CN117980322A - 用于阿尔茨海默病的基于血液的诊断测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物标志物组及其用于诊断、分期、治疗和评估以tau毒性为特征的神经认知障碍例如阿尔茨海默病的治疗响应的方法。包括至少三个位置的磷酸化肽，可用作筛查神经认知障碍的生物标志物。

Description

用于阿尔茨海默病的基于血液的诊断测定
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年7月23日提交的美国临时专利申请号63/225,423的优先权权益，该临时专利申请的全部内容通过引用整体并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
本说明书还通过引用纳入了通过EFS-Web以电子方式提交的2022年7月22日创建的文件名为“SequenceListing.xml”的同时提交的序列表。本文档中包含的序列表是说明书的一部分并且通过引用将其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及生物标志物组及其用于诊断、分期(staging)、治疗和评估以tau毒性为特征的神经认知障碍(例如阿尔茨海默病)的治疗响应的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是最大的医疗负担之一，全世界有3500万人受影响，预计到2050年人数将增加到1.15亿。[Wimo,Alzheimer’s Disease International World Report2010.The Global Economic Impact of Dementia,Alzheimer’s Disease International(2010)]。AD是一种毁灭性的痴呆症，首先表现为进行性记忆丧失，随后可能包括诸如抑郁、偏执、烦躁甚至攻击性等神经精神症状。目前，可用的AD治疗仅限于认知增强剂，其疗效有限且短暂。
以前，AD的诊断只能在尸检时通过淀粉样蛋白沉积物和含有微管相关蛋白tau的神经原纤维缠结(NFT)的存在来确认。当前AD的临床诊断满足McKhann et al.,Neurology34(7):939-944(1984)中关于可能AD的DSM-IV TR和NINCDS-ADRDA工作组标准。最初的诊断标准主要基于以上McKhann et al.提出的主观评估，要求通过神经心理学测试来确认存在认知障碍和疑似痴呆综合征，以进行可能或很可能AD的临床诊断；尽管他们需要组织病理学确认(脑组织显微镜检查)以进行明确诊断。
该标准指定了AD中可能受损的八个认知领域。这些认知领域是：记忆、语言、感知技能、注意力、建设性能力、定向能力、解决问题和功能能力。疾病早期不存在运动、感觉或协调缺陷。这些标准已表现出良好的可靠性和有效性，并且是本文用作断言AD临床诊断的基础的标准。
迄今为止，还无法通过实验室测定来确定诊断。此类测定的重要性主要在于确定导致痴呆症的其它可能原因，在自信地诊断阿尔茨海默病之前应排除这些原因。神经心理学测试为痴呆症的诊断提供了证实性证据，并有助于评估疗程和对疗法的响应。以上McKhann et al.提出的标准旨在作为诊断很可能、可能和明确的阿尔茨海默病的指南；随着更明确的信息的出现，这些标准可能会被修订。
最近，诊断标准得到了细化，以包括前驱期(在疾病全面症状显现之前出现的早期症状)，称为“由AD引起的轻度认知障碍(MCI)”。这一新诊断反映出希望尽早治疗该疾病，因为神经病理学预计在症状出现前10年就开始了。[Trojanowski et al.,AlzheimersDement 6,230-238(2010)]。潜在的疾病改善治疗的临床试验非常令人失望，部分原因可能是即使是“早期”患者也已经具有大量的淀粉样蛋白-β(Aβ)负担和具有显著突触缺陷和炎症的实质性病理。
根据Petersen et al.,Arch Neurol 56(3):303-308(1999)，对照受试者和患有MCI的受试者之间的主要区别在于记忆领域，而其它认知功能是相当的。然而，当将患有MCI的受试者与患有非常轻度AD的患者进行比较时，记忆表现相似，但患有AD的患者的其它认知领域也受到更多损害。纵向表现表明，患有MCI的受试者的下降速度高于对照，但低于患有轻度AD的患者。
符合MCI标准的患者可以与健康对照受试者和患有非常轻度AD的患者区分开来。它们似乎构成了一个可以表征用于治疗干预的临床实体。
淀粉样蛋白-β(Aβ)是长度为39-42个氨基酸残基的肽，通过β-分泌酶和γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白(APP)进行特异性蛋白水解切割在体内产生。Aβ42包含APP蛋白的残基677-713，其本身是770个残基的跨膜蛋白，在UniProtKB/Swiss-Prot***中具有名称P05067。Aβ且特别是Aβ42，通常被认为是AD中的主要致病因子，尽管其AD神经病理学的机制存在争议。
直到最近，只有以上McKhann et al.中讨论的基于症状的测定可用于诊断活体患者中存在阿尔茨海默病。最近，从2012年4月开始，从礼来公司(Eli Lilly)的开始以及随后批准的GE医疗(GE Healthcare)的/>和Piramal Imaging的已经使用PET扫描技术来检测活人中的AD。静脉输注的放射性标记的正电子发射化合物与脑斑块中的Aβ结合。
尽管准确，但PET扫描测定对患者来说并不方便，因为患者必须将其头部放置在闪烁检测器内相对有限的空间中，并且应该保持相对静止。PET扫描测定的成本也很高，特别是与更常见的血液测试相比，在更常见的血液测试中，抽取几毫升血液即可提供多达40种不同的测定，不幸的是，这些测定尚未在商业上包括针对AD的测试。
45年前作为第一个非肌肉肌动蛋白结合蛋白被发现[Hartwig et al.,JBiolChem 250:5696-5705(1975)；Wang et al.,Proc Natl Acad Sci USA 72:4483-4486(1975)]，细丝蛋白[FLN]是在非肌肉细胞中表达的细胞骨架蛋白家族-细丝蛋白A(FLNA)和B，但不包括细丝蛋白C。人类FLNA在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中的标识符为P21333，并且含有2647个氨基酸残基的序列(约280kDa)。该蛋白有时在本领域也称为肌动蛋白结合蛋白(ABP-280)。[Gorlin et al.,J Cell Biol 111:1089-1105(1990).]
FLNA蛋白将各种跨膜蛋白锚定到肌动蛋白细胞骨架上，并作为多种细胞质信号蛋白的支架。细丝蛋白对于哺乳动物细胞运动是必需的并且充当蛋白质-蛋白质相互作用的界面[van der Flier et al.,Biochim Biophys Acta1538:99-117(2001)]。除了在细胞运动中的作用外，越来越多地发现FLNA通过与各种受体和信号分子相互作用来调节细胞信号传导。[Stossel et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 2:138-145(2001)；Feng et al.,NatCell Biol 6:1034-1038(2004)]。
FLNA蛋白由被两个30个氨基酸残基的柔性环或铰链中断的N末端肌动蛋白结合结构域(ABD)和24个免疫球蛋白样重复结构域(IgFLNa’s)(每个长约96个氨基酸残基并且从N末端开始编号)的杆状结构域组成。该IgFLNa’s编号为1至24，从N末端附近开始并且在C末端附近结束。指定为H1的环位于重复15和16之间，并且指定为H2的环位于重复23和24之间[Gorlin et al.,J Cell Biol 111:1089-1105(1990)；van der Flier et al.,BiochimBiophys Acta 1538:99-117(2001)]。
H1和H2可以被钙蛋白酶和半胱天冬酶切割[Gorlin et al.,J Cell Biol111:1089-1105(1990)；Browne et al.,J Biol Chem 275:39262-39266(2000)]。H1处的切割发生在氨基酸残基1762和1764之间，并产生由ABD和重复1-15(IgFLNa-1-15)组成的约170kDa片段，加上由重复16-24(IgFLNa-16-24)组成的约110kDa多肽片段。
值得注意的是，UniProtKB/Swiss-Prot数据库列出了位置1740的重复15的C末端和位于氨基酸残基位置1779的重复16的N末端。另一方面，以上的Gorlin et al.将钙蛋白酶切割位点置于残基1762和1764之间，而Garcia et al.,Arch Biochem Biophys 446:140-150(2006)将该位点置于残基1761和1762之间。类似地，以上的Gorlin et al.写道，早期作者[Hartwig etal.,J Cell Biol 87:841-848(1980)]在第1089页报道了全长FLNA分子的分子量为270kDa，并且此后第1093页报道为具有280kDa蛋白。
以上的Garcia et al.报道了钙蛋白酶将全长FLNA切割成180、100、90和10kDa的多肽片段，而Bedolla et al.,Clin Cancer Res 15(3):788-796(2009)报道了170、110的蛋白水解片段和从110kDa片段切下的90kDa片段。以上的Browne et al.报道了细胞毒性T淋巴细胞蛋白酶颗粒酶B(grB)与裂解蛋白穿孔素协同切割细丝蛋白，并且在与Fas受体连接后，也以半胱天冬酶依赖性方式切割细丝蛋白。垂死Jurkat细胞裂解物的蛋白质印迹鉴定出来自FLNA的C末端区域的两种半胱天冬酶切割多肽，其质量分别为约110和95kDa。纯化的grB将细丝蛋白切割成数种多肽，包括质量为约205、200和110kDa的多肽。使用了提升到含有来自FLNA的C末端区域(位置2172-2647)的476个氨基酸残基的融合蛋白的多克隆兔抗体。Umeda et al.J Biochem 130:535-542(2001)在U937单核细胞性白血病和Jurkat人类T淋巴母细胞中通过半胱天冬酶-3进行蛋白水解发现了有些相似的结果(C末端135、120和110kDa多肽片段)。
值得注意的是，Loy et al.,Proc Natl Acad Sci,USA,100(8):4562-4567(2003)中提及IgFLNa-16-24具有约110kDa的质量。该约110kDa的多肽(IgFLNa-16-24)在H2处被钙蛋白酶进一步以较长的消化时间切割，产生含有重复16-23(IgFLNa-16-23)的约90kDa片段[Gorlin et al.,J Cell Biol111:1089-1105(1990)；van der Flier et al.,BiochimBiophys Acta 1538:99-117(2001)]。
由于如上所讨论的本领域报道的全长FLNA及其蛋白水解片段的残基位置和一些分子量的差异，全长FLNA分子和较小的FLNA切割产物分别具有“约”280kDa和“约”90kDa的分子量。
FLNA促进肌动蛋白丝的正交分支并将肌动蛋白丝与膜糖蛋白连接。细丝蛋白A通过跨膜区域附近的羧基末端重复(重复24)二聚化，提供对功能至关重要的细胞内V形结构。
每个v-形FLNA二聚体都有两个反向平行的自结合结构域24，形成“v”的顶点，并且其余结构域像串上的珠子一样伸展出，它们N末端ABD部分的每一个都与肌动蛋白分子结合。最近，据报道，ABD的C末端，杆段1(IgFLNa-1-15)，形成延伸的线性结构，没有明显的结构域间相互作用。由于多个结构域间相互作用，杆段2(IgFLNa-16-23)呈现出紧凑的结构，其中结构域16-17、18-19和20-21形成配对结构。[Heikkinen et al.,J Biol Chem,284:25450-25458(2009)；Lad et al.,EMBO J,26:3993-4004(2007).]
