CN118161473A - Isrib在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
ISRIB在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其中，所述ISRIB为trans‑ISRIB，其分子式为C22H24Cl2N2O4，CAS号为1597403‑47‑8，分子量为451.34。所述trans‑ISRIB的给药量为1‑5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。本发明通过在小鼠tMCAO模型注射ISRIB治疗可显著减小脑梗塞面积，减轻脑水肿，提示ISRIB对缺血性脑卒中具有一定的防治作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及ISRIB在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。
背景技术
脑卒中，又称脑中风或脑血管意外，是一组以脑部缺血或出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，主要分为出血性脑卒中(脑出血及蛛网膜下腔出血)和缺血性脑卒中(脑梗塞及脑血栓形成)两大类，其中以缺血性脑卒中最为常见。该病发病急、病死率高，是世界上最主要的致死性疾病之一。卒中的死亡率和年龄呈正相关，目前我国已进入老年化社会，其发病率及对国人的影响将有进一步增加的趋势，因此研究卒中尤其是缺血性脑卒中的病理机制及治疗防护一直是医药界的重点课题。
整合应激反应(ISR)是对各种细胞应激的高度保守的细胞内信号网络反应。ISR调节基因表达和蛋白质合成，在蛋白质运输、蛋白质质量控制和细胞核与细胞质之间的亚细胞器通讯中发挥重要作用。ISR使细胞能够有效地应对各种应激条件，同时保持其正常功能。整合应激反应(ISR)的四种激酶(PERK、PKR、GCN2和HRI)通过介导真核翻译起始因子2α(eIF2α)在ser51位点的磷酸化来调节ISR信号传导和细胞内蛋白翻译。早期ISR有利于细胞自我修复和恢复体内平衡。然而在ISR的后期，这种效应会逆转，此时细胞中未折叠蛋白积聚，应激损伤超过了ISR的调节能力，而且ISR的持续激活会促进凋亡因子CHOP基因的转录。CHOP可以与激活转录因子4(ATF4)相互作用，促进重新启动蛋白翻译以增加蛋白负荷，激活自噬、凋亡等途径，导致细胞死亡。目前，一些研究发现在心肌缺血、认知障碍、癌症、白质消失等疾病的病理过程中，ISR具有重要的作用。白质消融性白质脑病(VWM)是一种常染色体隐性遗传病，通常由eIF2B亚基的异常突变引起，这些突变会导致eIF2B的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)活性部分缺失。阿尔兹海默症(AD)，帕金森综合征(PD)等神经退行性疾病亦和ISR紧密联系。
ISRIB(C22H24Cl2N2O4，trans-ISRIB，CAS号为1597403-47-8)是一种ISR的小分子抑制剂。现有技术中，ISRIB在一些与ISR联系紧密的疾病中展现出了其独特的治疗作用。ISRIB可以逆转老年小鼠的空间记忆损伤，改善阿尔茨海默病(AD)模型小鼠的学习记忆和海马的突触可塑性。ISRIB在癌症和炎症等疾病中也展示出治疗价值，ISRIB显著降低小鼠肿瘤生长并延长其生存期。COVID-19感染可能与糖尿病相关，感染SARS-CoV-2后，β细胞的胰岛素表达较低，而α细胞和腺泡细胞标志物(包括胰高血糖素和胰蛋白酶)表达较高，表明β细胞转分化，而ISRIB逆转eIF2α途径介导的胰岛β细胞转分化。
目前，在缺血性脑卒中的病理机制中，ISR产生何种作用尚待阐明，ISRIB对缺血性脑卒中的预防和治疗作用也未见相关研究。为此，本发明人建立了小鼠短暂局灶性大脑中动脉脑缺血(tMCAO)模型，研究了ISRIB对体内脑缺血模型的保护作用。
发明内容
本发明提供ISRIB在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其目的是要寻求应用ISRIB作为有效成份制备防治缺血性脑卒中的药物。
为达到上述目的，本发明采用的第一技术方案是：ISRIB在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其中，所述ISRIB为trans-ISRIB，其分子式为C22H24Cl2N2O4，CAS号为1597403-47-8，分子量为451.34，结构式如式I所示：
为达到上述目的，本发明采用的第二技术方案是：一种用于防治缺血性脑卒中的药物，其特征在于：包括ISRIB和药学上可接受的载体，所述ISRIB为trans-ISRIB，其分子式为C22H24Cl2N2O4，CAS号为1597403-47-8，分子量为451.34，结构式如式I所示：
上述第一和第二技术方案中的有关内容解释如下：
1.上述两方案中，所述trans-ISRIB为现有物质，它是一种有效的选择性小分子PERK信号抑制剂。其中文名称可以称为整合应激反应抑制剂，也可以称为综合应激反应抑制剂，或者整合应激通路调节剂。
2.上述两方案中，所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d(mg/kg/d表示毫克/每公斤/每天)。
3.上述两方案中，所述trans-ISRIB的给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
