CN117990661A - 一种基于光散射的细菌活性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于光散射的细菌活性检测方法，通过测量光散射信号的变化得到光强自相关函数，再对该自相关函数进行指数函数拟合得到自相关函数，自相关函数的拟合可以获得衰减率，即颗粒运动的衰减速度，衰减率反映了颗粒的运动速度。通过提前建立好每一种细菌悬液的衰减率与细菌活性的关系，之后，利用光散射装置测量得到的衰减率即可得出细菌活性的信息。这种方法不需要培养细菌，也不需要使用特殊的仪器和试剂。它可以在短时间内完成测量，而且不会对细菌产生损伤，因此可以用于长时间监测细菌溶液活性的变化。

Description

一种基于光散射的细菌活性检测方法

技术领域

本发明属于细胞活性检测领域，具体涉及一种基于光散射的细菌活性检测方法。

背景技术

细菌是微生物中重要的一类，它们对人类健康有着复杂的影响，既包括有益的，也包括有害的。大多数细菌在人类的日常生活和身体健康中都发挥着积极的作用，如乳酸菌等；但也有一些细菌可以引起多种疾病和感染，对人类健康造成威胁。因此，细菌活性检测在许多领域都具有重要的应用价值，例如在食品工业、制药业、环境监测、生物医学研究等。

传统的细菌活性检测方法为细菌培养法，通常包括细菌培养、细胞计数等步骤，该方法只能检测活菌数量，检测时间过长，一般需要一天至几天，很多研究已经表明，培养法仅仅能检测到自然环境中不到1％的微生物，无法对处于“活的但又不可培养”(Viable butnon-culturable，VBNC)的状态的细菌和死细菌进行检测。目前常见的细菌活性检测方法有荧光染色法、酶联免疫法、流式细胞术等，这些方法与培养法相比缩短了检测时间，其中荧光染色法利用荧光染料选择性地标记活细胞和死细胞，使其发出不同颜色的荧光信号，从而实现对细菌活性的检测，其需要针对细菌种类选择合适的荧光染料，操作过程需要一定的技术水平和实验设备，依赖专业人员，另外，检测过程也容易对细菌造成伤害；酶联免疫法是利用特异性抗体对细菌或其代谢产物具有的高度选择性，可以实现对目标细菌的准确检测，其需要制备特异性抗体，检测过程可能存在与其他物质的交叉反应，导致假阳性结果；流式细胞术可以进行高通量分析，同时测量多个参数，但其需要昂贵的流式细胞仪设备和技术支持，样品需要特殊处理，对样品要求较高，且对细胞形态和大小较为敏感，可能对某些特殊形态的细菌检测不够灵活。总之，这些方法在检测细菌活性的过程中所需的成本较高、操作复杂，需要一定的技术水平和实验设备，依赖专业人员，另外，检测过程容易对细菌造成伤害，无法实现连续监测。

因此，开发一种简便、快速且无损的细菌活性检测方法具有重要的实际意义。这种检测方法应该能够快速准确地测量细菌的活性，同时不会对细菌产生损伤，以便进行长时间监测。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明基于光散射的细菌活性检测方法提供了一种简便、快速且无损的检测方法。通过寻找光散射信号与细菌活性之间的关联，建立关系式，测量光散射信号的变化，就可以得出细菌活性的信息。这种方法不需要培养细菌，也不需要使用特殊的仪器和试剂。它可以在短时间内完成测量，而且不会对细菌产生损伤，因此可以用于长时间监测细菌溶液活性的变化。克服了传统培养法、荧光染色法、酶联免疫法、流式细胞术等方法中操作复杂、耗时且可能损伤细菌、无法长时间测量等不足。

本发明的技术方案实现了细菌活性的光学检测。主要基于发明人发现活细菌与死细菌之间存在一些明显运动差异，如活细菌在溶液中做较为快速的游动，而死细菌在溶液中做布朗运动，运动速度的不同，反应在散射光自相关函数的衰减率不同。从而可以利用该特点构建衰减率与细菌活性之间的关系，如衰减率与细菌活性之间呈现正比关系，实现细菌活性的光学检测。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

