CN117965348A - 一种具有抑菌活性的副干酪乳酪杆菌ProSci-92及其用途 - Google Patents

一种具有抑菌活性的副干酪乳酪杆菌ProSci-92及其用途 Download PDF

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CN117965348A CN202311723168.0A CN202311723168A CN117965348A CN 117965348 A CN117965348 A CN 117965348A CN 202311723168 A CN202311723168 A CN 202311723168A CN 117965348 A CN117965348 A CN 117965348A
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刘晓军
张建军
张凌宇
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的副干酪乳酪杆菌ProSci‑92及其用途。本发明提供的一种副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ProSci‑92，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26526；本发明的副干酪乳酪杆菌ProSci‑92的代谢产物中包括肽类、有机酸类、嘧啶类等具有抑菌活性的代谢产物，抑菌圈法证实其代谢产物对于常见的腐败菌、食源性致病菌和口腔致病菌等具有广谱抑菌性能；ProSci‑92发酵上清液中分离纯化所得5‑10kD的精制细菌素具有良好的热稳定性、有机溶剂稳定性，并推测其为蛋白类物质。

Description

一种具有抑菌活性的副干酪乳酪杆菌ProSci-92及其用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有抑菌活性的副干酪乳酪杆菌ProSci-92及其用途。
背景技术
病原菌是危害食品安全和人类生命健康的重要因素之一，不同种类的病原菌不仅可以引起食品安全问题，也会感染人类及动物从而引发相关疾病甚至威胁生命。金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，在适宜的条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，是仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。目前，采用抗生素或化学合成药物抑制或杀死病原菌是目前主要的防治手段。但由于病原菌耐药性不断增强，化学药物体内残留及环境污染等不可逆损伤频发，对人类健康和社会经济的可持续发展提出了严峻的挑战，因此找寻一种新型的抑菌剂成了亟待解决的问题。
益生菌是指摄入足够数量会对宿主健康产生有益作用的一类活的微生物的总称，常见有乳杆菌属和双歧杆菌属，也包括其它细菌和真菌。目前，益生菌已广泛应用于食品、护肤、美妆、医药、保健、畜牧业和水产业等领域。益生菌的健康作用包括多方面，其中对有害菌、致病菌的拮抗作用是其益生功效的重要体现，也是常见筛选益生菌的考察指标之一。益生菌在病原菌的天然防控方面有着广阔的发展前景，其作用机制包括：(1)与病原菌相互竞争黏附位点；(2)与致病菌进行营养物质竞争；(3)分泌抑菌物质，包括抗菌素、抗菌肽、有机酸、抑菌多糖等；(4)与宿主细胞、组织互作，提高免疫力。因此，益生菌因其健康、安全、有效的抑菌性能而具有较高的研究价值和广阔的应用前景，将成为未来研究的主要方向。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有抑菌活性的副干酪乳酪杆菌ProSci-92及其用途。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ProSci-92，分离自香格里拉藏区酸牦牛乳，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年02月08日，保藏编号为CGMCC No.26526。
可选的，所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92的全基因组中包含细菌素合成相关的基因簇LSEI-23163(如SEQ ID NO.1所示)、LSEI-2386(如SEQ ID NO.2所示)或EnterolysinA(如SEQ ID NO.3所示)。
一种微生物制剂，含有所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92、其培养物、其发酵物和/或其至少一种代谢物。
可选的，所述代谢物包括抑菌活性物质和/或益生功能活性物质；
所述抑菌活性物质包括Arg-Pro、乙酰基羟脯氨酸、D-丙氨酸-D-丙氨酸、苯甲酸、水杨酸、棕榈油酸、辛酸、熊果酸、琥珀酸、草酸、L-哌啶酸、嘧啶和/或胞嘧啶；
