CN118109639B - 一种鉴定华中五味子性别的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴定华中五味子性别的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列5’端第770位、第879位、或第1098位碱基。本发明提供了一种鉴定华中五味子性别的SNP分子标记及华中五味子性别的鉴别方法。本发明能够在苗期、营养生长期而非生殖生长期、其他无花无果期实现对华中五味子的性别鉴定。本发明的SNP分子标记有利于应用至华中五味子的栽培种植以及研究过程中，从而快速区分华中五味子的性别，提高鉴别效率、降低种植成本和研究成本。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴定华中五味子性别的SNP分子标记及其应用。
背景技术
华中五味子（Schisandra sphenanthera），属于五味子科五味子属，是中药材“南五味子”的基原植物。华中五味子的果实具有药食两用的特性，可用于开发药物、保健食品等。在市场中，对于其果实的需求较大。华中五味子为雌雄异株的多年生植物，栽培三年以上才会开花。在其未达到生殖发育期时，即未开花之前，无法通过直接观察区分雄株和雌株。
华中五味子的雌雄植株在没有花时，形态上没有区别，且未发现异形性染色体。未到生殖发育期或者无花时无法鉴定性别，华中五味子的药用部位为果实，只有雌株才会结果，在生产过程中，因早期无法鉴定植株性别，导致大田栽培时大量雄株存在，严重影响药材产量，也给中药材种植带来了很大的困扰。
随着高通量测序技术的发展，通过SNP分析开发性别鉴定分子标记成为了可能。目前，华中五味子这一物种尚未报道用于性别鉴定的SNP分子标记。
综上，如何提供一种有效、可靠、操作简便的区分华中五味子雌雄性别的鉴定方法或分子标记是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
第一方面，本发明提供了与华中五味子性别相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列5’端第770位、第879位、或第1098位碱基。
所述第770位碱基的多态性为C/T；所述第879位碱基的多态性为G/T；所述第1098位碱基的多态性为G/A。
当第770位碱基为C/T杂合，第879位碱基为G/T杂合，第1098位碱基为G/A杂合时，样本性别为雄性；当第770位碱基为T/T纯合，第879位碱基为G/G纯合，第1098位碱基为G/G纯合时，样本性别为雌性。
第二方面，本发明提供了扩增所述SNP分子标记的引物。
优选地，所述引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
第三方面，本发明提供了一种鉴别华中五味子性别的试剂或试剂盒，其中含有上述任一方案中所述的引物。
第四方面，本发明提供了所述的SNP分子标记、所述的引物、或所述的试剂或试剂盒在华中五味子性别鉴定中的应用。
第五方面，本发明提供了一种华中五味子性别的鉴别方法，包括：以待测华中五味子的基因组DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增反应，分析PCR扩增产物的序列信息，确定待测华中五味子的基因型，鉴定性别。
通过利用本发明的SNP位点，能够在苗期、早期营养生长期及其他未开花时，通过收集叶片或枝条等材料，提取华中五味子的基因组DNA，利用PCR扩增反应及分析确定样本基因型，从而快速鉴定性别，不影响植株的正常生长。
优选地，所述分析PCR扩增产物的序列信息包括：对PCR扩增产物进行测序，将测序结果与参考序列进行比对。
优选地，参考序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述测序为一代Sanger测序。
优选地，PCR扩增反应的反应条件为：95℃ 3min，然后进行30~40个循环，所述循环包括94℃ 25s~30s，52℃~55℃ 25s~30s，72℃10s；最后72℃ 5min结束。
最优选地，PCR扩增反应的反应条件为：95℃ 3min；然后进行35个循环，包括94℃25s，52℃ 25s，72℃ 10s；最后72℃ 5min结束。
优选地，PCR扩增反应的体系包括：2× M5 Taq HiFi PCR mix、上游引物、下游引物、水、基因组DNA。
最优选地，PCR扩增反应的体系为20 μL体系，其中包括：2× M5 Taq HiFi PCRmix 10μL、上游引物 0.5μL、下游引物0.5μL、ddH2O 8μL、基因组DNA 1μL。
优选地，当第770位碱基为C/T杂合，第879位碱基为G/T杂合，第1098位碱基为G/A杂合时，待测华中五味子的性别为雄性；当第770位碱基为T/T纯合，第879位碱基为G/G纯合，第1098位碱基为G/G纯合时，待测华中五味子的性别为雌性。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种鉴定华中五味子性别的SNP分子标记及华中五味子性别的鉴别方法。本发明能够在苗期、营养生长期而非生殖生长期、其他无花无果期实现对华中五味子的性别鉴定。本发明的SNP分子标记有利于应用至华中五味子的栽培种植以及研究过程中，从而快速区分华中五味子的性别，提高鉴别效率、降低种植成本和研究成本。
附图说明
图1是本发明实施例1的Sanger测序代表图，其中上图为雌性(基因型分别为TT/GG/GG)，下图为雄性(基因型分别为CT/GT/GA)。
图2是本发明实施例2中雄性样本在770位的Sanger测序图。
图3是本发明实施例2中雄性样本在879位的Sanger测序图。
图4是本发明实施例2中雄性样本在1098位的Sanger测序图。
图5是本发明实施例2中雌性样本在770位的Sanger测序图。
图6是本发明实施例2中雌性样本在879位的Sanger测序图。