一种基于光散射的细菌活性检测方法，包括以下步骤：

1)将一系列细菌活性不同而细菌总浓度相同的标准细菌溶液分别测得散射光信号，通过信号自相关处理和数据分析，得到一系列衰减率；

2)建立衰减率与细菌活性的标准曲线；

3)将待测细菌溶液按照步骤1)进行操作，测得散射光信号，通过信号自相关处理和数据分析，获得衰减率，再根据标准曲线计算待测细菌溶液中细菌活性。

进一步地，所述散射光信号通过光散射装置测定；所述光散射装置包括：入射光源1、第一透镜2、样品瓶3、温控样品台4、第二透镜5、光纤6、光电探测器7和信号处理器8。

更进一步地，所述入射光源、第一透镜依次放置于所述样品瓶的一侧，且所述入射光源的中心、所述第一透镜的中心位于同一轴线。

更进一步地，所述入射光源经所述第一透镜汇聚垂直射入所述样品瓶。

更进一步地，所述温控样品台包括底座和控温模块，控温模块顶部留有放入样品瓶的入口，成直角的两侧分别留有入射光射入口、散射光射出口，剩余部分起控温作用，用于提供细菌生存最佳温度。

更进一步地，所述光纤、所述第二透镜的中心与所述样品瓶位于同一轴线，且与所述入射光源的中心、所述第一透镜的中心所在轴线垂直。

更进一步地，样品散射的光经所述第二透镜汇聚射入所述光纤，所述光纤用于接收散射光强。

更进一步地，所述光电探测器与所述光纤进行连接，用于接收所述光纤传输的光信号，将所述光信号转为电信号。

更进一步地，所述信号处理器用于接收所述光电探测器转换的电信号并拟合得到散射光的光强自相关函数，根据所述光强自相关函数计算衰减率；根据步骤1)所述标准细菌溶液的衰减率与步骤(1)已知的标准细菌溶液的细菌活性建立标准曲线；将步骤(3)所述待测细菌溶液的衰减率和步骤(2)建立的衰减率与细菌活性的标准曲线进行比对，进而输出细菌溶液的活性信息。

更进一步地，所述样品瓶经过无菌处理，用于添加样品；所述样品瓶无菌处理方式包括紫外线杀菌或高温高压灭菌。

更进一步地，所述样品瓶置于所述温控样品台中，温度依据不同细菌种类调至细菌最佳生存温度，测量过程保持恒温状态。

进一步地，所述信号自相关处理和数据分析，包括信号处理器对光电探测器转换的电信号U(t)做自相关运算得到散射光光强自相关函数：

G⁽²⁾(τ)＝<U(t)U(t-τ)>，

其中，t为输出电信号的时刻，τ为延迟时间，U(t)为光电转换器t时刻输出的电信号，U(t-τ)为(t-τ)时刻输出的电信号，<>表示对时间求平均值；实验中可测得到散射光强度随时间的变化，称为光信号,再由光电探测器将光信号转换为电信号U(t)，两者都是可获得的信号。

将散射光光强自相关函数G⁽²⁾(τ)进行归一化，得到归一化光强自相关函数：

其中Γ为衰减率。

通过上述式子可知，获取散射光归一化光强自相关函数后，再利用反演运算即可求得衰减率Γ，而衰减率Γ与溶液中的细菌运动有关，较大的衰减率对应较多的活细菌运动，而较小的衰减率则对应较少的活细菌运动，以此提前建立好衰减率与活性的关系曲线，可以实现细菌活性的快速测量。

进一步地，所述衰减率Γ与细菌活性V的标准曲线，在光散射装置参数一定的情况下，呈现线性关系：Γ＝k*V+b，其中，k为比例系数，与细菌种类、尺寸有关，b称为基数值，为测量细菌的死菌溶液在光散射装置中多次测量求得的平均衰减率值。在测量前，先通过光散射装置获取待测种类细菌的衰减率与细菌活性线性关系式，储存与信号处理器中，在测量待测样溶液时，只需要通过光散射装置测到衰减率Γ，再通过V＝1/k(Γ-b)×100％获得细菌活性即可。

