CN118147020A - 一种非脱羧勒克氏菌及抑制玉米赤霉烯酮的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非脱羧勒克氏菌及抑制玉米赤霉烯酮的应用，属于微生物菌剂技术领域，本发明的非脱羧勒克氏菌SGLH‑11的分类命名为非脱羧勒克氏菌Leclercia adecarboxylata，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2024年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2024020；所述非脱羧勒克氏菌能够抑制玉米穗粒腐菌生长及其孢子的产生，对玉米穗粒腐菌的抑菌率能够达到55.88%，还能够用于抑制玉米穗粒腐菌产生的玉米赤霉烯酮。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种非脱羧勒克氏菌及抑制玉米赤霉烯酮的应用。
背景技术
玉米穗粒腐病菌主要危害玉米的果穗，一般从果穗的顶部或基部发病，造成大片或者整个果穗腐烂，病穗的苞叶与果穗粘结在一起，之间生有1层淡紫色至浅粉红色的霉层，果穗顶部变为粉红色，籽粒间生有红色至灰白色菌丝。穗粒腐不仅造成玉米产量损失，也会在玉米籽粒中产生多种毒素，包括玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏马毒素等。
玉米赤霉烯酮（ZEN），又称 F-2 毒素，普遍存在于植物体内，在谷物及农副产品中均能检测到。玉米赤霉烯酮是由多种镰刀菌（Fusarium spp.）产生的一种***类霉菌毒素，对健康和农业发展造成严重危害。最近有研究表明，玉米赤霉烯酮具有遗传毒性和免疫毒性，对肿瘤发生也有一定的影响。
生物降解法是一种利用微生物吸附和降解玉米赤霉烯酮的脱毒方法，具有安全环保、高效、特异性强和脱毒率高的特性，且不影响谷物的营养价值，已成为玉米赤霉烯酮降解研究的热点。目前已发现研究ZEN脱毒的微生物包括芽孢杆菌、乳酸菌、假单胞菌、不动杆菌等细菌类及曲霉菌、粉红螺旋聚孢霉、酵母菌等真菌类。
非脱羧勒克菌（Leclerciaadecarboxylata）属于非脱羧勒克菌属，是肠杆菌科的一种具有动力的革兰阴性杆菌，通常来源于环境和动物，于1962 年被发现，生化特性与大肠埃希菌相似，其对玉米穗粒腐病菌的生防作用此前并未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种非脱羧勒克氏菌及抑制玉米赤霉烯酮的应用，能够将非脱羧勒克氏菌用于抑制玉米穗粒腐菌生长及其孢子的产生，还能够用于抑制玉米穗粒腐菌产生的玉米赤霉烯酮。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种非脱羧勒克氏菌，分类命名为非脱羧勒克氏菌Leclercia adecarboxylata，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2024年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2024020。
所述非脱羧勒克氏菌，菌落为黄色、圆形、凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，直径为2-3mm。
一种前述非脱羧勒克氏菌在抑制玉米赤霉烯酮的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明的非脱羧勒克氏菌SGLH-11，能够有效抑制玉米穗粒腐菌的生长，对玉米穗粒腐菌的抑菌率能够达到55.88%；
（2）本发明的非脱羧勒克氏菌SGLH-11，能够有效抑制玉米穗粒腐菌孢子的产生，对孢子的抑制率能够达到100%；
（3）本发明的非脱羧勒克氏菌SGLH-11，能够有效降解玉米穗粒腐菌产生的玉米赤霉烯酮，在与玉米穗粒腐菌混合9d后，对ZEN的降解率能够达到72.68%。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
实施例1 获得SGLH-11菌株
1.采集样品：从寿光林海生态博览园采集林下腐殖质新鲜土壤样品1份。
2.分离纯化：取1g采集的新鲜土壤样品，加入10mL无菌水，充分震荡得悬浮液，吸取100μL利用涂布器涂在固体NA培养基（蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，氯化钠5g，琼脂15g，水1000mL）平板中，37℃恒温培养24h，选取典型菌落（NA培养基平板上的菌落为黄色、圆形、凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，直径为2-3mm），用接种环进行3次划线分离，获得SGLH-11、SGLH-62、SGLH-91、SGLH-105、SGLH-23纯培养菌株。
实施例2对玉米穗粒腐菌YUFU-02菌丝的生长抑制
1.玉米穗粒腐菌分离纯化：选择具有典型症状的玉米穗粒腐样品，挑取菌丝，接入PDA 培养基，每皿4块，在28℃恒温箱中培养观察。待菌丝萌发后，选典型菌落转接3次，7d后用内径为0.5cm的打孔器从菌落边缘打取菌饼，转接于PDA平板纯化培养，标记为YUFU-02。将PDA平板上菌丝生长密集、菌落规则、无污染的菌株保存在1.8mL离心管中，4℃冰箱保存。
玉米穗粒腐病菌在PDA培养基上气生菌丝生长旺盛、棉絮状，初为白色，渐变土黄色，培养基质色素为苋菜红色至棕红色；分生孢子镰刀形，形态学鉴定为镰刀菌。
2.接种：采用十字交叉法测定实施例1得到的菌株SGLH-11、SGLH-62、SGLH-91、SGLH-105、SGLH-23对玉米穗粒腐菌YUFU-02生长的抑制，具体为准备6个PDA平板培养基，在每个PDA平板培养基上利用十字法打孔，打四个孔，中心点到孔的距离为2.5cm，在板的中心接种玉米穗粒腐菌YUFU-02菌饼（5mm），分别在其中5个PDA平板培养基的四个孔内接种SGLH-11菌液、SGLH-62菌液、SGLH-91菌液、SGLH-105菌液、SGLH-23菌液（菌液中的菌浓度均为2.15×108个/mL），另外1个PDA平板培养基作为空白对照，不接种任何菌液。5d后，利用十字交叉法测量YUFU-02菌饼的直径，做3次重复试验，并对直径取平均值，计算抑菌率。