4.上述第二方案中，除了所述trans-ISRIB可以单独作为防治缺血性脑卒中的药物而外，trans-ISRIB也可以与GSK2606414、GSK2656157和Salubrinal中的至少一种组合作为药物。具体包括以下组合方式：
(1)所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
(2)所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2656157组合，其中，GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
(3)所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
(4)所述trans-ISRIB与eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
(5)所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414和eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
(6)所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2656157和eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式均包括口服、静脉注射或静脉滴注。
(7)所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157，以及eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式均包括口服、静脉注射或静脉滴注。
本发明的作用机理：ISRIB(trans-ISRIB)是一种整合应激反应(ISR)的小分子抑制剂，能够抑制eIF2α的磷酸化来靶向ISR通路。研究表明，ISRIB特异性作用于eIF2B，促进了eIF2B十聚体复合物的组装，ISRIB增强了eIF2B的稳定性，使其恢复活性，促进eIF2-GTP-Met-tRNAi三元复合物的组装。这种作用抑制了eIF2α的磷酸化，从而干扰了ISR通路，减轻了ISR的不利效应。此外，ISRIB主要减少了长期ISR导致的细胞死亡，对早期ISR介导的细胞保护作用没有干扰。另外，ISR信号通路中的激酶抑制剂还可以包括PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157，以及eIF2磷酸酶的抑制剂Salubrinal。由于GSK2606414有抑制细胞中PERK的活化作用，GSK2656157是PERK酶活性的ATP竞争性抑制剂，Salubrinal是一种选择性eIF2α去磷酸化抑制剂，可以抑制ER应激介导的细胞凋亡，因此trans-ISRIB能够与PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157，eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合并且具有协同效果。
本发明ISRIB在缺血性脑卒中应用的优点和效果是：
1.ISRIB在动物实验中显著减少脑梗塞面积20－30％，由此可见ISRIB在缺血性脑卒中的应用具有显著的神经保护作用。
2.ISRIB作为防治缺血性脑卒中的药物相对安全。ISRIB在防治缺血性脑卒中的应用量较小，并且ISRIB本身没有生物毒性，已有相关文献证明，请参见：Halliday M,RadfordH,Sekine Y,Moreno J,Verity N,le Quesne J,et al.Partial restoration of proteinsynthesis rates by the small molecule ISRIB prevents neurodegenerationwithout pancreatic toxicity.Cell Death Dis 2015；6:e1672.。因此，可以认为ISRIB治疗缺血性脑卒中毒性较小，相对安全。
附图说明
附图1为本发明ISRIB减少小鼠tMCAO后的缺血损伤图，其中，图1A表示ISRIB给药流程示意图；图1B表示脑切片TTC染色图；图1C表示脑梗塞面积定量分析图；图1D表示脑含水量测定图；图1E表示LONGA法神经行为学评分图。
附图2为本发明ISRIB在小鼠tMCAO/R模型缺血损伤的时间窗研究图，其中，图2A表示ISRIB给药流程示意图；图2B表示脑切片TTC染色图；图2C表示脑梗塞面积定量分析图；图2D表示脑含水量测定图；图2E表示LONGA法神经行为学评分图。
附图3为本发明ISRIB对小鼠脑缺血再灌注后神经功能恢复的影响图，其中，图3A表示ISRIB给药流程示意图；图3B表示平衡木实验测试图；图3C表示转棒实验测试图；图3D表示缺血半球的脑萎缩代表图；图3E表示脑萎缩体积测量图。
附图4为本发明ISRIB通过抑制ISR来减轻缺血再灌注损伤图，其中，图4A和图4B表示ISRIB对脑缺血后蛋白质合成速率的影响的蛋白印迹代表图和定量图；图4C表示ISRIB对CHOP,eIF2α磷酸化，PERK磷酸化和ATF4蛋白印迹代表图；图4D表示ISRIB对CHOP影响的定量图；图4E表示ISRIB对eIF2α磷酸化影响的定量图；图4F表示ISRIB对PERK磷酸化影响的定量图；图4G表示ISRIB对ATF4影响的定量图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例：
