CN118076378A - 包含肿瘤相关抗原衍生肽以及由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂的抗癌疫苗组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及：一种抗癌疫苗组合物，其包含[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]；及其用途。具体地，所述肿瘤相关抗原衍生肽特异性结合人白细胞抗原(HLA)，将具有上述特征的肽的组合与佐剂以最佳比例混合以制备疫苗组合物，并且所述疫苗组合物用于预防或治疗癌症。
Description
发明背景
1.发明所属领域
本发明涉及一种抗癌疫苗组合物，其包含肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽和由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂，以及其用途。具体而言，本发明涉及一种特异性结合人白细胞抗原(HLA)的肽的用途，由所述肽、脂肽和聚(I：C)构成的佐剂组成的抗癌疫苗，以及包含所述抗癌疫苗的药物组合物，所述抗癌疫苗是所述药物组合物的活性成分，所述药物组合物用作癌症预防或治疗药剂。
2.相关现有技术概述
癌症的特征在于与正常细胞相比不受控制的细胞生长、侵入附近组织的能力和转移到其它远端组织的能力。现代随着科学和医学技术的发展，许多疾病变得可以治愈，而不可治愈的疾病几乎消失了。然而，与其它疾病不同，癌症需要非常复杂和苛刻的治疗，但该治疗并非完全有效。
通过物理去除癌组织，抑制癌细胞存活所必需的基因(例如抗凋亡分子、端粒酶、生长因子受体基因和信号分子)的表达，或通过放射或施用抗癌剂诱导凋亡来进行抗癌治疗(Knudson AG，Nature Reviews.Cancer 1(2)：157-162，2001)。
然而，这种治疗的问题在于不仅癌细胞还有正常细胞都可能受到影响，从而导致副作用。因此，作为一种癌症治疗的替代方法，对抗癌疫苗的需求日益凸显。
抗癌疫苗是一种通过记住人免疫***中癌细胞特有的抗原来攻击癌细胞的疫苗，并且有各种类型的抗原和抗原递送方法(例如肽、DNA、RNA和树突细胞)。与预防外源性病毒或细菌感染的传统预防性疫苗不同，用于癌症治疗的疫苗必须诱导针对自身抗原而不是非自身抗原的免疫应答。另外，在癌症形成后施用，该疫苗应当起作用并发挥抑制癌症的免疫作用，并且该疫苗应当尽可能多地呈递不同类型的癌抗原，因为即使在患有同种癌症的不同患者中，每种癌抗原的表达率也是不同的。
事实上，许多类型的肿瘤相关抗原是自身抗原并且是免疫耐受原，因此难以诱导特异性免疫应答。这些局限可以通过诱导针对在各种癌症类型中都普遍表达的抗原的免疫应答或针对在某种癌症中高表达的抗原的免疫应答来克服。在各种癌症类型中都普遍表达的抗原以及在某种癌症中高表达的抗原，最近都已见报道。
作为抗癌疫苗的标靶，肿瘤相关抗原(TAA)被分为如下几类。A)癌-睾丸抗原：属于这一类的抗原在除睾丸***细胞/***以外的正常组织中不表达，但在癌组织中高表达，因此它们从一开始就被称为癌-睾丸(CT)抗原。由于睾丸细胞不表达I类或II类HLA分子，这些抗原在正常细胞上不被T细胞识别，因此可以被认为是免疫学上肿瘤特异性的。众所周知的CT抗原包括MAGE家族成员和NY-ESO-1。B)分化抗原：这类TAAs是特定组织的细胞分化过程中表达的蛋白，也是肿瘤和肿瘤发端的正常细胞之间共有的抗原。代表性的分化抗原是在黑素瘤和正常黑素细胞中发现的Melan-A/MART-1。该黑素细胞谱系相关蛋白参与黑色素的生物合成，尽管不是肿瘤特异性的，但被广泛用于癌症免疫治疗。其它例子包括黑素瘤相关的酪氨酸酶或***癌相关的***特异性抗原(PSA)。C)过表达的TAA：这是一类在正常组织中通常显示低表达，而在不同类型的肿瘤中被广泛表达的TAA。被正常组织内的抗原呈递细胞(APCs)加工并可能呈递的许多肽表位可能低于T细胞识别的阈值水平，因此在正常细胞中不诱导免疫应答，但它们在肿瘤细胞中的过表达可以通过破坏先前建立的抗性来启动抗癌应答。该类TAAs中代表性例子包括Her-2/neu、存活蛋白、端粒酶或WT-1(Wilms'tumor 1)。D)肿瘤特异性抗原：这类独特的TAAs是由正常基因(β-连环蛋白、CDK4、EGFRVIII等)的突变引起的。这些分子改变中的一部分与肿瘤转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原通常可以诱导强免疫应答，而不会引发对正常组织的自身免疫应答的风险。另一方面，在大多数情况下，肿瘤特异性抗原通常在各种癌症中并不普遍表达，仅在特定癌症中表达。E)由异常翻译后修饰引起的TAA：这类TAAs可以存在于既非特异的也不过表达的蛋白中，但这些蛋白主要通过主动翻译后加工与肿瘤相关。这类肿瘤相关抗原的例子来自于例如可能是或可能不是肿瘤特异性的降解期间的蛋白质剪接事件，或者来源于导致在肿瘤中产生新表位的突变的糖基化模式，例如MUC-1(Mucin 1)。
有多种方法将肿瘤细胞裂解物、蛋白质、DNA/RNA、质粒和肽(这些都是T细胞表位)用作抗癌疫苗的抗原形式。其中，肽表位是活化抗原特异性T细胞以杀死癌细胞或抑制癌细胞生长的最有效物质。另外，肽本身具有安全性高、价廉、易于生产和能够结合多种抗原的优点。
抗癌疫苗靶向肿瘤相关抗原衍生肽表位，该肽表位由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递。人类的MHC分子被称为HLA (人白细胞抗原)。有两类MHC分子，MHC I类分子和MHC II类分子。MHC I类分子由一条α链和一条β2-微球蛋白链组成，而MHC II类分子由一条α链和一条β链组成。它们的三维形状构成结合槽，其用于与肽的非共价结合。
MHC I类分子见于大多数有核细胞中，并且呈递内源蛋白、缺陷核糖体产物(DRIPs)和由大型肽的蛋白水解切割产生的肽。然而，也在MHC I类分子上发现了内体区室衍生肽或外部来源衍生肽。这种非经典形式的I类呈递在文献中被称为交叉呈递(Brossart和Bevan，Blood，1997)。
MHC II类分子主要存在于专门的抗原呈递细胞(APCs)上，其主要呈递由抗原呈递细胞摄取的外源蛋白或跨膜蛋白。肽和MHC I类分子的复合物被表达适配的T细胞受体(TCR)的CD8+T细胞识别，而肽和MHC II类分子的复合物被表达适配的TCR的CD4+辅助性T细胞识别。CD4+辅助性T细胞在有效诱导和维持CD8+细胞毒性T细胞的应答中起重要作用。因此，由肿瘤相关抗原诱导的CD4+T细胞表位对于激发抗肿瘤免疫应答的药物的开发是至关重要的(Gnjatic等，PNAS，2003)。
辅助T细胞通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)友好细胞因子支持肿瘤部位的环境，并吸引效应细胞，例如CTL、自然杀伤细胞、巨噬细胞和粒细胞(Tay等，Cancer Gene Therapy，2020)。MHCⅡ类分子活化的辅助性T细胞在调节抗肿瘤免疫中CTL效应子的功能发挥重要作用。引起TH1型辅助T细胞应答的辅助T细胞表位支持CD8+杀伤T细胞的支持效应子功能，包括针对在细胞表面上表达肿瘤相关肽/MHC复合物的肿瘤细胞的细胞毒性功能。这样，肿瘤相关辅助T细胞肽表位可单独或与其它肿瘤相关肽组合用作疫苗组合物的活性药物成分以激发抗肿瘤免疫应答。例如，在哺乳动物模型如小鼠中，已知即使在没有CD8+T淋巴细胞的情况下，CD4+T细胞通过分泌干扰素γ(IFN-g)抑制血管生成来抑制肿瘤(Beatty和Paterson，Immunologic Research，2001；Mumberg等，PNAS，1999)。
肿瘤相关抗原的鉴定和表征对于肿瘤疫苗的开发是重要的，所述肿瘤相关抗原由CD8+T细胞(配体：MHC I类分子+肽表位)或CD4+辅助性T细胞(配体：MHC II类分子+肽表位)识别并通过CD8-和CD4-依赖性应答协同促进抗肿瘤作用。因此，在本发明中，识别MHC I类分子的肽表位和识别MHC II类分子的肽表位被联合应用。
基本上，任何能结合MHC分子的肽都可以作为T细胞表位。在体外或体内诱导T细胞应答的先决条件是存在表达相应TCR的T细胞，而没有对该特异性表位的免疫耐受。