和/或，所述益生功能活性物质包括D-苯丙氨酸、6-氨基己酸、L-色氨酸、熊果酸、L-异亮氨酸、水杨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和/或2-羟基肉桂酸。
一种细菌素，由所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92发酵制备得到。
可选的，所述细菌素包含分子量为1-3kD、5-10kD和/或>10kD的细菌素；
可选的，所述细菌素为分子量范围为5-10kD的细菌素。
可选的，所述细菌素的制备方法包括：将副干酪乳酪杆菌ProSci-92的发酵液，离心，收集上清液，提取。
可选的，所述提取步骤包括将所述上清液进行脱盐处理，然后将得到的脱盐后的上清液进行＞10kD、5-10kD、3-5kD、1-3kD的4个分子量段的细菌素的截留，得到各分子量段的细菌素的上清液，过滤，采用硫酸铵沉淀法进行细菌素粗提，得到细菌素粗提物。
可选的，所述硫酸铵沉淀法为在所述上清液中加入硫酸铵，使其饱和度分别为50％、60％、70％、80％或90％，静置过夜后离心，去除上清液，即得细菌素粗提物样品。
可选的，还包括将所述细菌素粗提物进行纯化和精制的步骤。
所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92、所述的微生物制剂、所述的细菌素具有如下任一项的用途：
(1)、在抑制致病菌和/或腐败菌或制备抑制致病菌和/或腐败菌的产品中的用途；
(2)、在食品防腐、饲料防腐、口腔护理、皮肤护理或女性生殖道健康领域中的用途；
(3)、在制备食品防腐、饲料防腐、口腔护理、皮肤护理或女性生殖道健康领域的产品中的用途。
可选的，所述产品包括药品、食品、化妆品、生物防腐剂、食品添加剂或抑菌剂；
和/或，所述致病菌包括食源性致病菌和口腔致病菌。
可选的，所述腐败菌包括假单胞菌属(Pseudomonas)或芽孢杆菌属(Bacillus)；
和/或，所述食源性致病菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus)或李斯特菌属(Listeria)；
和/或，所述口腔致病菌包括链球菌属(Streptococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)或卟啉单胞菌属(Porphyromonas)；
可选的，所述假单胞菌属包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；
可选的，所述芽孢杆菌属包括蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；
可选的，所述葡萄球菌属包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；
可选的，所述李斯特菌属包括单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)；
可选的，所述链球菌属包括变异链球菌(Streptococcus mutans)；
可选的，所述梭杆菌属包括具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；
可选的，所述卟啉单胞菌属包括牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的一种副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ProSci-92，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26526；本发明的副干酪乳酪杆菌ProSci-92经过全基因组测序分析表明其含有的寡肽转运***和肽酶等基因较多，推测其具有较强的蛋白水解功能，有助于产抗菌肽，通过代谢组学技术鉴定到该菌的代谢产物中包括肽类、有机酸类、嘧啶类等具有抑菌活性的代谢产物，抑菌圈法证实其代谢产物对于常见的腐败菌、食源性致病菌和口腔致病菌等具有广谱抑菌性能，可广泛应用于食品防腐、饲料防腐、口腔护理、皮肤护理或女性生殖道健康领域。
2、本发明提供的一种副干酪乳酪杆菌ProSci-92，经全基因组分析发现其含有3个细菌素合成相关的基因簇，所述基因簇包含LSEI-23163、LSEI-2386和Enterolysin A，对该菌株的代谢产物进行分离纯化，得到的不同分子量段的细菌素，这些细菌素均具有抑菌活性，尤其分子量段5-10kD的细菌素抑菌效果最为显著，且具有良好的热稳定性、有机溶剂稳定性和酶稳定性。
一株副干酪乳酪杆菌ProSci-92，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.26526，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年02月08日。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中副干酪乳酪杆菌ProSci-92细胞形态图；
