CN118109505A - 一种gRNA靶点基因编辑效率评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种gRNA靶点基因编辑效率评价方法，属于植物基因工程技术领域，解决了现有技术中gRNA靶点基因编辑体系评价周期长、效率低的问题。该方法包括：确定gRNA的待编辑片段，制备包含待编辑片段的串联序列；构建串联序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体；将CRISPR/Cas9基因编辑载体转入植株，培养，筛选，得到阳性植株；对阳性植株进行基因编辑效率评价，分析得到每个gRNA靶点的突变效率。本发明提供的方法，提高在T0代获得纯合突变的编辑体系的效率，极大地缩短获得纯合突变植株的周期。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体的涉及一种gRNA靶点基因编辑效率评价方法。
背景技术
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）因产量高、品质优、适口性好、适应性广，被誉为“牧草之王”，是重要的饲料作物之一。但紫花苜蓿传统育种周期长、时间成本和经济成本高，近些年紫花苜蓿的基因功能研究、基因编辑等生物育种研究受到越来越多的关注，相应地，苜蓿相关研究的技术手段有了更多需求。
自CRISPR/Cas9技术成功应用到植物中后，草本植物也陆续建立基因编辑体系并将其应用到基因功能研究和生物育种当中。由于不同物种的基因组不同，因此基因编辑手段在应用于不同物种时需要不同的条件。紫花苜蓿为高度杂合的同源四倍体植物，遗传背景非常复杂，编辑难度大。在已建立的紫花苜蓿基因***中，尽管个别***突变总效率较高，但编辑T0代获得纯合突变的效率较低，只有通过后续的杂交或自交才能获得纯合突变植株，这个问题也是目前已建立的紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因编辑体系的共性问题，所以亟需建立在T0代获得纯合突变的高效编辑体系来满足基因功能研究和生物育种需求。另外，已建立体系常需2个载体完成最终载体的构建，其中1个中间载体含gRNA模块，1个终载体含Cas9模块，中间载体完成gRNA的构建后再通过Gateway技术将gRNA模块构建到终载体，构建难度大、成本高。
编辑效率的主要影响因素是载体和gRNA序列，不同gRNA序列编辑效率差异非常显著，差异可达10倍及以上，所以gRNA编辑效率的评价是非常必要的。目前gRNA编辑效率的评价方法经过长期的编辑、分析工作后，可能出现无法获得编辑植株或者非纯合的编辑植株的情况，严重影响种质创制和生物育种工作。
发明内容
本发明提供一种gRNA靶点基因编辑效率评价方法，用以解决现有技术中存在的苜蓿基因编辑体系评价效率低的问题。
第一方面，本发明提供了一种gRNA靶点基因编辑效率评价方法，其特征在于，包括：确定gRNA的待编辑片段，制备包含所述待编辑片段的串联序列；构建所述串联序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体；将所述CRISPR/Cas9基因编辑载体转入植株，培养，筛选，得到阳性植株；对所述阳性植株进行基因编辑效率评价，分析得到每个所述gRNA靶点的突变效率；其中，所述gRNA包括序列如SEQ ID No：2所示的gRNA1、序列如SEQ ID No：3所示的gRNA2和序列如SEQ ID No：4所示的gRNA3。
作为一种可能的实现方式，所述串联序列的模块顺序为，任一所述gRNA之前连接有1组tRNA，任一所述gRNA之后连接有1组scaffold，所述串联序列的最前端连接有启动子。在转录时，相邻gRNA被tRNA切断。
作为一种可能的实现方式，所述串联序列的模块顺序如下：启动子 + tRNA +gRNA1 + scaffold + tRNA + gRNA2 + scaffold + tRNA + gRNA3 + scaffold + tRNA +gRNA4 + scaffold，其中，tRNA的序列如SEQ ID No：5所示，scaffold的序列如SEQ ID No：6所示。
