ΔFDH3>ΔFDH4，ΔFDH3氧化方向初始反应速率较低为FDH的51.2％，但在反应1h过程中，氧化活性在逐渐增长，虽最终氧化活性仍低于FDH，但相对较高。而ΔFDH4氧化方向初始反应速率仅为FDH的20.6％，且反应10min后氧化方向催化活性快速增长，在20min时达到最高后虽有较大波动，但基本稳定不再变化，反应1h后，氧化方向酶活明显低于FDH。
实施例7
本实施例基于实施例3的甲酸脱氢酶突变体酶活比较测定最优突变体的甲酸产量。
使用实施例2纯化所得突变体进行实验，在1000μL催化体系中，底物为CO2，辅酶NADH浓度为1mM，甲酸脱氢酶的添加量为0.2mg/mL，体系所用缓冲液为100mM磷酸缓冲液(pH7.0)。在25℃下反应1h，加10％8M尿素终止反应，12000rpm离心2min，取上清检测通过显色反应检测甲酸产量。结果如图4所示，突变体最优甲酸产量为0.23mg/mL。
Claims (9)
1.一种用于活化CO2的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体具有(I)或(II)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(I)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变而来，选自如下的一个或多个氨基酸残基发生突变：159位、235位、270位、274位，且氨基酸残基突变后为Ile、Gly、Leu、Met；
(II)所述甲酸脱氢酶突变体与(I)所述氨基酸序列具有≥99％相同性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列选自如下的一组或多组位点，突变为以下所示氨基酸残基：在159位为Ile，和/或者在235位为Gly，和/或者在270为Leu，和/或者在274位为Met。
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体为一组位点159Ile或274Met，两组位点159Ile和274Met，以及三组位点159Ile和235Gly和274Met。
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5。
3.一种编码权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列，优选地，如编码SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列；更优选地，如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
4.一种用于异源表达甲酸脱氢酶突变体的基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体包括：编码如权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列或如权利要求3所述的核苷酸序列；
优选地，所述基因表达载体为pET质粒，优选为pETDuet质粒。
5.一种如权利要求4所述的基因表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
通过基因合成将SEQ ID NO.1序列构建于pETDuet质粒的BamHI/SacI酶切位点之间，构建质粒pETDuet-FDH。基于权利要求1或2所述的单位点设计引物，以pETDuet-FDH为模板，通过PCR扩增序列，获得到单位点表达载体；多位点表达载体构建方法相同，以单位点表达载体为模板构建。
6.一种用于合成甲酸脱氢酶突变体的重组工程菌，其特征在于，包含如权利要求4所述的基因表达载体和/或编码权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列或如权利要求3所述的核苷酸序列。所述工程菌可以是E.coli BL21(DE3)。
7.一种利用如权利要求6表达的甲酸脱氢酶突变体活化CO2的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将所述重组工程菌培养、诱导后的得到的菌液离心并重悬，得到菌悬液，经超声破碎后进行蛋白纯化，得到游离的甲酸脱氢酶突变体，所述游离酶与含辅酶NADH的缓冲液混合，通入CO2反应，经8M尿素终止反应后，检测NADH消耗量和甲酸浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系中NADH的浓度为0～10mM，甲酸脱氢酶的添加量为0～2.0mg/mL，体系温度为25～40℃，时间为0.5～3h；
优选地，所述混合反应的时间为0.5～1h；
优选地，所述混合液中NADH的浓度为1～5mM；
优选地，所述混合液中甲酸脱氢酶的浓度为0.20mg/mL；；
优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH为7.0；
优选地，所述催化反应的温度为25℃；
优选地，所述催化反应在静置的条件下进行；
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)将重组工程菌培养、诱导后得到的菌液离心，冻存后重悬得到菌悬液，用超声细胞破碎仪裂解菌悬液后，8000～12000rpm离心20min，获得粗酶液；
(2)利用AKTA蛋白纯化仪对粗酶液中的甲酸脱氢酶突变体进行分离纯化，并利用BCA蛋白定量的方法对所述游离酶进行定量。
9.如权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体氨基酸序列、如权利要求3所述的核苷酸序列、如权利要求5所述的基因表达载体或如权利要求6所述的重组工程菌株在CO2活化中的应用。
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