图2是本发明实施例2中副干酪乳酪杆菌ProSci-92蛋白质水解相关基因注释结果；
图3是本发明实施例2中副干酪乳酪杆菌ProSci-92细菌素基因预测图；
图4是本发明实施例4中不同分子量段的细菌素的抑菌结果；
图5是图4的量化结果；
图6是本发明实验例3中副干酪乳酪杆菌ProSci-92精制细菌素5-10kD的热稳定性检测结果；
图7是图6的量化结果；
图8是本发明实验例3中副干酪乳酪杆菌ProSci-92精制细菌素5-10kD的有机溶剂稳定性检测结果；
图9是图8的量化结果；
图10是本发明实验例3中副干酪乳酪杆菌ProSci-92精制细菌素5-10kD的有机溶剂稳定性检测结果；
图11是图10的量化结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1副干酪乳酪杆菌ProSci-92的分离、鉴定和保藏
(1)、将采集于中国云南省香格里拉市藏区的传统酸牦牛乳样品进行10倍和20倍稀释，吸取各稀释样品200μL均匀涂布于MRS固体培养基平皿内，37℃厌氧培养48-72h；
(2)、挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养24h；
(3)、待菌株生长良好后，观察记录其菌落形态和革兰氏染色细胞特征形态，并进行过氧化氢酶试验，分离出呈阴性的杆菌，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析，最终分离筛选得到副干酪乳酪杆菌，命名为ProSci-92，图1为细胞形态图；
(4)、在低温真空冷冻保存，-80℃冻结保存和(或)4℃条件下冷藏保存分离株。
实施例2副干酪乳酪杆菌ProSci-92的全基因组分析
对副干酪乳酪杆菌ProSci-92进行Nanopore和Illumina测序，并对原始数据进行质控。对三代读长(reads)进行组装、环化，结合二代数据进行矫正，并对组装后的全基因组序列进行分类学地位鉴定。
使用BLAST4在线网站对副干酪乳酪杆菌ProSci-92的细菌素基因簇进行预测。
Nanopore测序的原始数据结果见表1，菌株的全基因组序列分类学地位鉴定结果见表2。菌株的全基因组序列与GTDB和全球模式微生物基因组数据库(gcType wholegenome database)的比对结果显示其为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)，因此将其命名为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ProSci-92，并且基因组未注释到任何抗生素抗性基因。
表1三代测序原始数据质量
深度(X) 平均读取质量 平均读取深度(bp)
383 13.3 4439
表2基因组分类数据库比对结果和基因组信息
全基因组分析结果表明，副干酪乳酪杆菌ProSci-92含有1个染色体和1个质粒，长度分别为3047361bp和82319bp。
如图2所示，对蛋白质相关基因进行注释发现，副干酪乳酪杆菌ProSci-92含有较多胞壁蛋白酶基因，可将蛋白质降解为多肽类物质，通过寡肽转运***转运至胞内，且其含有的编码寡肽转运***和肽酶的基因较多，可能具有较强的蛋白水解能力。进一步可推测，副干酪乳酪杆菌ProSci-92具有产抗菌肽的能力。
细菌素是某些细菌在生长代谢过程中，通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。在副干酪乳酪杆菌ProSci-92基因组中发现3个细菌素合成相关的基因簇，注释菌株的3个基因簇分别编码3种细菌素，分别是LSEI-23163(如SEQ ID NO.1所示)、LSEI-2386(如SEQ ID NO.2所示)和Enterolysin A(如SEQ ID NO.3所示)，表明副干酪乳酪杆菌ProSci-92具有产细菌素的潜力(图3)。
将上述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26526，保藏日期为2023年02月08日。
实施例3副干酪乳酪杆菌ProSci-92的发酵
本实施例提供了一种副干酪乳酪杆菌ProSci-92的发酵方法，包括如下步骤：
(1)种子培养
将冷冻保存在-80℃的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ProSci-92接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24h，以体积分数2％的接种量连续活化至第3代，培养18h后，得到种子液；
(2)扩大培养
将所述种子液以体积比5％的接种量接入MRS液体培养基中，然后加入氨水或氢氧化钠调整发酵液初始pH至6.50±0.02，空气保压0.02～0.03MPa，设置搅拌速度100rpm/min，在温度37±0.2℃条件下进行发酵，使用氨水作维持pH恒定(5.50～6.00)，发酵至终点(OD600值前后0.5h无显著性变化)得到发酵液。将得到的发酵液以6000×g离心10min，弃除菌体，得无细胞上清液。将收集到的无细胞上清液经脱盐(纳滤电荷膜设备GCM-E-50脱盐)、浓缩和喷雾干燥得到代谢产物。
