CN118085053A - 以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用 - Google Patents
以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118085053A CN118085053A CN202211492231.XA CN202211492231A CN118085053A CN 118085053 A CN118085053 A CN 118085053A CN 202211492231 A CN202211492231 A CN 202211492231A CN 118085053 A CN118085053 A CN 118085053A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- inx5
- protein
- gene
- sleep
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101100341033 Drosophila melanogaster Inx5 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 101150045414 Inx5 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 56
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 20
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 208000020685 sleep-wake disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 230000003860 sleep quality Effects 0.000 claims description 8
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 206010062519 Poor quality sleep Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 2
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 claims description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 230000004622 sleep time Effects 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 abstract description 65
- 230000007958 sleep Effects 0.000 abstract description 50
- 102000010970 Connexin Human genes 0.000 abstract description 36
- 108050001175 Connexin Proteins 0.000 abstract description 36
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000003976 gap junction Anatomy 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 12
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 101100341032 Caenorhabditis elegans inx-5 gene Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700035323 Drosophila a Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000014416 Innexin Human genes 0.000 description 2
- 108050003470 Innexin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000037007 arousal Effects 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 101100341026 Caenorhabditis elegans inx-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100341038 Caenorhabditis elegans inx-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 101150090596 DMA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 108700002304 Drosophila can Proteins 0.000 description 1
