CN118077830A - 一种促进水生动物生长的复合益生菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进水生动物生长的复合益生菌剂及其制备方法和应用，所述复合益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC 21879的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株和保藏编号为CGMCC 21765的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA71菌株。本发明制备的复合菌剂能够显著抑制嗜水气单胞菌，同时凝结芽孢杆菌BC66还能调节水生动物肠道健康，提高水生动物存活率，促进水生动物生长，且与嗜酸乳杆菌LA71联合使用效果更好，二者在上述效果上具有意料不到的协同作用。

Description

一种促进水生动物生长的复合益生菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种促进水生动物生长的复合益生菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，我国水产养殖高速发展，水产动物营养价值高，极大地丰富了人们的物质生活。但随着高密度集约化养殖，养殖水体生态环境恶化，极大地增加了水产动物之间病原体交叉混合感染的机会。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是水产养殖中常见的条件致病菌，同时也是人-兽-鱼共患的条件致病菌。在水中分布广泛，尤其对淡水鱼、虾蟹、蛙、鳖、龟危害极大，引起淡水鱼细菌性败血症、细菌性肠炎；虾蟹烂鳃病；蛙红腿病；鳖龟红脖子病、溃烂病、穿孔病和红底板病。由于养殖水体水质恶劣，在高温条件下，嗜温性的嗜水气单胞菌大量滋生，同时养殖密度大和人工操作的不当导致水生动物的健康受损，水生动物自身免疫机能降等，导致机体容易感染嗜水气单胞菌，诱发大面积病害的爆发。嗜水气单胞菌引起的疾病，发病快，传播迅速，发病初期不易察觉，病情难以控制，容易引发大面积病害的爆发。水温在25℃以上易爆发。

针对该菌的防治，传统的方法是使用抗生素，短时间内能很好控制病情，但是长期使用容易导致病原菌产生耐药性，水生动物肠道菌群失衡，抗生素富集在水生动物体内通过食物链影响人类自身健康。用微生态制剂进行水产养殖动物病害的防治是禁抗后有效方法，微生态制剂不会使病原菌产生耐药性，同时还具有调节肠道菌群的功能。

凝结芽孢杆菌是我国农业农村部、欧美等国批准的人用、兽用益生菌，有益生菌之王的美誉。它具有如下特点：G⁺菌，芽孢端生；最适生长温度为37-45℃，最适pH为6.6-7.0，可耐受100℃温度存活；可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、海藻糖，产酸而不产气；同型耗氧发酵，主产物为L(+)一乳酸，还有少量甲酸、乙酸、丙酸和乙醇等；分泌抗菌肽物质-抑菌素；D-葡萄糖可作为营养性萌发剂，生物素和硫胺素可作为生长因子。饲料添加目录中乳酸菌由于不产生芽孢，抗逆性差，常温放置易失活，储藏成本高，在饲料应用中受到一定限制。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进水生动物生长的复合益生菌剂及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种促进水生动物生长的复合益生菌剂，所述复合益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC 21879的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株和保藏编号为CGMCC 21765的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA71菌株。

本发明使用的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是能产生乳酸的芽孢杆菌，既具有乳酸菌的特点又具有耐高温，耐常温储存，高活性的等优点。凝结芽孢杆菌制备的微生态制剂能够显著抑制嗜水气单胞菌，同时凝结芽孢杆菌还能调节水生动物肠道健康，提高水生动物存活率，促进水生动物生长。且与嗜酸乳杆菌LA71联合使用效果更好，二者在上述效果上具有意料不到的协同效果。

优选地，所述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA71菌株的活菌数之比为(1-2):(1-2)。

其中(1-2)中的具体点值均可选择1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA71菌株的活菌数独立地不低于1×10⁸CFU/g，例如1×10⁸CFU/g、2×10⁸CFU/g、3×10⁸CFU/g、4×10⁸CFU/g、5×10⁸CFU/g、6×10⁸CFU/g、7×10⁸CFU/g、8×10⁸CFU/g、1×10⁹CFU/g、2×10⁹CFU/g、5×10⁹CFU/g、8×10⁹CFU/g、1×10¹⁰CFU/g、1×10¹¹CFU/g、1×10¹²CFU/g等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述复合益生菌剂还包括功效成分、保护剂、抑菌剂。

优选地，所述复合益生菌剂以质量份数计包括菌株4-10份、功效成分6-10份、保护剂76-87份、抑菌剂3-6份。

所述菌株的质量份数可以选择4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份等，所述功效成分的质量份数可以选择6份、6.5份、7份、7.5份、8份、8.5份、9份、9.5份、10份等，所述保护剂的质量份数可以选择76份、78份、80份、82份、84份、87份等，所述抑菌剂的质量份数可以选择3份、3.2份、3.5份、3.8份、4份、4.2份、4.4份、4.6份、4.8份、5份、5.2份、5.4份、5.6份、5.8份、6份等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述保护剂包括玉米淀粉和/或麦芽糊精。