图7是本发明实施例2中雌性样本在1098位的Sanger测序图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例通过基因组高通量测序对比以获取华中五味子雌雄个体之间存在差异且表征雌雄性别的单核苷酸多态性位点(SNP)。具体步骤如下：
选择20例华中五味子雌性样本和20例华中五味子雄性样本进行RNA的提取，根据Illumina文库构建流程要求，构建转录组文库。然后采用IlluminaNovaSeq6000测序平台对每个样本进行高通量测序，每个样本测序量为6Gb，测序策略为Pair-End 150bp。整合所有样本的测序数据，使用Trinity组装为参考转录本。进一步，使用Trinity分别组装每个样本的转录本。使用Sentieon对每个样本的转录本进行SNP检索。对SNP检索结果进行筛选，筛选雌性样本之间完全相同、雄性样本之间完全相同、且雌雄样本不同的SNP位点作为性别鉴定候选分子标记。
经对候选分子标记的分析后发现SEQ ID NO.1序列中可能包含区分性别的SNP分子标记。根据CDS（SEQ ID NO.4）设计引物进行PCR扩增反应，上下游引物分别如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。PCR扩增反应的体系为20 μL，其中包括：2× M5 Taq HiFi PCRmix 10μL、上游引物0.5μL、下游引物 0.5μL、ddH2O 8μL、基因组DNA 1μL。PCR扩增反应的反应条件为：95℃ 3min；然后进行35个循环，包括94℃ 25s，52℃ 25s，72℃ 10s；最后72℃5min结束。
结果表明能够扩增出目标长度的序列，通过Sanger测序比对序列发现，在上述20例华中五味子雌性样本和20例华中五味子雄性样本中，所有雄性样本第770位碱基为C/T杂合，第879位碱基为G/T杂合，第1098位碱基为G/A杂合；所有雌性样本第770位碱基为T/T纯合，第879位碱基为G/G纯合，第1098位碱基为G/G纯合，Sanger测序代表图如图1所示。
实施例2
为了验证实施例1的SNP位点在鉴别华中五味子性别的准确性，本实施例在花期时，在华中五味子的分布区广泛取样，从待测样本中，提取基因组DNA，通过PCR和Sanger测序的方式验证引物的特异性，并与华中五味子样本的性别相互对照，以确认实施例1中的SNP分子标记、引物用于华中五味子性别鉴定的准确性。
1、样本准备
选择采自陕西、山西、河南等多个地区的华中五味子样本71份，含32份雌性样品和39份雄性样品，进行验证。
2、基因组DNA提取
选择华中五味子的叶片，采用DNA提取试剂盒提取待测华中五味子的基因组DNA。
3、PCR扩增
以待测华中五味子的基因组DNA为模板，利用上游引物SEQ ID NO.2和下游引物SEQ ID NO.3，进行PCR扩增反应。
PCR扩增反应的体系为20 μL，其中包括：2× M5 Taq HiFi PCR mix 10μL、上游引物 0.5μL、下游引物0.5μL、ddH2O 8μL、基因组DNA 1μL。
PCR扩增反应的反应条件为：95℃ 3min；然后进行35个循环，包括94℃ 25s，52℃25s，72℃ 10s；最后72℃ 5min结束。
4、结合Sanger测序进行分析，确定待测华中五味子的基因型，鉴定性别，鉴定标准如下：当第770位碱基为C/T杂合，第879位碱基为G/T杂合，第1098位碱基为G/A杂合时，待测样本为雄性；当第770位碱基为T/T纯合，第879位碱基为G/G纯合，第1098位碱基为G/G纯合时，待测样本为雌性。
71个验证样本Sanger测序图如图2~图7所示，鉴定结果对照如表1所示。
表1
结果表明，依据实施例1的SNP位点反映的雌雄信息与收集样本的性别信息一致，即通过本发明设计的引物以及SNP位点能够实现准确的华中五味子雌雄性别鉴定。该鉴定方法无需借助花，便可判断华中五味子植株的性别。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.与华中五味子性别相关的SNP分子标记在华中五味子性别鉴定中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列5’端第770位、第879位、或第1098位碱基；
当第770位碱基为C/T杂合，第879位碱基为G/T杂合，第1098位碱基为G/A杂合时，样本性别为雄性；当第770位碱基为T/T纯合，第879位碱基为G/G纯合，第1098位碱基为G/G纯合时，样本性别为雌性。
2.扩增华中五味子性别相关的SNP分子标记的引物，所述引物如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列5’端第770位、第879位、或第1098位碱基。
3.一种鉴别华中五味子性别的试剂或试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求2所述的引物。
4.权利要求2所述的引物或权利要求3所述的试剂或试剂盒在华中五味子性别鉴定中的应用。
5.一种华中五味子性别的鉴别方法，其特征在于，包括：以待测华中五味子的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增反应，分析PCR扩增产物的序列信息，确定待测华中五味子的基因型，鉴定性别；当扩增产物中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列5’端第770位碱基为C/T杂合，第879位碱基为G/T杂合，第1098位碱基为G/A杂合时，待测华中五味子的性别为雄性；当第770位碱基为T/T纯合，第879位碱基为G/G纯合，第1098位碱基为G/G纯合时，待测华中五味子的性别为雌性。
6.根据权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，PCR扩增反应的反应条件为：95℃3min，然后进行30~40个循环，所述循环包括94℃ 25s~30s，52℃~55℃ 25s~30s，72℃ 10s；最后72℃ 5min结束。
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