- 101100341030 Drosophila melanogaster Inx3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100341035 Drosophila melanogaster Inx6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100341037 Drosophila melanogaster Inx7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100341024 Drosophila melanogaster ogre gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102000002512 Orexin Human genes 0.000 description 1
- 102000015982 Pannexin Human genes 0.000 description 1
- 108050004251 Pannexin Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 101100341025 Schistocerca americana inx1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010340 Sleep Deprivation Diseases 0.000 description 1
- 208000032140 Sleepiness Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 210000004242 electrical synapse Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000007230 neural mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000422 nocturnal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 108060005714 orexin Proteins 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000004617 sleep duration Effects 0.000 description 1
- 230000037321 sleepiness Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000003977 synaptic function Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用。本发明通过遗传操作手段在果蝇神经元中增加或降低间隙连接蛋白Inx5的表达量，通过DAM2***分析果蝇睡眠片段、平均睡眠片段时长、最大睡眠片段时长等参数，发现间隙连接蛋白Inx5表达量影响果蝇睡眠，间隙连接蛋白Inx5可作为睡眠障碍的潜在治疗靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用。
背景技术
神经元之间的电突触，也被称为间隙连接，是一种细胞连接方式，是相邻神经元之间的直接细胞膜通道。这些通道连接每个细胞的细胞质，并允许分子、离子和电信号在它们之间传递，使细胞发生化学或电耦合，实现细胞间的交流。间隙连接只存在于动物细胞中，在不同物种的大脑中广泛分布，在神经信息处理中发挥着重要作用。与化学突触相比，在神经网络中，间隙连接具有简单、快速和非离散的信息传递特性。
间隙连接由一个细胞间通道组成，该通道由两个半通道组成，含有六个同质或异质蛋白亚基。这些亚基在脊椎动物中属于连接蛋白(connexin)或(pannexin)基因家族，在无脊椎动物中属于Innexin(Inx)基因家族。在果蝇中，Inx蛋白家族则包括Inx1/Inx2/Inx3/Inx4/Inx5/Inx6/Inx7/Inx8等八类。现已知间隙连接和视觉学习和记忆相关：果蝇蘑菇体神经元中存在Innexin5(Inx5)间隙连接通道，研究发现在蘑菇体细胞中降低Inx5的表达量会损害其视觉学习记忆能力。而在蘑菇体神经元中敲除Inx5会破坏巩固的麻醉抵抗记忆，而不破坏不稳定的麻醉敏感记忆，这项研究为果蝇记忆巩固提供了更详细的神经元机制。
目前只有在哺乳动物中研究过间隙连接蛋白如何影响睡眠。比如，在哺乳动物中，星形胶质细胞和神经元之间可通过间隙连接方式进行作用，构成神经胶质网络。研究表明，敲除整个老鼠大脑星形胶质细胞中的间隙连接亚基连接蛋白43会造成其在夜间活动期间过度嗜睡和碎片性清醒。哺乳动物中枢神经***的复杂性使得研究人员很难确定间隙连接亚基在睡眠调节中的功能。
已知间隙连接影响记忆，也有极其少数的研究证明间隙连接影响睡眠。一项在线虫研究指出睡眠期间神经元活动调节具有保守性和重要性，并明确表明间隙连接功能对正常睡眠至关重要。另一项研究则提到，在哺乳动物背外侧被盖核(sublaterodorsalnucleus，SLD)脑区中，食欲素能刺激其受体神经元并增加神经元之间的间隙连接电导，这也提示了间隙连接和睡眠调节相关。但是，构成间隙连接的亚基如何参与睡眠调控仍然不清楚。
精神压力增加、睡眠-觉醒障碍发生率升高，这与很多精神疾病，如焦虑障碍、抑郁障碍、精神***症，脑信息处理异常等相关联，更与很多常见慢性疾病如高血压、心肌梗死、痴呆、肥胖、免疫功能失调有着重要关系，因此睡眠-觉醒障碍是不容忽视的“慢性杀手”。