FLNA的蛋白水解部分受到重复20(IgFLNa-20)中Ser 2152(S2152)上其磷酸化的调节，据报道，其可使全长蛋白稳定且抗切割。[Gorlin et al.,J Cell Biol 111:1089-1105(1990)；Garcia et al.,Arch Biochem Biophys446:140-150(2006)；和Chen et al.,J Biol Chem 264(24):14282-14289(1989).]
Loy et al.,Proc Natl Acad Sci,USA,100(8):4562-4567(2003)报道，含有重复16-24且分子量为约100kDa的H1裂解产物与雄激素受体共定位至***癌细胞中的细胞核。这些工作人员注意到，FLNA通常被认为是细胞质结构分子，并且将他们发现的其约100kDa多肽(由钙蛋白酶切割产生)作为雄激素受体的核调节剂的额外功能表征为“完全出乎意料的”(第4565页)。
细胞核中发现的约100kDa FLNA片段在S2152上未磷酸化。事实上，据报道，在***癌系和血小板中，S2152上的磷酸化可阻断钙蛋白酶对全长FLNA的切割。[Garcia etal.,Arch Biochem Biophys 446:140-150(2006)；和Chen et al.,J Biol Chem 264(24):14282-14289(1989)]。
Wang et al.,Oncogene 26:6061-6070(2007)表明FLNA的核定位与***癌中的激素依赖性相关。在雄激素依赖形式的疾病中，约90kDa的非磷酸化片段(IgFLNa-16-23)迁移至激素幼稚细胞的细胞核。相反，在激素难治性雄激素非依赖性***肿瘤细胞中，FLNA被磷酸化，防止其切割和核易位。这些作者和同事随后表明，***癌转移不仅与FLNA的细胞质定位相关，而且可以通过磷酸化蛋白的切割和随后的核易位来预防转移。[Bedolla etal.,Clin Cancer Res.15(3):788-796(2009).]
作为细胞骨架网络的关键调节剂，FLNA与参与癌症转移[Yue et al.,Cell&Biosci 3:7(2013)]以及许多其它病情的许多蛋白质相互作用。因此，Nakamura et al.,Cell Adh Migr.5(2):160-169(2011)讨论了有关FLNA的研究历史，并指出该蛋白质可作为90多种结合配偶体(包括通道、受体、细胞内信号分子和转录因子)的支架。
FLNA也与肿瘤进展有关。FLNA敲除小鼠显示K-Ras的致癌特性降低，包括ERK和Akt的下游激活。[Nallapalli et al.,Mol Cancer 11:50(2012).]与相应正常组织中较低水平的FLNA相反，许多不同的癌症显示高水平的FLNA表达，包括结直肠癌和胰腺癌[Uhlen etal.,Mol Cell Proteomics4:1920-1932(2005)]和胶质母细胞瘤[Sun et al.,CancerCell 9:287-300(2006)]。
FLNA表达的抑制使癌细胞对顺铂和放射敏感[Sun et al.,Cancer Cell9:287-300(2006)]，并且癌细胞中的FLNA缺陷同样使它们对化疗剂[Yue etal.,DNA Repair(Amst)11:192-200(2012)]和辐射[Yue et al.,Cancer Res69:7978-7985(2009)；Yuan etal.,J Biol Chem 276:48318-48324(2001)]敏感。另一方面，Jiang et al.,Int.J.Biol.Sci.9:67-77(2013)报道，抑制细丝蛋白A表达可减少植入有黑色素瘤和乳腺癌细胞的裸鼠中的转移。
磷酸化已被认为是细胞活动的全局调节剂，并且异常磷酸化与许多人类疾病(特别是癌症)有关。蛋白质的磷酸化涉及酶介导的一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的氨基酸侧链羟基被磷酸基团(-OPO3 -2)的替换。
磷酸化及其逆反应(去磷酸化)是通过两种关键酶类型的作用发生的。蛋白激酶通过将磷酸基团从三磷酸核苷酸(例如三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸鸟苷(GTP))转移到其靶蛋白来磷酸化蛋白质。这个过程通过蛋白磷酸酶的作用来平衡，蛋白磷酸酶随后可以去除磷酸基团。
因此，在特定时间与蛋白质结合的磷酸酯的量由特异于该蛋白质和经历磷酸化/去磷酸化的特定氨基酸残基的特定的一种或多种相关激酶和磷酸酶的相对活性决定。如果磷酸化蛋白质是一种酶，磷酸化和去磷酸化会影响其酶活性，本质上就像一个开关，以受控的方式打开和关闭它。磷酸化可以类似地通过促进与伴侣蛋白的结合来调节非酶促蛋白质-蛋白质相互作用。
蛋白质磷酸化可能在细胞内信号转导中起着至关重要的作用。构成信号通路的许多蛋白质都是激酶，从细胞表面的酪氨酸激酶受体到下游效应蛋白，其中许多是丝氨酸/苏氨酸激酶。
在正常细胞和患病细胞(例如癌细胞)中，FLNA在其蛋白质序列中的许多位置都被磷酸化。例如，酶PAK1(EC 2.7.11.1)是STE20家族的一种蛋白激酶，可调节细胞运动和形态。PAK1在位置2152处的FLNA磷酸化是PAK1-介导的肌动蛋白细胞骨架重组和PAK1-介导的膜扰动所必需的。[Vadlamudi et al.,Nat.Cell Biol.4:681-690(2002)；Woo et al.,MolCell Biol.24(7):3025-3035(2004).]细胞周期素Bl/Cdkl(EC:2.7.11.22；EC:2.7.11.23)在体外在FLNA依赖性肌动蛋白重塑中磷酸化丝氨酸1436。[Cukier et al.,FEBS Letters581(8):1661-1672(2007).]
人类FLNA的UniProtKB/Swiss-Prot数据库条目(No.P21333)列出了以下氨基酸残基位置在不同情况下被磷酸化的已发表报告：11、1081、1084、1089、1286、1338、1459、1533、1630、1734、2053、2152、2158、2284、2327、2336、2414和2510。此外，多克隆和单克隆抗体可从Abgent,Inc.(San Diego,CA)、Inc.(Beverly,MA)、Bioss,Inc.(Woburn,MA)和GeneTex,Inc.(Irvine,CA)中的一家或多家商购获得，它们与在丝氨酸-1083、酪氨酸-1046、丝氨酸-1458、丝氨酸-2152和丝氨酸-2522处磷酸化(磷酸-FLNA)的FLNA发生免疫反应。
可以定位到细胞核并与转录因子相互作用的90kDa FLNA片段包括可以磷酸化的丝氨酸-2152残基。然而，之前讨论的核定位约90kDa FLNA片段在丝氨酸-2152处没有磷酸化。事实上，已报道FLNA在丝氨酸-2152处的磷酸化(“pS2152”FLNA)可保护FLNA免受蛋白水解而形成约90kDa片段[Garcia et al.,Arch Biochem Biophys 446:140-150(2006)；Gorlin et al.,JCell Biol 111:1089-1105(1990)；和Chen et al.,J Biol Chem264(24):14282-14289(1989)]。
已经证明，α7-烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)发出的淀粉样蛋白-β42(Aβ42)毒性信号会导致tau磷酸化和与阿尔茨海默病相关的神经原纤维缠结的形成，需要招募支架蛋白FLNA以通过CD14激活TLR4。Wang etal.,J.Neurosci.32(29):9773-9784(2012年7月18日)。该论文还表明，PTI-125(simufilam)通过类似地减少FLNA与toll样受体4(TLR4)的关联并防止细胞因子释放来提供抗炎作用。
发明内容
支架蛋白FLNA通过参与通过α7nAChR的Aβ42信号传导被认为与阿尔茨海默病的发展有关，并且被认为是该过程中连接剂的FLNA的异常折叠形式是PTI-125(simufilam)的靶，PTI-125是FLNA的小分子拮抗剂，目前正在研究用于治疗AD。有趣的是，FLNA在血小板中也强烈表达，在血小板中其被认为可以调节正常的血小板功能，而FLNA的突变可导致血小板相关病症。血小板还表达功能性α7nAChR(Schedel et al.,ArteriosclThrom,Vas,31:928-934(2011.))。还有报道称，血小板可以将Aβ42运送到大脑(Catricala et al.,ImmunAgeing9:20(2012)。还已知FLNA在激活过程中在血小板中进行加工[Buitrago etal.,bioRxiv 307397]，并且这可以有助于创建异常折叠形式的FLNA，能够在血小板内和血小板裂解后的大脑中结合Aβ42和/或α7nAChR。
目前的研究未能产生基于FLNA的可行诊断测定。事实上，当前用于阿尔茨海默病的诊断方法通常需要通过侵入性外科手术获得的组织样本(例如用于尸检后确认)或脑脊液。本公开通过提供可用于诊断AD和其它tau蛋白病的新的基于血液的测定和方法，以及在用于神经认知障碍(例如阿尔茨海默病)的诊断、分期、治疗和评估治疗响应的方法中使用的基于新生物标志物(例如具有特定磷酸化特性的FLNA)或其片段与之相关的试剂盒和试剂，解决了与当前测定相关的这些和其它缺点。此外，本发明提供了用于开发针对tau蛋白病的新疗法或用于重新利用最初并非设计用于治疗神经认知障碍(如tau蛋白病)的现有疗法的新靶。
在第一个一般方面，本公开提供了生物标志物组，该生物标志物组包含从细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的体外消化获得的一种或多种磷酸化肽。在一些方面，FLNA包含在从疑似患有神经***疾病(例如阿尔茨海默病或其它tau蛋白病)的受试者采集的生物流体或组织样品内或从该生物流体或组织样品获得。为了简洁起见，给出了基于用蛋白酶胰蛋白酶、GluC和AspN消化的示例序列。技术人员将理解，用其它蛋白酶消化产生包含相同磷酸化残基的替代肽序列，并且所有此类替代物都涵盖在本说明书内。
在一些方面，磷酸化肽在SEQ ID NO:1的残基丝氨酸2152处被磷酸化。在一些方面，磷酸化肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列(即全长FLNA的片段)。在一些方面，生物标志物组可包含FLNA的多种磷酸化片段，例如两种或更多种磷酸化肽，每种包含FLNA的片段并具有SEQ ID NO:2-5中任一个的氨基酸序列，其中两种或更多种磷酸化肽中的至少一种在对应于SEQ ID NO:1(全长FLNA)的丝氨酸2152的位置处被磷酸化。
