CN118147142A - 一种靶向肿瘤细胞端粒的sgRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向肿瘤细胞端粒的sgRNA及其应用，属于生物技术领域。上述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过实验证实，该sgRNA能够特异性识别端粒DNA重复序列，然后利用SaCas9核酸酶对其进行持续切割，从而缩短肿瘤细胞端粒长度，最终杀伤肿瘤细胞。本发明提供了的sgRNA可以通过缩短肿瘤细胞端粒长度实现杀伤肿瘤细胞的目的，这对肿瘤的治疗提供了科学依据和新方向，具有重要的医学价值。

Description

一种靶向肿瘤细胞端粒的sgRNA及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种靶向肿瘤细胞端粒的sgRNA及其应用。

背景技术

RISPR/Cas9基因编辑技术：CRISPR/Cas9基因编辑技术是目前最前沿、最有效的基因组编辑方法。CRISPR/Cas9的技术原理包括sgRNA引导的Cas9靶向DNA基因编辑和DNA修复两个基本过程。

2020年，吕志民团队在《Nature cell biology》期刊上发表研究，使用空肠弯曲菌CRISPR-Cas9融合腺嘌呤碱基编辑器(CjABE)校正了胶质瘤TERT启动子突变，这种修饰阻断了E26转录因子家族成员与TERT启动子的结合，降低了TERT转录和TERT蛋白表达，并诱导癌细胞衰老和增殖停滞。局部注射表达sgRNA引导的CjABE的腺相关病毒可抑制携带TERT启动子突变胶质瘤的生长，这些临床前概念验证研究确立了基因编辑作为癌症治疗方法的可行性；2021年，刘如谦研究团队在《Nature》期刊上发表研究，针对镰刀型细胞贫血病，对红细胞进行单碱基编辑，能将80％的突变血红蛋白变为具有功能的变异血红蛋白；2023年，刘如谦研究团队在《Science》期刊上发表研究，展示了单碱基编辑***通过一次性治疗，治愈脊髓性肌萎缩症(SMA)的潜力，将SMA模型小鼠的最长生存时间延长了10倍。综上所述，对于基因突变引起的疾病，CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种非常有前景的治疗方法。

如今CRISPR/Cas9基因编辑技术对于治疗基因突变疾病的应用已经十分成熟。但是，目前还没有研究证明可以利用该技术靶向肿瘤细胞的端粒序列，使肿瘤细胞端粒序列缩短，从而杀灭肿瘤细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向肿瘤细胞端粒的sgRNA及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该sgRNA能够特异性识别端粒DNA重复序列，然后利用SaCas9核酸酶对其进行持续切割，从而缩短肿瘤细胞端粒长度，最终杀伤肿瘤细胞。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种靶向肿瘤细胞端粒的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明还提供了转录所述的sgRNA的DNA分子。

本发明还提供含有所述的sgRNA或所述的DNA分子的表达盒。

本发明还提供了含有所述的表达盒的重组载体。

本发明还提供了含有所述的重组载体的重组菌。

本发明还提供了一种所述的sgRNA或所述的DNA分子或所述的表达盒或所述的重组载体或所述的重组菌在如下任一项中的应用：

(1)在制备缩短肿瘤细胞端粒长度的药物中的应用；

(2)在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的是，所述肿瘤包括胶质瘤。

本发明还提供了一种体外基于CRISPR***构建端粒长度缩短的肿瘤细胞模型的方法，包括以下步骤：

构建包含所述的sgRNA的重组载体；

将所述重组载体与Cas9表达载体转染肿瘤细胞中。

利用所设计的sgRNA特异性识别并结合目的基因片段(即为端粒DNA重复序列)，然后将SaCas9核酸酶引导到所述目的基因片段后对所述目的基因片段进行剪切，实现对目的基因的基因编辑，所述编辑方法适用于疾病的诊断和治疗。这种直接利用CRISPR/Cas9技术切割端粒DNA的方法，相比于现有的抑制端粒酶活性，效率更高，方法更简便，成本较低，且没有抑制酶活性的后续问题。

优选的是，所述肿瘤细胞包括但不限于胶质瘤。还可以为其它类型人细胞。

本发明还提供了一种缩短肿瘤细胞端粒长度或者抗肿瘤的药物，包含所述的sgRNA。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的sgRNA能够特异性识别端粒DNA重复序列，然后利用SaCas9核酸酶对其进行持续切割，从而缩短肿瘤细胞端粒长度，最终杀伤肿瘤细胞。通过实验验证证实，端粒切割腺相关病毒感染LN229细胞9天后，细胞数目明显减少、细胞端粒长度明显缩短。说明本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过设计的sgRNA实现对肿瘤细胞端粒的靶向基因编辑，可以高效引起肿瘤细胞端粒序列缩短，最终导致肿瘤细胞死亡。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为为pX601-GFP质粒图谱；