与现有技术相比，本发明技术方案的优点在于：

本发明首次利用活细菌和死细菌在溶液中运动速度不同，使得溶液散射光信号自相关函数的衰减率不同，从而可以构建活细菌占比与衰减率之间的关系，以实现光学方法来检测细菌活性。光学方法检测细菌活性的方法操作简单，成本低，速度快，且检测过程不会损伤细菌，相对现有的培养法、荧光染色、酶联免疫等，具有明显的技术优势。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)快速简便：该方法操作简单，无需培养细菌和繁琐的试剂准备过程，可以在短时间内完成测量，大大节省了时间和人力资源。

(2)无损检测：光散射装置所用的激光强度远低于使细菌致死的强度，所以检测过程中不会损伤细菌，因此可用于长时间监测细菌溶液活性的变化。

(3)多种细菌检测：该方法可以建立不同种类细菌的活性与衰减率之间的关系，实现多种细菌的活性检测，为科学研究和实践应用提供了更有效和便捷的工具。

(4)实时监测：由于该方法可用于长时间监测细菌溶液活性的变化，因此可以实时反映细菌的生长和死亡情况，为科学研究、工业生产和医疗实践提供重要的参考依据。

综上所述，本发明提供的基于光散射的细菌活性检测方法具有快速简便、无损、多种细菌检测和实时监测等优点，为细菌活性检测提供了新的解决方案。

附图说明

图1为细菌活性的检测流程图，图1中的A为检测流程概括图；图1中的B为各步骤具体流程图。

图2为光散射装置的结构示意图。

图3为不同活性大肠杆菌的散射光光强的归一化自相关曲线图。

图4为大肠杆菌的活性Viability-衰减率Γ标准曲线图。

图5为不同活性枯草芽孢杆菌的散射光光强的归一化自相关曲线图。

图6为枯草芽孢杆菌的活性Viability-衰减率Γ标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

图2为本发明所使用的光散射装置的结构示意图，其中，1为激光器、2为第一透镜、3为样品瓶、4为温控样品台、5为第二透镜、6为光纤、7为光电探测器、8为信号处理器。

在以下实施例中，所述激光器选择的是功率为5mW、波长为632.8nm的He-Ne激光器，用于产生入射光束；所述第一透镜为凸透镜，位于激光器和温控样品台之间，通过调节摆放的位置，使得焦点位于温控样品台中央，增强散射光强；所述样品瓶选用透光率大于80％的圆形玻璃瓶，进行高温高压灭菌后，置于温控样品台之中；所述温控样品台内部装有体积小、效率高的半导体制冷片及其控制电路及散热部件，温度调节范围为-10℃～70℃；所述第二透镜为凸透镜，设置于样品溶液散射光夹角为90°处，将散射光汇聚到光纤并耦合至光电探测器进行探测；所述光纤选择传输特性良好的多模光纤；所述信号处理器包括信号处理和数据处理功能，探测的信号经过信号处理器自相关处理和数据分析得散射光强的自相关曲线数据并反演输出衰减率信息，与建立的衰减率与细菌活性的标准曲线进行比对输出细菌活性信息。

其中，信号自相关处理和数据分析的基本原理如下：

信号处理器对光电探测器转换的电信号U(t)做自相关运算得到散射光光强自相关函数：

G⁽²⁾(τ)＝<U(t)U(t-τ)>，

式中，τ为延迟时间，U(t)为光电转换器t时刻输出的电信号，U(t-τ)为(t-τ)时刻输出的电信号，<>表示对时间求平均值；将散射光强自相关函数G⁽²⁾(τ)进行归一化，得到归一化光强自相关函数：

式中，Γ为衰减率；

因此，根据在实验中获取散射光归一化光强自相关函数可以获得衰减率Γ，而衰减率Γ与溶液中的细菌运动有关，较大的衰减率对应较多的活细菌运动，而较小的衰减率则对应较少的活细菌运动，以此提前建立好衰减率与活性的关系曲线，可以实现细菌活性的快速测量。