在一些方面，磷酸化肽在SEQ ID NO:1的残基丝氨酸2143处被磷酸化。在一些方面，磷酸化肽具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列(即全长FLNA的片段)。在一些方面，生物标志物组可以包含FLNA的多种磷酸化片段，例如两种或更多种磷酸化肽，每种包含FLNA的片段并具有SEQ ID NO:6-9的氨基酸序列，其中两种或更多种磷酸化肽中的至少一种在对应于SEQ ID NO:1(全长FLNA)的丝氨酸2143的位置处被磷酸化。
在一些方面，磷酸化肽在SEQ ID NO:1的残基丝氨酸2180处被磷酸化。在一些方面，磷酸化肽具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列(即全长FLNA的片段)。在一些方面，生物标志物组可以包含FLNA的多种磷酸化片段，例如两种或更多种磷酸化肽，每种包含FLNA的片段并具有SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列，其中两种或更多种磷酸化肽在对应于SEQ ID NO:1(全长FLNA)的残基丝氨酸2180的位置处被磷酸化。
在一些方面，磷酸化肽在SEQ ID NO:1的残基丝氨酸1459处被磷酸化。在一些方面，磷酸化肽具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列(即全长FLNA的片段)。在一些方面，生物标志物组可以包含FLNA的多种磷酸化片段，例如两种或更多种磷酸化肽，每种包含FLNA的片段并具有SEQ ID NO:13-15的氨基酸序列，其中两种或更多种磷酸化肽在对应于SEQ ID NO:1(全长FLNA)的残基丝氨酸1459的位置处被磷酸化。
在一些方面，生物标志物组包含多种磷酸化肽，其中每种磷酸化肽是FLNA(SEQ IDNO:1)的片段并且在对应于全长FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸1459、2143、2152和/或2180的位置处包含磷酸化位点。例如，生物标志物组可以包含多种磷酸化肽，每种具有SEQ ID No:2-15的序列并且在对应于全长FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸1459、2143、2152和/或2180的位置处被磷酸化。在一些方面，生物标志物组可以包含一种或多种磷酸化肽，其包含在两个或更多个以上确定的磷酸化位点处(例如在全长FLNA的丝氨酸1459、2143、2152和/或2180处)被磷酸化的全长FLNA的片段。
在一些方面，生物标志物组包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的磷酸化肽，每种在对应于全长FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸残基1459、2143、2152和/或2180的位点处被磷酸化。
在一些方面，生物标志物组进一步包含表4中列出的一种或多种肽，其可以使用蛋白酶或蛋白酶的组合从细丝蛋白A的体外消化获得，其中一种或多种肽中的每一种包含SEQID NO:1中存在的氨基酸序列。在一些方面，肽对于FLNA是蛋白型的(proteotypic)。
在第二个一般方面，本公开提供了生物标志物组，其包含：(i)使用蛋白酶或蛋白酶的组合从细丝蛋白A的体外消化获得的一种或多种肽，其中一种或多种肽中的每一种包含SEQ ID NO:1中存在的氨基酸序列；和(ii)从表1中列出的一种或多种(任选两种或更多种)蛋白质的体外消化获得的一种或多种肽。在一些方面，一种或多种肽从使用选自胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶中的一种蛋白酶或其组合进行体外消化而获得。在一些方面，表1中列出的细丝蛋白A和一种或多种蛋白质包含在从怀疑患有神经***疾病的受试者获得的生物流体或组织样品内。在一些方面，神经***疾病是阿尔茨海默病或另一种tau蛋白病。在一些方面，从细丝蛋白A的体外消化获得的一种或多种肽包含一个或多个磷酸化位点。在一些方面，一个或多个磷酸化位点对应于全长FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸残基2143、2152和/或2180。
在第三个一般性方面，本公开提供了生物标志物组，其包含：(i)使用蛋白酶或蛋白酶的组合从细丝蛋白A的体外消化获得的一种或多种肽，其中一种或多种肽中的每一种包含SEQ ID NO:1中存在的氨基酸序列；和(ii)从表2中列出的一种或多种(任选两种或更多种)蛋白质的体外消化获得的一种或多种肽。在一些方面，一种或多种肽从使用选自胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶中的一种蛋白酶或蛋白酶的组合进行体外消化而获得。在一些方面，细丝蛋白A和表2中列出的一种或多种蛋白质包含在从怀疑患有神经***疾病的受试者获得的生物流体或组织样品内。在一些方面，神经***疾病是阿尔茨海默病或另一种tau蛋白病。在一些方面，从细丝蛋白A的体外消化获得的一种或多种肽包含一个或多个磷酸化位点。在一些方面，一个或多个磷酸化位点对应于全长FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸残基2143、2152和/或2180。
在第四个一般性方面，本公开提供了生物标志物组，其包含：(i)使用蛋白酶或蛋白酶的组合从细丝蛋白A的体外消化获得的一种或多种肽，其中一种或多种肽中的每一种包含SEQ ID NO:1中存在的氨基酸序列；和(ii)从表3中列出的一种或多种(任选两种或更多种)蛋白质的体外消化获得的一种或多种肽。在一些方面，一种或多种肽从使用选自胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶中的一种蛋白酶或蛋白酶的组合进行的体外消化而获得。在一些方面，细丝蛋白A和表3中列出的一种或多种蛋白质包含在从怀疑患有神经***疾病的受试者获得的生物流体或组织样品内。在一些方面，神经***疾病是阿尔茨海默病或另一种tau蛋白病。在一些方面，从细丝蛋白A的体外消化获得的一种或多种肽包含一个或多个磷酸化位点。在一些方面，一个或多个磷酸化位点对应于全长FLNA(SEQ IDNO:1)的丝氨酸残基2143、2152和/或2180。
在第五个一般方面，本公开提供了生物标志物组，其包含：(i)使用蛋白酶或蛋白酶的组合从细丝蛋白A的体外消化获得的一种或多种肽，其中一种或多种肽中的每一种包含SEQ ID NO:1中存在的氨基酸序列；和(ii)从表1、2、3或4中列出的一种或多种(任选两种或更多种)蛋白质的体外消化获得的一种或多种肽。在一些方面，一种或多种肽从使用选自胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶中的一种蛋白酶或蛋白酶的组合进行的体外消化而获得。在一些方面，细丝蛋白A和表1中列出的一种或多种蛋白质包含在从怀疑患有神经***疾病的受试者获得的生物流体或组织样品中。在一些方面，神经***疾病是阿尔茨海默病或另一种tau蛋白病。
在第六个一般方面，本公开提供了生物标志物组，其包含：一种或多种合成肽，其中合成肽中的一种或多种富含H、C、N、O和/或S的重同位素。在一些方面，合成肽中的一种或多种包含存在于细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)中的氨基酸序列；或存在于表1、2、3或4中列出的蛋白质之一中的氨基酸序列。在一些方面，合成肽中的一种或多种包含对应于使用选自胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶中的一种蛋白酶或蛋白酶的组合从SEQ IDNO:1的体外消化或表1、2、3或4中列出的蛋白质之一的体外消化获得的肽的序列的氨基酸序列。
在第七个一般方面，本公开提供了一种用于诊断/预后神经障碍的方法，其包括：从受试者(任选地，怀疑患有神经障碍例如阿尔茨海默病的受试者)获得体液或组织样品；用一种或多种蛋白酶(例如胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶)消化体液或组织样品中的一种或多种蛋白质材料(例如蛋白质和/或多肽)；和使用质谱检测和/或测量由消化产生的一种或多种肽的水平。在一些方面，一种或多种肽中的每一种包含对应于从细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的体外消化或表1、2或3中列出的蛋白质之一的体外消化获得的肽的序列的氨基酸序列。
在第八个一般方面，本公开提供了一种用于监测神经障碍的进展的方法，其包括：(a)在第一时间点从受试者(任选地，怀疑患有神经障碍例如阿尔茨海默病的受试者)获得体液或组织样品；(b)用一种或多种蛋白酶(例如胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶)消化体液或组织样品中的一种或多种蛋白质；(c)使用质谱检测和/或测量由消化产生的一种或多种肽的水平；和(d)在第二时间点重复步骤(a)-(c)。在一些方面，该方法进一步包括步骤(e)：基于步骤(c)的一种或多种肽的检测水平和/或测量水平，确定给予受试者的治疗性治疗对治疗神经障碍是否有效。在一些方面，一种或多种肽中的每一种包含对应于从细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的体外消化或表1、2或3中列出的蛋白质之一的体外消化获得的肽的序列的氨基酸序列。
在第九个一般方面，本公开提供了一种用于诊断或监测神经障碍(例如阿尔茨海默病或另一种tau蛋白病)的进展的方法，其包括：从受试者获得体液或组织样品；用一种或多种蛋白酶(例如胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶)消化体液或组织样品中的一种或多种蛋白质；和测量由细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的消化产生的一种或多种磷酸化肽片段中任一个的水平。在一些方面，一种或多种片段在对应于细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2152和/或2143的位置处包含磷酸化丝氨酸。
在一些方面，该方法进一步包括确定两种或更多种以上肽片段的比率。在一些方面，该比率包括在对应于细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2143的位置处磷酸化的片段与在对应于细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2152的位置处磷酸化的片段的比率。在一些方面，使用各自包含SEQ ID NO:2-9的序列的两种或更多种肽来确定该比率。在一些方面，该比率包括在对应于细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2143的位置处磷酸化的片段与在对应于细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2152的位置处磷酸化的片段的比率；其中<5的比率表明该受试者没有患有阿尔茨海默病并且>10的比率表明该受试者患有阿尔茨海默病。