ISRIB在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其中，所述ISRIB为trans-ISRIB，其分子式为C22H24Cl2N2O4，CAS号为1597403-47-8，分子量为451.34，结构式如式I或图1所示：
所述trans-ISRIB为现有物质，它是一种有效的选择性小分子PERK信号抑制剂。其中文名称可以称为整合应激反应抑制剂，也可以称为综合应激反应抑制剂，或者整合应激通路调节剂。
所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d。所述trans-ISRIB的给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。具体trans-ISRIB在缺血性脑卒中的使用方法：口服给药1-5mg/kg/d，也可以是静脉注射或静脉滴注1-5mg/kg/d。
一种用于防治缺血性脑卒中的药物，包括ISRIB和药学上可接受的载体，所述ISRIB为trans-ISRIB，其分子式为C22H24Cl2N2O4，CAS号为1597403-47-8，分子量为451.34，结构式如式I或图1所示：
下面提供动物实验以及数据统计分析的有关情况：
1.实验方法
(1)小鼠短暂局灶性大脑中动脉脑缺血再灌注(tMCAO)模型的建立
ICR小鼠，雄性，体重25－30g，清洁级。小鼠背位固定，颈正中切口，分离右侧颈总、颈内、颈外动脉，结扎颈外动脉，颈总动脉近心端结扎，远心端用医用线结扎阻断血流，在颈外动脉剪一小口，将线栓(Doccol Corporation)经颈外动脉***颈内动脉，打开远心端丝线，将线栓缓缓推入至大脑中动脉起始端，结扎固定丝线，缺血2h后，拔出线栓实现再灌，结扎缝合。
在ISRIB的量效关系实验中(图1)，小鼠随机分为5组：tMCAO组、tMCAO+ISRIB0.6mg/kg、1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg,ISRIB在tMCAO模型后立即给药，每组10只小鼠。ISRIB购买自江苏睿捷生物科技有限公司，AbMole。
在ISRIB的时间窗实验中(图2)，小鼠随机分为5组：tMCAO组、tMCAO+ISRIB1.25mg/kg0h、1h、3h、6h组,在tMCAO/R术后0h、1h、3h和6h腹腔注射给予ISRIB 1.25mg/kg，每组10只小鼠。
在ISRIB的长期实验中(图3)，小鼠随机分为4组：正常对照组、tMCAO组、Sham+ISRIB,tMCAO+ISRIB，ISRIB剂量为1.25mg/kg，持续给药一周。之后减少给药频率，每隔3天给药1次，每组6只小鼠。
在ISRIB作用机制实验中(图4)，小鼠随机分为13组：正常对照组，对照给药组(1h、3h、6h、12h)，tMCAO组(1h、3h、6h、12h)、tMCAO+ISRIB腹腔注射1.25mg/kg(1h、3h、6h、12h)，每组3只小鼠。
(2)脑梗塞面积测定
小鼠缺血再灌24h后处死并完整取脑，切为5片，每片厚2mm。脑片用1％(1g溶于100ml生理盐水)的-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色，37℃避光染色10min，每隔3-4分钟摇晃数次，使染色均匀。正常组织呈红色，梗塞组织为白色。用Image J软件计算脑梗塞面积所占百分比。
(3)脑含水量测定
TTC染色后，称取大脑湿重，置于烘箱烘干，称量干重，计算含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％。
(4)神经症状评分
脑缺血小鼠行为学评分参照Longa法，方法如下：
0分：无神经功能缺损症状；
1分：对侧前肢屈曲；
2分：拉尾时对侧前肢抓力下降；
3分：无方向性运动，抓尾时向对侧转圈；
4分：自发向对侧转圈及意识障碍。
(5)平衡木实验
平衡木行走实验用于评定小鼠的运动整合能力及平衡协调能力。平衡木长115cm，宽2cm，高44cm，提前一天训练小鼠，使小鼠自主地穿过平衡木的首末位置两次。测试时，记录小鼠从平衡木一端到达另一端的时间，只计爬行时间，停留时间不计，若中途摔落，暂停时间，并从摔落处继续出发计时。每次试验每只小鼠测3次，取平均值，每测完一次休息1h。
(6)转棒实验
转棒实验要求小鼠在匀速旋转棒上保持平衡，这需要本体觉、位置觉及微调运动能力，因此是评价小鼠运动协调的重要方法。提前一天训练小鼠，仪器设定为4转/min恒速运转60s，使小鼠能自主地在转棒上保持平衡。测试时，仪器设定为开始时以4转/min恒速运转，然后在300s内从4转/min匀加速到40转/min。记录其在转棒上的运动时间及跌落时间的转棒旋转速度，每次试验每只小鼠测3次，取平均值，每测完一次休息30min。
(7)脑萎缩体积检测
小鼠深度麻醉后分别经PBS(磷酸盐缓冲液)和4％多聚甲醛进行心脏灌流，完整地取出脑组织，使用4％的多聚甲醛固定至少72h，使用脑模将固定完成的脑均匀地切成5片，每片约2mm，使用扫描仪扫描，脑萎缩体积＝(萎缩体积÷半脑体积)×100％，使用Image J计算大脑右侧萎缩体积。
(8)免疫印迹