作为一种可能的实现方式，所述阳性植株获得过程包括：将所述CRISPR/Cas9基因编辑载体转入农杆菌，培养，得到侵染菌株；用所述侵染菌株侵染发芽植株的切口，培养侵染后的植株，保留具有所述农杆菌选择性状的植株，进行选择培养，得到阳性植株。
作为一种可能的实现方式，所述农杆菌为发根农杆菌，所述农杆菌选择性状为毛状根。
作为一种可能的实现方式，CRISPR/Cas9基因编辑载体为m-pRGEB31，所述m-pRGEB31包含Cas9模块和gRNA模块。
作为一种可能的实现方式，所述植株为苜蓿。
第二方面，本发明提供了一种苜蓿品种培育的方法，包括：应用第一方面任一种可能的实现方式所述的方法，得到每个所述gRNA靶点的突变效率；选择突变效率最高的gRNA，构建基因编辑载体，转入发根农杆菌，培养，得到载体侵染菌株；用所述载体侵染菌株侵染发芽苜蓿的真叶或幼根，愈伤培养，得到纯合突变苜蓿植株；选择具有目的性状的苜蓿植株，保留种质，得到具有目的性状的苜蓿品种。
第三方面，本发明提供了一种基因编辑载体，将如SEQ ID No：1所示的序列片段与Bsa I酶切的m-pRGEB31载体通过同源酶重组进行构建，得到所述基因编辑载体。所述基因编辑载体能够携带适用于所述植株的特异抗性，以便利用所述特异抗性对所述植株进行筛选。作为一种可能的实现方式，所述特异抗性为抗除草剂。
第四方面，本发明一种载体侵染菌株，将第三方面所述的基因编辑载体转入大肠杆菌，获得阳性克隆大肠杆菌；将所述阳性克隆大肠杆菌转入发根农杆菌中，获得阳性克隆发根农杆菌，即为所述载体侵染菌株。所述发根农杆菌的是农杆菌的一种菌株，适合豆科、茄科植物毛状根的诱导，以便利用毛状根的性状对所评价的植株进行筛选。
本发明设计包含gRNA的待编辑片段并构建载体，转基因植株进行基因编辑效率的评价，建立了快捷的gRNA编辑效率评价体系，同时也可作为载体的评价体系；快速获得编辑效率的结果，提高在T0代获得纯合突变的编辑体系的效率，极大地降低了编辑基因直接转入叶盘后带来的突变结果不确定性，减少了工作量。
本发明提供的gRNA靶点基因编辑效率评价方法应用于苜蓿品种培育，提供的基因编辑载体m-pRGEB31，包含Cas9模块和gRNA模块，不需要gRNA模块的中间载体。
本发明结合苜蓿毛状根遗传转化体系和高通量测序技术，建立了高效且周期短的gRNA效率评价的体系，直观高效地呈现基因编辑的结果和突变效率，无需经过长周期的遗传转化，极大地缩短了获得纯合突变植株的周期，加速了苜蓿CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立，推动了紫花苜蓿在基因功能研究和生物育种等领域的进一步研究。
本发明提供的gRNA靶点基因编辑效率评价方法可操作性强、成本较低，对打破苜蓿基因编辑壁垒具有重要现实意义，具有广阔的应用前景和技术成果转化潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的gRNA靶点基因编辑效率评价流程，其中，A-H为苜蓿毛状根转化过程中不同时期的苜蓿生长状态，A为MS培养基中培育2d，B为侵染后共培养1d，C为侵染后共培养7d，D为二次切根植株选择培养1d，E为二次切根植株选择培养7d，F为二次切根植株选择培养10d，G为水培培养7d，H为毛状根转化植株，I为PCR产物电泳结果，J为高通量测序样品包装，K为gRNA1-gRNA3编辑效率和类型的结果分析。
图2为本发明实施例提供的高通量测序结果中gRNA1的突变情况。
图3为本发明实施例提供的高通量测序结果中gRNA2的突变情况。
图4为本发明实施例提供的高通量测序结果中gRNA3的突变情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为解决现有技术中存在的苜蓿基因编辑体系评价效率低的问题，本实施例提供了一种gRNA靶点基因编辑效率评价方法，图1示例性地示出了本发明实施例提供的gRNA靶点基因编辑效率评价流程，包括：确定gRNA的待编辑片段，设计包含待编辑片段的串联序列；构建串联序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体；将CRISPR/Cas9基因编辑载体转入植株，培养，筛选，得到阳性植株；对阳性植株进行基因编辑效率评价，分析得到每个gRNA靶点的突变效率；其中，gRNA包括序列如SEQ ID No：2所示的gRNA1、序列如SEQ ID No：3所示的gRNA2和序列如SEQ ID No：4所示的gRNA3。