识别在肿瘤组织或人肿瘤细胞系中过表达或选择性表达的基因，对于从这些基因转录的抗原在免疫疗法中的应用，则无法提供精确信息。这是因为只有这些抗原的表位的个别亚群适合于这样的应用，因为必须存在表达相应TCR的T细胞，而对该特异性表位的免疫耐受必须不存在或最小。因此，重要的是只选择出过表达或选择性表达的肽，这些肽与MHC分子相关，同时这些肽使T细胞免疫耐受最小化而使T细胞功能和增殖最大化。
然而，由于MHC的等位基因如此之多，为每个等位基因制备候选肽并直接测试它们以从中选出结合地牢固稳定的那些肽是不切实际的。相反，计算机算法程序或数据库可用来有效地预测哪些肽可与存在于各种MHC分子上的三维结合槽牢固结合。
利用这些数据库中所拥有的有关MHC与肽结合的肽基序的信息，以及利用通过质谱仪洗脱与各MHC分子结合的肽而获得的数据库，可以在给定蛋白质序列中预测并发现各种肽表位。
代表性的数据库包括SYFPEITHI、MHCPEP、NetMHCpan-4.1EL和NetMHCIIpan-4.0EL。然而，并非所有通过结合能力预测出的肽都能有效地诱导出体外或体内T细胞应答。尽管在计算机程序中预测的结合亲和力高，但是它实际上不能在体外或体内诱导出足够的免疫原性，并且甚至可能诱导出免疫耐受。
因此，为了这些预测出的肽能被用作抗癌疫苗，必须通过实际的实验选择最有效和安全的肽，以确定它们是否在体外或体内引发有效的免疫原性以及它们是否不诱导免疫耐受。然而，进行这些实验需要经济、物质和时间方面的大量投入。因此，在本发明中，优先选择那些已知与各种癌抗原中MHC I类和II类分子相关的、能够使T细胞的功能和增殖最大化的、并且在各种先前的临床试验中已经证明是安全的肽。
尽管TCR与肽的结合对于增强T细胞针对肿瘤相关抗原的活化和功能是至关重要的，但是先前那些真正使用肽作为疫苗的临床试验的结果没有显示出预期的效果。主要原因是肽单独不能诱导出足够的免疫原性。有效的免疫原性需要通过抗原呈递细胞的共刺激信号传导和适当细胞因子的辅助。否则，T细胞可能变得无反应性，并且可以诱导免疫耐受。因此，佐剂对于诱导适当和充分的T细胞活化并由此诱导抗癌免疫应答是必需的。
在本发明中，由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂被用于抗癌疫苗组合物。该佐剂是体液免疫应答和细胞免疫应答的优良诱导剂，并增强Th1型免疫应答，这对于抗癌应答特别重要。因此，本发明人通过证实由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂有助于肽活化癌抗原特异性T细胞，并诱导更有效的肿瘤相关抗原特异性免疫应答，从而完成了本发明。
发明内容详述
技术挑战
本发明的一个目的是提供一种包含[肿瘤相关抗原衍生肽]的抗癌疫苗组合物。
本发明的另一个目的是提供一种包含[肿瘤相关抗原衍生肽]和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]的抗癌疫苗组合物。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的上述抗癌疫苗组合物。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含上述抗癌疫苗组合物以及选自化疗、靶向治疗、免疫检查点抑制剂和放疗中的一种或多种。
解决方案
为了实现上述目的，本发明提供一种抗癌疫苗组合物，所述抗癌疫苗组合物包含[肿瘤相关抗原衍生肽，所述肿瘤相关抗原选自hTERT、MAGE-A3、MUC-1、存活蛋白和WT-1中的一种或多种]。
本发明还提供一种抗癌疫苗组合物，所述抗癌疫苗组合物包含[肿瘤相关抗原衍生肽，所述肿瘤相关抗原选自hTERT、MAGE-A3、MUC-1、存活蛋白和WT-1中的一种或多种]和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]。
所述[肿瘤相关抗原衍生肽]包括下列肽中的一种或多种。
i)序列SEQ.ID.NO：1的hTERT衍生肽，属于HLA-A02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO：1：ILAKFLHWL)，
ii)序列SEQ.ID.NO：2的hTERT衍生肽，属于HLA-A24型(MHC I类)(SEQ.ID.NO：2：VYAETKHFL)，
iii)序列SEQ.ID.NO：3的hTERT衍生肽，属于HLA-DRB1型(MHC II类)(SEQ.ID.NO：3：EARPALLTSRLRFIPK)，
iv)序列SEQ.ID.NO：4的hTERT衍生肽，属于HLA-DRB1型(MHC II类)(SEQ.ID.NO：4：RPGLLGASVLGLDDI)，
v)序列SEQ.ID.NO：5的存活蛋白衍生肽，属于HLA-A02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO：5：ELTLGEFLKL)，
vi)序列SEQ.ID.NO：8的Mage-A3衍生肽，属于HLA-A02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO：8：KVAELVHFL)，
vii)序列SEQ.ID.NO：9的Mage-A3衍生肽，属于HLA-A24型(MHC I类)(SEQ.ID.NO：9：IMPKAGLLI)，
viii)序列SEQ.ID.NO：12的MUC-1衍生肽，属于HLA-A02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO：12：TAPPVHNV)，
ix)序列SEQ.ID.NO：15的WT-1衍生肽，属于HLA-A02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO：15：RMFPNAPYL)，和
x)序列SEQ.ID.NO：16的WT-1衍生肽，属于HLA-DRB1型(MHC II类)(SEQ.ID.NO：16：KRYFKLSHLQMHSRKH)。
所述佐剂由所述脂肽和所述免疫活性物质混合而成。
所述佐剂包含表面有脂肽***的脂质体和免疫活性物质。
所述脂质体由脂质构成。
所述免疫活性物质选自聚(I∶C)、QS21、MPLA、CpG和鞭毛蛋白中的一种或多种。
本发明还提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的上述抗癌疫苗组合物。
另外，本发明提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含上述抗癌疫苗组合物以及选自化疗、靶向治疗、免疫检查点抑制剂和放疗中的一种或多种。
有益效果
由本发明的一方面提供的肿瘤相关抗原衍生肽可以有效地诱导抗癌免疫，包含所述肿瘤相关抗原衍生肽和佐剂的抗癌疫苗组合物可以有效地诱导针对各种癌症的抗癌免疫，所述佐剂包含脂肽和免疫活性物质，并且所述抗癌疫苗组合物可以与常规抗癌治疗(如不同机制的化学抗癌剂、免疫检查点抑制剂和放射治疗)联合使用，以显著增强抗癌效果，从而可用于预防和治疗癌症。
附图说明
图1显示利用ELISPOT法确证本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽单独的免疫原性的结果。
图2显示利用ELISPOT法确证本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽按照抗原进行组合时的免疫原性的结果。
图3显示利用ELISPOT法确证本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽根据肽的数目组合时的免疫原性的结果。
图4a显示单独的CHA-2(IL-2 20U/ml)肽(5μg/ml或50μg/ml)、10种肽的组合(50μg/ml)和由所述肽组合(50μg/ml)以及脂肽和聚(I∶C)的佐剂组成的组合处理的各组，利用四聚体结合法比较肽特异性四聚体+CD8+T细胞的占比(％)的结果。
图4b显示利用图4a的四聚体结合法比较CHA-2肽特异性四聚体+CD8+T细胞的数目的结果。
图4c显示单独的CHA-8(IL-2 20U/ml)肽(5μg/ml或50μg/ml)、10种肽的组合(50μg/ml)和由所述肽组合(50μg/ml)以及脂肽和聚(I∶C)的佐剂组成的组合处理的各组，利用四聚体结合法比较肽特异性四聚体+CD8+T细胞的占比(％)的结果。
图4d显示利用图4c的四聚体结合法比较CHA-8肽特异性四聚体+CD8+T细胞的数目的结果。