优选地，所述功效成分包括黄芪多糖。

优选地，所述抑菌剂包括柠檬酸。

优选地，所述复合益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂的制备方法，所述制备方法包括：

(1)将菌株与保护剂混合，得到乳化液；

(2)将乳化液冷冻干燥，粉碎即得菌粉；

(3)将菌粉、功效成分、抑菌剂混合，即得。

第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂在制备促进水生动物生长的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明使用的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66是能产生乳酸的芽孢杆菌，既具有乳酸菌的特点又具有耐高温，耐常温储存，高活性的等优点。凝结芽孢杆菌制备的微生态制剂能够显著抑制嗜水气单胞菌，同时凝结芽孢杆菌BC66还能调节水生动物肠道健康，提高水生动物存活率，促进水生动物生长。且与嗜酸乳杆菌LA71联合使用效果更好，二者在上述效果上具有意料不到的协同效果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

下述实施例、对比例涉及的产品中包含的功效成分来源方式如下(仅体现功效成分，其他市售原料中含有的必要辅料成分不再赘述)：

下述内容中涉及的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA71菌株，分类命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏编号为CGMCC 21765，保藏日期为2021年1月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述内容中涉及的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株，分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏编号为CGMCC 21879，保藏日期为2021年3月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

黄芪多糖为购自江苏金荷塘中药有限公司商品名为黄芪多糖的产品。

实施例1

本实施例提供一种复合益生菌剂，所述复合益生菌剂以质量份数计包括菌株7份、黄芪多糖8份、玉米淀粉40份、麦芽糊精40份、柠檬酸4份，所述菌株包括活菌数之比为1:1的凝结芽孢杆菌BC66和嗜酸乳杆菌LA71，总活菌数为1×10¹⁰CFU/g。

其制备方法为：

(1)将菌株与保护剂混合，得到乳化液；

(2)将乳化液冷冻干燥，粉碎即得菌粉；

(3)将菌粉、功效成分、抑菌剂混合，即得。

实施例2

本实施例提供一种复合益生菌剂，所述复合益生菌剂以质量份数计包括菌株15份、玉米淀粉40份、麦芽糊精40份、柠檬酸4份，所述菌株包括活菌数之比为1:1的凝结芽孢杆菌BC66和嗜酸乳杆菌LA71，总活菌数为1×10⁹CFU/g。

制备方法参考实施例1。

对比例1

本对比例提供一种复合益生菌剂，其与实施例1的区别仅在于，所述菌株仅包括凝结芽孢杆菌BC66，其他成分和含量保持不变，总活菌数与实施例1保持一致。

制备方法参考实施例1。

对比例2

本对比例提供一种复合益生菌剂，其与实施例1的区别仅在于，所述菌株仅包括嗜酸乳杆菌LA71，其他成分和含量保持不变，总活菌数与实施例1保持一致。

制备方法参考实施例1。

对比例3

本对比例提供一种复合益生菌剂，其与实施例1的区别仅在于，将凝结芽孢杆菌BC66等活菌数地替换为凝结芽孢杆菌ATCC7050，其他成分和含量保持不变，总活菌数与实施例1保持一致。

制备方法参考实施例1。

对比例4

本对比例提供一种复合益生菌剂，其与实施例1的区别仅在于，将嗜酸乳杆菌LA71等活菌数地替换为嗜酸乳杆菌ATCC4356，其他成分和含量保持不变，总活菌数与实施例1保持一致。

制备方法参考实施例1。

对比例5

本对比例提供一种制剂，所述制剂以质量份数计包括黄芪多糖15份、玉米淀粉40份、麦芽糊精40份、柠檬酸4份。

制备方法参考实施例1。

测试例1

凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的抑菌实验

(1)凝结芽孢杆菌BC66按1％接种量接到10mL MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养48h。嗜酸乳杆菌LA71按1％接种量接到10mL MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养48h。

(2)致病指示菌按1％接种量接到5mL TSB肉汤培养基中，30℃160rpm培养18h。培养完成后取少量菌液用血球计数板法计数菌数，用生理盐水将菌悬液调整到1×10⁶CFU/mL。

(3)制备TSA平板：称取16g TSA培养基粉，加入400mL蒸馏水，搅拌均匀，用封口膜封口，高压灭菌。待培养基温度凉到45℃左右倒入90cm平皿中，约10mL/板。

(4)取100μL致病菌指示菌使用菌液于TSA固体平板上，加入约15颗玻璃珠，前后左右滚动均匀，倒出玻璃珠。

(5)用镊子将灭菌过的牛津杯放在TSA平板上，不能让其滑动。

(6)取150μL凝结芽孢杆菌发酵液于牛津杯中，缓慢移动，于30℃恒温培养箱中培养24h。

(7)用游标卡尺测抑菌圈直径(d)

凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌的抑菌结果如表1所示。

表1

由表1可知，凝结芽孢杆菌BC66和嗜酸乳杆菌LA71对嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌有显著的抑菌效果。