3.结果分析：得到的抑菌率结果见下表，由下表可以看出，菌株SGLH-11的抑菌率最高，抑菌率>50%，说明菌株SGLH-11能够有效抑制YUFU-02的菌丝生长。
实施例3 鉴定SGLH-11菌株
1.形态学鉴定：菌株SGLH-11为革兰阴性杆菌，在NA培养基平板上生长良好，菌落为黄色、圆形、凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，直径为2-3mm。
2.16S rDNA序列鉴定：以提取的菌株基因组DNA为模板，用27F（序列如SEQ IDNO.1所示) 和 1492R （序列如SEQ ID NO.2所示)为引物进行PCR扩增，PCR产物使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳法来检测，根据Marker的相对位置初步判断待测目的片段的大小，PCR扩增获得的DNA片段长度750-1500 bp之间，与细菌16s rDNA的目的片段长度相似，16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。将扩增的 PCR 产物送华大基因公司进行 DNA 序列的测定，将确定的碱基序列在 GenBank 中进行BLAST 比对，通过与Leclerciaadecarboxylata基因序列（MG254798.1（Leclercia sp. strain T3196-2）、KT260889.1（Leclerciaadecarboxylatastrain RCB677）、LT899940.1（Leclerciaadecarboxylata partial 16S rRNA gene,strain HAMBI 1696）、MH071320.1（Leclerciaadecarboxylata strain G9TT3）、MT133354.1（Leclerciaadecarboxylata strain LSRBMoFPIKRGCFTRI47）、OR054217.1（Leclercia sp. strain H-S-2））比对，同源性>99.9%，可以鉴定SGLH-11为非脱羧勒克菌（Leclerciaadecarboxylata）。
本发明筛选的SGLH-11菌株，分类命名为非脱羧勒克氏菌Leclerciaadecarboxylata，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2024年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2024020。
实施例4 SGLH-11菌株对YUFU-02孢子的生长抑制
1.制备PDA液体培养基：取2个PDA液体培养基，其中一个作为处理培养基，另一个作为对照培养基，在处理培养基中加入100μL SGLH-11菌液（菌液中的菌浓度为2.15×108个/mL）和实施例2得到的YUFU-02（5mm）菌饼一个；在对照培养基中只加入实施例2得到的YUFU-02（5mm）菌饼一个。将处理培养基和对照培养基在28℃下振荡培养，分别在振荡培养1d、3d、5d、7d、9d后取样并采用血球计数法对孢子个数进行计数。
2.结果统计：采用血球计数法记录并计算处理培养基和对照培养基中YUFU-02孢子个数，将盖玻片盖在血球计数板计数室上，用移液器吸取充分振荡混匀的样品液，滴加在盖玻片的边缘上，让菌液由盖玻片与计数板的缝隙间渗入计数室，静置片刻，待菌体自然沉降并稳定后开始计数。做2次平行实验，每次实验做3个重复，取平均值。
通过血球计数法记录的振荡培养1d、3d、5d、7d、9d后处理培养基和对照培养基中YUFU-02孢子个数结果见下表，由下表可以看出，未加SGLH-11菌液的对照培养基随着振荡培养时间的延长，分生孢子数逐渐增加。加SGLH-11菌液的处理培养基中分生孢子数为0，抑制率达到了100%。说明SGLH-11可以有效抑制玉米穗粒腐菌YUFU-02孢子的产生。
实施例5 SGLH-11菌株对ZEN的降解
利用玉米赤霉烯酮（ZEN）快速检测卡（武汉观锐生物科技有限公司）检测实施例4中得到的振荡培养1d、3d、5d、7d、9d后的处理培养基和对照培养基中ZEN含量。具体为：
利用移液器从处理培养基或对照培养基中量取100μL样品液，加入100μL提取液（无水乙醇：蒸馏水=1:1），高速涡旋3min，4000rpm下离心3min，得到处理好的待测样品液；测试前将所使用的玉米赤霉烯酮（ZEN）快速检测卡和处理好的待测样品液恢复至室温；取出玉米赤霉烯酮（ZEN）快速检测卡，用移液器吸取处理好的待测样品液50μL，垂直加入加样孔中；将玉米赤霉烯酮（ZEN）快速检测卡置于免疫定量速测仪（提前15min打开），选择“孵育检测”，选择稀释基数为1，仪器自动设置10min后读取定量结果。
通过结果发现未加SGLH-11菌液的对照培养基中，随着振荡培养时间的延长，YUFU-02菌的ZEN产生量逐渐增加。但加SGLH-11菌液的处理培养基中，随着振荡培养时间的延长，对照培养基中ZEN含量与处理培养基中ZEN含量之间的差距呈逐渐扩大的趋势，9d时降解率达到72.68%，说明SGLH-11菌株能够有效降低玉米穗粒腐菌YUFU-02中ZEN产生。
由实施例2、4-5的结果可以看出，SGLH-11菌株通过抑制YUFU-02菌的菌丝生长、孢子产生以及直接降解玉米赤霉烯酮，从而起到降解ZEN的作用。
Claims (2)
1.一种非脱羧勒克氏菌SGLH-11，其特征在于，所述非脱羧勒克氏菌的分类命名为非脱羧勒克氏菌Leclercia adecarboxylata，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2024年1月4日，保藏编号为CCTCC NO：M 2024020。
2.一种如权利要求1所述的非脱羧勒克氏菌SGLH-11在抑制玉米赤霉烯酮的应用。
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