图4e显示单独的CHA-9(IL-2 20U/ml)肽(5μg/ml或50μg/ml)、10种肽的组合(50μg/ml)和由所述肽组合(50μg/ml)以及脂肽和聚(I∶C)的佐剂组成的组合处理的各组，利用四聚体结合法比较肽特异性四聚体+CD8+T细胞的占比(％)的结果。
图4f显示利用图4e的四聚体结合法比较CHA-9肽特异性四聚体+CD8+T细胞的数目的结果。
图4g显示单独的CHA-15(IL-2 20U/ml)肽(5μg/ml或50μg/ml)、10种肽的组合(50μg/ml)和由所述肽组合(50μg/ml)以及脂肽和聚(I∶C)的佐剂组成的组合处理的各组，利用四聚体结合法比较肽特异性四聚体+CD8+T细胞的占比(％)的结果。
图4h显示利用图4g的四聚体结合法比较CHA-15肽特异性四聚体+CD8+T细胞的数目的结果。
图5a显示确证本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽的组合对结直肠癌细胞系SW620的细胞毒性作用的结果。
图5b显示按照3个健康个体(供体8、9和10)的外周血单个核细胞(PBMC)示出的图5a的结果。
图5c显示确证本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽的组合对***癌细胞系PC-3的细胞毒性作用的结果。
图5d显示按照3个健康个体(供体8、9和10)的外周血单个核细胞(PBMC)示出的图5c的结果。
图5e显示确证本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽的组合对乳腺癌细胞系MCF-7的细胞毒性作用结果。
图5f显示按照3个健康个体(供体8、9和10)的外周血单个核细胞(PBMC)示出的图5e的结果。
图5g显示确证本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽的组合对卵巢癌细胞系OVCAR-3的细胞毒性作用结果。
图5h显示按照3个健康个体(供体8、9和10)的外周血单个核细胞(PBMC)示出的图5g的结果。
图6显示本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽的组合处理的SW620、PC-3、MCF-7和OVCAR-3细胞系中颗粒酶B分泌水平的比较结果。
图7a显示存活蛋白+MAGE-A3肽(S+M肽)、hTERT+WT-1肽(H+W肽)和10种肽的组合在供体8的PBMC中对结直肠癌细胞系SW620的细胞毒性作用(CTL活性)的比较结果(#P<0.0510肽组合组vs未刺激组，$P<0.05 10肽组合组vs H+W组，&P<0.05 10肽组合组vs S+M组)。
图7b显示存活蛋白+MAGE-A3肽(S+M肽)、hTERT+WT-1肽(H+W肽)和10种肽的组合在供体9的PBMC中对结直肠癌细胞系SW620的细胞毒性作用(CTL活性)的比较结果(#P<0.0510肽组合组vs未刺激组，$P<0.05 10肽组合组vs H+W组，&P<0.05 10肽组合组vs S+M组)。
图7c显示存活蛋白+MAGE-A3肽(S+M肽)、hTERT+WT-1肽(H+W肽)和10种肽的组合在供体10的PBMC中对结直肠癌细胞系SW620的细胞毒性作用(CTL活性)的比较结果(#P<0.0510肽组合组vs未刺激组，$P<0.05 10肽组合组vs H+W组，&P<0.05 10肽组合组vs S+M组)。
图7d显示存活蛋白+MAGE-A3肽(S+M肽)、hTERT+WT-1肽(H+W肽)和10肽的组合对结直肠癌细胞系SW620的颗粒酶B分泌水平的比较结果(n是肽的数目，供体8-10)。
图8a显示由本发明提供的肿瘤相关抗原衍生肽、脂肽和聚(I∶C)的佐剂或另一种TLR佐剂组合制成的试验疫苗在小鼠模型中产IFN-γ细胞的数目比较的结果。[自左始，PBS-阴性对照组，肽处理组，肽+TLR2配体处理组，肽+TLR3配体处理组，肽+TLR7/8(咪喹莫特)配体处理组，肽+TLR9配体处理(CpG)组，肽+L-pampo处理组]。
图8b显示图8a中肽特异性IFN-γ分泌水平的比较结果。
图9是显示由本发明提供的10种肽组合、10种肽和L-pampo、以及10种肽和Lipo-pam制成的试验疫苗在小鼠模型中产IFN-γ细胞的数目的比较结果。
具体实施方式
下面，详细描述本发明。
本发明提供一种包含[肿瘤相关抗原衍生肽]的抗癌疫苗组合物。
肿瘤相关抗原(TAA)是一种在癌细胞或肿瘤细胞中表达的蛋白。TAAs的例子包括新生抗原(在肿瘤发生期间表达的和由正常或健康细胞的类似蛋白变异而来的新抗原)、癌基因和肿瘤抑制基因的产物、过表达或异常表达的细胞蛋白(例如HER2、MUC-1)、由致癌病毒(例如EBV、HPV、HCV、HBV、HTLV)产生的抗原、癌睾丸抗原(CTA，例如MAGE家族、NY-ESO)、和细胞类型特异性分化抗原(例如MART-1)。TAA序列可通过实验或通过公开的科学论文或公众可获得的数据库如路德维希癌症研究所数据库(www.cta.lncc.br/)、癌症免疫数据库(cancerimmunity.org/peptide)和TANTIGEN肿瘤T细胞抗原数据库(cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)而获知。
所述[肿瘤相关抗原衍生肽]可以是选自属于HLA-A02型(MHC I类)的序列SEQ.ID.NO：1的hTERT衍生肽(SEQ.ID.NO：1：ILAKFLHWL)，属于HLA-A24型(MHC I类)的序列SEQ.ID.NO：2的hTERT衍生肽(SEQ.ID.NO：2：VYAETKHFL)，属于HLA-DRB1型(MHC II类)的序列SEQ.ID.NO：3的hTERT衍生肽(SEQ.ID.NO：3：EARPALLTSRLRFIPK)，属于HLA-DRB1型(MHCII类)的序列SEQ.ID.NO：4的hTERT衍生肽(SEQ.ID.NO：4：RPGLLGASVLGLDDI)，属于HLA-A02型(MHC I类)的序列SEQ.ID.NO：5的存活蛋白衍生肽(SEQ.ID.NO：5：ELTLGEFLKL)，属于HLA-A02型(MHC I类)的序列SEQ.ID.NO：8的Mage-A3衍生肽(SEQ.ID.NO：8：KVAELVHFL)，属于HLA-A24型(MHC I类)的序列SEQ.ID.NO：9的Mage-A3衍生肽(SEQ.ID.NO：9：IMPKAGLLI)，属于HLA-A02型(MHC I类)的序列SEQ.ID.NO：12的MUC-1衍生肽(SEQ.ID.NO：12：TAPPVHNV)，属于HLA-A02型(MHC I类)的序列SEQ.ID.NO：15的WT-1衍生肽(SEQ.ID.NO：15：RMFPNAPYL)，和属于HLA-DRB1型(MHC II类)的序列SEQ.ID.NO：16的WT-1衍生肽(SEQ.ID.NO：16：KRYFKLSHLQMHSRKH)中的至少一种。
每种肽处理来自健康人的PBMCs后，免疫原性高于未处理的对照组，但差异程度不同(图1)。根据这些结果，排除了始终显示最低免疫原性的CHA-6、CHA-10和CHA-11。排除显示低免疫原性的肽的原因是因为如果将这些肽组合在一起，则可能诱导免疫耐受性。因此，在13种肽中，根据免疫原性结果最终确证了10种肽(SEQ.ID.NOs:1-5、8、9、12、15和16)(表1)。
为了在这10种确证的肽中选出最有效的肽组合来诱导针对多种肿瘤相关抗原的免疫应答，首先将5种抗原对应的肽根据抗原混合并施用于获自6个健康人的PBMCs，然后使用ELISPOT法分析免疫原性的增强或降低。结果证实，当根据5种抗原分别组合时，对应于hTERT和WT-1的肽的组合和对应于MAGE-A3和存活蛋白的肽的组合的免疫原性被有效增强(图2)。
为了检测免疫原性是否随组合的肽的数目而增强，在各种条件下组合肽并将其施用于3个健康人的PBMCs，不同数目肽组合的ELISPOT结果显示在图中(图3)。实验结果示出，用10种肽的组合处理的组比用其它组合处理的组显示更高的免疫原性，并且特别地，证实了10种肽组合的免疫原性比hTERT+WT-1组合和存活蛋白+MAGE-A3组合增强得更多(图3)。
10种肽(CHA-1、CHA-2、CHA-3、CHA-4、CHA-5、CHA-8、CHA-9、CHA-12、CHA-15和CHA-16)的组合由多种癌抗原(hTERT、存活蛋白、MAGE-A3、MUC1和WT-1)衍生肽组成。该组合可诱导针对多种癌抗原的抗癌免疫应答，包含了针对可同时活化CD8和CD4 T细胞的MHC I类和II类的肽，这对于抗癌免疫应答是至关重要的，并提供了增强至最大的免疫原性。因此，所述组合被证实是用于针对多种癌症的治疗性和预防性疫苗的最有效的肽表位组合。