取缺血侧皮质，匀浆，并用含有150mM(毫摩尔)NaCl、10mM Tris-HCl、1％脱氧胆酸钠、1％ Triton X-100(曲拉通X-100)、5mM EDTA(乙二胺四乙酸)、10％ SDS(十二烷基硫酸钠)和2％蛋白酶抑制剂片(Roche)的缓冲液裂解，缓冲液pH值为7.4。BCA法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳，30-50μg蛋白上样，转移至硝酸纤维素膜，蛋白印迹分析PERK，P-PERK，PKR，P-PKR,eIF2α，P-eIF2a，ATF4水平。以βactin为内参。
(9)数据统计与分析
数据均以均数±SD(Mean±SD)表示，统计分析采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，P<0.05为统计学差异有显著性。
2.实验结果
(1)ISRIB减少小鼠tMCAO后的缺血损伤
对tMCAO小鼠模型，给药ISRIB 1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg显著减小tMCAO再灌后脑梗塞面积，梗死面积减小约20％-30％，降低脑含水量，改善神经功能(图1B-E)。表明ISRIB对缺血性脑卒中具有一定的防治作用。
图1为ISRIB减少小鼠tMCAO后的缺血损伤图，其中，图1A表示ISRIB给药流程示意图。从图1A看出，ISRIB在tMCAO模型后立即给药，TTC检测脑梗塞面积,检测神经行为学和脑含水量。图1B表示脑切片TTC染色图，其中TTC染色后梗塞区显示白色,图1C表示脑梗塞面积定量分析图。从图1B和图1C看出，ISRIB 1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg显著减小tMCAO再灌后脑梗塞面积，梗死面积减小约20％-30％。图1D表示脑含水量测定图。从图1D看出，ISRIB2.5mg/kg和5mg/kg显著降低脑含水量。图1E表示LONGA法神经行为学评分图。从图1E看出，ISRIB 1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg降低神经损伤。Mean±SD,与给予溶媒组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
(2)ISRIB在小鼠tMCAO/R模型的时间窗研究
对tMCAO小鼠模型，用1.25mg/kg ISRIB分别在复灌后0h、1h、3h和6h给药。其中复灌后0h、1h和3h给药显著减小了tMCAO再灌后脑梗塞面积，梗死面积减小约20％-30％(图2B和图2C)，降低脑含水量(图2D),改善神经功能(图2E)。表明ISRIB对缺血性脑卒中的时间窗可延长至缺血后3小时。
图2为ISRIB在小鼠tMCAO/R模型缺血损伤的时间窗研究图，其中，图2A表示ISRIB给药流程示意图。从图2A看出，用1.25mg/kg ISRIB分别在tMCAO小鼠复灌后0h、1h、3h和6h给药，TTC检测脑梗塞面积,检测神经行为学和脑含水量。图2B表示脑切片TTC染色图，TTC染色后梗塞区显示白色。图2C表示脑梗塞面积定量分析图。从图2B和2C看出，复灌后0h、1h和3h，ISRIB给药显著减小了tMCAO再灌后脑梗塞面积。图2D表示脑含水量测定图。从图2D看出，复灌后0h、1h和3h，ISRIB给药显著减小了tMCAO再灌后脑含水量。图2E表示LONGA法神经行为学评分图。从图2E看出，复灌后0h、1h，ISRIB给药显著改善神经功能。Mean±SD,与给予溶媒组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
(3)ISRIB改善小鼠脑缺血再灌注后长期神经功能恢复
对小鼠进行tMCAO/R术，并在术后持续注射1.25mg/kg ISRIB。在tMCAO术后第14天和第28天对小鼠进行了转棒试验和平衡木试验，在术后第30天采集脑标本进行脑萎缩体积检测和定量分析(图3A)，以检测ISRIB对神经功能恢复的影响。在平衡木实验中，ISRIB能显著改善小鼠的协调能力(图3B),在转棒实验中，ISRIB有改善小鼠运动能力的趋势(图3C)。ISRIB长期给药可以显著减低tMCAO/R小鼠的脑萎缩体积(图3D和图3E)。这些数据表明，ISRIB改善了小鼠tMCAO模型的长期功能恢复，并减轻缺血性脑半球萎缩。
图3为ISRIB对小鼠脑缺血再灌注后长期存活及神经功能恢复的影响图，其中，图3A表示ISRIB给药流程示意图。从图3A看出，对小鼠进行tMCAO/R术，并在术后持续注射1.25mg/kg ISRIB。在tMCAO术后第14天和第28天对小鼠进行了转棒试验和平衡木试验,在术后第30天采集脑标本进行脑萎缩体积检测和定量分析。图3B表示平衡木实验测试图。从图3B看出,tMCAO术后第14天，ISRIB显著改善小鼠的协调能力。图3C表示转棒实验测试图，从图3C看出，ISRIB有改善小鼠运动能力的趋势。图3D表示缺血半球的脑萎缩代表图；图3E表示脑萎缩体积测量图，从图3D和3E看出，ISRIB长期给药可以显著减低tMCAO/R小鼠的脑萎缩体积。Mean±SD,n＝6,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
(4)ISRIB通过抑制ISR来减轻缺血再灌注损伤