图2为本发明sgRNA测序结果；

图3为本发明LN229细胞病毒感染的荧光显微观察图；

图4为本发明LN229细胞病毒感染效率统计图；

图5为本发明LN229细胞感染病毒后细胞端粒长度对比图；

图6为本发明LN229细胞病毒感染细胞数目观察图；

图7为本发明LN229细胞病毒感染细胞计数统计图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、sgRNA的设计与质粒构建

1.1sgRNA的设计

本发明针对人染色体端粒DNA的重复序列TTAGGG设计了一种sgRNA，以及一种不靶向任何基因组序列的sgRNA(ng-sgRNA)，其对应的sgRNA序列信息如表1所示。

表1sgRNA序列信息

1.2质粒构建

1.2.1载体酶切

根据表2，配制50μL酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜。对骨架质粒pX601-GFP(addgene，#84040)酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，其中pX601-GFP质粒图谱如图1所示。

表2酶切体系

1.2.2引物退火

按照表3配制退火体系(以tel-sgRNA为例)，90℃水浴15min，自然冷却至室温，即得退火产物，其中各sgRNA对应的引物序列信息分别如表4所示。

表3退火体系

表4引物序列

1.2.3退火产物与载体进行连接

按照表5配制连接体系(以tel-sgRNA为例)，通过T4 DNAligase将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接，16℃连接1-3h，或连接过夜，得到重组质粒pX601-GFP-tel-sgRNA和pX601-GFP-ng-sgRNA。

表5连接体系

1.2.4转化

将10μL连接反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。

1.2.5测序

将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序，tel-sgRNA和ng-sgRNA的菌液测序结果如图2所示，结果显示与预期***位点一致。

1.2.6质粒抽提

将测序正确的菌液转接于50mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用AmMag Quatro Plasmid Purification Kit-24prep(水洗脱)试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。

2、腺相关病毒包装与质量检测

2.1质粒转染与AAV病毒收获

(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞(AAV-293细胞)，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5×10⁶细胞/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；

(2)转染前2h更换为含2％血清培养基；

(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒5μg、pHelper载体质粒5μg、AAV-RC质粒5μg)，与相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1mL，在室温下温育15min；

(4)混合液缓慢滴加至AAV-293细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(5)培养6h后弃去含有转染混合物的培养基，加入10mL的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混合物后倒弃；

(6)缓慢加入含5％血清的细胞培养基10mL，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h。

2.2AAV病毒浓缩与纯化

(1)根据细胞状态，收集转染后72h的AAV-293细胞上清液和细胞；

(2)于4℃，3000g离心5min，分离细胞与上清；

(3)在上清中加入AAV病毒浓缩试剂盒以得到上清中的病毒，细胞沉淀中加入重悬液重悬，于液氮/37℃中反复冻融4次，离心，之后将两部分病毒合并；

(4)分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为63000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在18℃；

(5)吸取病毒所在的分离层，放入超滤柱中进行超滤，至无色或淡粉色澄清液体；

(6)将所得病毒液过0.22μm滤膜除菌、分装；

(7)准备样品待检测。

2.3AAV病毒物理指标检测

(1)颜色判定：通过肉眼判定，AAV病毒保存液呈无色或淡粉色澄清液体状；

(2)粘稠度判定：用20-200μL规格移液器缓慢吸取50μL慢病毒保存液体，无明显粘稠感或吸液滞后现象。

2.4AAV病毒无菌检测

将病毒加入AAV-293细胞验证，正常培养24h后镜检，无任何细菌及真菌污染情况，同时参照空细胞组，细胞间隙无明显颗粒存在，培养基澄清透明。

2.5AAV病毒Q-PCR法检测滴度

(1)标准品制备：每一个标准品准备8份90μL水，装在EP管中。取10μL样品加入到第一份水中，混匀并命名为-1，然后从中取出10μL加入到第二份水中，命名为-2，依次类推。最后得到8个稀释度的样品作为模板进入定量PCR；

(2)每个样品取20μL加入到180μL水中，混匀并命名为-1，准备5份90μL水，装在EP管中，然后从中取出10μL加入到90μL水中，命名为-3，依次类推。最后得到5个稀释度，取后4个进入定量PCR；