实验例4副干酪乳酪杆菌ProSci-92代谢产物的分析鉴定
将实施例3中获得的代谢产物进行分析，分析方法如下：在50mg样品中加入150μL含内标的提取液(乙腈：甲醇＝1：4，V/V)。然后涡旋3min，12000×g离心10min(4℃)。取150μL上清液于-20℃放置30min，12000×g离心3min(4℃)，取120μL上清液进行液相色谱-质谱联用分析(LC-MS)。所有样品均由LC-MS***按照机器顺序采集。UPLC：色谱柱，WatersACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8μm，2.1mm*100mm)；柱温40℃；流速0.4mL/min；进样量2μL；溶剂***，A相为水(0.1％甲酸)：B相为乙腈(0.1％甲酸)；梯度程序：0min时为A相：B相为95：5，V/V；11.0min时为A相：B相为10：90，V/V；12.0min时为A相：B相为10：90，V/V；12.1min时为A相：B相为95：5，V/V；14.0min时为A相：B相为95：5，V/V。
分析结果如下：
副干酪乳酪杆菌ProSci-92代谢产物中检测到D-苯丙氨酸、6-氨基己酸、L-色氨酸、熊果酸、L-异亮氨酸、水杨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、2-羟基肉桂酸等大量具有潜在益生功能的活性物质。其中包括13种抑菌成分，分别是Arg-Pro、乙酰基羟脯氨酸、D-丙氨酸-D-丙氨酸、苯甲酸、水杨酸、棕榈油酸、辛酸、熊果酸、琥珀酸、草酸、L-哌啶酸、嘧啶及胞嘧啶。
实验例5副干酪乳酪杆菌ProSci-92代谢产物的抑菌活性测试
1实验方法
将实施例3中获得的副干酪乳酪杆菌ProSci-92的代谢产物用无菌水进行40倍体积稀释复溶(相当于25‰干物质)，将复溶液调pH至7.0，采用牛津杯双层琼脂平板扩散法检测方法(方法见GB/T 39101-2020多肽抗菌性测定抑菌圈法)，分别判断其对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)及牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的抑菌能力。
2实验结果
副干酪乳酪杆菌ProSci-92代谢产物的40倍稀释复溶液对荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、变异链球菌、具核梭杆菌及牙龈卟啉单胞菌均有抑菌作用，尤其对金黄色葡萄球菌具有突出的抑制效果，如表3所示。
表3副干酪乳酪杆菌ProSci-92代谢产物的抑菌活性测试
实施例6副干酪乳酪杆菌ProSci-92的细菌素的制备方法
本实施例提供了一种副干酪乳酪杆菌ProSci-92的细菌素的制备方法，包括如下步骤：
细菌素粗提：将实施例3中发酵步骤得到的副干酪乳酪杆菌ProSci-92高密度发酵液(活菌数为3×1011CFU/mL)进行高速离心(离心条件12000×g，30min)，收集无细胞的上清液。将上清液分批加入纳滤电荷膜设备GCM-E-50进行脱盐处理。脱盐后的上清液通过高压切向流设备GCM-S-20经行高压切向流处理，并分别利用＞10kD、5-10kD、3-5kD、1-3kD的4类膜管进行不同分段的截留。采用0.22μm的滤膜将各个分子量段的上清液过滤除杂质，并进行25h的冷冻干燥，收集成品。然后采用硫酸铵沉淀法进行细菌素粗提，在各上清液中加入硫酸铵粉末，使其饱和度分别为50％、60％、70％、80％及90％。静置过夜后离心(8000×g，10min)，去除上清液，即得各分子量段的细菌素粗提样品。
细菌素纯化：使用AKTA avant150蛋白纯化***，采用凝胶过滤层析对细菌素粗提样品进行分离纯化。具体地，将前期所得细菌素粗提样品通过0.22μm过滤器进行过滤，并通过Sephadex G-10(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉，Uppsala)层析柱与三蒸水平衡纯化，三蒸水以13mL/min的流速洗脱样品，分别在280nm和214nm处监测和收集蛋白质峰的洗脱液，浓缩至上样体积。
细菌素精制：采用制备型C18反相高效液相色谱进一步分离纯化。具体地，将从凝胶柱层析洗脱液中得到的有抑菌活性的样品过滤膜，并用超纯水稀释成合适的浓度；检测仪器，灌注溶剂使溶剂充满整个管路，上样前设置A相(0.05％TFA+超纯水)、B相(0.05％TFA+乙腈)，流速为13mL/min，紫外检测波长为215nm；在注射器中加入样品(避免气泡)，梯度洗脱程序为：0-30min，5v/v％-30v/v％B相；30-32min，30v/v％-50v/v％B相；32-42min，50v/v％B相；42-45min，50v/v％-5v/v％B相。进样结束，用高比例的超纯水和高比例的纯乙腈先后冲洗，将***和色谱柱中残留的样品杂质去除，收集每个峰的组分。将不同上清液活性分子量段进行真空冷冻干燥后得精致细菌素，以金黄色葡萄球菌为指示菌，进一步通过牛津杯扩散法检测其抑菌活性(方法见GB/T 39101-2020多肽抗菌性测定抑菌圈法)，结果见图4和图5所示，副干酪乳酪杆菌ProSci-92上清液中分子量1-3kD、5-10kD及>10kD的肽段均有抑菌活性，其中5-10kD的抑菌活性尤为显著。