利用嘌呤霉素的抗体，通过免疫印迹检测了脑缺血再灌注后蛋白质的合成速率。脑缺血后6h和12h的蛋白合成速率显著下降，而ISRIB在缺血后12h能够恢复蛋白质的合成(图4A和图4B)。我们进一步检测了ISRIB给药后，在脑缺血再灌注后不同时间点，ISR关键蛋白的表达变化。结果表明，在ISRIB治疗6h可以显著降低CHOP的表达(图4D)。在ISRIB治疗1h-12h可以显著降低P-eIF2α的表达(图4E)。在ISRIB治疗3h可以显著降低P-PERK的表达(图4F)。在ISRIB治疗12h可以显著降低ATF4的表达(图4G)。表明ISRIB通过抑制ISR来减轻缺血再灌注损伤。
图4为ISRIB通过抑制ISR来减轻缺血再灌注损伤图，其中，图4A和图4B表示ISRIB对脑缺血后蛋白质合成速率的影响的蛋白印迹代表图和定量图，嘌呤霉素在样本采集前0.5h腹腔注射。从图4A和4B看出，ISRIB在缺血后12h能够恢复蛋白质的合成。图4C表示ISRIB对CHOP,eIF2α磷酸化，PERK磷酸化和ATF4蛋白印迹代表图。图4D表示ISRIB对CHOP影响的定量图，从图4D看出，在ISRIB治疗6h可以显著降低CHOP的表达。图4E表示ISRIB对eIF2α磷酸化影响的定量图，从图4E看出，在ISRIB治疗1h-12h可以显著降低P-eIF2α的表达。图4F表示ISRIB对PERK磷酸化影响的定量图。从图4F看出，在ISRIB治疗3h后可以显著降低P-PERK的表达。图4G表示ISRIB对ATF4影响的定量图。从图4G看出，在ISRIB治疗12h后可以显著降低ATF4的表达。Mean±SD,n＝3，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。
结论：在小鼠tMCAO模型注射ISRIB治疗可显著减小脑梗塞面积，减轻脑水肿，改善神经功能，其作用时间窗可延长至缺血后3小时，在长期实验中，ISRIB改善了小鼠tMCAO模型的长期功能恢复，并减轻缺血性脑半球萎缩，ISRIB通过抑制ISR来减轻缺血再灌注损伤。这些结果说明ISRIB对缺血性脑卒中具有一定的防治作用。
针对上述实施例，本发明可能产生的变化描述如下：
以上实施例是以trans-ISRIB单独作为防治缺血性脑卒中的药物有效活性成份，除此而外trans-ISRIB也可以与GSK2606414、GSK2656157和Salubrinal中的至少一种组合作为药物有效活性成份。具体包括以下组合方式：
1.所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。由于GSK2606414有抑制细胞中PERK的活化作用，因此trans-ISRIB能够与PERK激酶抑制剂GSK2606414组合并且具有协同效果。这是本领域技术人员能够理解和知晓的。
2.所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2656157组合，其中，GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。由于GSK2656157是PERK酶活性的ATP竞争性抑制剂，因此trans-ISRIB能够与PERK激酶抑制剂GSK2656157组合并且具有协同效果。这是本领域技术人员能够理解和知晓的。
3.所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。由于GSK2606414有抑制细胞中PERK的活化作用，GSK2656157是PERK酶活性的ATP竞争性抑制剂，因此trans-ISRIB能够与PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157组合并且具有协同效果。这是本领域技术人员能够理解和知晓的。
4.所述trans-ISRIB与eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。由于Salubrinal是一种选择性eIF2α去磷酸化抑制剂，可以抑制ER应激介导的细胞凋亡，因此trans-ISRIB能够与eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合并且具有协同效果。这是本领域技术人员能够理解和知晓的。
5.所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414和eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。由于GSK2606414有抑制细胞中PERK的活化作用，Salubrinal是一种选择性eIF2α去磷酸化抑制剂，可以抑制ER应激介导的细胞凋亡，因此trans-ISRIB能够与GSK2606414和Salubrinal组合并且具有协同效果。这是本领域技术人员能够理解和知晓的。
6.所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2656157和eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式均包括口服、静脉注射或静脉滴注。由于GSK2656157是PERK酶活性的ATP竞争性抑制剂，Salubrinal是一种选择性eIF2α去磷酸化抑制剂，可以抑制ER应激介导的细胞凋亡，因此trans-ISRIB能够与GSK2656157和Salubrinal组合并且具有协同效果。这是本领域技术人员能够理解和知晓的。