在第十个一般方面，本公开提供了一种用于诊断或监测神经障碍(例如阿尔茨海默病或另一种tau蛋白病)的进展的方法，其包括：从受试者获得体液或组织样品；用一种或多种蛋白酶(例如胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶)消化体液或组织样品中的一种或多种蛋白质；和测量由细丝蛋白A(SEQ ID NO:1)的消化产生的一种或多种磷酸化肽以及衍生自整联蛋白α-IIb、整联蛋白β-3和/或用于活化T-细胞家族成员1的接头的一种或多种肽中任何一种的水平，其中整联蛋白α-IIb、整联蛋白β-3和/或用于活化T-细胞家族成员1的接头的存在表明离体或人工血小板活化。
附图说明
图1显示了TMTcalibratorTM质谱分析工作流程的示意图。耗尽Top 14种丰度蛋白质后，对血浆样品进行消化并用TMTproTM试剂进行标记。与此同时，也将脑裂解物消化并用TMTproTM试剂标记。然后将血浆和脑裂解物消化物混合，并通过串联质谱(LC-MS/MS)对一小等分进行分析以获得总蛋白表达。从剩余混合物中富集磷酸肽级分并通过LC-MS/MS进行分析。数据分析基于TMTproTM报告离子和用于识别AD和对照样品中显示差异表达的特征的线性模型确定了肽序列和相对丰度。
图2显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中FLNA表达谱的直方图。值表达为相对于参考脑裂解物通道的log2比率。
图3显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2152处磷酸化的胰蛋白酶肽APsVANVGSHCDLSLK的表达谱的直方图。值表达为同位素校正的TMTproTM报告离子强度。
图4显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2152处磷酸化的胰蛋白酶肽RAPsVANVGSHCDLSLK的表达谱的直方图。值表达为同位素校正的TMTproTM报告离子强度。
图5显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2143处磷酸化的胰蛋白酶肽VKEsITR的表达谱的直方图。值表达为同位素校正的TMTproTM报告离子强度。
图6显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2180处磷酸化的胰蛋白酶肽IPEISIQDMTAQVTsPSGK的表达谱的直方图。值表达为同位素校正的TMTproTM报告离子强度。
图7，在如图7A、7B、7C和7D所示的四个部分中，显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中代表四种FLNA磷酸肽RAPsVANVGSHCDLSLK(SEQ ID NO:3；图7A)、IPEISIQDMTAQVTsPSGK(SEQ ID NO:10；图7B)、VKEsITR(SEQ ID NO:6；图7C)和CSGPGLsPGMVR(SEQ ID NO:13；图7D)的相对表达的四个箱须图。显示的值是相对于参考脑裂解物通道的log2比率。
图8，在如图8A、8B和8C所示的三个部分中，显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中相对于脑裂解物通道的log2转化的磷酸肽表达水平的热图。受调节的磷酸肽的亲代基因名称显示在每个图中图的右侧。图8A显示了AD病例与老年对照相比的调节磷酸肽。图8B显示了AD病例与年轻对照相比的调节磷酸肽。图8C显示了AD病例与所有对照相比的调节磷酸肽。
图9，在如图9A、9B和9C所示的三个部分中，提供了显示在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中，在FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2143处磷酸化的胰蛋白酶肽VKE[p]sITR(图9A)、在FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2152处磷酸化的胰蛋白酶肽RAP[p]sVANVGSHCDLSLK(图9B)以及在FLNA(SEQ ID NO:1)的丝氨酸2152处磷酸化的胰蛋白酶肽AP[p]sVANVGSHCDLSLK(SEQ ID NO:138)(图9C)的表达谱的直方图。值表达为同位素校正的TMTproTM报告离子强度。
图10，在如图10A、10B、10C和10D所示的四个部分中，显示了在上制备的6个AD血浆样品和在EDTA管中收集的6个血浆样品中，代表四种FLNA磷酸肽AP[p]sVANVGSHCDLSLK(SEQ ID NO:1；图10A)、RAP[p]sVANVGSHCDLSLK(SEQID NO:3；图10B)、rL[p]tVSSLQESGLk(SEQ ID NO:186；图10C)和CSGPGL[p]sPGMVR(SEQ IDNO:13；图10D)的相对表达的四个箱须图。显示的值是相对于参考脑裂解物通道的log2比率。
具体实施方式
为了解释本说明书的目的，除非另有说明，否则将应用以下定义和缩写，并且只要适当，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。
术语“生物标志物”包括所鉴定的蛋白质的所有生物学相关形式，包括翻译后修饰。例如，生物标志物可以以糖基化、磷酸化、多聚化、片段化或前体形式存在。生物标志物片段可以是天然存在的或例如酶促产生的并且仍然保留完整蛋白质的生物活性功能。片段的长度通常为至少约10个氨基酸，通常至少约50个氨基酸，并且长度可以长达300个氨基酸或更长。
本文使用的术语“规范序列”是指直系同源物种中最普遍的序列和/或最相似的序列。特别地，除非另有说明，本文中的规范序列是指人类序列。
本文公开的肽序列使用IUPAC单字母代码表示。使用小写字母表示如下修饰：“c”-脲甲基化胱氨酸；“m”-氧化蛋氨酸；“n”-脱酰胺天冬酰胺；“q”-脱酰胺谷氨酰胺；且“k”-TMT标记的赖氨酸。N末端的小写字母代表TMT修饰的氨基酸。另外，符号“[p]”用于表示后续氨基酸上的磷酸化，例如“[p]s”表示磷酸化的丝氨酸；“[p]t”表示磷酸化的苏氨酸；且“[p]y”表示磷酸化的酪氨酸。
术语“KEGG通路”是指手工绘制的通路图的集合，代表新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、有机体***、人类疾病和药物开发的分子相互作用和反应网络。“KEGG通路映射”是将分子数据集(特别是基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的大规模数据集)映射到KEGG通路图的过程，用于对更高层次的***功能进行生物学解释；(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。
术语“浓度或量”是指样品中生物标志物的相对浓度或量，例如通过LC-MS/MS无标记定量方法(例如曲线下面积和光谱计数)确定。
术语“比较”或“比较”或其语法等同物是指测量样品中生物标志物相对于其它样品(例如存储在专有或公共数据库中的蛋白质浓度或量)的相对浓度或量。
术语“参考浓度或量”是指但不限于存储在专有或公共数据库中的蛋白质浓度或量。“参考浓度或量”可以从对患者的大量筛选中获得，或者通过参考此类确定与对照患者中临床信息之间的已知或先前确定的相关性来获得。例如，可以通过与对照受试者(例如与受试者年龄和性别相似的健康人(即没有痴呆症))中生物标志物的浓度或量进行比较来确定参考值。或者，参考值是可以在文献中找到的值，例如ApoE 24等位基因的存在，其中在位置112和158处突变的存在或不存在代表参考要与CSF中总tau(T-tau)>350ng/L、磷酸-tau(P-tau)>80ng/L和A～42<530ng/L的水平进行比较或同该水平(Hansson et al.,LancetNeural.5(3):228-234(2006))。另外，参考值可以在测试时间点时间之前的一个或多个时间点从同一受试者获得。这种较早的样品可以在测试时间点的日期之前一周或更长、一个月或更长、三个月或更长、最优选六个月或更长采集。在一些实施方式中，可以纵向方式比较多个较早的样品，并且生物标志物表达(如果有的话)的变化斜率可以计算为认知变化的相关性，例如通常注意到的下降。
术语“对照”或如本文使用的“非AD对照”或“非AD受试者”是指取自人类或非人类受试者的组织样品或体液样品，该人类或非人类受试者认知正常或被诊断患有或呈现认知异常的症状，但根据现有生化测试定义为非AD受试者。
术语“选择的反应监测”、“SRM”和“MRM”是指质谱测定，其中代表已知生物标志物的已知质荷比的前体离子优先被靶向用于在离子阱或三重四极杆质谱仪中通过串联质谱进行分析。在质谱分析期间，母离子被破碎，并且对第二预定质荷比的选定子离子的数量进行计数。通常，该方法中包括具有预定数量的稳定同位素替换但在其它方面化学上与目标离子相同的等效前体离子，以充当定量内标。
术语“平行反应监测”和“PRM”是指质谱测定，其中代表已知生物标志物的已知质荷比的前体离子优先被靶向用于在OrbitrapTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中通过串联质谱进行分析。在分析过程中，母离子被破碎，并且对每个子离子的数量进行计数。通常，该方法中包括具有预定数量的稳定同位素替换但在其它方面化学上与目标离子相同的等效前体离子，以充当定量内标。
术语“蛋白型”是指独特地代表其所源自的蛋白质的肽，使得除了来自同一基因的其它表达亚型或剪接变体外，肽中氨基酸残基的序列在来自同一物种的任何其它蛋白质中都不存在。
术语“磷酸肽”是指含有至少一个通过添加磷酸基团修饰的氨基酸的肽。
术语“分离的”或其语法等同物在整个说明书中意指蛋白质、肽、抗体、多核苷酸或化学分子视情况可以存在于与其在自然界中可能存在的物理环境不同的物理环境中。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。
术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、啮齿动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”或其语法等同物包括治疗性治疗、预防性治疗和其中降低受试者发生病症或其它危险因素的风险的应用。治疗不需要完全治愈病症，而是涵盖减轻症状或潜在的风险因素。