睡眠障碍会促进神经退行性疾病的严重程度和发展进程，很有可能造成神经退行性疾病患者中突触功能丧失和记忆缺陷。因此，找寻神经和精神疾病的新的治疗靶点对治疗睡眠-觉醒障碍具有重要的实际意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用。本发明通过遗传操作手段在果蝇神经元中增加或降低间隙连接蛋白Inx5的表达量，通过DAM2***分析果蝇睡眠片段(文中用觉醒次数来体现)、平均睡眠片段时长、最大睡眠片段时长等参数，发现间隙连接蛋白Inx5表达量影响果蝇睡眠质量，间隙连接蛋白Inx5可作为睡眠障碍的潜在治疗靶点。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供以Inx5基因和/或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质在制备睡眠障碍治疗药物中的应用。
哺乳动物中枢神经***的复杂性使得研究人员很难确定间隙连接亚基在睡眠调节中的功能，而本发明采取果蝇作为模式生物进行研究。果蝇具有更为简单的神经***以及保守的睡眠调控机制，不失为研究间隙连接蛋白亚基调控睡眠的机制模型。在果蝇中有8种Inx基因，在果蝇中可以通过降低或者升高某一类神经元中间隙连接蛋白的表达量，检测果蝇的睡眠参数，判断间隙连接蛋白在睡眠调控中所起的作用，从而初步判断睡眠障碍相关的间隙连接蛋白治疗靶点。
本发明通过遗传操作手段在果蝇神经元中降低或升高间隙连接蛋白Inx5的表达量，通过DAM2***分析果蝇睡眠片段、睡眠片段时长等参数，发现所述蛋白的表达量影响果蝇睡眠质量，间隙连接蛋白Inx5能成为一种药物靶点。
间隙连接是一种跨细胞膜通道蛋白，由同一种或者不同种类的间隙连接蛋白亚基组成(图1)，降低其中一种间隙蛋白的表达量则能破坏该通道的功能，Inx5为其中一种蛋白，降低Inx5蛋白表达量理论上即可破坏该通道，升高则造成通道功能异常。本发明通过RNA(核糖核酸)干扰手段在果蝇神经元中降低Inx5基因的表达量(图2)，并且通过果蝇遗传学手段在果蝇神经元中升高Inx5基因的表达量，最后通过DMA2***检测果蝇的睡眠参数，如觉醒次数，判断Inx5蛋白的表达量是否和睡眠质量直接相关，从而验证其是治疗睡眠障碍的治疗靶点。
优选地，所述以Inx5基因作为作用靶点的物质是提高Inx5基因活性和/或表达量的促进剂，或是降低Inx5基因活性和/或表达量的抑制剂。
本发明中，所述促进剂和抑制剂的选择在于睡眠障碍的发生是Inx5基因的表达异常下降或是异常上升所致。
优选地，所述以Inx5蛋白作为作用靶点的物质是提高Inx5蛋白表达与功能的促进剂，或降低Inx5蛋白表达与功能的抑制剂，或Inx5重组蛋白，或Inx5蛋白的片段活性多肽。
本发明中，所述提高Inx5蛋白表达与功能的促进剂包括能够在体内或体外提高Inx5蛋白表达与功能的物质。其中，例如可通过下述方法增加Inx5的表达量：组织自身分泌大量Inx5蛋白或人工过表达Inx5蛋白、或者人工输送Inx5蛋白或者减少Inx5蛋白降解等。
所述降低Inx5蛋白表达与功能的抑制剂包括能够在体内或体外降低Inx5蛋白表达与功能的物质。其中，例如可通过下述方法降低Inx5的表达量：人工输入干扰Inx5基因表达的小分子化合物，人工输入酶，增加Inx5蛋白降解等。
优选地，所述Inx5基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述Inx5蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1：
aaacaagtaggtaataatgacggcacggacaaaaaaatatgtaaaaccaagcgacgatctgatctgtgaactggctaccatcctcggtcggcaattcgattgcattcattgtcatccctcaaagatcgaagtgattaatcccaggggcagcatagatagggcaaaaacccggacgaaaaccaggacaaaggaggatcgaaatcgggactgtgatcgggaacaggaacacgaacgggaacaggaacaggaacataaacaggtagcaccgcgaggcgaagaggagcggagcgttgagagttggaaactgtcctcgaggaactcttcccggaggcagaagaaatgttttcggcggtgaagccgctctccaagtatctccagttcaagtcaatacgcatctacgattccgtcttcaccatccactccaggtgcaccgtcgtcatcctgctcacctgctcgcttctcctgtccgcgcgtcagtactttggggatccgatccagtgcatcagcgaggagaagaacatcgagtacatacagtcctactgctggaccatgggcacctacatcctcaagctggacgacttcggcgatcaggagcaggcgctggtttccccaaatcaggaagtctcctacaactctgccttcttctcatccgccacaaccaacgcaccgcagtcatcgtcgagggtccgcaccaggccccacttcagatcgagtctgcgcaggattggcgagtacaacgaggcctacgcgcggtccctgtcgatagccgagggcgtgggccccgagattcgtggccagacggagcggcagtatctgcgctactaccagtgggtcatcatcctgctgctcttccagtcgttcgtcttctacttcccctcgtgcctgtggaaggtgtgggagggccggcggcttaagcagctctgctcggaggtcggcgacgcgctcctctcggaggagacctacaatacccggctgcgcatgctggtcaagtacttcaccaccgactacgaggacatgcacttttgctacatggccaagtacgtcttctgcgaggtcctcaatttcctcatcagtgtgagtaggtttgtgaatgtgaagaggagaaaacttacagaatattataacatatatgactttaaactgttatgaacaatttccgtgggttttctttgaatatagagctcttagcttgtgtaaaatataaatttagtacttaaacataaggacttaacataacagtcaataggacatctaaacttttggattttgtattatagtttttttgttatcgaaaaactaatatatcacaagatatgtttactaattttaccataatcgtaatacagcttatggtatccaatccgcaggtggtgaacataatcgtgttggaagtgttcctgaacggattctggtcgaagtatctgcgcgcgctggccaccattccgttctacgactgggatcgctggaaccgcgtgtcctcgagcgtcttcccgaagatcgccaagtgcgaggtgctcaagttcgggggcagcggcacggcgaacgttatggacaacctgtgcatcctgccgctgaacattctgaacgagaaaatcttcgtcttcctttgggcgtggttcctgctcatggccctgatgtccggtttgaaccttctgtgccggctggccatgatttgcagcaggtatctccgagagcagatgatacgcagccagttgcgtttcatgaccaaacggcatgtgaagcgtgccctgcgggacctgaccatcggcgactggttcctgatgatgaaggttagcgtcaacgtaaatcctatgctcttccgcgacctaatgcaggaactttgcgagctgcgcacctccgcatcgggcagcaccctggagagtcccgtctaggatcgctagtgatcaggtccacggattggattaggatccccagttcgcctcgtcctccgactgccgactatcaattgacgttgctgtcgttcgttaattcgtgccctttgcatatatctaaatctgtatattgcatatatttcctctcaattccttttaaaattatgtacttctatgttttaagacaataagcgaatataaatctatttaaagtc。
SEQ ID NO:2：
MFSAVKPLSKYLQFKSIRIYDSVFTIHSRCTVVILLTCSLLLSARQYFGDPIQCISEEKNIEYIQSYCWTMGTYILKLDDFGDQEQALVSPNQEVSYNSAFFSSATTNAPQSSSRVRTRPHFRSSLRRIGEYNEAYARSLSIAEGVGPEIRGQTERQYLRYYQWVIILLLFQSFVFYFPSCLWKVWEGRRLKQLCSEVGDALLSEETYNTRLRMLVKYFTTDYEDMHFCYMAKYVFCEVLNFLISVVNIIVLEVFLNGFWSKYLRALATIPFYDWDRWNRVSSSVFPKIAKCEVLKFGGSGTANVMDNLCILPLNILNEKIFVFLWAWFLLMALMSGLNLLCRLAMICSRYLREQMIRSQLRFMTKRHVKRALRDLTIGDWFLMMKVSVNVNPMLFRDLMQELCELRTSASGSTLESPV。
优选地，所述提高Inx5基因活性和/或表达量的促进剂包括：小分子化合物、多肽或表达Inx5基因的载体中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述降低Inx5基因活性和/或表达量的抑制剂包括：小分子化合物、表达Inx5基因的干扰RNA载体中任意一种或两种的组合。
优选地，所述提高Inx5蛋白表达与功能的促进剂包括：构建Inx5基因过表达体系的载体、小分子化合物或多肽中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述降低Inx5蛋白表达与功能的抑制剂包括：构建Inx5基因敲低或者敲除体系的载体、小分子化合物任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述Inx5重组蛋白是指基于氨基酸序列SEQ ID NO:2合成的重组蛋白。
优选地，所述Inx5重组蛋白包括：经修饰的Inx5蛋白、与天然Inx5蛋白同源且具有天然Inx5蛋白活性的蛋白分子、Inx5蛋白的二聚体或多聚体或含有Inx5蛋白氨基酸序列的活性多肽。
优选地，所述载体包括：腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、质粒、脂质体或纳米颗粒中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述以Inx5基因和/或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质具有选自以下的一种或多种用途：
(1)增加神经元细胞中Inx5基因表达量和/或提高Inx5蛋白的活性；
(2)降低神经元细胞中Inx5基因表达量和/或降低Inx5蛋白的活性；
(3)提高睡眠质量；
(4)增加睡眠时长；
(5)降低觉醒次数；
(6)降低觉醒总时长占比。
本发明使用果蝇作为模式动物，可以更方便快捷地进行基因降低或者其他遗传操作，能够降低成本和提高效率；在果蝇神经元中进行遗传学操作，可更细致地定位到某一类神经元和间隙连接蛋白与睡眠调控的关系。通过分析果蝇的睡眠参数判断间隙连接蛋白如何影响睡眠，在果蝇神经元中降低或者升高Inx5基因的表达量均会造成果蝇睡眠片段化，即造成觉醒次数增多，平均和最大睡眠片段时长缩短。结果表明Inx5蛋白/基因为一种潜在的治疗睡眠障碍的治疗靶点。