所述[肿瘤相关抗原衍生肽]及其组合识别MHC I类、MHC II类或两者。
本发明还提供一种包含[肿瘤相关抗原衍生肽]和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]的抗癌疫苗组合物。
所述脂肽可以由脂肪酸和几个与甘油分子结合的氨基酸构成。甘油分子中构成脂肪酸或脂肽的氨基酸的数目可以是一个或多个。在本发明中，所述脂肪酸和氨基酸可以被化学修饰。所述脂肽可以是脂蛋白，所述脂蛋白是衍生自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌或支原体的分子的一部分或整个分子。
所述脂肽选自Pam3Cys-SKKKK、Pam3-CSKKKK、PHC-SKKKK、Ole2PamCys-Pam3Cys-SKKKK、Pam3-CSKKKK、PHC-SKKKK、Ole2PamCys-SKKKK、Pam2Cys-SKKKK、PamCys(Pam)-SKKKK、Ole2Cys-SKKKK、Myr2Cys-SKKKK、PamDhc-SKKKK、Pam-CSKKKK、Dhc-SKKKK和FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF)中的至少一种，但并不总限于此。
免疫活性物质可以是选自聚(I∶C)、QS21、单磷酰脂质A(MPLA)、CpG和鞭毛蛋白中的任何一种或多种。在体外和体内研究中，聚(I∶C)已经被用作1型干扰素的强诱导剂。此外，已知聚(I∶C)稳定且成熟地形成树突细胞，该细胞是哺乳动物体内最强的抗原呈递细胞(Rous，R.等，International Immunol.，2004)。根据这些现有报道，聚(I∶C)是强IL-12诱导剂，IL-12是一种重要的免疫活性物质，其通过促进Th1免疫应答的发展，诱导细胞免疫应答和IgG2a或IgG2b的形成。
聚(I∶C)的长度可以为50至5,000bp。所述佐剂中所包含的聚(I∶C)的浓度可以是10至150、10至90、10至50、10至30、30至60、30至90、30至150、30至50、10至1500、10至900、10至500、10至300、30至600、30至900、30至1500、或30至500μg/剂，但并不总限于此。
QS21是从南美皂皮树的树皮中提取的一种分子量为1990.14Da的称为三萜葡糖苷的皂苷物质的一部分。已知QS21与脂质如MPLA(单磷酰脂质A)或胆固醇一起施用时，通过抗原呈递细胞如巨噬细胞和树突细胞分泌Th1型细胞因子而诱导体液和细胞免疫应答。
所述佐剂中所包含的QS21的浓度可以是1至150、1至90、1至50、1至30、3至60、3至90、3至150、3至50、1至1500、1至900、1至500、1至300、3至600、3至900、3至1500或3至500μg/剂，但并不总限于此。
进行四聚体结合试验以确证CD8+T细胞的增殖。对可四聚的CHA-2、CHA-8和CHA-9、以及CHA-15肽进行实验时，与单独给予每种肽相比，在用10肽的组合处理的组中，每种肽特异的CD8+T细胞的数量和占比(％)都增加，而脂肽和聚(I∶C)佐剂增加了每种肽特异的CD8+T细胞的数量和占比(图4)。
这些结果表明，相比可活化CD 8+T细胞的单个肽，10种优选出的肽的组合能够更有效地增加CD 8+T细胞，并且当10种肽的组合与佐剂一起施用时，显示更大的协同效应。这是因为CD 4+T细胞被10种肽的组合中可结合MHC II类的肽(CHA-3、CHA-4和CHA-16)活化，活化的CD 4+T细胞又使更多的肽特异性CD 8+T细胞增殖。此外，可以看出，由于脂肽和聚(I∶C)佐剂诱导的Th1应答，对CD 8+T细胞增殖的协同效应被最大化(图4a至4h)。
为了确证被所述多种肿瘤相关抗原衍生肽的组合所增殖并功能性活化的T细胞是否能够作为细胞毒性T细胞(CTLs)去识别并杀死癌细胞，将CTLs、效应细胞和癌细胞一起培养，然后通过流式细胞仪分析被CTLs杀死的癌细胞的占比。
实验结果证实，在结肠直肠癌细胞系SW620、***癌细胞系PC-3、乳腺癌细胞系MCF-7或卵巢癌细胞系OVCAR-3中，通过用所述肽组合处理3个健康人的PBMCs而被活化的效应细胞比不用所述肽组合培养的效应细胞杀伤了更多的癌细胞。并且结果示出细胞特异性的细胞毒性效应，效应细胞的数目越多，杀伤的癌细胞越多(图5a至图5h)。
此外，为了确证被多种肿瘤相关抗原衍生肽组合所增殖和功能性活化的T细胞对各种癌细胞的活性，通过ELISA测定了效应细胞和癌细胞一起培养的培养基中的颗粒酶B的分泌水平。颗粒酶B是CD8 T细胞，特别是CTLs分泌的一种酶，在直接杀伤癌细胞中起重要作用。
实验结果证实，在活化的效应细胞和结肠直肠癌细胞系SW620、***癌细胞系PC-3、乳腺癌细胞系MCF-7或卵巢癌细胞系OVCAR-3共培养的培养基中，其中效应细胞通过用所述肽组合处理来自6个健康人的PBMCs而被活化，颗粒酶B含量比在未被肽组合处理的效应细胞和癌细胞共培养的培养基中明显更高。这表明CTLs识别癌细胞并分泌颗粒酶B，从而诱导了癌细胞死亡(图6)。
从上述结果可以证实，被所述肽组合所增殖并功能性活化的肿瘤抗原特异性T细胞可以作为细胞毒性T细胞识别癌细胞并分泌颗粒酶B以直接杀死癌细胞。
接下来，本发明人比较了图3、4和5中证实显示优异免疫原性的所述10种肽的组合是否比图2中证实显示优异免疫原性的存活蛋白+MAGE-A3或hTERT+WT-1肽组合具有更高的CTL活性效力。
在结肠直肠癌细胞系SW620中测定了颗粒酶B的细胞毒性和分泌水平。结果显示，通过用所述10种肽的组合处理3个健康人的PBMCs而被活化的效应细胞，与用存活蛋白+MAGE-A3或hTERT+WT-1肽组合处理而被活化的效应细胞相比，分泌明显更多的颗粒酶B，并且能够杀死更多的癌细胞(图7a至7d)。
这10种优选出的肽组合由多种肿瘤相关抗原(hTERT、存活蛋白、MAGE-A3、MUC-1和WT-1)衍生肽组成，因此它可以诱导针对多种癌抗原的抗癌免疫应答。并且该组合可以活化CD 8和CD 4T细胞，这两种细胞对于抗癌免疫应答至关重要，因此该组合可以通过活化的CTLs诱导针对癌细胞的高免疫应答并杀死更多的癌细胞。
最后，本发明人比较了由10种肽和脂肽与聚(I∶C)佐剂的组合制成的试验疫苗，以及由10肽和其它TLR佐剂的组合制成的试验疫苗诱导的细胞免疫应答。总设如下7个实验组：PBS阴性对照，10种肽组合，10种肽和TLR2配体，10种肽和TLR3配体，10种肽和TLR7/8配体(咪喹莫特)，10种肽和TLR9配体(CpG)，以及10种肽和L-pampo(脂肽和聚(I∶C)佐剂)(图8a至8b)。实验结果证实，与采用TLR2、TLR3、TLR7/8或TLR9佐剂的试验疫苗相比，采用脂肽和聚(I∶C)佐剂(即L-pampo)的试验疫苗使产IFN-γ细胞的数量显著增加。此外，证实了与采用TLR2、TLR3、TLR7/8或TLR9佐剂的试验疫苗相比，采用L-pampo的试验疫苗还增加了每种肽特异性IFN-γ的分泌(图8a至8b)。
此外，在图8所示的小鼠模型中，测定了用10种肽和由表面***有脂肽的脂质体和免疫活性物质组成的Lipo-pam佐剂的组合制成的试验疫苗是否可以诱导出类似于L-pampo的细胞免疫应答。结果证实，与对照组相比，采用Lipo-pam的试验疫苗显著增加了产IFN-γ细胞的数量，效果与采用L-pampo的疫苗相似(图9)。
由以上结果可以证实，与含有TLR2、TLR3、TLR7/8、TLR9等其他佐剂的疫苗组合物相比，由本发明的一个方面提供的所述抗癌疫苗组合物是一种能够强烈诱导杀伤癌细胞的细胞免疫应答的抗癌疫苗组合物。
同时，在本发明的一个实施方案中，所述抗癌疫苗组合物是通过将脂肽和免疫活性物质以一定比例混合作为佐剂而制备的。
所述抗癌疫苗组合物可以是油乳剂或水溶液制剂。
所述抗癌疫苗组合物还可包含缓冲剂、等渗剂、防腐剂、稳定剂和增溶剂。所述缓冲剂可以包括磷酸盐、乙酸盐、磷酸铵、碳酸铵、柠檬酸盐等。
在包括上述组合物的整个疫苗组合物的组成比例中，脂肽优选以0.01至0.5重量％，最优选以0.01至0.1重量％的重量比包括在所述脂肽和聚(I∶C)佐剂中，聚(I∶C)优选以0.01至0.4重量％的重量比，最优先以0.01至0.08％的重量比包括在所述脂肽和聚(I∶C)佐剂中，但并不总限于此。