本文所使用的术语“诊断”或其语法等同物包括提供关于患者中病症的存在或不存在或缺乏或可能性的任何信息。它还包括提供有关病症的类型或分类或与该疾病相关或与该疾病相关可能经历的症状的类型或分类的信息。例如，这可以包括病症严重程度的诊断。术语“诊断”涵盖病症的医学病程的预后，例如其持续时间、严重程度以及从轻度认知障碍(MCI)发展为AD或其它痴呆的病程。
如本文所用，术语“分期”或其语法等同物意指在受试者中鉴定神经认知障碍(特别是AD)的阶段。例如，AD的特征为3个阶段或7个阶段，取决于所使用的诊断框架。全球痴呆量表就是这样一种衡量全局功能的指标。它是通过根据一组标准化的严重性标准评估严重性(包括认知和功能)来衡量的。
术语“功效”表示给定干预(例如药物、医疗器械、外科手术等)带来有益改变的能力。如果建立功效，则该干预可能至少与已进行比较的其它可用干预一样好。术语“功效”和“有效性”在本文中可互换使用。
术语“包括”指示受试者包括列出的所有要素，但可以可选地还包括附加的未提及的要素。
本文使用的术语“和/或”应被视为具有公开了在存在或不存在另一个的情况下两个指定特征或组分中的每一个。例如，“A和/或B”应被视为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中每一个，就像每一个在本文中单独阐述一样。
除非上下文另有规定，否则上文阐述的特征/术语的定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且同样适用于本文描述的所有方面和实施方式。
在本说明书的上下文中，以下缩写应理解如下：CSF(脑脊液)；LBD(路易体痴呆)；FTD(额颞型痴呆)；VaD(血管性痴呆)；ALS(肌萎缩侧索硬化症)；CJD(克雅氏病)；CNS(中枢神经***)； TEAB(四乙基碳酸氢铵)；TFA(三氟乙酸)；SDS(十二烷基硫酸钠)；TCEP(三(2-羧乙基)膦)；ACN(乙腈)；Da(道尔顿)；HPLC(高效液相色谱)；FA(甲酸)；LC-MS/MS(液相色谱串联质谱检测)；MS(质谱)；MS/MS或MS2(串联MS)；MS/MS/MS或MS3(三重MS)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；SCX(强阳离子交换)；ppm(份每百万)；TiO2(二氧化钛)；IMAC(铁金属亲和色谱)。
在AD发病机制中，淀粉样蛋白-β肽(Aβ)的积累与调节tau磷酸化的信号通路相互作用。tau的过度磷酸化会破坏其调节轴突运输的正常功能，并且导致神经原纤维缠结和可溶性tau的有毒物种的积累。目前AD无法治愈。
批准的AD治疗很少且功效有限，主要用于减缓或延迟进展。由于缺乏有效的诊断、预后和预测性生物标志物以及缺乏用于设计新疗法的新靶，用于治疗AD和其它tau蛋白病的新疗法的鉴定和开发也受到很大影响。目前，AD只能通过脑活检或患者死亡后的尸检来明确诊断。显然，在临床环境中，很少进行脑活检，并且诊断仍然主要基于症状史进行，并依赖于一系列神经学、心理测量和生化测试。
这些后面的测试包括ApoE e4等位基因状态的评估以及脑脊液中淀粉样蛋白β、tau和磷酸-tau的测量。然而，这些现有方法不仅对于AD和其它tau蛋白病的早期诊断仍然不能令人满意，而且对于预测神经***疾病的进展仍然不能令人满意，而预测神经***疾病的进展对于招募患者进行临床试验、设计新疗法和预测当前和新疗法的有效性是重要的。因此，本公开提供了新的基于血液的测定和方法，其可用于诊断AD和其它tau蛋白病以及监测或预测这些疾病的进展(例如用于指导治疗决策)。
理想的诊断生物标志物应该对疾病与非疾病具有高特异性，并且对区分疾病类型和阶段具有高敏感性。预后生物标志物应反映病理变化的强度和严重性，并预测从疾病的非常早期阶段(在观察到变性之前)直到疾病的晚期阶段的其未来病程。药效学生物标志物应基于容易获得的体液(例如血液、包括血小板的血液产品、血清和最优选血浆和CSF)中疾病相关蛋白质水平的变化，给出给予的疗法是否有效的可靠指示。还期望此类药效学生物标志物可以为临床医生提供何时停止治疗或切换到不同的疗法的指导。
新靶需要是有效的、安全的、满足临床和商业需求，并且最重要的是“可成药”。“可成药”靶可接近推定的药物分子，无论是小分子还是较大的生物制品，并且一旦结合，就会引发可在体外和体内测量的生物响应。换句话说，它的抑制或激活导致疾病状态下的治疗效果。因此，仍然需要能够在诊断、分期、预后监测和评估患有阿尔茨海默病和其它tau蛋白病的患者的治疗效果中作为生物标志物以优异的灵敏度和/或特异性进行的蛋白质和/或肽，并且其可以用作用于开发新疗法的新靶。
细丝蛋白A(FLNA)是一种广泛表达的肌动蛋白结合蛋白，其调节细胞形态并且特别地在诸如神经元等结构化细胞中表达，尽管在诸如肺、肾和肌肉等其它器官中表达水平通常较高(Human Protein Atlas)。FLNA在体内可在多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基处被磷酸化，并且约280kDa的亲本蛋白被加工以形成约110kDa和90kDa的片段。此前已经证明，FLNA的所有三种主要亚型可在丝氨酸2152处被磷酸化，并且使用pS2152特异性抗体进行蛋白质印迹中的染色的相对强度可将阿尔茨海默病(AD)患者与认知正常对照区分开来。
通过蛋白水解切割和磷酸化对FLNA进行修饰被认为促进大脑中蛋白质结构和/或构象的变化。其它尚未确定的疾病特异性因素也可使FLNA具有改变的构象。具有改变构象的FLNA被认为在Aβ寡聚物的毒性信号传导机制中发挥作用。在阿尔茨海默病患者中，改变的FLNA独立地与α7-烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)和toll样受体4(TLR4)相互作用。据报道，通过α7nAChR的信号传导使tau过度磷酸化，并且通过TLR4的信号传导则被报道为诱发神经炎症。
此外，FLNA是肌动蛋白细胞骨架的调节剂，对突触功能很重要，这表明FLNA可能导致认知功能障碍的另一种机制。因此，改变的FLNA代表了新的AD疗法的一个有希望的靶，并且是simufilam(PTI-125)的靶，simufilam(PTI-125)是一种小分子结构调节剂，其可减轻或预防改变的FLNA的病理效应。
使用pS2152特异性抗体诊断AD的用途尚未得到验证。在某种程度上，这可能是由于抗体可能与未磷酸化的蛋白质结合引起的，或者可能反映了人群中磷酸化缺乏一致性。除了在蛋白质印迹中使用pS2152抗体(其中可以基于它们的分子量容易地区分各个亚型)之外，在液相测定(例如ELISA)中区分FLNA亚型(其中每个亚型中都存在pS2152表位)的能力仍然是一个挑战。此外，FLNA的广泛表达，尤其是在血小板中发现的表达，使外周液体的测量容易出现潜在的假阳性。迄今为止，尚未证明测量特定FLNA亚型或磷酸化可以可靠地用于AD诊断。
鉴于使用抗体进行FLNA分析的局限性，本公开提供了一种更特异性的自下而上质谱分析方法来分析患者血浆中FLNA衍生的胰蛋白酶肽的分布，特别关注特异性磷酸化事件的测量。具体地，在一些方面，本公开提供了使用TMTcalibratorTM方法的测定(美国专利号10,976,321；[Russel et al.,Rapid Commun.Mass Spectrom.31:153-159(2017)]，其中将AD脑组织裂解物的同量异位标记的(isobarically-labelled)消化物与类似标记的血浆样品混合，并且其中脑裂解物消化物以不同浓度存在，并且它们的总量相对于来自血浆通道的消化物的总浓度过量。通过这种安排，脑裂解物中高浓度的疾病相关蛋白可充当血浆中存在的相同蛋白的增强剂，即使这些蛋白的浓度通常低于自下而上质谱所需的浓度。使用这种方法极大地增强了测量衍生自FLNA的肽的能力，并且还允许分析在AD大脑和血浆中常见表达的更广泛的蛋白质组。
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实施例
应当理解的是，上述实施方式和以下实施例是为了说明而不是限制而给出的。从本说明书本领域技术人员将清楚在本发明范围内的各种变化和修改。
实施例1：制备的阿尔茨海默病血浆和EDTA对照血浆的TMTcalibratorTM分析
样品
将来自6名对照(3名老年对照、3名认知完好的年轻人)的人血浆样品抽取到含有K2EDTA的管(Becton，Dickinson and Company Franklin Lakes，NJ)中。[使用对pS2152特异的磷酸特异性兔多克隆抗体(Origene TA313881，Origene TechnologiesRockville，MD)通过蛋白质印迹法显示的，来自对照的血浆的90kDa FLNA生物标志物呈阴性(-)]。抽取后30分钟内，将血液以约1000X G离心血液15分钟，优选在4-5℃下进行。离心后30分钟内，收集血浆。然后，将对照血浆与5％体积/体积的20X蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物组合并添加，通过涡旋1分钟彻底混合并等分。通过将IX Roche PhosStop EASYpak与IX Roche完整片剂不含EDTA的迷你EASYpack(Thomas Scientific，Swedesboro，NJ)一起溶解到500ml蒸馏水中来制备蛋白酶-磷酸盐抑制剂混合物。将来自6名AD患者的人血浆样品抽吸到/>管中并运送到实验室进行处理。使用对pS2152特异的磷酸特异性兔多克隆抗体(Origene TA313881，Origene Technologies Rockville，MD)通过蛋白质印迹法显示，来自AD患者的人血浆的90kDa FLNA生物标志物呈阳性(+)。在实验室，将来自管中的4ml全血分层到14ml一次性管中的4ml/>(Sigma-Aldrich)。将一次性管在室温下在400g下离心30分钟，然后将血浆转移至1.5ml Eppendorf管中保存，并且添加5％体积/体积的20X蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，通过涡旋1分钟充分混合并等分用于生物标志物测定。将等分试样储存于-80摄氏度下。3份死后AD脑(BraakIV-VI期)裂解物的等分试样由Proteome Sciences提供并且用作源自脑的蛋白质的触发样品。
分析方法
对于本实验，使用12个AD血浆样品并以AD脑组织用作触发样品进行TMTcalibratorTM磷酸化蛋白质组分析(图1)。使用Top14 Abundant Protein Depletion离心柱去除血浆样品的高丰度蛋白质。使用胰蛋白酶消化蛋白质并用TMTproTM标记肽，并混合生成一份TMTproTM16-plex样品(试剂从Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA可获得)。将四个TMTproTM通道用于AD脑组织触发。