第二方面，本发明提供一种治疗睡眠障碍的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括第一方面所述的以Inx5基因和/或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
本发明所述的药学上可接受的辅料包括但不限于：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)使用果蝇作为模式动物，可以更方便快捷地进行基因降低或者其他遗传操作，提高成本和效率；
(2)在果蝇神经元中进行遗传学操作，可更细致地定位到某一类神经元和间隙连接蛋白、睡眠调控的关系；
(3)本发明中涉及的果蝇神经元和哺乳动物相应神经元类似，调控睡眠机制保守，有助于研究睡眠障碍治疗的靶向神经元；
(4)有助于研究间隙连接亚基在睡眠调节中的功能，为哺乳动物睡眠障碍研究提供思路借鉴；
(5)Inx5蛋白在调控睡眠质量中具备作用，是睡眠障碍治疗药物开发的潜在靶点；
(6)除Inx5亚基之外，是否还有其他亚基调控睡眠质量，以及调控的神经机制还未知，这将为睡眠调控领域提供新的新路和应用。
附图说明
图1是两个神经元之间间隙连接和间隙连接蛋白示意图；
图2是果蝇中核糖核酸(RNA)干扰技术原理图；
图3是果蝇神经元中降低Inx5表达量与睡眠觉醒次数的关***计图；
图4是果蝇神经元中降低Inx5表达量与平均睡眠片段时长的关***计图；
图5是果蝇神经元中降低Inx5表达量与最大睡眠片段时长的关***计图；
图6是果蝇神经元中升高Inx5表达量与睡眠觉醒次数的关***计图；
图7是果蝇神经元中升高Inx5表达量与平均睡眠片段时长的关***计图；
图8是果蝇神经元中升高Inx5表达量与最大睡眠片段时长的关***计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
实验室构建特异性标记果蝇神经元的工具果蝇a：构建带有标记神经元基因的启动子序列的重组质粒，将质粒注射入果蝇胚胎，筛选阳性胚胎并培育至成虫，扩增果蝇并鉴定保种，最终获得的果蝇既能标记神经元，又能驱动相关蛋白在该神经元中表达。
所述靶序列位于果蝇三号染色体Chr.3:31016713-31021641，长度为4939bp，来源于NCBI，相应信息为RID:RBSHGYBW013，Query ID：lcl|Query_62613，Sequence ID：NT_033777.3。
使用高保真PCR***(试剂型号Roche，Indianapolis，IN)从1μL野生型果蝇基因组DNA中扩增该序列，其中5'端包含Not I限制性内切位点。使用的正向引物(SEQ ID NO:3)为：5'-gcggccgcggtagccaaatgaacgttgagcgc-3'；反向引物(SEQ ID NO:4)为：5'-gcggccgcacgaatcgaatatctgaattccgc-3'；退火温度为55.0℃，延伸温度是68℃。将扩增产物使用按照制造商说明进行凝胶纯化(试剂型号：Zymo gel DNA Recovery Kit，Orange，CA)。最后将该序列***到pERGP GAL4表达质粒中(该质粒来源于Charles Nichols实验室)。纯化的启动子PCR产物和pERGP均用Not I酶进行剪切并进行凝胶纯化，再使用连接试剂盒(型号：Fast-Link DNA)将启动子片段连接到pERGP载体的Not I位点，至此构建好启动子-GAL4果蝇。
从中国科学院生物物理所和清华果蝇库中分别获取靶向Inx5基因的工具果蝇：带有过表达Inx5基因遗传元件的工具果蝇b1(UAS-Inx5)，和降低Inx5基因遗传元件的工具果蝇b2(Inx5 RNAi，清华果蝇库编号：THU2881)；
分别挑选果蝇a和b1/b2的雄蝇或者处女蝇并将其进行杂交，收取子一代果蝇，获得已经升高Inx5基因表达的果蝇品系F1-1(启动子-GAL4>UAS-Inx5)，或者降低Inx5基因表达的果蝇品系F1-2(启动子-GAL4>Inx5 RNAi)。
分别将2-5天的F1-1或F1-2单只果蝇装进DAM2(果蝇睡眠监测***，型号：Trikinetics，Waltham)***的小管中，管子中装有果蝇食物(2％琼脂加5％蔗糖)，对照组和实验组分别32管，其中实验组为启动子-GAL4>UAS-Inx5和启动子-GAL4>Inx5 RNAi，对照组为启动子-GAL4、UAS-Inx5、Inx5 RNAi。将管子***睡眠检测板，板子中央有红外线穿过小管，果蝇活动将阻断红外线。板子和电脑连接，对应的睡眠监测软件将通过果蝇穿梭阻断红外线来检测果蝇的睡眠行为。睡眠检测完成后，导出5天左右的睡眠数据，将数据通过MATLAB软件(型号：MATLAB_R2017a，MathWorks，Natick，MA)和程序SCAMP2019v2进行分析，比较果蝇F1-1或F1-2和对照组的睡眠质量表征参数(觉醒次数、平均和最大睡眠时长)。
后续将在果蝇其他类型神经元或者其他组织中进行Inx5基因的敲低和过表达实验并检测睡眠变化，找到该基因作用的特异性；其次，将进行Inx5调控睡眠的机制研究；再次，将在多种果蝇睡眠障碍模型中进行Inx5基因的敲低或者过表达，检测睡眠质量的改善情况，找到该基因成为治疗睡眠障碍的直接证据；最后，将在哺乳动物中敲低或者过表达间隙连接蛋白，检测睡眠行为，并在睡眠障碍模型中进行间隙连接蛋白的敲低或者过表达，研究间隙连接蛋白在睡眠障碍治疗中的应用。
其中，已经降低Inx5基因表达的果蝇品系F1-2的检测结果如图3、图4或图5所示，已经升高Inx5基因表达的果蝇品系F1-1的检测结果如图6、图7或图8所示。从图中可知，降低Inx5表达水平之后，平均睡眠片段时长，最大睡眠片段时长显著缩短；过表达Inx5后睡眠觉醒次数增加，过表达Inx5后平均睡眠片段时长、最大睡眠片段时长缩短。