本发明设计包含gRNA的待编辑片段并构建载体，转基因植株进行基因编辑效率的评价，建立了快捷的gRNA编辑效率评价体系，同时也可作为载体的评价体系；快速获得编辑效率的结果，提高在T0代获得纯合突变的编辑体系的效率，极大地降低了编辑基因直接转入叶盘后带来的突变结果不确定性，减少了工作量。
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。
实施例1
本实施例提供了Marker基因的多gRNA靶点的设计与合成。
克隆参与苜蓿根腐病抗性调控的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（MSgene72216）作为验证体系的marker基因：通过转录组数据，获得参考基因组新疆大叶苜蓿的MSgene72216基因的CDS区，设计克隆引物（F：ATGGCTTCGGCTACTTTCTCTGTAG，R：TCACTTCCAGTTATTGGCAACAATG），使用高保真酶2×Phanta® Flash Master Mix(Dye Plus)（Vazyme #P520），对MSgene72216基因片段进行PCR扩增，将扩增产物转入T-载体连接，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α后在LB固体培养基（50mg/mL Kan）上涂板，37℃培养箱培养至过夜，挑选阳性单克隆后测序，分析测序结果。
根据克隆得到的Marker基因，通过在线网站（http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/SCORE）在基因的保守区设计3个gRNA，分别为gRNA1、gRNA2、gRNA3，合成序列为：启动子 + tRNA + gRNA1 + scaffold + tRNA + gRNA2 + scaffold + tRNA + gRNA3 +scaffold + tRNA + gRNA4 + scaffold，根据序列模块顺序进行序列合成，得到合成序列。在转录时，相邻gRNA被tRNA切断，scaffold为载体自有序列。Marker基因的序列如SEQ IDNo：1所示，其中下划线部分按照先后顺序分别为gRNA1、gRNA2、gRNA3的序列，gRNA1序列如SEQ ID No：2所示，gRNA2序列如SEQ ID No：3所示，gRNA3序列如SEQ ID No：4所示；多gRNA靶点设计序列模块中的tRNA序列如SEQ ID No：5所示、scaffold序列如SEQ ID No：6所示。
SEQ ID No：1：
ATGGCTTCGGCTACTTTCTCTGTAGCCAACCCAGCTCTTAAGGTAAATGGGAAAGGCTTTTCTGAATTCTCTGGTCTCCGTAACTCATCAGGATATCTTCCCTTTTCTAGAAAAACTTCAGATGACTTTCATTCTGTCATTTCCTTCCAAACCAATGCAGTTGGAAGCAGTGGAAGATCCAGGAAAGGTGTTGTAGTGGAAGCAAAAATTAAGGTAGCCATAAACGGATTTGGAAGGATTGGAAGGAACTTCTTGAGATGTTGGCATGGTCGTAAGGACTCGCCTCTTGATGTCATTGCCATCAATGACACCGGAGGTGTAAAGCAAGCCTCTCACCTTCTCAAGTATGATTCTACACTTGGAATCTTTGATGCTGATGTTAAACCTGTTGGCACTGATGGTATCTCTGTTGATGGAAAGGTTATCAAAGTTGTCTCTGACCGTAACCCTGCCAACCTTCCTTGGGGGGAGTTGGGAATAGATTTGGTGATTGAAGGAACTGGAGTGTTTGTGGACAGAGAAGGTGCTGGGAAGCACATTACAGCAGGAGCTAAGAAGGTACTCATCACAGCCCCCGGAAAAGGAGACATCCCAACTTACGTGGTTGGTGTCAATGCTGATGGTTACAGCCACGCTGATGATATCATCAGCAACGCTTCTTGCACCACTAACTGCCTTGCTCCCTTTGTCAAGGTCCTTGATCAGAAATTCGGTATCATCAAGGGTACCATGACTACCACTCACTCCTACACCGGTGACCAAAGGCTTCTTGATGCTAGCCACCGTGATCTAAGGCGTGCAAGAGCAGCAGCTCTTAACATTGTGCCAACTTCAACCGGAGCAGCAAAGGCAGTGGCCCTTGTCCTCCCATCACTCAAAGGCAAGCTCAACGGTATTGCACTTCGTGTGCCAACACCAAACGTCTCGGTTGTTGACCTCGTTGTTCAAGTCTCAAAGAAGACATTTGCTGAAGAAGTGAATGAGGCTTTCAGAGACAGTGCAGCCAAGGAGCTGAGCGGTATTCTCTCAGTTTGTGATGAGCCACTTGTGTCTGTAGATTTTAGGTGCACTGATGTGTCCTCAACCGTTGATTCGTCATTGACAATGGTCATGGGAGATGACATGGTGAAGGTGATTGCTTGGTATGATAATGAATGGGGTTACTCACAAAGGGTTGTTGATTTGGCTGACATTGTTGCCAATAACTGGAAGTGA
SEQ ID No：2：
TGTAGCCAACCCAGCTCTTA
SEQ ID No：3：
TCTGGTCTCCGTAACTCATC
SEQ ID No：4：
TGTAGTGGAAGCAAAAATTA
SEQ ID No：5：
AACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCA
SEQ ID No：6
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
实施例2
本实施例提供了CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建。
将实施例1得到的合成序列与Bsa I酶切的m-pRGEB31载体大片段通过同源酶重组进行构建；构建后的载体转入大肠杆菌DH5α，提取测序正确的阳性单克隆。
CRISPR/Cas9基因编辑载体为实验室建立的双元载体m-pRGEB31，包含Cas9模块和gRNA模块，不需要gRNA模块的中间载体，载体关键元件为：-LB-MAS启动子 + Bar基因（除草剂抗性）-AtUBQ10启动子 + Cas9 + NLS + NOS-AtU6启动子 + Bsa I酶切位点--Bsa I酶切位点 + scaffold + TTTTT-RB-。pRGEB31载体（购自addgene）为将启动子OsU6替换为启动子AtU6、启动子CaMV35S替换为启动子AtUBQ10，将载体中的潮霉素抗性替换为除草剂抗性的适合苜蓿基因编辑的载体。
实施例3
本实施例提供了编辑载体的苜蓿毛状根遗传转化。
图1中的A-H为本发明实施例提供的苜蓿毛状根转化过程中不同时期的生长状态。将苜蓿种子放到离心管中，用ddH2O清洗3次，每次间隔2min，用涡旋振荡器振荡；用75%的酒精消毒5min，用ddH2O清洗3次，转移至30%次氯酸钠中清洗20min，用ddH2O清洗3次后放置于1/2MS固体培养基中，保鲜膜封口后用锡箔纸包裹置于4℃冰箱2天，转入25℃光照培养箱中（16h光/8h暗）竖直培养2天，得到如图1中的A所示的苜蓿发芽幼苗。其中，1/2MS固体培养基配制方法如下：MS（Murashige&Skoog Basal Medium With Vitamins）2.22g/L，蔗糖8.0g/L，琼脂7.0g/L，pH调至5.8，灭菌。
TY培养基配制方法如下：胰蛋白胨（Tryptone）5g/L，酵母提取物（Yeast extract）3g/L，氯化钙（CaCl2）0.6g/L，灭菌。
m-Fahraeus培养基的配制方法如下：MgSO4•7H2O 0.5mM、KH2PO4 0.7mM、Na2HPO4•7H2O 0.8mM、NH4NO3 0.5mM、MnCl2 0.1μg/L、CuSO4 0.1μg/L、ZnCl2 0.1μg/L、H3BO3 0.1μg/L、Na2MoO4 0.1μg/L、Ferric Citrate 0.02mM、CaCl2•2H2O 0.9mM，以上溶液按照终浓度加量后定容于1L蒸馏水中，pH调至6.8后加入8g琼脂，灭菌。