将TMTproTM16-plex样品分成用于总蛋白质组分析(非富集的)的等分试样和用于磷酸蛋白质组分析(磷酸肽富集的)的等份试样。磷酸肽富集后，生成了6个磷酸肽富集级分和6个非富集级分。使用高性能Orbitrap FusionTMTribridTM质谱仪(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)使用数据依赖性采集方法(对于非富集级分，使用FLNA肽的包含列表)对每个级分进行LC-MS2分析。使用Proteome DiscovererTMv2.5(Thermo FisherScientific)搜索原始数据。使用专有的生物信息学管道进一步处理数据，包括过滤、标准化、生物统计、注释和功能分析。还生成了目的蛋白质的箱线图。
样品管理
收到后，对所有样品进行目视检查，以评估是否存在解冻、标签是否正确以及总体完整性。将样品储存于-80℃下。详细信息以唯一的参考号输入实验室信息管理***(LIMS)。
脑裂解
来自汇集的AD脑组织裂解物的可用蛋白质被用作校准剂/触发脑样品。
蛋白质浓度测量和SDS-PAGE
通过Bradford蛋白质测定确定血浆、耗尽的血浆和脑裂解物样品的蛋白质浓度，并且通过考马斯染色(Imperial Stain，Pierce，Thermo Fisher Scientific)SDS-PAGE 4-20％梯度凝胶(Criterion，Biorad)使每个样品可视化。
蛋白质耗尽
使用HighSelect Top14 Abundant Protein Depletion(Pierce，Thermo FisherScientific)基于制造商的协议对35μL血浆耗尽。对于多个样品，35μl的多个等分试样各自被耗尽以获得足够的量(表S2)。
消化和TMTpro标记
校准剂/触发脑样品：将6.6mg合并的脑裂解液还原(二硫苏糖醇)、烷基化(碘乙酰胺)、消化(胰蛋白酶)以生成肽，脱盐(tC18柱，Waters Corp.,Milford，MA，USA)，等分成4部分，每部分反映1:4:6:10的比例，并冻干至干燥。
分析耗尽的血浆样品：使用180μg每个单独的耗尽血浆样品。将耗尽的血浆样品调至等体积。将样品还原、烷基化并用胰蛋白酶消化以生成肽，并在脱盐(tC18柱)后将样品冻干至干燥。
将干肽(来自耗尽的血浆和脑样品)溶解在TEAB/ACN缓冲液中。将肽与它们各自的TMTproTM试剂混合(标记方案在表2中示出)。用羟胺处理TMTproTM标记的样品，合并标记的消化物以生成TMTproTM16-plex样品，其含有12种耗尽的血浆分析样品(12x 180μg＝2160μg)+合并的脑消化物混合物(4个通道中约3780μg，比例为1:4:6:10，蛋白质质量比为1:1.75)。通过固相萃取纯化50μg混合物，用于评估标记效率和报告离子分布(等摩尔检查)。取出两份，每份100μg，作为非富集臂的碱性反向分级(basic-reversed fractionation)分离样品(包括备用样品)，并取出约5,690μg部分用于磷酸肽富集。
磷酸肽富集
将约5,690μg的TMTproTM16-plex样品在两根High SelectTMFe-NTA磷酸肽富集试剂盒(Thermo Scientific Pierce，目录号A32992)柱上根据制造商的说明进行磷酸肽富集，并且合并产生一份合并的磷酸肽样品。
碱性反相分级(bRP)
取A)100μg非富集样品和B)富集的磷酸肽对TMTproTM16plex进行bRP分级。此处，根据制造商的说明，使用Thermo ScientificTMPierceTM高pH反相肽分级试剂盒(目录号84868)。
液相色谱质谱(LC-MS/MS)
使用与Orbitrap FusionTM TribridTM质谱仪耦合的EASYnLC-1000***(均来自Thermo Scientific)，通过LC-MS/MS对每个单独的级分(每个16-plex，6个磷酸肽富集的级分和6个非富集级分)进行分析。将肽重新悬浮于含有0.1％甲酸(FA)的2％乙腈(ACN)中。从恒温自动进样器，将样品(约5％的非富集级分和约25％的磷酸肽富集级分)加载到2cm的75μm内径(ID)C18 Acclaim PepMap 100捕获柱(Thermo Scientific，PN 164946)上，并且使用0.1％FA中梯度递增的ACN以流速200nL/min，通过50cm的75μm ID EasySpray分析柱(Thermo Scientific，PN ES803A)进行解析。非富集级分的梯度起始条件为8％CAN以及磷酸富集级分的梯度起始条件为10％ACN。有机溶剂的百分比不断增加至最大30％ACN。
在整个色谱运行(180分钟)中获取肽质谱。质谱仪以数据依赖模式运行，以120.000分辨率进行全扫描，并以50.000分辨率采集MS2片段扫描。占空比设置为3秒，这意味着至少每3秒采集一次完整扫描，然后对从最丰富的目标中挑选的碎片前体进行MS2扫描。在被破碎一次后，前体从另外的破碎排除30秒。
计算质谱法
总共，使用SEQUEST HT搜索算法在Proteome Discoverer(PD)v2.5(ThermoScientific)中搜索了12个单独的原始质谱数据文件(12个级分-6个富集的&6个非富集的)。原始光谱是相对于uniprot审查的人类数据库(2021年1月版本)进行搜索的，具有完整的胰蛋白酶特异性和至多两个遗漏的切割。以半胰蛋白酶特异性再次搜索所有未以高置信度匹配的肽的光谱，以考虑潜在的裂解产物。半胰蛋白酶搜索后仍然不匹配的光谱再次以没有切割特异性进行搜索。将N末端和赖氨酸残基的TMTproTM修饰以及半胱氨酸的脲甲基化设置为静态修饰；将蛋氨酸的氧化视为是可变修饰。仅在磷酸肽富集级分的搜索中将丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化设置为可变修饰。
将前体质量容差设置为20ppm，而碎片质量容差设置为0.02Da。ProteomeDiscoverer中包含的Percolator节点将PSM级别的错误发现率控制在1％。设置报告离子定量器节点以提取TMTproTM16plex单同位素离子(126、127N、127C、128N、128C、129N、129C、130N、130C、131N、131C、132N、132C、133N、133C、134N)的原始强度值。所有原始报告离子强度值均导出到制表符分隔的文本文件中，以进行进一步处理和生物信息分析。
生物信息学数据分析
使用以R统计编程语言(R Core Team 2017)编写的内部开发软件进行统计分析。所有数据集成工具都是为了处理标记的MS数据而开发的，并包括用于处理隔离干扰[Savitski,M.,et al.“Measuring and managing ratio compression for accurateiTRAQ/TMT quantification.”J.Proteome Research 12.8(2013):3586-3598]、同位素串扰[Rauniyar,N.,et al.“Isobaric labeling-based relative quantification inshotgun proteomics.”J.Proteome Research 13.12(2014):5293-5309]、PSM标准化和总结为肽的功能。
统计分析
统计分析是使用内部软件进行的，并基于线性模型。[T.,Tibshirani,etal.,TheElements of Statistical Learning:Data Mining,Inference,and Prediction(Vol.2,pp.1-758).New York:Springer(2009).]对于特征选择，选择了经过调整的t统计法[Ritchie,M.,et al.“Limma Powers Differential Expression Analyses for RNA-sequencing and Microarray Studies.”Nucleic Acids Research 43.7(2015):e47-e47；Phipson,B.,et al.“Robust Hyperparameter Estimation Protects AgainstHypervariable Genes and Improves Power to Detect Differential Expression.”Annals of Applied Statistics 10.2(2016):946.)]，它有效地从特征集合中借用信息来帮助推断每个单独的特征，并且对于小数据集是有用的。
对3种不同的对比进行分析：对比1＝AD与对照(老年)；对比2＝AD与对照(年轻)；对比3＝AD与对照(全部)。对于每个对比，提供了倍数变化、p值和调整后的p值(使用Benjamini-Hochberg FDR计算)。LIMMA p值基于经过调整的t统计学(Ritchie,Phipson)，并且是跨所有特征借用信息以克服样品量小问题的结果。使用Benjamini-Hochberg程序应用多次测试校正。
样品评估
通过改进的Bradford测定进行的蛋白质确定显示，血浆样品的蛋白质浓度在41.9至73.6μg/μl之间(平均值：约59μg/μl)。AD样品显示出的平均蛋白质浓度低于对照(48.7相对于68.5μg/μl)。所有血浆样品的SDS-PAGE显示出非常均匀的条带图案。血浆样品显示蛋白质浓度在预期范围内，并且不存在关于样品质量的问题。脑组织碎片的裂解为研究提供了足够的蛋白质。三种脑裂解物的SDS-PAGE显示出可接受的条带模式。
血浆耗尽
在12个血浆样品的Top 14耗尽后，可用的总蛋白质量为189至354μg。Top 14耗尽的血浆样品的SDS-PAGE显示出均匀的条带图案。视觉评估证实了典型的耗尽后模式，例如白蛋白条带明显减少。实现了约95％的耗尽。
TMTpro T M分析质量控制
TMTproTM16plex实验的TMTproTM标记反应效率的分析表明，～98.2％的N-末端氨基被标记，这表明标记基本完成。分级样品的所有质谱分析均通过了基于总离子色谱图(TIC)最大强度、MS扫描次数和肽谱匹配(PSM)数量的内部质量评估。
度量：量化的肽和蛋白质
我们报告了39,686个肽序列以及所有12个患者来源样品的表达值(表3)。其中，9,337个被磷酸化并与6,047个不同的可靠定位的磷酸位点的组合相关。这39,686个肽与4,192个不同的蛋白质组相关，并在所有12个样品中进行了量化。总体而言，TMTcalibratorTM磷酸蛋白质组工作流程在人血浆上的应用提供了血浆蛋白质组和磷酸蛋白质组的出色覆盖。
表5.检测的和量化的特征数量
在表5中，肽行代表非磷酸化肽和磷酸化肽，后者描述于后续行中(斜体)。请注意，量化的特征允许一定数量的缺失值，这些值是在数据预处理期间估算的。
特征选择：磷酸肽
我们发现了与对照相比AD组中磷酸肽的强烈上调，其中许多磷酸肽与表达变化超过6倍相关。在应用的阈值下，没有检测到显著下调的磷酸肽。