另外，作为等渗剂，优选包含0.1至0.8重量％的重量比的氯化钠，更优选包含0.2至0.6重量％的重量比的氯化钠。根据本发明的一个优选实施方案，最优选包含0.44重量％重量比的氯化钠。
此外，优选使用磷酸盐、乙酸盐、磷酸铵、碳酸铵、柠檬酸盐等作为缓冲剂，并且根据本发明的一个优选实施方案，更优选使用磷酸盐和乙酸盐，但并不总限于此。优选地，磷酸盐的重量比为0.01至0.4重量％，更优选为0.01至0.2重量％。根据本发明的一个优选实施方案，磷酸盐最优选的重量比为0.13至量％。另外，乙酸盐的重量比优选为0.01至0.3重量％，更优选为0.01至0.2重量％。根据本发明的一个优选实施方案，乙酸盐最优选的重量比为0.08重量％。因此，本发明的疫苗组合物优选含有重量比为0.02至0.6重量％的缓冲剂，并且根据本发明的一个优选实施方案，最优选重量比为0.15至0.25重量％。
同时，在本发明的另一个实施方案中，通过将表面***有脂肽的脂质体与免疫活性物质混合而制成所述佐剂。
脂肽可以以20至250、20至50、50至250、150至250、50至150、20至2500、20至500、50至2500、150至2500、或50至1500μg/剂的浓度***所述脂质体中。
所述脂质体由脂质构成。
所述脂质可以是阳离子、阴离子或中性脂质。例如，所述脂质选自DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DDA(二甲基双十八烷基铵)、DC-Chol(3β-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)])、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和胆固醇中的至少一种，但并不总限于此。
脂质可以以15至300、15至150、15至90、15至50、15至40、20至30、15至3000、15至1500、15至900、15至500、15至400、或20至300μg/剂的浓度***脂质体中。
所述佐剂由带正电荷的脂质体和带负电荷的免疫活性物质组成，其中带正电荷的脂肽***到所述脂质体的脂质双分子层中。
所述抗癌疫苗组合物可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
所述抗癌疫苗组合物可增强Th1免疫应答。IgG2a或IgG2b由辅助T细胞1(Th1)分泌的细胞因子产生，它们促进在抗病毒和抗癌免疫应答中发挥作用的Th1免疫应答。因此，本发明的抗癌疫苗组合物也可用作由病毒感染发展而来的癌症的预防或治疗药剂。
因本发明的佐剂而增加的滤泡辅助性T细胞(Tfh)和分泌的细胞因子能够诱导体液免疫应答。
通过增加IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B的分泌能够诱导细胞免疫应答。
本发明还提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的所述抗癌疫苗组合物。
所述抗癌疫苗组合物可以具有上文所述的特征。
在本发明的一个实施方案中，所述抗癌疫苗组合物可以包含佐剂和抗原。所述佐剂可以包含脂肽***其中的脂质体，并且可以进一步包含免疫活性物质。
本发明的预防或治疗药剂可以包括药学上可接受的载体，可以制成人用或兽医制剂，并且可以通过各种途径施用。施用途径可以是口服、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮和鼻内等。优选地，其被制成并作为注射剂施用。注射剂可以使用水性溶剂(如生理盐水溶液和林格氏液)和非水性溶剂(如植物油、高级脂肪酸酯(如油酸乙酯等)和醇(如乙醇、苯甲醇、丙二醇、甘油等))来制备，并且可以包括药用载体，如防止变质的稳定剂(如抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、BHA、生育酚、EDTA等)、乳化剂、调节pH的缓冲剂和抑制微生物生长的防腐剂(如硝酸苯汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等)。
本发明的用于预防或治疗癌症的药物组合物可以以药学有效量施用。术语“药学有效量”是指足以使疫苗效果显现而不引起副作用或严重或过度免疫应答的量，并且准确的施用浓度可以根据疫苗中包含的抗原而变化。此外，本领域技术人员可以根据医学领域公知的因素，例如患者的年龄、体重、健康状况、性别和对药物的敏感性、施用途径和施用方法，容易地确定所述预防或治疗药剂的用量。本发明的药物组合物可以一次至多次施用。
所述癌症选自卵巢癌、良性星形细胞瘤、恶性星形细胞瘤、垂体腺瘤、脑膜瘤、脑淋巴瘤、少突胶质细胞瘤、颅内肿瘤、室管膜瘤、脑干肿瘤、喉癌、口咽癌、鼻腔/副鼻窦癌、鼻咽癌、唾液腺癌、下咽癌、甲状腺癌、口腔癌、胸部肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胸腺癌、纵隔肿瘤、食道癌、乳腺癌、腹部肿瘤、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、***癌、***癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、女性外生殖器癌和皮肤癌中的至少一种，但不总限于此。
所述抗癌疫苗组合物可与选自化疗、靶向疗法、免疫检查点抑制剂和放射疗法中的一种或多种治疗联合使用，并且与现有治疗相比显示出协同抗癌作用。
以下，通过实施例和实验例对本发明进行详细说明。
然而，以下实施例和实验实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于此。
实施例1：发现肿瘤相关抗原衍生的MHC I类和MHC II类抗原肽表位
<1-1>诱导免疫原性的候选肽的筛选
为了筛选出能诱导免疫原性的候选肽，从已经处于针对多种癌症的临床试验阶段的、由已知的肿瘤相关抗原衍生的肽中选出候选者。选出的肿瘤相关抗原是hTERT、存活蛋白、MAGE-A3、MUC-1、EGFRvIII、NY-ESO-1和WT-1抗原，进而选出了由它们衍生的16种肽(表1)。
【表1】
在这16种肽中，排除了三种肽(CHA-7、CHA-13和CHA-14)，因为它们的氨基酸残基都有半胱氨酸，这些残基能形成二硫键并干扰与MHC分子的结合。使用计算机算法来验证以这种方式选择的13种肽是否对MHC I类或MHC II类具有高结合亲和力。
结果，所选的13种肽证实源自多种肿瘤相关抗原并特异性结合HLA-A02/A24和HLA-DRB1，从而确定该13种肽为诱导免疫原性的候选肽。由一家肽合成公司(Anygen，韩国)将13个确认的肽序列合成为肽。
<1-2>确证选择的肽的免疫原性并选出最终的肽
为了确证实施例1中选择的13种肽的免疫原性，进行干扰素γ(IFNγ)-酶联免疫SPOT实验(ELISPOT)。
该实验是一种灵敏的免疫实验，其可以检测由单个细胞分泌的细胞因子。通过将细胞活化时分泌的细胞因子附着于捕获抗体，可以测定分泌的细胞因子，而不受细胞表面表达的蛋白或蛋白水解酶的影响。在细胞因子附着于捕获抗体后，除去细胞，加入检测抗体，所述检测抗体与可识别所述被附着的捕获抗体的酶结合，并加入酶的显色底物，在分泌细胞因子的细胞位置形成显色斑点，斑点的数目可用于确定对刺激抗原应答的细胞的数目。
实验所需的外周血单核细胞(PBMC)按照如下方法从人静脉血分离。静脉血用1×PBS稀释，置于SepMate-50管中，并在室温下以800g离心20分钟。离心后，洗涤血浆和分离的PBMC，以1×106细胞/mL的浓度置于6孔组织培养板的每个孔中，并在培养箱中培养过夜(37℃，5％ CO2)。第二天，回收PBMC培养液，并在室温下以2000rpm离心15分钟。离心后，将PBMC接种在6孔细胞培养板中，将肽加入其中并培养以刺激细胞。
此时，用实施例1中选择的13种肽单独处理或用多种肽组合处理，并且还制备了未处理组和ConA组用于对照分析。在6孔细胞培养板中培养后，将200μL PBMC培养液分配到ELISPOT板的每个孔中，并在37℃和5％ CO2条件下培养24小时。培养结束后，用1×PBS洗涤平板五次以准备用于ELISPOT实验。将检测抗体(R4-642-生物素)稀释在PBS(0.5％ FBS)中，以100μL/孔加入到板中，然后在室温下反应2小时。接着用1×PBS洗涤平板5次，并以100μL/孔的量向平板中加入链霉亲和素-HRP的PBS(0.5％FBS)稀释液，然后在室温下反应1小时。随后，用1×PBS洗涤平板，以100μL/孔的量向平板中加入TMB底物溶液。当斑点颜色显色清楚时，用DW洗涤板六次以终止反应。除去水之后，将板包裹在铝箔纸中并且在阴凉处干燥一天。在将ELI-FOIL附着于干燥的ELISPOT板并冲压膜之后，使用ELISPOT读取器读取每个孔中的斑点数目。从未处理组的斑点数目中减去测试组的斑点数目，作图。