所述衰减率Γ与细菌活性V的标准曲线，在光散射装置参数一定的情况下，呈现线性关系：Γ＝k*V+b，其中，k为比例系数，与细菌种类、尺寸有关，b称为基数值，为测量细菌的死菌溶液在光散射装置中多次测量求得的平均衰减率值。在测量前，先通过光散射装置获取待测种类细菌的衰减率与细菌活性线性关系式，储存与信号处理器中，在测量待测样溶液时，只需要通过光散射装置测到衰减率Γ，再通过V＝1/k(Γ-b)×100％获得细菌活性即可。

实施例1

本发明检测细菌活性检测流程图如图1所示，图1中的A为检测流程概括图；图1中的B为各步骤具体流程图。该检测方法具体包括以下步骤：

1)标准曲线的标定：将大肠杆菌分别接种于营养肉汤和70％异丙醇溶液中，培养12小时后，离心弃去上清液，用生理盐水将沉淀菌体洗1-2次，制得活/死细菌溶液；用生理盐水将活/死细菌溶液都稀释到细菌总数浓度为10⁵个细胞/毫升；

2)将活细菌溶液和死细菌溶液按不同比例混合，制备得到一系列不同活性(0％、25％、50％、75％、100％)而细菌总浓度相同标准细菌溶液；

3)将一系列不同活性而细菌总浓度相同标准细菌溶液依次加入光散射装置样品瓶中；

4)打开激光器向样品瓶中发射入射光，散射光结果第二透镜汇聚到光纤并耦合至光电探测器进行探测；

5)探测的信号经过信号处理器进行自相关处理和数据分析得到散射光强的归一化自相关曲线数据并反演输出一系列衰减率信息；

6)重复上述实验两次，并对三组数据就行线性拟合，建立大肠杆菌活性与衰减率的标准曲线，存储于信号处理器中。

7)实际样品的测量：取待测大肠杆菌溶液，按照步骤3)、4)、5)进行操作，获得衰减率，再与步骤6)中获得的标准曲线比对，得到待测大肠杆菌溶液的活性。

光散射方法测量得到的不同活性比例的大肠杆菌的散射光归一化自相关曲线如图3所示，图中可以看到，大肠杆菌活性越大，自相关曲线随时间下降的越快，即对应的衰减率越大。

光散射方法测量得到的大肠杆菌的活性Viability-衰减率Γ标准曲线如图4所示，图中由三组实验数据拟合得到大肠杆菌的衰减率与细菌活性的标准曲线为：

Γ＝0.3112V+96.3295，其中，比例系数k＝0.3112，基数值b＝96.3295，相关指数R²为0.98073，相关性显著；

光散射方法测量得到的待测大肠杆菌溶液得到的活性与实际活性比对如表1所示，表中可以看出光散射方法适用于细菌活性的测量。当然还存在一定误差，要求后续对测量过程或者方法进行细致的调整，例如提高信号的信噪比等。

表1

在检测细菌活性过程中，光散射方法只需要初次建立好细菌的标准曲线，对待测细菌做简单的浓度控制，即可检测，测量时间为3min，操作难度和时间远小于传统方法，光散射装置的激光强度远低于使细菌致死的强度，检测过程不损伤细菌，可用于长时间监测细菌溶液活性的变化。

实施例2

采用枯草芽孢杆菌替换实施例1中的大肠杆菌；测量温度改为适合枯草芽孢杆菌生长的温度30℃，其它操作步骤相同，实验次数为1次。

光散射方法检测得到的不同活性比例的枯草芽孢杆菌的散射光光强的归一化自相关曲线如图5所示，图中可以看到，枯草芽孢杆菌活性越大，自相关曲线随时间下降的越快，即对应的衰减率越大；枯草芽孢杆菌的活性Viability-衰减率Γ标准曲线图如图6所示，图中由实验数据拟合得到枯草芽孢杆菌的衰减率与细菌活性的标准曲线为：Γ＝0.2457V+81.0883，其中，比例系数k＝0.2457，基数值b＝81.0883，相关指数R2为0.98894，相关性显著。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将一系列细菌活性不同而细菌总浓度相同的标准细菌溶液分别测得散射光信号，通过信号自相关处理和数据分析，得到一系列衰减率；