最高度调节的磷酸肽是来自连接粘附分子A(F11R，也称为JAM-1)的肽kVIYSQP[p]sAR(logFC:6.6，对比#1)，其在丝氨酸284上含有修饰。下一个最高度调节的磷酸肽是来自细胞膜穴样内陷相关蛋白2(CAVIN2，也称为SDPR)的kVD[p]sLkk(logFC:6.5，对比#1)，其在丝氨酸241上被修饰。第三最高度调节的磷酸肽是vkE[p]sITR(logFC:6.4，对比#1)-在细丝蛋白A(FLNA)和细丝蛋白-B(FLNB)之间共享的序列，并在丝氨酸2143(FLNA)和丝氨酸2098(FLNB)上被修饰。
观察量化的四个FLNA磷酸肽特征(图7)，与总对照组相比，AD中磷酸化的FLNA似乎更加丰富。然而，年轻和老年对照之间的表达存在一些差异。含有pS2152的“RAPSVAN”肽在AD和年轻对照中的水平相似，但在认知健康的老年对照中水平低得多。相反，含有pS1459的肽“CSGPG”在AD和老年对照中较高，而在年轻对照中则低得多。
我们还进行了事后分析以确定通过它们表达变化的显著性选择的磷酸肽是否可以解释实验类别之间的差异(图8)。对于所有比较，选定的磷酸肽能够成功区分AD组和对照组，这表明它们的组间表达差异占数据集中总方差的约95％(PC1)。基于这些结果，这组肽与两个对照组之间的显著差异(PC2<2％)无关。这些结果反映在热图中，其中对照组在样品簇类树状图上混合(图4)，而AD组形成清晰的子簇，具有显著更高的表达值。
特征选择：蛋白质
所有对比都显示与对照组相比疾病组的蛋白质强烈上调，其中许多蛋白质与表达变化超过4倍相关。在应用的阈值下，仅检测到两种显著下调的蛋白质。
在所有三个对比中，我们观察到蛋白质之间具有良好的一致性，无论是在其特性还是倍数变化幅度方面。最高度调节的蛋白质是桥接整合子2(BIN2)(logFC:4.5，对比#1)。下一个最高度调节的蛋白质是整合素α-IIb(ITGA2B)(logFC:4.5，对比#1)。第三个最高度调节的蛋白质是蛋白质S100-A12(S100A12)(logFC:3.6，对比#1)。在前面描述的三个高度调节的磷酸肽中，相应的总蛋白表达(FLNA和CAVIN2)与疾病样品中显著增加的水平(FLNAlogFC:1.8，对比#1；CAVIN2 logFC:1.9，对比#1)相关。
仔细观察三个观察的样品组之间目的蛋白质FLNA的表达谱(图2)，显示了蛋白质水平上的趋势与之前在磷酸肽水平上观察到的趋势相同：相对于对照，AD组中的FLNA表达更高。两个对照组本身的比较显示出相似的表达，与老年对照组相比，年轻认知完整组的平均值稍高。
FLNA覆盖的总结
在蛋白质和磷酸肽水平上成功检测到细丝蛋白A(FLNA)，并且在AD患者与老年和年轻对照的比较中发现细丝蛋白A受到显著调节。在胰蛋白酶肽的标准搜索中，通过来自46个肽(不包括磷酸肽)的85个PSM(表6)对蛋白质本身进行定量。在5种检测的磷酸肽中，4种可以在所有个体中进行定量(例如参见表7)。磷酸肽aP[p]sVANVGSHcDLSLk没有为对照样品提供足够数量的数据点，因为这些数据点的信号低于可检测范围。然而，当绘制相应肽光谱匹配的报告离子强度值时，很明显，该肽在AD样品中被很好地检测到，这与对照相反，与为覆盖蛋白质中相同磷酸化位点(S2152)的肽RAP[p]sVANVGSHcDLSLk生成的数据一致(图9)。
表6.FLNA的定量肽(非磷酸化的)。
表7.靶蛋白FLNA的磷酸肽。
已确定靶蛋白FLNA的磷酸位点的磷酸肽概述。位置不明确并且置信度得分低于设定阈值(75％)的位点位置由“？”字符指示。尽管FLNA肽的强烈调节令人鼓舞，但由于AD和对照血浆样品的制备方法不同，存在因采集后伪影(例如血小板活化)而产生信号的风险。为了探究这一点，并提供扩展的生物标志物组来控制伪影信号，我们进行了实施例2和3中给出的进一步实验。
实施例2：分析1077血浆样品中FLNA、磷酸化FLNA和其它蛋白质的变化。
在本实施例中，我们使用了来自AD和对照组的新鲜血浆样品，这些样品是通过预期触发血小板活化的相同方法制备的。再次，使用TMTcalibratorTM使用与实施例1中描述的相同AD脑触发分析来自对照(3个老年对照，3个年轻认知完整)(FLNA条带阴性或‘-’)和6名AD患者(FLNA条带阳性或“+”))的6个样品。使用之前描述的1077方法采集和处理来自AD和对照组的全血。
样品处理
血浆样品解冻后，所有处理步骤均如实施例1中描述的进行。使用实施例1中检测到的所有FLNA肽的包含列表进行质谱分析。
结果
在MS采集过程中使用专用的细丝蛋白A包含方案，我们获得了细丝蛋白A序列的良好覆盖(大约40％)。尽管序列的特定部分在不同组之间显示出不同的丰度变化，但整个蛋白质的丰度没有观察到显著变化。我们还只观察到两个定量磷酸位点表达水平的细微差异。
除了FLNA之外，我们还对源自3,493种蛋白质的总共29,786种肽和3,297个磷酸位点进行了定量，这为鉴定阿尔茨海默病病理依赖性血浆标志物提供了有用的资源。统计分析表明，磷酸肽和蛋白质特征的组的存在推动了实验类别的分离，并且这些代表了独立于血小板活化状态的候选生物标志物。功能富集表明细胞骨架组织、补体级联调节和脂蛋白代谢的变化。
FLNA覆盖
用220个PSM对77种(磷酸化)肽进行FLNA鉴定，并在胰蛋白酶和半胰蛋白酶肽的标准搜索中通过来自54种肽(不包括磷酸肽)的158个PSM(表4)进行量化。所有四种检测到的磷酸肽均可在所有个体中进行定量(表5含有统计数据)。仅在对照样品中鉴定出两种肽：在6个对照中的4个(3名年轻和1名老年)中鉴定出AGQSAAGAAPGGGVDTR(aa 8-24，SEQ ID NO:xx)；并且仅在1名年轻对照中鉴定出DNGNGTYSCSYVPR(SEQ ID NO:vv)。仅在阿尔茨海默病样品中鉴定出一种肽AVPTGDASK(aa 1636-1644；SEQ ID NO:CC)，获得的值为6名患者中的5名。
令人惊讶的是，当由于使用1077制品而导致AD和对照样品中的血小板活化水平可能相似时，之前在AD中观察到的升高消失了。事实上，AD样品的游离血浆FLNA水平较低，这表明AD血小板比来自认知健康对照的血小板更不容易活化。我们认为，这种调节的丧失是由于本研究中对照血浆样品中FLNA的显著释放所致。
表8. 1077血浆样品中FLNA的定量
我们还鉴定了四种磷酸化的FLNA肽，其中三种在实施例1中可见，而另一种是当前分析所独有的。与之前的研究不同的是，含有pS2152的两种肽的水平在AD组和对照组之间没有显示出调节，尽管AD组和老年对照中“RAPSVAN”肽有高表达的趋势，表明与样品处理相比，这可能与疾病更相关，至少在***中。相反，含有pS1459的肽“CSGPG”在健康老年人中表现出强烈的上调，这可能表明存在保护性翻译后修饰。有趣的是，这在之前的研究中也出现过，尽管AD组也出现了升高，但这次没有看到，这可能表明该位点是人为产生的，需要进一步评估。残基T2336处的苏氨酸磷酸位点显示出与上述丝氨酸磷酸化类似的行为：在老年对照中检测到的水平高于阿尔茨海默病患者以及年轻健康对照。
表9.来自1077血浆中FLNA的定量磷酸化肽
实施例3：AD和对照EDTA血浆样品的TMTcalibratorTM分析。
实施例2的结果提供了蛋白质表达的一些调节可以由样品制备方法驱动的证据。因此，我们通过分析AD的新鲜样品和对照血浆样品来完成我们的研究，这些样品都是在相同条件下从EDTA采血管制备的。所有其它条件如实施例1和2中所描述。我们预计这组样品中血小板活化水平最低，这更好地反映了标准临床实践。
结果
在蛋白质和磷酸肽水平上成功检测到FLNA。我们检测到60种与FLNA相关的未修饰肽，其中54种是FLNA独有的且42种可以在所有12个样品中进行量化。发现与健康对照组相比，AD样品中的蛋白质显著上调(约2倍)。将检测到的与FLNA相关的四种磷酸肽中的三种用于量化。这些肽在磷酸化位点pS1459、pS2143和pS2152处携带修饰。所有三种磷酸肽特征在AD组中都更丰富，如在实施例1中所见，但此处的调节程度不那么强。我们假设这反映了阿尔茨海默病患者中FLNA丰度的真正生物学差异。当血小板活化显著时，释放的FLNA量足以模拟在疾病中看到的情况，并且甚至逆转健康个体和AD患者之间的相对丰度特征。
表10.EDTA血浆中磷酸化FLNA肽的相对表达
表11.EDTA血浆中非磷酸化FLNA的相对表达。
除了FLNA之外，我们还量化了总共31,382种肽、7,677种磷酸肽和3,478种蛋白质。统计分析揭示了多种显著调节的磷酸肽和蛋白质特征推动了实验类别的分离。功能富集表明了血小板活化、细胞-细胞外基质相互作用和细胞连接组织的变化。
我们在AD和对照K2EDTA血浆中获得了细丝蛋白A的良好表征。与使用1077方法制备的血浆获得的结果不同，当前研究中检测到了细丝蛋白A丰度和多种其它蛋白质特征的量化差异。结果与第一项研究(40-224)相当，尽管观察到的差异不那么明显。
我们发现，各种FLNA相关胰蛋白酶肽在AD组和对照组之间具有良好的调节作用。我们相信，这些结果可以作为开发FLNA靶向质谱方法的良好基础，该方法在选择和监测接受simufilam治疗的患者时具有诊断和预后效用。
实施例4：通过三种不同的样品制备方法比较AD和认知正常个体中的蛋白质表达。
我们比较了在AD1077与对照EDTA、AD/>1077与对照1077以及AD EDTA与对照EDTA的不同血浆组中不同蛋白质(包括FLNA和FLNA的磷酸化肽)的相对表达。这证实了FLNA且特别是FLNA的磷酸化表位作为阿尔茨海默病的外周生物标志物的适用性。然而，很明显，使用非标准血浆制品对血小板的潜在活化可模仿在AD中观察到的升高的FLNA水平，因此我们搜索了在/>1077血浆中水平升高但在EDTA血浆中未检测到的肽和蛋白质。我们还关注了此类蛋白质的记录与血小板生物学相关的特定子集。
FLNA的相对表达明显受到使用1077进行血浆制备的影响。通常，我们发现与AD患者相比，认知健康个体的磷酸化FLNA的相对水平尤其升高(表12)。在实施例1中，/>1077用于制备AD血浆，而对照是使用EDTA制备的。发现实施例1中检测到的所有三种磷酸化FLNA肽在AD组中均有增加，但是当两者均由/>1077制备时，与对照组相比，这些中的两种在AD中显示出降低的水平。对于FLNA的pS1459，看到与对照组相比，AD组中的调节程度在实施例3中测试的EDTA-制备的血浆样品中被进一步扩展。
表12.与来自实施例1-3的对照相比，来自AD患者的血浆中FLNA磷酸肽的相对表达。
我们还鉴定了三种肽，其可用于评估血浆或血清制备过程中人工血小板活化的水平。这些肽源自带有血小板生物学作用注释的蛋白质，并且当仅在AD样品中使用1077时，这些肽在AD组与对照组中存在差异表达，当/>1077用于两个组时，这些肽未受调节，并且当使用EDTA制备血浆时，两组均未检测到。在这一方面，在本发明的方法中包含这些肽或它们各自的蛋白质可用于指示已发生血小板活化的样品，并且应测试新鲜样品，其中这些肽/蛋白质的缺失表明样品良好。
表13.表明过度血小板活化的肽
贯穿本说明书，引用了各种专利、专利申请和/或其它类型的出版物(例如，期刊文章和书籍)。本文引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (40)