测试例2

微生态制剂抑菌试验

(1)致病指示菌培养：1％接种量接到5mL TSB肉汤培养基中，30℃160rpm培养18h。培养完成后取少量菌液用血球计数板法计数菌数。

(2)实施例1-2、对比例1-5按质量体积比0.5％、1％、3％、5％添加，使致病菌终浓度达1×10⁵CFU/mL，30℃160rpm培养24h。设置只有致病菌没加复合益生菌剂的为对照组，每组3个平行。

(3)取菌悬液用10倍梯度稀释法稀释到合适梯度，计数连续3个梯度，培养基为TSA，30℃培养24h，数菌落在30-300CFU/皿，计算平均值，计算对致病菌的抑制率。

抑制率R＝(对照组平均菌数-试验组平均菌数)/对照组平均菌数×100％

表2

由表2可知，本发明所述复合益生菌剂具有良好的抑菌效果，且凝结芽孢杆菌BC66和嗜酸乳杆菌LA71在上述效果上可以相互配合，两种菌株联合使用效果更好。

测试例3

微生态制剂在牛蛙上的应用

选用平均体重30g左右的健康牛蛙进行为期8周的养殖试验，对照组饲喂基础饲料，试验组在基础饲料基础上添加0.1％的实施例1-2，对比例1-5所述益生菌剂，所述益生菌剂溶水后均匀喷洒在牛蛙饲料上，常温晾干。每组设3个重复，每个重复80只牛蛙。养殖试验贴近生产高密度牛蛙养殖模式，养殖网箱规格为0.5平米。每天分别于8：00、17：00表观饱食投喂，养殖过程中记录每顿投喂量、水温和死亡情况，每次投喂前清理区域内残饵料，实时关注区域内蛙状态，及时捞出死蛙并称重、解剖做好记录。养殖试验结束后，进行采样，检测分析。

表3

组别	增重率(％)	成活率(％)	特定生长率(％)	饲料转化率(％)
					对照组	190±12.05	95.66±0.68	1.90±0.17	1.02±0.13
实施例1	210*±14.33	99.05*±0.55	2.02*±0.16	1.13*±0.19
					实施例2	203*±15.60	98.00*±0.60	1.98*±0.19	1.09*±0.12
对比例1	200*±17.33	96.05±0.18	1.96*±0.18	1.07*±0.16
					对比例2	195*±20.33	97.05*±2.89	1.93±0.25	1.05±0.11
对比例3	191±21.22	96.02±4.66	1.90±0.27	1.05±0.17
					对比例4	191±24.34	95.99±3.66	1.90±0.25	1.05±0.12
对比例5	191±21.54	96.05±2.89	1.89±0.25	1.05±0.11

注：*为p<0.05。

结果如表3所示，与对照组相比，实施例1组的增重率、成活率、饲料转化率、特定生长率表现出显著差异；表明复合益生菌剂在提高生长性能方面有很好的促进作用。实施例1复合菌剂提高牛蛙生长性能的能力强于其他复合菌剂，说明凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌复合制剂比单一菌种的制剂应用效果更好。

测试例4

微生态制剂在加州鲈鱼上的应用

选用480尾平均体重25g左右的健康加州鲈鱼苗，随机分为对照组和试验组，每组设置3个重复，每个重复20尾鱼。对照组饲喂基础饲料，试验组饲料在基础饲料中添加0.1％复合益生菌剂。养殖试验在工厂化循环水养殖***中进行，采用饱食投喂方式，每天投喂2次，养殖时间为8周，试验结束后进行采样检测。

表4

注：*p<0.05。

如表4所示，与对照组相比，实施例1组的增重率、特定生长率以及饲料系数均有提高的趋势，表现出显著差异；而摄食量试验组显著提高，表明试验组饲料的适口性或诱食性提高。实施例1提高加州鲈鱼生长性能的能力强于对比例1和对比例2，说明凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌复合制剂比单一菌种的制剂应用效果强。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种促进水生动物生长的复合益生菌剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC 21879的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株和保藏编号为CGMCC 21765的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA71菌株。

2.根据权利要求1所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA71菌株的活菌数之比为(1-2):(1-2)。

3.根据权利要求1或2所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans BC66菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilusLA71菌株的活菌数独立地不低于1×10⁸CFU/g。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂还包括功效成分、保护剂、抑菌剂。

5.根据权利要求4所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂以质量份数计包括菌株4-10份、功效成分6-10份、保护剂76-87份、抑菌剂3-6份。

6.根据权利要求4或5所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述保护剂包括玉米淀粉和/或麦芽糊精；

优选地，所述功效成分包括黄芪多糖。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述抑菌剂包括柠檬酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)将菌株与保护剂混合，得到乳化液；

(2)将乳化液冷冻干燥，粉碎即得菌粉；

(3)将菌粉、功效成分、抑菌剂混合，即得。

10.一种根据权利要求1-8中任一项所述的促进水生动物生长的复合益生菌剂在制备促进水生动物生长的产品中的应用。