(2)建立衰减率与细菌活性的标准曲线；

(3)将待测细菌溶液按照步骤1)进行操作，测得散射光信号，通过信号自相关处理和数据分析，获得衰减率，再根据标准曲线计算待测细菌溶液中细菌活性。

2.根据权利要求1所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述散射光信号通过光散射装置测定；所述光散射装置包括：入射光源、第一透镜、样品瓶、温控样品台、第二透镜、光纤、光电探测器和信号处理器。

3.根据权利要求2所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，所述入射光源、第一透镜依次放置于所述样品瓶的一侧，所述入射光源的中心、所述第一透镜的中心位于同一轴线；所述入射光源经第一透镜汇聚垂直射入样品瓶。

4.根据权利要求2所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，所述温控样品台包括底座和控温模块，控温模块顶部留有放入样品瓶的入口，成直角的两侧分别留有入射光射入口、散射光射出口，剩余部分有控温作用，用于提供细菌生存最佳温度。

5.根据权利要求2所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，所述光纤、第二透镜的中心与所述样品瓶位于同一轴线，且垂直于所述入射光源的中心及所述第一透镜的中心所在轴线。

6.根据权利要求2所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，通过样品散射的光经所述第二透镜汇聚射入所述光纤，所述光纤用于接收散射光强；所述光电探测器与所述光纤进行连接，用于接收所述光纤传输的光信号，将光信号转为电信号。

7.根据权利要求2所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，所述信号处理器用于接收所述光电探测器转换的电信号并拟合得到散射光的光强自相关函数，根据所述光强自相关函数计算衰减率；根据步骤1)所述标准细菌溶液的衰减率与步骤(1)已知的标准细菌溶液的细菌活性建立标准曲线；将步骤(3)所述待测细菌溶液的衰减率和步骤(2)建立的衰减率与细菌活性的标准曲线进行比对，进而输出细菌溶液的活性信息。

8.根据权利要求2所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，所述样品瓶经过无菌处理，用于添加样品；所述样品瓶的无菌处理方式包括紫外线杀菌或高温高压灭菌；所述样品瓶置于所述温控样品台中，温度依据不同细菌种类调至细菌最佳生存温度，测量过程保持恒温状态。

9.根据权利要求1所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，所述信号自相关处理和数据分析，包括信号处理器对光电探测器转换的电信号U(t)做自相关运算得到散射光光强自相关函数：

G⁽²⁾(τ)＝<U(t)U(t-τ)>，

其中，<>表示对时间求平均值，U(t)为光电转换器t时刻输出的电信号，U(t-τ)为(t-τ)时刻输出的电信号，t为输出电信号的时刻，τ为延迟时间，G⁽²⁾(τ)为散射光强自相关函数；将散射光强自相关函数G⁽²⁾(τ)进行归一化，得到归一化光强自相关函数g⁽²⁾(τ)：

其中Γ为衰减率，τ为延迟时间；

获取散射光归一化光强自相关函数后，再利用反演运算即可求得衰减率Γ，而衰减率Γ与溶液中的细菌运动有关，较大的衰减率对应较多的活细菌运动，而较小的衰减率则对应较少的活细菌运动，以此提前建立好衰减率与活性的关系曲线，可以实现细菌活性的快速测量。

10.根据权利要求9所述的一种基于光散射的细菌活性检测方法，其特征在于，所述衰减率Γ与细菌活性V呈线性关系：Γ＝k*V+b，其中，k为比例系数，与细菌种类、尺寸有关，b称为基数值，为测量细菌的死菌溶液在光散射装置中多次测量求得的平均衰减率值。在测量前，先通过光散射装置获取待测种类细菌的衰减率与细菌活性线性关系式，储存于信号处理器中，在测量待测样溶液时，只需要通过光散射装置测到衰减率Γ，再通过V＝1/k(Γ-b)×100％获得细菌活性。