7.所述trans-ISRIB与PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157，以及eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal组合，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44。GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5。Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81。所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式均包括口服、静脉注射或静脉滴注。由于GSK2606414有抑制细胞中PERK的活化作用，GSK2656157是PERK酶活性的ATP竞争性抑制剂，Salubrinal是一种选择性eIF2α去磷酸化抑制剂，可以抑制ER应激介导的细胞凋亡，因此trans-ISRIB能够与PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157以及Salubrinal组合并且具有协同效果。这是本领域技术人员能够理解和知晓的。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.ISRIB在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其中，所述ISRIB为trans-ISRIB，其分子式为C22H24Cl2N2O4，CAS号为1597403-47-8，分子量为451.34，结构式如式I所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述trans-ISRIB的给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
4.一种用于防治缺血性脑卒中的药物，其特征在于：包括ISRIB和药学上可接受的载体，所述ISRIB为trans-ISRIB，其分子式为C22H24Cl2N2O4，CAS号为1597403-47-8，分子量为451.34，结构式如式I所示：
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述trans-ISRIB的给药量为1-5mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：包括PERK激酶抑制剂GSK2606414，其GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44；所述GSK2606414的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
7.根据权利要求4或6所述的药物，其特征在于：包括PERK激酶抑制剂GSK2656157，其GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5；所述GSK2656157的给药量为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
8.根据权利要求4或6所述的药物，其特征在于：包括eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal，其CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81；所述Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式包括口服、静脉注射或静脉滴注。
9.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：包括PERK激酶抑制剂GSK2656157和eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal，其中，GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5；Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81；所述GSK2656157和Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式均包括口服、静脉注射或静脉滴注。
10.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：包括PERK激酶抑制剂GSK2606414和GSK2656157，以及包括eIF2磷酸酶抑制剂Salubrinal，其中，GSK2606414的CAS号为1337531-36-8，分子式为C24H20F3N5O，分子量为451.44；GSK2656157的CAS号为1337532-29-2，分子式为C23H21FN6O，分子量为416.5；Salubrinal的CAS号为405060-95-9，分子式为C21H17Cl3N4OS，分子量为479.81；所述GSK2606414、GSK2656157和Salubrinal的给药量均为0.1-10mg/kg/d，给药方式均包括口服、静脉注射或静脉滴注。
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