含除草剂的m-Fahraeus选择培养基的配制方法如下：在m-Fahraeus培养基中以2mg/mL的剂量加入除草剂。
将实施例2得到的阳性单克隆转入发根农杆菌Ar.1193菌株中，阳性单克隆转接于TY培养基中，28℃培养14h，得到侵染菌株。将胚根长度为1~1.5cm的苜蓿发芽幼苗切掉根尖3~5mm，用镊子夹住幼苗子叶，切口处轻轻蘸取得到的侵染菌株，转入m-Fahraeus培养基中进行共培养，共培养1d的生长状态见图1中的B，22℃、16h光照/8h黑暗条件竖直培养7d，生长状态见图1中的C，将胚根附近长出的根切掉，保留胚根底部膨大部分，得到二次切根植株；将二次切根植株转入含除草剂的m-Fahraeus培养基中进行选择培养，培养1d的生长状态见图1中的D，22℃、16h光照/8h黑暗条件竖直培养，前3-5天可稍倾斜，待有根长出后再完全竖直培养，培养7d的生长状态见图1中的E，选择培养10d，生长状态见图1中的F，将幼苗根上的琼脂在流水下小心并且彻底地洗除，将植株转移至水培培养7d，生长状态见图1中的G，得到转化苗。水培培养的培养液为1/2 Hoagland营养液，Hoagland营养液配制原料见表1。
表1 Hoagland营养液配制原料
配制1/2 Hoagland营养液时，须每种药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液避光储存。配制营养液工作液时，A、B母液分别稀释400倍，C液稀释2000倍配置，D液铁盐稀释400倍，混合后得到1/2 Hoagland营养液。
实施例4
本实施例提供了毛状根植株的阳性鉴定。
培养实施例3得到的转化苗，获得如图1中的H所示的毛状根转化植株；提取毛状根转化植株根部DNA进行PCR扩增，扩增反应体系：I5Mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA 50ng，加入ddH2O至20μL；扩增反应条件：预变性98℃、2min；变性98℃、10sec，退火60℃、15sec，延伸72℃、2min，重复35个循环；彻底延伸72℃、5min。扩增引物PPT-F1序列如SEQID No：7所示；PPT-R1序列如SEQ ID No：8所示。
SEQ ID No：7：GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC
SEQ ID No：8：AGTCGACCGTGTACGTCTCC
PCR结束后，在PCR产物中加4μL的10×Loading Buffer混匀，在1%的琼脂糖上进行电泳（120V，20min），电泳结束后在凝胶成像仪观察结果，得到如图1中的I所示的电泳检测结果图，得到阳性植株。
实施例5
本实施例提供了高通量测序方法分析突变类型和突变比例。
以实施例4得到的阳性植株的毛状根DNA为模板，设计如图2所示的目的基因的引物及引物所处的位置，扩增含gRNA片段的目的基因100-200bp，每对扩增的上下游引物距离gRNA位置不超100bp。其中扩增gRNA1区域的引物为（gRNA1-F2：ggagtgagtacggtgtgcCTTCCTTGTAGGCTTAATCATG；gRNA1-R2：gagttggatgctggatggGCCCTAGCTTTATTGCTACAAC），PCR产物的野生型序列为147bp；扩增gRNA2区域的引物为（gRNA2-F2：ggagtgagtacggtgtgcCTAGTGGTACCATGTTGTAGCA；gRNA2-R2：gagttggatgctggatggGGTTTGGAAGGAAATGACAGAA），PCR产物的野生型序列为207bp；扩增gRNA3区域的引物为（gRNA3-F2：ggagtgagtacggtgtgcCATTTGAAGGTTGGAAGCAGTG；gRNA3-R2：gagttggatgctggatggACCATGCCAACATCTCAAGAAG），PCR产物的野生型序列为120bp；序列中小写字母为高通量测序外加的搭桥序列，大写字母为在Marker基因上设计的扩增含gRNA片段的引物，扩增产物进行高通量测序，测序完成后进行gRNA编辑效率分析和突变类型分析，确定编辑效率较高的gRNA。