综上，本发明通过遗传操作手段在果蝇神经元中增加或降低间隙连接蛋白Inx5的表达量，通过DAM2***分析果蝇睡眠片段、平均睡眠片段时长、最大睡眠片段时长等参数，发现间隙连接蛋白Inx5表达量影响果蝇睡眠，间隙连接蛋白Inx5可作为睡眠障碍的潜在治疗靶点。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.以Inx5基因和/或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质在制备睡眠障碍治疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述以Inx5基因作为作用靶点的物质是提高Inx5基因活性和/或表达量的促进剂，或是降低Inx5基因活性和/或表达量的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述以Inx5蛋白作为作用靶点的物质是提高Inx5蛋白表达与功能的促进剂，或是降低Inx5蛋白表达与功能的抑制剂，或Inx5重组蛋白，或Inx5蛋白的片段活性多肽。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述Inx5基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述Inx5蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述提高Inx5基因活性和/或表达量的促进剂包括：小分子化合物、多肽或表达Inx5基因的载体中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述降低Inx5基因活性和/或表达量的抑制剂包括：小分子化合物、表达Inx5基因的干扰RNA载体中任意一种或两种的组合。
6.根据权利要求3或4项所述的应用，其特征在于，所述提高Inx5蛋白表达与功能的促进剂包括：构建Inx5基因过表达体系的载体、小分子化合物或多肽中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述降低Inx5蛋白表达与功能的抑制剂包括：构建Inx5基因敲低或者敲除体系的载体、小分子化合物任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述Inx5重组蛋白是指基于氨基酸序列SEQ ID NO:2合成的重组蛋白；
优选地，所述Inx5重组蛋白包括：经修饰的Inx5蛋白、与天然Inx5蛋白同源且具有天然Inx5蛋白活性的蛋白分子、Inx5蛋白的二聚体或多聚体或含有Inx5蛋白氨基酸序列的活性多肽。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述载体包括：腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、质粒、脂质体或纳米颗粒中任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述以Inx5基因和/或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质具有选自以下的一种或多种用途：
(1)增加神经元细胞中Inx5基因表达量和/或提高Inx5蛋白的活性；
(2)降低神经元细胞中Inx5基因表达量和/或降低Inx5蛋白的活性；
(3)提高睡眠质量；
(4)增加睡眠时长；
(5)降低觉醒次数；
(6)降低觉醒总时长占比。
9.一种治疗睡眠障碍的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包括权利要求1-8中任一项所述的以Inx5基因和/或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质。
10.根据权利要求9所述的治疗睡眠障碍的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211492231.XA CN118085053A (zh) | 2022-11-25 | 2022-11-25 | 以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用 |
| PCT/CN2022/138191 WO2024108678A1 (zh) | 2022-11-25 | 2022-12-09 | 以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211492231.XA CN118085053A (zh) | 2022-11-25 | 2022-11-25 | 以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118085053A true CN118085053A (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=91140887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211492231.XA Pending CN118085053A (zh) | 2022-11-25 | 2022-11-25 | 以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118085053A (zh) |