实验例7副干酪乳酪杆菌ProSci-92精制细菌素的稳定性评价
将实施例6中获得的精制副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素的热稳定性、有机溶剂稳定性和酶稳定性。
热稳定性测试方法：将5-10kD精制细菌素样品用无菌水进行10倍体积稀释(相当于10％干物质)，分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃、120℃及15℃常温(空白对照)条件下水浴30min，冷却至室温，调pH至7.0并控制其渗透压低于1000mOsmol/kg。然后以金黄色葡萄球菌为指示菌(浓度：1.67×105CFU/mL)，采用牛津杯扩散法进行三次平行抑菌实验，测量并记录抑菌圈(方法见GB/T 39101-2020多肽抗菌性测定抑菌圈法)。
有机溶剂稳定性测试方法：将5-10kD精制细菌素采用无菌水稀释10体积倍稀释(相当于10％干物质)作为样品，分别评价细菌素在丙酮、乙腈、甲醇、乙酸乙酯的有机溶剂中的稳定性。设置实验组和对照组(实验组：1.9mL精制细菌素稀释液+0.1mL有机溶剂；空白对照组：1.9mL精制细菌素稀释液+0.1mL蒸馏水)。具体地，将所有组别分别置于37℃水浴4h，调pH至7.0并控制渗透压低于1000mOsmol/kg。然后以金黄色葡萄球菌为指示菌(浓度：1.21×105CFU/mL)，采用牛津杯扩散法进行三次平行抑菌实验，测量并记录抑菌圈(方法见GB/T 39101-2020多肽抗菌性测定抑菌圈法)。
酶稳定性测试方法：将5-10kD精制细菌素采用无菌水稀释10体积倍稀释(相当于10％干物质)作为样品，分别检测细菌素的酶稳定性，所使用的酶为(胃蛋白酶(酶活2500U/mg)、蛋白酶K(酶活30U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活2000U/mg)、胰蛋白酶(酶活250U/mg)、淀粉酶(α-淀粉酶(酶活50U/mg)、β-淀粉酶(酶活50U/mg))。设置实验组和对照组(实验组：0.9mL精制细菌素稀释液+0.1mL酶稀释液；空白对照(或阳性对照)组：0.9mL精制细菌素稀释液+0.1mL蒸馏水)。具体地，用蒸馏水以1：100的比例配制酶稀释液，并与样品混合，将所有组别分别置于37℃水浴4h，调pH至7.0并控制渗透压低于1000mOsmol/kg。然后以金黄色葡萄球菌为指示菌(浓度：1.21×105CFU/mL)，采用牛津杯扩散法进行三次平行抑菌实验，测量并记录抑菌圈(方法见GB/T 39101-2020多肽抗菌性测定抑菌圈法)。
实验结果如下：
热稳定性测试结果如图6和图7所示，副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素在20-120℃下均具有显著的抑菌活性，与空白对照组相当甚至更优，说明副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素具有良好的热稳定性。
有机溶剂稳定性测试结果如图8和图9所示，副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素经过丙酮、乙腈、乙酸乙酯处理均具有显著的抑菌活性，与空白对照组相当甚至更优，经过甲醇处理，其抑菌活性相比空白对照略有下降，但并不显著，依然产生了较强的抑菌活性，说明副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素具有良好的有机溶剂稳定性。
酶稳定性测试结果如图10和图11所示，胃蛋白酶、α-淀粉酶及β-淀粉酶对副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素样品的抑菌活性均有影响，其抑菌活性相比空白对照略有下降，依然产生了较强的抑菌活性，蛋白酶K和胰蛋白酶处理可提高抑菌活性，而木瓜蛋白酶处理后可使其抑菌活性完全消失。以上说明，副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素对于胃蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶K和胰蛋白酶具有良好的酶稳定性。进一步的，副干酪乳酪杆菌ProSci-92的5-10kD精制细菌素经木瓜蛋白酶处理后可使其抑菌活性完全消失，可进一步验证抑菌活性物质为蛋白质或多肽。
综上所述，本发明所述副干酪乳酪杆菌ProSci-92具有抑制致病菌和腐败菌的能力，其代谢产物，特别是5-10kD的精制细菌素，对于常见致病菌，特别是金黄色葡萄球菌，体现出显著的抑制效果。因此，本发明的副干酪乳酪杆菌ProSci-92及其代谢产物具有广谱抑菌性能，可广泛应用于食品防腐、饲料防腐、口腔护理、皮肤护理或女性生殖道健康领域。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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Claims (10)

1.一种副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ProSci-92，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2023年02月08日，保藏编号为CGMCCNo.26526。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92，其特征在于，所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92的全基因组中包含细菌素合成相关的基因簇LSEI-23163、LSEI-2386或Enterolysin A。
3.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92、其培养物、其发酵物和/或其至少一种代谢物。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述代谢物包括抑菌活性物质和/或益生功能活性物质；
所述抑菌活性物质包括Arg-Pro、乙酰基羟脯氨酸、D-丙氨酸-D-丙氨酸、苯甲酸、水杨酸、棕榈油酸、辛酸、熊果酸、琥珀酸、草酸、L-哌啶酸、嘧啶和/或胞嘧啶；
和/或，所述益生功能活性物质包括D-苯丙氨酸、6-氨基己酸、L-色氨酸、熊果酸、L-异亮氨酸、水杨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和/或2-羟基肉桂酸。
5.一种细菌素，其特征在于，由权利要求1或2所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92发酵制备得到。
6.根据权利要求5所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素包含分子量为1-3kD、5-10kD和/或>10kD的细菌素；
可选的，所述细菌素为分子量范围为5-10kD的细菌素。
7.根据权利要求5或6所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素的制备方法包括：将副干酪乳酪杆菌ProSci-92的发酵液，离心，收集上清液，提取。
8.权利要求1或2所述的副干酪乳酪杆菌ProSci-92、权利要求3或4所述的微生物制剂、权利要求5-7任一项所述的细菌素具有如下任一项的用途：
(1)、在抑制致病菌和/或腐败菌或制备抑制致病菌和/或腐败菌的产品中的用途；
(2)、在食品防腐、饲料防腐、口腔护理、皮肤护理或女性生殖道健康领域中的用途；
(3)、在制备食品防腐、饲料防腐、口腔护理、皮肤护理或女性生殖道健康领域的产品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述产品包括药品、食品、化妆品、生物防腐剂、食品添加剂或抑菌剂；
和/或，所述致病菌包括食源性致病菌和口腔致病菌。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述腐败菌包括假单胞菌属(Pseudomonas)或芽孢杆菌属(Bacillus)；
和/或，所述食源性致病菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus)或李斯特菌属(Listeria)；
和/或，所述口腔致病菌包括链球菌属(Streptococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)或卟啉单胞菌属(Porphyromonas)；
可选的，所述假单胞菌属包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；
可选的，所述芽孢杆菌属包括蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；
可选的，所述葡萄球菌属包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；
可选的，所述李斯特菌属包括单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)；
可选的，所述链球菌属包括变异链球菌(Streptococcus mutans)；
可选的，所述梭杆菌属包括具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)；
可选的，所述卟啉单胞菌属包括牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)。
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