结果如图1所示，证实了与未用肽处理的对照组相比，所有用13种肽处理的组中的免疫原性都增强。其中，始终显示最低免疫原性的CHA-6、CHA-10和CHA-11被排除。这是因为如果加入显示低免疫原性的肽，则该肽可能诱导免疫耐受。因此，根据免疫原性结果，在13种肽中，最终确定选出了10种肽(CHA-1至CHA-5、CHA-8、CHA-9、CHA-12、CHA-15和CHA-16)(表1)。
为了在10种确证的肽中选出能够诱导针对多种癌抗原的最有效免疫应答的肽组合，首先将对应于5种抗原中相同抗原的肽混合，处理6个健康人的PBMCs，然后使用ELISPOT实验测定免疫原性的增强和降低。
结果如图2所示，证实了hTERT和WT-1对应的肽的组合以及MAGE-A3和存活蛋白对应的肽的组合比五种抗原各自对应的肽的组合更有效地增强了免疫原性。此外，证实了当将其它抗原组合加入上述组合时，或将除这两种组合以外的抗原组合时，免疫原性降低或增加，但超不过这两种组合的值。
在上述实验中，hTERT和WT-1的组合中有6个肽(4个hTERT衍生，2个WT-1衍生)，MAGE-A3和存活蛋白的组合中有3个肽(2个MAGE-A3衍生，1个存活蛋白衍生)，因此本发明人进行了实验以确定免疫原性是否随着组合的肽数目而增加。
为此，在图3所示的各种条件下，用肽组合处理3个健康人的PBMCs，得到了根据肽数目的ELISPOT实验结果。
结果如图3所示，相比用其它组合处理的组，特别是相比用hTERT+WT-1的组合和存活蛋白+MAGE-A3的组合处理的组，用10种肽处理的组表现出更高的免疫原性。
由于10种肽(CHA-1、CHA-2、CHA-3、CHA-4、CHA-5、CHA-8、CHA-9、CHA-12、CHA-15和CHA-16)的组合由多种癌抗原(hTERT、存活蛋白、MAGE-A3、MUC1和WT-1)衍生肽组成，因此该组合可诱导针对多种癌抗原的抗癌免疫应答，包含了针对MHC I类和II类的肽(MHC I类和II类可同时活化CD8和CD4 T细胞，这对于抗癌免疫应答至关重要)，并提供了增至最强的免疫原性。因此，所述10种肽的组合被证实是用于针对各种癌症的治疗性和预防性疫苗的最有效的肽表位组合。
实施例2：包含肿瘤相关抗原衍生肽的抗癌疫苗的制备
利用合适的树脂，采用Fmoc化学法通过标准的和成熟的固相肽合成方法从C-末端到N-末端合成了所有的肽(Anygen公司，韩国)。通过质谱和HPLC分析确认每种肽的纯化和纯度。肽是白色冻干物，纯度为95％或更高。所有肽使用时的浓度为10mg/ml。
实施例3：包含[肿瘤相关抗原衍生肽]和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]的
抗癌疫苗的制备
<3-1>L-pampo
将实施例<1-2>中选出的肽组合与本发明的Pam3Cys-SKKKK和聚(I∶C)佐剂混合，制备得到抗癌疫苗。
首先，制备了包含Pam3Cys-SKKKK和聚(I∶C)的试验疫苗以观察当同时用Pam3Cys-SKKKK和聚(I∶C)来制备疫苗时的佐剂效果。当制备包含肽的疫苗混合物时，使用含有150mMNaCl和10mM磷酸钠的10×缓冲液(pH7.0)。
<3-2>Lipo-pam
首先，制备DOTAP∶DPPC脂质体。为此，将DOTAP和DPPC分别溶解在氯仿中，用氮气将有机溶剂带出，同时旋转DOTAP和DPPC的混合物，直至其均匀地挂在玻璃容器的壁上。此时，在壁上形成了一层薄膜，通过将其放置在真空干燥器中除去残留在形成的薄膜中的有机溶剂。加入蒸馏水使完全干燥的脂质膜再水合。当产生多层囊泡(MLV)悬浮溶液时，向其中加入与蒸馏水等量的2×缓冲液(pH 7.0)(20mM磷酸钠中含有300mM NaCl)。将得到的MLV超声处理5分钟，5个循环，每次3秒/3秒(脉冲开/关)，以制备得到小单层囊泡(SUV)形式的DOTAP∶DPPC脂质体。
然后按照与制备DOTAP∶DPPC脂质体相同的方法制备Lipo-pam，不同之处在于将DOTAP、DPPC和Pam3-CSKKKK分别用有机溶剂溶解，混合DOTAP和DPPC，然后向其中加入Pam3-CSKKKK。将免疫活性物质佐剂(聚(I∶C))和肽加入Lipo-pam中，制备得到疫苗混合物。本实施例中，使用含有150mM NaCl和10mM磷酸钠的10×缓冲液(pH 7.0)。
实验例1：肽组合诱导的CD8 T细胞特异性免疫原性的验证
CD8+T细胞是抗癌免疫中最重要的免疫细胞，其直接杀死癌细胞并阻止癌细胞增殖。因此，如果有大量对肿瘤相关抗原特异的CD8+T细胞，则可诱导更有效的抗癌免疫。在本实验例1中，通过给予实施例1中的单个肽、给予肽的组合、以及联合给予佐剂(脂肽和聚(I∶C))，进行四聚体结合试验以证实CD8+T细胞的增殖。
通过测定MHC四聚体结合的CD8+T细胞的数量或占比(％)，四聚体结合试验可以灵敏地验证抗原特异性CD8 T细胞应答，特别是CTL(细胞毒性T淋巴细胞)应答。该实验使用“MHC四聚体”，其是四个MHC/肽复合物被制成一个复合物，然后附着于荧光团标记的链霉亲和素。
因此，在本实验中，采用抗MHC I类的肽，即可识别CD8 T细胞的HLA-A02和HLA-24，制备了下列四种四聚体(CHA-2/HLA-A24四聚体、CHA-8/HLA-A02四聚体、CHA-9/HLA-A24四聚体和CHA-15/HLA-A02四聚体)。
像ELISPOT实验一样，从人静脉血中分离PBMCs，并分配到96孔细胞培养板中(200mL/孔)。用肽处理来刺激分离出的PBMCs。在本实验例中，每种肽浓度为5mg/mL或50mg/mL，实施例<1-2>中确认的10种肽的组合也使用相同浓度。同时，还为实验制备了对照组，其中一组未用肽处理(未处理)，一组用不相关的肽处理(非特异性四聚体)。
96孔细胞培养板置于培养箱中，在37℃和5％ CO2下培养24小时。培养结束，取出96孔板，将培养的细胞收获在FACS(荧光活化细胞分选器)管中，并在室温下以2000rpm离心15分钟。离心结束，除去上清液，用FVS(可固定活力染色剂)处理，细胞再悬浮。再悬浮后，FACS管用铝箔纸覆盖，并在室温下反应15分钟。用2mL PBS洗涤每支试管，然后在室温下以2000rpm离心5分钟。离心结束，取出FACS管，除去上清液，每支管用1mL FACS缓冲液洗涤，再置于离心机中，并在室温下以2000rpm离心5分钟。离心结束，取出FACS管，除去上清液，向每支管中加入100μL FACS缓冲液并再悬浮。再悬浮后，将人Fc R阻断溶液和MHC四聚体加入FACS管中并充分混合。FACS管用铝箔纸包裹，并在室温下反应20分钟。20分钟后，向其中加入抗人CD3、CD45和CD8抗体，并充分混合。将FACS管用铝箔纸包裹并置于冰箱中反应，然后将FACS管从冰箱中取出，加入FACS缓冲液，在室温下离心。离心结束后，取出FACS管，去除上清液，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中。然后，使用流式细胞仪检测MHC四聚体+CD8+T细胞的数目和MHC四聚体+CD8+T细胞在总CD8+T细胞中的占比(％)。
结果如图4a-4h所示，用10种肽的组合处理的组中，对每种肽特异的四聚体+CD8+T细胞的占比(％)和总数显著高于单独用CHA-2、CHA-8、CHA-9和CHA-15肽处理的组(实线框)。当脂肽和聚(I∶C)佐剂与10种肽的组合混合并处理时，每种肽特异的四聚体+CD8+T细胞的占比和数量比仅加入10种肽的组合时提升得更多(虚线框)。
上述结果表明，与可以活化CD8+T细胞的单一肽相比，10种优选出的肽的组合可以更有效地增加CD8+T细胞，并且特别地，当10种肽的组合和佐剂一起施用时，有更大的协同效应。这是因为在10种肽的组合中，CD4+T细胞被能结合MHC II类的肽(CHA-3、CHA-4和CHA-16)活化，随后更多的肽特异性CD8+T细胞能在活化的CD4+T细胞的辅助下增殖。此外，可以看出，由于已知的脂肽和聚(I∶C)佐剂诱导的Th1应答，对CD8+T细胞增殖的协同效应得以最大化。
实验例2：肽组合诱导的CD8+T细胞的细胞毒性能力的验证
为了确证被所述多种肿瘤相关抗原衍生肽的组合所增殖并功能性活化的T细胞是否能够作为CTLs(细胞毒性T细胞)去识别并杀死癌细胞，进行了细胞毒性测定，将效应细胞和癌细胞一起培养，然后通过流式细胞仪分析被CTLs杀死的癌细胞的占比。
首先，为了制备效应细胞，即由肽增殖和活化的CTLs，从人静脉血分离PBMCs，然后逐一加入10mg/mL实施例<1-2>中选出的10种肽和5ng/mL hIL-2，随后进行培养。将不用肽仅用5ng/mL hIL-2培养的细胞作为对照。
为了确定由肽增殖的效应细胞是否能够MHC特异性地识别和杀伤靶癌细胞，将效应细胞与仅表达HLA-A02或HLA-A24或同时表达两者的癌细胞一起培养。加入或不加入肽组合，将效应细胞和靶细胞(癌细胞)分别以2.5:1、5:1和10:1的比例一起培养16小时。然后，使用CFSE/7-AAD(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯/7-氨基放线菌素D)染色检测癌细胞被效应细胞杀伤的程度。
在CFSE/7-AAD染色法中，靶癌细胞被一种称为CFSE的物质染色成绿色。被CFSE染色的靶癌细胞与效应细胞一起培养16小时，然后再用称为7-AAD的物质染色。由于7-AAD仅染色死细胞，并呈红色，所以同时表达CFSE和7-AAD的靶癌细胞可以确定是被效应细胞杀伤的死细胞。染色后，使用流式细胞仪测定CFSE+7-AAD+癌细胞的占比，结果以图的形式呈现。
实验以表达HLA-A02和HLA-A24的结肠癌细胞系SW620、仅表达HLA-24的***癌细胞系PC-3、仅表达HLA-02的乳腺癌细胞系MCF-7和卵巢癌细胞系OVCAR-3为靶标。结果证实，由肽组合活化的效应细胞比不用肽培养的效应细胞杀死了更多的癌细胞，并且在三个供体中观察到相同的趋势。此外，随着效应细胞的数目增加，死亡的癌细胞更多，从而证实了细胞毒性效应是细胞特异性的(图5a至5h)。
实验例3：肽组合诱导颗粒酶B分泌的验证
为了确证被多种肿瘤相关抗原衍生肽的组合增殖和功能性活化的T细胞是否能分泌颗粒酶B，这些T细胞能够作为CTLs直接杀死癌细胞，使用ELISA测定了在效应细胞和癌细胞共培养的培养基中的颗粒酶B的水平。
使用与上述<实验例2>相同的方法，加入或不加入肽组合，将效应细胞和靶细胞(癌细胞)分别以2.5:1、5:1和10:1的比例一起培养16小时以得到培养基质。得到的培养基质以2000rpm离心5分钟，得到上清液，用于颗粒酶B测定。
采用MABTECH公司的人颗粒酶B(HRP)试剂盒(目录号3486-1H-6)，按照相应的规程进行颗粒酶B ELISA检测。将2μg/mL捕获mAb MT34B6加入96孔免疫平板(100μL/孔)并在4℃反应过夜。反应结束后，除去上清，按200μL/孔向板中加入含有0.1％ BSA的PBST(PBS+0.05％吐温20)，室温下反应1小时。用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤平板五次，然后将每次得到的上清液或0-2000pg/mL的试剂盒中自带的标准品按100μL/孔加到平板中，并在室温下反应2小时。用PBST(PBS+0.05％ Tween 20)洗涤平板五次，然后按100μL/孔向平板中加入1μg/mL的MT28-生物素，随后在室温下反应1小时。用PBST(PBS+0.05％ Tween 20)洗涤平板五次，然后按100μL/孔将链霉亲和素-HRP加到平板中，随后在室温下反应1小时。用PBST(PBS+0.05％ Tween 20)洗涤平板五次。按100μL/孔向板中加入TMB底物，并在室温下反应15分钟，然后按50μL/孔向其中加入0.2M硫酸，以中止TMB底物反应。用ELISA读数器测定OD450，通过与标准物质对比测定上清液中颗粒酶B的量。
结果如图6所示，证实了在活化的效应细胞和结肠癌细胞系SW620、***癌细胞系PC-3、乳腺癌细胞系MCF-7或卵巢癌细胞系OVCAR-3共培养的培养基中，其中用所述10种肽的组合处理来自6个健康人的PBMCs而激活效应细胞，测得的颗粒酶B水平显著高于无肽的效应细胞和癌细胞共培养的培养基。由此，证明CTLs识别癌细胞并分泌颗粒酶B，从而诱导癌细胞的死亡。
实验例4：癌抗原不同或肽数目不同的肽组合活化的细胞毒性T细胞的癌细胞杀伤
能力的验证
比较了在图3中被证实表现出优异的免疫原性的10种肽的组合和在图2中示出高免疫原性的存活蛋白+MAGE-A3或hTERT+WT-1肽组合的CTL活性功效。
实验方法同前述<实验例2和3>，采用大肠癌细胞系SW620。
结果如图7a至7d所示，证实了与经存活蛋白+MAGE-A3或hTERT+WT-1肽组合处理而活化的效应细胞相比，用所述10种肽的组合处理来自3个健康人的PBMCs而活化的效应细胞分泌了更高水平的颗粒酶B，并且可以杀死更多癌细胞。
上述结果表明，所述10种肽的组合可以诱导针对多种癌抗原的抗癌免疫应答，因为它由多种癌抗原(hTERT、生存素、MAGE-A3、MUC-1和WT-1)衍生的肽组成，并且可以同时激活CD8和CD4 T细胞(这对于抗癌免疫应答至关重要)，从而诱导针对癌细胞的免疫应答，通过诱导的免疫应答激活CTLs杀死更多的癌细胞。
实验例5：由肽组合和脂肽+免疫活性物质佐剂或其它TLR佐剂制备的试验疫苗在
小鼠模型中诱导细胞免疫应答的效力的评价
在小鼠模型中比较了由10种肽的组合和脂肽+免疫活性物质佐剂(L-pampo)制备的试验疫苗和用10种肽的组合和其它TLR佐剂制备的试验疫苗诱导的细胞免疫应答水平。
10种肽各50μg混合，然后在混合物中加入脂肽(Pam3Cys-SKKKK)+免疫活性物质(聚(I∶C))佐剂或其它TLR佐剂(TLR2配体脂肽，TLR3配体聚(I∶C)，TLR7/8配体咪喹莫特，TLR9配体CpG)，从而制备得到试验疫苗。C57BL/6小鼠皮下注射每种试验疫苗三次(100μL/小鼠)，每次注射间隔一周。三次免疫给药结束后一周，摘取小鼠脾脏，分离总脾细胞，并利用ELISPOT实验测定免疫原性。
结果如图8a和8b所示，证明与施用由TLR2、TLR3、TLR7/8或TLR9佐剂制备的试验疫苗相比，施用由Pam3Cys-SKKKK和聚(I∶C)佐剂(L-pampo)制备的试验疫苗产IFN-γ细胞的数目显著升高，并且每种肽特异的IFN-γ的分泌也增加。
上述结果显示，与包含TLR2、TLR3、TLR7/8或TLR9佐剂的疫苗组合物相比，由本发明一个方面提供的抗癌疫苗组合物可诱导更有效的能够杀死癌细胞的细胞免疫反应。
实验例6：本发明的肿瘤相关抗原衍生的肽组合与脂肽+免疫活性物质佐剂制成的
试验疫苗和所述肽组合与由***了脂肽的脂质体和免疫活性物质构成的Lipo-pam佐剂制
成的试验疫苗的细胞免疫应答诱导效力的评价
在小鼠模型中比较了10种肽的组合与脂肽+免疫活性物质佐剂制成的试验疫苗和10种肽的组合与由***了脂肽的脂质体和免疫活性物质构成的Lipo-pam佐剂制成的试验疫苗诱导的细胞免疫应答水平。
10种肽各50μg混合，然后在混合物中加入脂肽(Pam3Cys-SKKKK)+免疫活性物质(聚(I∶C))佐剂或由表面***脂肽的脂质体和免疫活性物质(聚(I∶C))构成的Lipo-Pam佐剂，从而制备得到试验疫苗。C57BL/6小鼠皮下注射每种试验疫苗三次(100μL/小鼠)，每次注射间隔一周。三次免疫给药结束后一周，摘取小鼠脾脏，分离总脾细胞，并利用ELISPOT实验测定免疫原性。
结果如图9所示，证明与施用Pam3Cys-SKKKK和聚(I∶C)佐剂(Lipo-Pam)制备的试验疫苗相比，施用Lipo-Pam佐剂(由表面***了脂肽(Pam3Cys-SKKKK)的脂质体和免疫活性物质(聚(I∶C))构成)制备的试验疫苗，产IFN-γ细胞数目显著增加。
上述结果表明，本发明一个方面提供的抗癌疫苗组合物，包含脂肽和免疫活性物质佐剂或由表面***脂肽的脂质体和免疫活性物质构成的Lipo-pam佐剂，能够强烈诱导杀伤癌细胞的细胞免疫应答。
Claims (26)
1.一种抗癌疫苗组合物，所述抗癌疫苗组合物包含[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]。
2.一种抗癌疫苗组合物，所述抗癌疫苗组合物包含[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]，和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]。
3.根据权利要求1或2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述肿瘤相关抗原选自hTERT、MAGE-A3、MUC-1、存活蛋白和WT-1中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]包括下列肽中的一种或多种：
i)序列SEQ.ID.NO:1的hTERT衍生肽，属于HLA-02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO:1：ILAKFLHWL)，
ii)序列SEQ.ID.NO:2的hTERT衍生肽，属于HLA-24型(MHC I类)(SEQ.ID.NO:2：VYAETKHFL)，
iii)序列SEQ.ID.NO:3的hTERT衍生肽，属于HLA-DRB1型(MHC II类)(SEQ.ID.NO:3：EARPALLTSRLRFIPK)，
iv)序列SEQ.ID.NO:4的hTERT衍生肽，属于HLA-DRB1型(MHC II类)(SEQ.ID.NO:4：RPGLLGASVLGLDDI)，
v)序列SEQ.ID.NO:5的存活蛋白衍生肽，属于HLA-02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO:5：ELTLGEFLKL)，
vi)序列SEQ.ID.NO:8的Mage-A3衍生肽，属于HLA-02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO:8：KVAELVHFL)，
vii)序列SEQ.ID.NO:9的Mage-A3衍生肽，属于HLA-02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO:9：IMPKAGLLI)，
viii)序列SEQ.ID.NO:12的MUC-1衍生肽，属于HLA-02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO:12：TAPPVHNV)，
ix)序列SEQ.ID.NO:15的WT-1衍生肽，属于HLA-02型(MHC I类)(SEQ.ID.NO:15：RMFPNAPYL)，和
x)序列SEQ.ID.NO:16的WT-1衍生肽，属于HLA-DRB1型(MHC II类)(SEQ.ID.NO:16：KRYFKLSHLQMHSRKH)。
5.根据权利要求1或2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述[肿瘤相关抗原衍生肽]识别MHC I类、MHC II类或两者。
6.根据权利要求2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述佐剂由所述脂肽和所述免疫活性物质混合而成。
7.根据权利要求2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述佐剂包括脂质体，所述脂肽***到所述脂质体表面。
8.根据权利要求2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述脂肽选自Pam3Cys-SKKKK、Pam3-CSKKKK、PHC-SKKKK、Ole2PamCys-Pam3Cys-SKKKK、Pam3-CSKKKK、PHC-SKKKK、Ole2PamCys-SKKKK、Pam2Cys-SKKKK、PamCys(Pam)-SKKKK、Ole2Cys-SKKKK、Myr2Cys-SKKKK、PamDhc-SKKKK、Pam-CSKKKK、Dhc-SKKKK和FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF)中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的抗癌疫苗组合物，其中所述脂质体由脂质构成。
10.根据权利要求9所述的抗癌疫苗组合物，其中所述脂质选自DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DDA(二甲基双十八烷基铵)、DC-Chol(3β-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)、DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)])、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和胆固醇中的至少一种。
11.根据权利要求2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述佐剂由带正电荷的脂质体和带负电荷的免疫活性物质组成，其中带正电荷的脂肽***到所述脂质体的脂质双分子层中。
12.根据权利要求2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述免疫活性物质选自聚(I∶C)、QS21、MPLA(单磷酰脂质A)、CpG和鞭毛蛋白中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的抗癌疫苗组合物，其中所述聚(I∶C)的长度为50至5,000bp。
14.根据权利要求6所述的抗癌疫苗组合物，其中所述脂肽和聚(I∶C)以1.25:1至2:1的组成比例混合，其中脂肽为0.01重量％至0.1重量％；且聚(I∶C)为0.01重量％至0.08重量％。
15.根据权利要求1或2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述抗癌疫苗组合物诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
16.根据权利要求1或2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述抗癌疫苗组合物增强Th1免疫应答。
17.根据权利要求15所述的抗癌疫苗组合物，其中所述体液免疫应答增加T滤泡辅助细胞(Tfh)以分泌细胞因子。
18.根据权利要求15所述的抗癌疫苗组合物，其中所述细胞免疫应答增强IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B的分泌。
19.根据权利要求1或2所述的抗癌疫苗组合物，其中所述组合物是水溶液制剂。
20.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的权利要求1或2所述的抗癌疫苗组合物。
21.根据权利要求19的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中所述癌症选自卵巢癌、良性星形细胞瘤、恶性星形细胞瘤、垂体腺瘤、脑膜瘤、脑淋巴瘤、少突胶质细胞瘤、颅内肿瘤、室管膜瘤、脑干肿瘤、喉癌、口咽癌、鼻腔/副鼻窦癌、鼻咽癌、唾液腺癌、下咽癌、甲状腺癌、口腔癌、胸部肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胸腺癌、纵隔肿瘤、食道癌、乳腺癌、腹部肿瘤、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、***癌、***癌、***、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、女性外生殖器癌和皮肤癌中的至少一种。
22.根据权利要求19的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中所述抗癌疫苗组合物可与选自化疗、靶向疗法、免疫检查点抑制剂和放射疗法中的一种或多种治疗联合使用。
23.一种预防、改善或治疗癌症的方法，包括向受试者施用[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]的步骤。
24.一种预防、改善或治疗癌症的方法，包括施用[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]的步骤。
25.[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]在制备用于预防、改善或治疗癌症的药物中的用途。
26.[肿瘤相关抗原(TAA)衍生肽]和[由脂肽和免疫活性物质组成的佐剂]在制备用于预防、改善或治疗癌症的药物中的用途。
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