高通量测序采用HI-TOM测序技术，每个PCR产物测序深度2000reads，测序结果如表2及图2-图4所示。
表2 突变结果分析
注：1D表示1个碱基缺失，1I表示1个碱基***，SNP表示单碱基替换。
由表2和图2可知，由gRNA1引起的突变有6株，突变效率为30%，突变类型有碱基缺失和碱基替换；由表2和图3可知，由gRNA2引起的突变植株为2株，突变效率为10%；由表2和图4可知，由gRNA3引起的突变植株为14株，突变的类型有碱基缺失和碱基替换，突变效率为70%；不同gRNA的突变效率差异显著，其中gRNA3的编辑效率最高，其次为gRNA1，而gRNA2的突变效率最低。由表2可知，参与统计的20株植株突变发生率为70%，纯合突变10%，可以利用高效编辑的gRNA3构建多gRNA编辑载体，在T0代获得纯合突变效率更高的编辑体系，获得纯合突变植株，缩短育种周期短。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种gRNA靶点基因编辑效率评价方法，其特征在于，包括：
确定gRNA的待编辑片段，制备包含所述待编辑片段的串联序列；
构建所述串联序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体；
将所述CRISPR/Cas9基因编辑载体转入植株，培养，筛选，得到阳性植株；
对所述阳性植株进行基因编辑效率评价，分析得到每个所述gRNA靶点的突变效率；
其中，所述gRNA包括序列如SEQ ID No：2所示的gRNA1、序列如SEQ ID No：3所示的gRNA2和序列如SEQ ID No：4所示的gRNA3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述串联序列的模块顺序为，任一所述gRNA之前连接有1组tRNA，任一所述gRNA之后连接有1组scaffold，所述串联序列的最前端连接有启动子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述串联序列的模块顺序如下：启动子 +tRNA + gRNA1 + scaffold + tRNA + gRNA2 + scaffold + tRNA + gRNA3 + scaffold +tRNA + gRNA4 + scaffold，其中，tRNA的序列如SEQ ID No：5所示，scaffold的序列如SEQID No：6所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳性植株获得过程包括：
将所述CRISPR/Cas9基因编辑载体转入农杆菌，培养，得到侵染菌株；
用所述侵染菌株侵染发芽植株的切口，培养侵染后的植株，保留具有所述农杆菌选择性状的植株，进行选择培养，得到阳性植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为发根农杆菌，所述农杆菌选择性状为毛状根。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体为m-pRGEB31，所述m-pRGEB31包含Cas9模块和gRNA模块。
7.根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于，所述植株为苜蓿。
8.一种苜蓿品种培育的方法，其特征在于，包括：
应用权利要求7所述的方法，得到每个所述gRNA靶点的突变效率；
选择突变效率最高的gRNA，构建基因编辑载体，转入发根农杆菌，培养，得到载体侵染菌株；
用所述载体侵染菌株侵染发芽苜蓿的真叶或幼根，愈伤培养，得到纯合突变苜蓿植株；
选择具有目的性状的苜蓿植株，保留种质，得到具有目的性状的苜蓿品种。
9.一种基因编辑载体，其特征在于，将权利要求3所述的串联序列与Bsa I酶切的m-pRGEB31载体通过同源酶重组进行构建，得到所述基因编辑载体，其中，所述串联序列如SEQID No：1所示。
10.一种载体侵染菌株，其特征在于，将权利要求9所述的基因编辑载体转入大肠杆菌，获得阳性克隆大肠杆菌；
将所述阳性克隆大肠杆菌转入发根农杆菌中，获得阳性克隆发根农杆菌，即为所述载体侵染菌株。
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