1.一种生物标志物组，包含从具有SEQ ID NO:1的多肽序列的细丝蛋白A蛋白质的体外消化获得的一种或多种磷酸化肽。
2.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，细丝蛋白A包含在取自疑似患有神经***疾病的受试者的生物流体或组织样品内或者从所述生物流体或组织样品获得。
3.根据权利要求3所述的生物标志物组，其中，所述神经***疾病是阿尔茨海默病。
4.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述磷酸化肽在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2152的残基处被磷酸化。
5.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述磷酸化肽具有SEQID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述生物标志物组包含多种FLNA的磷酸化片段，任选地两种或更多种片段或者三种或更多种片段。
7.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述生物标志物组包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的FLNA的磷酸化片段。
8.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述生物标志物组包含两种或更多种磷酸化肽，每种包含FLNA的片段并具有SEQ ID NO:2-5中任一个的氨基酸序列，其中所述两种或更多种磷酸化肽中的至少一种在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2152的位置处被磷酸化。
9.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述磷酸化肽在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143的位置处被磷酸化。
10.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述磷酸化肽具有SEQID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述生物标志物组包含两种或更多种磷酸化肽，每种包含FLNA的片段并具有SEQ ID NO:6-9中任一个的氨基酸序列，其中所述两种或更多种磷酸化肽中的至少一种在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143的位置处被磷酸化。
12.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述磷酸化肽在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2180的位置处被磷酸化。
13.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述磷酸化肽具有SEQID NO:10、SEQID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的生物标志物组，其中，所述生物标志物组包含两种或更多种磷酸化肽，每种包含FLNA的片段并具有SEQ ID NO:10-12中任一个的氨基酸序列，其中所述两种或更多种磷酸化肽中的至少一种在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2180的位置处被磷酸化。
15.一种生物标志物组，其中所述生物标志物组包含多种磷酸化肽，其中每种磷酸化肽是SEQ ID NO:1的片段并且在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143、2152和/或2180的位置处包含磷酸化位点。
16.一种生物标志物组，包含多种磷酸化肽，每种具有SEQ ID NO:2-12的序列并且在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143、2152和/或2180的位置处被磷酸化。
17.根据权利要求15或16所述的生物标志物组，其中，一种或多种磷酸化肽在SEQ IDNO:1的丝氨酸2143、丝氨酸2152和/或丝氨酸2180中的两个或更多个处被磷酸化。
18.一种生物标志物组，包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的磷酸化肽，每种在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸残基2143、2152和/或2180的位点处被磷酸化。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的生物标志物组，进一步包含表4中列出的一种或多种肽。
20.根据权利要求19所述的生物标志物组，其中，所述一种或多种肽从使用蛋白酶或蛋白酶的组合体外消化细丝蛋白A获得，其中所述一种或多种肽中的每一种包含SEQ ID NO:1中存在的氨基酸序列。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的生物标志物组，其中，一种或多种磷酸化肽对于FLNA是蛋白型的。
22.一种生物标志物组，包含：(i)从使用蛋白酶或蛋白酶的组合体外消化细丝蛋白A获得的一种或多种肽，其中所述一种或多种肽中的每一种包含SEQ ID NO:1中存在的氨基酸序列；和(ii)从表1-4中列出的一种或多种、任选两种或更多种蛋白质的体外消化获得的一种或多种肽。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的生物标志物组，其中，一种或多种肽或者一种或多种磷酸化肽从使用选自胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶中的一种蛋白酶或蛋白酶的组合进行的体外消化获得。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的生物标志物组，包含一种或多种合成肽，其中所述合成肽中的一种或多种富含H、C、N、O和/或S的重同位素。
25.根据权利要求24所述的生物标志物组，其中，所述合成肽中的一种或多种包含与从使用选自胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN和/或胰凝乳蛋白酶中的一种蛋白酶或蛋白酶的组合体外消化SEQ ID NO:1或者表1、2、3或4中列出的蛋白质之一获得的肽的序列相对应的氨基酸序列。
26.一种用于诊断/预后神经障碍的方法，包括：
从受试者获得体液或组织样品；
用一种或多种蛋白酶消化所述体液或组织样品中的一种或多种蛋白质；和
使用质谱检测和/或测量由所述消化产生的一种或多种肽的水平。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述受试者疑似患有阿尔茨海默病。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，使用胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN、胰凝乳蛋白酶或它们的任意组合进行消化步骤。
29.根据权利要求26所述的方法，进一步包括确定由所述消化产生的两种或更多种肽的比率。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述比率包括在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143的位置处被磷酸化的片段与在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2152的位置处被磷酸化的片段的比率。
31.根据权利要求30所述的方法，进一步包括当在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143的位置处被磷酸化的片段与在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2152的位置处被磷酸化的片段的比率大于10.0时，将所述受试者诊断为患有阿尔茨海默病。
32.根据权利要求30所述的方法，进一步包括当在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143的位置处被磷酸化的片段与在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2152的位置处被磷酸化的片段的比率小于5.0时，将所述受试者诊断为未患有阿尔茨海默病。
33.一种用于监测神经障碍的进展的方法，包括：
(a)在第一时间点从受试者获得体液或组织样品；
(b)用一种或多种蛋白酶消化所述体液或组织样品中的一种或多种蛋白质；
(c)使用质谱检测和/或测量由所述消化产生的一种或多种肽的水平；和
(d)在第二时间点重复步骤(a)-(c)。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述受试者疑似患有阿尔茨海默病。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，使用胰蛋白酶、GluC、ArgC、AspN、胰凝乳蛋白酶或它们的任意组合进行消化步骤。
36.根据权利要求33所述的方法，进一步包括步骤(f)：基于检测和/或测量的所述一种或多种肽的水平确定给予所述受试者的治疗性治疗对治疗所述神经障碍是否有效。
37.根据权利要求33所述的方法，进一步包括确定由所述消化产生的两种或更多种肽的比率。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述比率包括在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2143的位置处被磷酸化的片段与在对应于SEQ ID NO:1的丝氨酸2152的位置处被磷酸化的片段的比率。
39.根据权利要求38所述的方法，进一步包括当与所述第一时间点相比所述比率在所述第二时间点较高时，将所述受试者诊断为正在向阿尔茨海默病进展。
40.根据权利要求38所述的方法，进一步包括当与所述第一时间点相比所述比率在所述第二时间点较高时，确定给予所述受试者的治疗对于减缓、预防或治疗所述受试者的神经障碍无效。
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