(3)测算所需要的反应孔数，每个反应中2X SYBR Green Mix为10μL，上下游引物各0.5μL，Rox参比染料0.2μL，加水补充到15μL。每20个反应多准备一个反应体系，以避免试剂不足；

(4)将配好的反应体系加入到96孔反应板中，每孔15μL。每个样品加入5μL，设置复孔；

(5)PCR反应按照SYBR Green试剂盒说明进行；

(6)得到Ct值数据后，按照标准品浓度的对数值和Ct平均值得到标准曲线，其他样品的浓度可以根据标准曲线算出；

(7)待测样品浓度最终值由测定值除以稀释度并乘2得到，此处乘2是因为标准品是双链的，而AAV病毒颗粒是单链的；

(8)将不同稀释度病毒测定得到的滴度加以平均(以tel-sgRNA为例)，即为病毒的最终浓度，不同样品滴度如表6所示。加删除线部分为实验误差较大的数据，不参与平均滴度的计算。

表6不同样品滴度

3、细胞感染

本发明进一步在胶质瘤细胞(LN229)中感染了上述腺相关病毒。感染的具体方法为：将1X 10⁵个细胞接种至6cm培养皿中，37℃培养箱中培养16-24h，至细胞汇合度30-40％。根据病毒滴度，加入相应病毒量至m.o.i.＝100。

计算公式：m.o.i.＝(病毒滴度X病毒体积)/细胞数目。

37℃培养箱中培养16h，更换为完全培养基，继续培养。感染后约72h，观察感染效率。

感染效率如图3和图4所示，其中图3为感染后72h拍摄的荧光显微观察图，图4为LN229细胞感染效率统计图。结果显示，采用本发明的感染方法能够获得较好的感染效果。

病毒感染当天记为第0天，病毒感染后第9天各组别细胞数目观察如图6所示，统计第3天、第6天、第9天不同组别的细胞数目，统计结果如图7所示，与对照病毒组相比，感染目的病毒组的细胞数目明显减少，提示病毒可以切割肿瘤细胞端粒，诱导肿瘤细胞端粒缩短，最终杀伤肿瘤细胞。

4、病毒感染后细胞端粒长度检测

感染结束后，选择感染效率较高的细胞，用0.05％胰酶消化细胞，将细胞悬液转移至1.5mL EP管中，用基因组提取试剂盒(TIANGEN)提取基因组，并用人端粒长度定量qPCR分析检测端粒长度。

具体检测方法如下：配制表7和表8的反应体系，其对应的引物序列信息如表9和表10所示，并使用荧光定量PCR仪进行检测，反应程序见表11和表12。

表7样本DNAqPCR反应体系

表8内参DNAqPCR反应体系

表9样本端粒引物序列

表10内参基因引物序列

表11样本DNAqPCR反应程序

表12内参DNAqPCR反应程序

将qPCR结果导出分析，利用Biosystems Prism 7700序列检测***生成标准曲线，利用标准曲线计算每个样品的输入量。

平均端粒长度比(ATLR)＝样本DNAqPCR的相对输入量/内参DNAqPCR的相对输入量

结果如图5所示，结果显示端粒切割腺相关病毒感染LN229细胞9天后，细胞端粒长度明显缩短，说明病毒可以诱导肿瘤细胞端粒长度明显缩短。

综上所述，本发明通过设计和构建可靶向端粒DNA重复序列的sgRNA，并利用CRISPR/Cas9技术成功实现了对端粒DNA重复序列的有效切割，使得大量的端粒DNA双链断裂、重组，从而达到端粒缩短的目的。

进一步地，本发明对切割后的端粒长度进行检测，结果表明肿瘤细胞端粒长度明显缩短，并且端粒缩短后的肿瘤细胞出现大量死亡，提示本发明可以作为一种有潜力的新的肿瘤治疗手段。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种靶向肿瘤细胞端粒的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.转录权利要求1所述的sgRNA的DNA分子。

3.含有权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的DNA分子的表达盒。

4.含有权利要求3所述的表达盒的重组载体。

5.含有权利要求4所述的重组载体的重组菌。

6.一种权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组菌在如下任一项中的应用：

(1)在制备缩短肿瘤细胞端粒长度的药物中的应用；

(2)在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括胶质瘤。

8.一种体外基于CRISPR***构建端粒长度缩短的肿瘤细胞模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建包含权利要求1所述的sgRNA的重组载体；

将所述重组载体与Cas9表达载体转染肿瘤细胞中。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞包括胶质瘤。

10.一种缩短肿瘤细胞端粒长度或者抗肿瘤的药物，其特征在于，包含权利要求1所述的sgRNA。