| WO (1) | WO2024108678A1 (zh) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015120446A1 (en) * | 2014-02-10 | 2015-08-13 | California Institute Of Technology | Compositions and methods for modulating sleep and wakefuleness |
| EP4007764A4 (en) * | 2019-08-02 | 2023-08-09 | Enterin, Inc. | HUMAN ENT-03 AMINOSTEROL COMPOUNDS, RELATED COMPOSITIONS COMPRISING THEM, AND METHODS OF USE THEREOF |
| JP2022543244A (ja) * | 2019-08-02 | 2022-10-11 | エンターイン、 インコーポレイテッド | ヒトスクアラミン誘導体、それを含む関連組成物、およびそれを用いた方法 |
-
2022
- 2022-11-25 CN CN202211492231.XA patent/CN118085053A/zh active Pending
- 2022-12-09 WO PCT/CN2022/138191 patent/WO2024108678A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024108678A1 (zh) | 2024-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yoshimura et al. | Signaling networks in neuronal polarization | |
| Winkler et al. | Large animal models of inherited retinal degenerations: a review | |
| CN103687957A (zh) | 工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法 | |
| Uesaka et al. | Retrograde signaling from progranulin to Sort1 counteracts synapse elimination in the developing cerebellum | |
| JP6326703B2 (ja) | 外因性遺伝子発現増強剤 | |
| JPWO2003041496A1 (ja) | トランスジェニック動物 | |
| WO2019201331A1 (zh) | 一种CRISPR/Cas效应蛋白及*** | |
| CN111424053B (zh) | 一种轴突型腓骨肌萎缩症果蝇模型的构建方法及应用 | |
| CN110862988B (zh) | 一种sgRNA及其构建的CREBRF点突变型巴马香猪和应用 | |
| WO2001040519A2 (en) | Methods for identifying modulators for balance related disorders | |
| CN118085053A (zh) | 以Inx5基因或以Inx5蛋白作为作用靶点的物质的应用 | |
| KR20210039495A (ko) | 피드백이 가능한 합성 유전자, 표적 시드 매치 카세트, 및 그 용도 | |
| Levitas-Djerbi et al. | Neurotensin enhances locomotor activity and arousal and inhibits melanin-concentrating hormone signaling | |
| CN111778323B (zh) | AchR、睡眠和觉醒 | |
| CN109652542B (zh) | Gsα基因在制备抗腹主动脉瘤药物中的应用 | |
| CN116814689B (zh) | 特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法及其应用 | |
| CN111808907B (zh) | 调整觉醒的物质及方法 | |
| Banazadeh et al. | Unexplored power of CRISPR-Cas9 in neuroscience, a multi-OMICs review | |
| CN116555162B (zh) | 基于piRNA与m6A甲基化在高糖损伤肾小管上皮细胞的调控应用 | |
| CN104131036B (zh) | 条件型伊维菌素受体ivmr转基因小鼠模型的构建方法及应用 | |
| CN116970604B (zh) | 一种shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 | |
| JP2006288387A (ja) | 気分障害又は関連障害による疾患症状を改善させる方法 | |
| Chalmers | Drosophila melanogaster as a high-throughput and in vivo model to study body weight and feeding behaviour | |
| CN116004638A (zh) | 褐飞虱锚定蛋白基因NlGPI作为靶点在防治褐飞虱中的应用 | |
| CN115349015A (zh) | 用于调节睡眠的药剂和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |