CN118028326A - 厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法,本申请的无细胞反应方法首先根据脱卤酶TmrA的生产条件特异性的配制无细胞反应体系,反应体系能满足脱卤酶TmrA的生产;此外,针对脱卤酶TmrA的生产需要厌氧环境的条件,设计了专用的反应容器,反应容器中采用氮气曝气搅拌的方式,满足了厌氧的反应条件;此外,反应器中利用透析膜将反应器分成了“反应区”和“缓冲液区”在反应器中,反应完成后,废液透析到缓冲液区,有效延长了蛋白反应时间,降低废液对蛋白反应的影响,有效提升了蛋白的产量。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域,特别涉及厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法。
【背景技术】
无细胞蛋白表达***又称为体外翻译***是一种相对胞内表达***而言的开放表达***。它以外源mRNA或DNA为模板在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质。随着生物组学时代的到来无细胞蛋白质合成***显示出快速、方便、易于高通量等优点,通常的蛋白表达是用细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等表达***表达外源基因的一种分子生物学技术。该技术的出现极大促进了生物制品领域的发展,生产出了多种应用于人和动物疾病诊断和治疗的生物制品,保障了人和动物的生命健康。
大肠杆菌是一种典型的革兰氏阴性菌原核表达***,也是最有效的异源蛋白生产者之一。利用该***表达蛋白质是最简单、最快速和最便宜的。迄今为止,经过改造的大肠杆菌因其生长速度快(短至20~30min),较强的连续发酵能力和相对较低的成本,已经成为广泛用于表达外源蛋白的宿主。目前有许多不同N末端和C末端标签的表达载体,并且针对特殊应用也正在优化许多不同的菌株。但是现在使用大肠杆菌作为无细胞蛋白表达***生产蛋白的过程中会存在以下问题:1、针对不同的蛋白其表达需要的营养条件不同,反应体系的各成分会有所差别,需要针对不同的蛋白设计不同的反应液。2、在生产蛋白的过程中,通常反应1-2h就会停止反应。因此,如何提升无细胞蛋白表达***的反应能力,提高蛋白产量是目前无细胞蛋白表达***中亟待解决的技术问题。
【发明内容】
鉴于研究进展,有必要提供厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法,该***能提升无细胞蛋白表达***的反应能力,提高蛋白产量,是目前的蛋白反应体系技术中研究的重点。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:
无细胞反应体系,所述无细胞反应体系共20ml,包括如下成分:1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为4%的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液和5nM带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
进一步的,所述带有目的基因的重组质粒制备方法为:以T7p14-deGFP质粒为模板,采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切,然后接入荧光蛋白基因8His-mcherry和目的基因TmrA,即得重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA;所述目的基因TmrA的基因序列如SEQ IDNO.1所示。
本申请还包括一种应用所述无细胞反应体系生产TmrA酶的方法,所述方法为:
(1)构建带有目的基因的质粒以T7p14-deGFP质粒为模板,采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切,然后接入荧光蛋白基因和目的基因,得到重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA;所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)在无细胞反应体系中进行反应,所述无细胞反应体系共20ml,包括如下成分:1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM,1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为4%的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液、5nM步骤(1)构建的带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
进一步的,所述无细胞反应体系在蛋白反应器中进行反应,所述蛋白反应器从内到外依次为反应区和缓冲液区;所述反应区的由透析膜完全包裹形成;所述蛋白反应器还设有搅拌装置,搅拌装置包括位于缓冲液区的搅拌器和位于反应区的搅拌器。
进一步的,反应区内的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置,氮气曝气搅拌装置包括进气管和位于反应区的曝气头,曝气头上设有多个曝气孔。
进一步的,反应缓冲液区的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置和/或机械搅拌装置。
进一步的,所述透析膜的孔径小于目的蛋白的大小,本次表达过程中用到的是膜是3kDa。
进一步的,所述反应区和缓冲液区都使用氮气曝气搅拌装置,两区的最佳反应条件相同,氮气的流速均为200ml/min。
进一步的,所述反应区使用氮气曝气搅拌装置,缓冲液区使用机械搅拌装置,所述反应区的氮气的流速为200ml/min,所述缓冲液区的机械搅拌装置转速为180转/分钟。
进一步的,包括如下成分:1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸,20种常见氨基酸各2mM,1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为的4% PEG 8000。
本发明中所有缓冲液、反应体系中提到的20种常见氨基酸及浓度为:2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸。
本发明具有如下有益效果:
本申请的无细胞反应方法首先根据TmrA酶的生产条件特异性的配制无细胞反应体系,反应体系能满足TmrA酶的生产;此外,针对TmrA酶的生产需要厌氧环境的条件,设计了专用的反应容器,反应容器中采用氮气曝气搅拌的方式,满足了厌氧的反应条件;此外,反应器中利用透析膜将反应器分成了“反应区”和“缓冲液区”在反应器中,反应完成后,废液排到缓冲液区,有效延长了蛋白反应时间,降低废液对蛋白反应的影响,有效提升了蛋白的产量。
【附图说明】
图1为T7CF_8His-mcherry-TmrA质粒的构建示意图;
图2不采用蛋白反应器和使用蛋白反应器不同时间点生产蛋白的表达图;
图3蛋白反应器的示意图;图中标号示意为:1-蛋白反应器、2-氮气曝气搅拌装置、3-泄压阀。
图4蛋白反应器的内部结构示意图;图中标号示意为:101-反应区、102-缓冲液区、3-泄压阀、201-进气管、202-曝气头、1011-透析膜、4-机械搅拌装置。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1:
本实施例为采用厌氧酶的无细胞反应体系制备TmrA酶的方法,具体如下:
本实施例的无细胞反应体系共20ml包括如下成分:
①反应液:1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为的4% PEG 8000、2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸;
②5ml LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液;
③5nM带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
其中,LOBSTR-BL21(DE3)-RI大肠杆菌细胞裂解液的制备方法为:采用LB培养基对大肠杆菌进行培养,培养到OD600达到2.0时进行细胞破碎,离心、去掉细胞碎片,保留上清液I。上清液在37℃恒温培养箱中孵育2小时,然后15000rpm/min离心,去掉沉淀,保留上清II。将上清液II放入3kDa透析袋中,对50mM HEPES pH 8.0,150mM NaCl过夜透析,最后得到大肠杆菌裂解液。
重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA的构建方法为(质粒的构建示意图如图1所示):
(1)以T7p14-deGFP质粒为模板,采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切,然后接入荧光蛋白基因和目的基因,并将目的基因质粒命名为T7CF_8His-mcherry-TmrA;所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示;
其中,酶切反应具体为:采用NcoI和XhoI酶对质粒T7p14-deGFP进行酶切,酶切体系(总体积为50μL):NcoI酶2μL,XhoI酶2μL,10×H Buffer 5μL,T7p14-deGFP质粒41μL。置37℃水浴锅中作用4h,酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,再进行胶回收及目的片段的纯化。
其中,目的基因和荧光蛋白基因的连接用T4 DNA连接酶连接酶切、纯化、回收的目的片段与质粒,连接体系(总体积为20μL):T4 DNA连接酶1μL,10×Buffer 2μL,酶切带目的荧光基因片段的基因片段2μL、酶切质粒2μL,ddH2O 13μL。16℃过夜连接。取连接产物10μL,加到冰上解冻的大肠杆菌Top10感受态细胞中,吹打混匀后在冰上孵育30min,42℃水浴热激45s,再冰浴2min。随后向离心管中加入LB培养基100μL,振荡培养1h;取出菌液,4 000r/min离心2min;吸弃上清液850μL,将剩余菌液与沉淀吹打混匀,涂布于含氨苄西林的LB营养琼脂上,37℃培养12~16h。
(2)PCR鉴定及测序挑取LB营养琼脂上的单个菌落接种于含氨苄西林的LB培养基中,振荡培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取阳性克隆菌液提取质粒并测序,选取测序正确的含目的序列的质粒。
(3)构建无细胞反应体系并进行反应:按照上述配方构建无细胞反应体系,将反应液、裂解液和重组质粒一起放入反应体系中,在无氧条件下反应16小时。
实施例2:
本实施例为采用反应器配合反应体系制备厌氧酶的方法,具体如下:
1、按照实施例1的方法构建重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
2、按照实施例1的无细胞反应体系(总体积20ml)将步骤1的重组质粒5nM与反应液(1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为的4% PEG 8000、2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸)和5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液混匀后放入蛋白反应器(1)的反应区(101)中进行无细胞反应。并在缓冲液区加入缓冲液反应液(1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为的4%PEG 8000、2mM的甘氨酸、2mM的丙氨酸、2mM的缬氨酸、2mM的亮氨酸、2mM的异亮氨酸、2mM的脯氨酸、2mM的苯丙氨酸、2mM的酪氨酸、2mM的色氨酸、2mM的丝氨酸、2mM的苏氨酸、2mM的半胱氨酸、2mM的蛋氨酸、2mM的天冬酰胺、2mM的谷氨酰胺、2mM的天冬氨酸、2mM的谷氨酸、2mM的赖氨酸、2mM的精氨酸和2mM的组氨酸)。
其中,蛋白反应器(1)从内到外依次为反应区(101)和缓冲液区(102);所述反应区(101)的由透析膜(1011)完全包裹形成;此外,为了加强反应区(101)的反应能力,加强废物的排出,所述蛋白反应器(1)还设有搅拌装置,搅拌装置包括位于缓冲液区(102)的搅拌器和位于反应区(101)的搅拌器。
为了维持***的“无氧”条件,反应区(101)内的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置(2),氮气曝气搅拌装置(2)包括进气管(201)和位于反应区(101)的曝气头(202),曝气头(202)上设有多个曝气孔。
为了加快反应区(101)内的废液流出,缓冲液区(102)的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置(2)和/或机械搅拌装置(4)。
为了平衡气压,蛋白反应器的顶部还设有泄压阀(3)。
为了使生产的蛋白能被约束在反应区(101)内,所述透析膜(1011)的孔径小于目的蛋白的大小。
本实施例中,如果反应区(101)和缓冲液区(102)都使用氮气曝气搅拌装置(2)的条件下,两区的最佳反应条件相同,氮气的流速均为200ml/min。
如果反应区使用氮气曝气搅拌装置而缓冲液区(102)使用机械搅拌装置(4)的条件下,反应区的最佳反应条件为:氮气的流速在200ml/min,缓冲液区(102)机械搅拌装置转速为180转/分钟。
不同条件下进行无细胞生产TmrA酶的效率,具体如下:
采用实施例1的方法生产TmrA酶,即不使用本申请专用的蛋白反应器(1),在反应1-2h后反应停止,TmrA酶的产量仅为0.5mg/10ml。
采用实施例2的方法生产TmrA酶,在氮气流速为200ml/min的条件下,反应8小时后反应停止,TmrA酶的产量为6mg/10ml。
采用实施例2的方法生产TmrA酶,在氮气流速为200ml/min的条件下,反应16小时后反应停止,TmrA酶的产量为16mg/10ml。
此外,申请人还进行了如下对照实验:
对照组:采用普通大肠杆菌表达***和常规方法生产TmrA酶;20℃,0.1mM IPTG诱导表达时间为16h。
实验组:采用本申请实施例2的方法生产TmrA酶,在氮气流速为200ml/min的条件下,分别在反应30min、反应60min、反应180min、反应8h、反应16h的条件下进行一次蛋白印记反应。
得到的结果如图2所示,从图中可见:采用普通大肠杆菌表达***生产TmrA酶产量极低,蛋白几乎不表达,而采用本申请实施例2的方法生产TmrA酶,开始时产量不高,但随着时间的推移产量越来越高,甚至在反应到达16h时仍能产生TmrA酶,这也进一步说明了使用实施例2的方法生产TmrA酶,能显著提升酶产量、延长酶的反应时间。
综上所述,使用本申请的蛋白反应器和反应体系相互配合,能显著提升TmrA酶的产量、延长TmrA酶的反应时间,反应体系是根据TmrA酶的生产条件而设定的,本申请还根据TmrA酶的反应条件设计了专用的反应容器,配合特定的反应条件有效提升了TmrA酶的产量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.无细胞反应体系,其特征在于,所述无细胞反应体系共20ml,包括如下成分:1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM、1mM的醋酸镁、3mM的二谷氨酸钾、质量百分浓度为4%的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液和5nM带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
2.根据权利要求1所述的无细胞反应体系,其特征在于,所述带有目的基因的重组质粒制备方法为:以T7p14-deGFP质粒为模板,采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切,然后接入荧光蛋白基因8His-mcherry和目的基因TmrA,即得重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA;所述目的基因TmrA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种应用如权利要求1或2所述无细胞反应体系生产TmrA酶的方法,其特征在于,所述方法为:
(1)构建带有目的基因的质粒以T7p14-deGFP质粒为模板,采用NcoI和XhoI酶对质粒进行酶切,然后接入荧光蛋白基因和目的基因得到重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA;所述目的基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)在无细胞反应体系中进行反应,所述无细胞反应体系共20ml,包括如下成分:1.2mM的ATP和1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸、20种常见氨基酸各2mM,1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为4%的PEG 8000、5ml的LOBSTR-BL21(DE3)-RI的大肠杆菌细胞裂解液、5nM步骤(1)构建的带有目的基因的重组质粒T7CF_8His-mcherry-TmrA。
4.根据如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述无细胞反应体系在蛋白反应器中进行反应,所述蛋白反应器从内到外依次为反应区和缓冲液区;所述反应区的由透析膜完全包裹形成;所述蛋白反应器还设有搅拌装置,搅拌装置包括位于缓冲液区的搅拌器和位于反应区的搅拌器。
5.根据如权利要求3所述的方法,其特征在于,反应区内的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置,氮气曝气搅拌装置包括进气管和位于反应区的曝气头,曝气头上设有多个曝气孔。
6.根据如权利要求3所述的方法,其特征在于,反应缓冲液区的搅拌器选用氮气曝气搅拌装置和/或机械搅拌装置。
7.根据如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述透析膜的孔径小于目的蛋白的大小。
8.根据如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述反应区和缓冲液区都使用氮气曝气搅拌装置,两区的最佳反应条件相同,氮气的流速均为200ml/min。
9.根据如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述反应区使用氮气曝气搅拌装置,缓冲液区使用机械搅拌装置,所述反应区的氮气的流速为200ml/min,所述缓冲液区的机械搅拌装置转速为180转/分钟。
10.根据如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述缓冲液区的缓冲液包括如下成分:1.2mM的ATP、1.2mM的GTP、0.8mM的CTP、0.8mM的UTP、30mM的3-磷酸甘油酸,20种常见氨基酸各2mM,1mM的醋酸镁,3mM的二谷氨酸钾,质量百分浓度为的4%PEG 8000。
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