CN117946203A - 一种甘草次酸-金配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘草次酸‑金配合物及其制备方法和应用，该金配合物用于肌腱病(Tendinopathy)的治疗。本发明通过体内外实验对金配合物的抗氧化应激及治疗肌腱病的活性进行评价，结果发现，该甘草次酸‑金配合物不仅在体外有抗肌腱干细胞氧化应激和炎症的作用，在体内抑制了肌腱损伤过程中造成的胶原排列紊乱，并减少了脂质过氧化物MDA、炎症因子IL‑1β和HMGB1的表达，发挥了较好的抗肌腱病的作用。本研究创新性的发现甘草次酸与金属元素共价结合后通过抗炎、抗氧化发挥抗肌腱病的作用及机制，为开发治疗肌腱病的药物开发提供理论依据和新的方向。

Description

一种甘草次酸-金配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于小分子化合物医药领域，具体涉及一种甘草次酸-金配合物及其制备方法和应用。

背景技术

肌腱病(tendinopathy)是发生于损伤或病变肌腱中的一系列病理变化，临床症状主要表现为疼痛与僵硬、功能减退和运动耐受性下降。作为目前康复医学科与骨科门诊较常见的疾病之一，肌腱病的发病率在全球范围均呈现逐年上升的趋势，尤其常发于运动员。现今，肌腱病的治疗包括药物或注射治疗、基于运动策略的物理治疗、冲击波疗法、肌腱负荷管理等，多集中于以减轻症状为目标，同时受限于肌腱较差的自修复能力导致预后效果往往不佳，为患者及其家庭带来不小的身心负担和经济压力。

普遍认为炎症反应是肌腱病发生的核心环节，机械损伤和其他多重因素共同引起肌腱炎症状态，导致肌腱正常生理***的稳态被破坏，最终致使肌腱组织胶原紊乱和细胞外基质沉积，严重影响肌腱功能，故而组织病理学上将肌腱炎作为肌腱病分类的简化。现有研究表明，损伤相关分子模式(DAMP)理论对肌腱病这种非外源感染性炎症具有适用性，认为细胞损伤后释放内源性危险信号——称为警报素，激活固有免疫应答，并进一步直接或间接激活适应性免疫应答，引起炎症。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是其中一种关键警报素，生理状态下分布于细胞核内，细胞受损后释放到胞外刺激免疫细胞分泌炎性介质，产生炎症反应。已有研究证实HMGB1存在于肌腱细胞、肌腱干细胞内，参与肌腱病炎症的发生发展。

中药甘草味甘性平，具有和中缓急、调和诸药之效，用药历史悠久。甘草的主要化学成分甘草酸、甘草次酸具有多种药理活性，能发挥增强巨噬细胞功能、调节细胞免疫、抗病毒的作用，被广泛应用于肝脏疾病的临床治疗。值得注意的是，最近研究发现二者为天然的HMGB1抑制剂，能直接结合HMGB1抑制其表达从而抑制炎症。目前尚未见甘草次酸治疗肌腱病的相关报道。

金属离子及其生物活性材料在骨组织工程中的探索于众多研究中有所报道，预示了其治疗骨科疾病的可观前景。金诺芬是一款治疗类风湿性关节炎的经典口服药物，彰显了金配合物优良的抗炎效果，也提示了将金元素应用于骨科疾病领域的可能性。目前尚未见金配合物治疗肌腱病的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘草次酸-金配合物及其制备方法和应用，该配合物在体内外能有效抑制HMGB1的表达，调控炎症反应，缓解肌腱病进程，以解决现有的肌腱病治疗方案繁多但疗程长而复杂且疗效不确切等问题。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种甘草次酸-金配合物，其结构如Ⅰ(产物10)所示

本发明提供一种所述甘草次酸-金配合物的制备方法，如下：

首先以化合物1(4,5-二(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑)为起始原料经两步反应合成关键中间体化合物3(3-(5-溴戊基)-1-(5-羟基戊基)-4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-3-鎓溴化物)，之后化合物3分别与甘草次酸(glycyrrhizinic acid,GA)和BMS-1(化合物8,(S)-1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸)酯化反应制备化合物4(3-(5-(((1S,4R)-3-((4bS,7S,10aR)-7-羟基-1,1,4b,8,8,10a-六甲基-4-氧-1,4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9,10,10a-十二氢菲-2-基)-1,(4-二甲基环己烷-1-甲酰氧基)戊基)-1-(5-羟基戊基)-4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-3-鎓溴化物)和化合物9((S)-3-(5-((1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酰)氧基)戊基)-1-(5-羟基戊基)-4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-3-鎓溴化物)。最后，化合物9经银转移法制备氮杂环卡宾溴化金，不处理或经简单处理后，与化合物4反应生成最终的产物10(18β-甘草次酸金配合物,其化学名为(1-(5-(((S)-1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟苯基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)(1-(5-(((2S,4aS,6aS,6bR,10S,12aS)-10-羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-13-氧-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-二十二氢吡啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟基戊基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)金(Ⅰ))。

进一步地，所述关键中间体化合物3的制备方法包括以下步骤：

(1)以化合物1与5-溴戊醇为原料进行回流反应，反应结束后经萃取、减压旋蒸、柱层析纯化、浓缩、干燥，得到中间体化合物2(5-(4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-1-基)戊-1-醇)；

(2)将化合物2溶于乙腈中与1，5-二溴戊烷进行回流反应，反应结束后经减压旋蒸、分离纯化、浓缩干燥，得到化合物3。

进一步地，所述化合物8的制备方法包括以下步骤：

(1)以化合物5(3-(氯甲基)-2-甲基-1,1'-联苯)与化合物6(4-羟基-2,6-二甲氧基苯甲醛)为原料，在氮气保护下将二者和三苯基膦溶于无水四氢呋喃中反应，反应结束后经减压旋蒸、分离纯化、浓缩干燥，得到中间体化合物7(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苯甲醛)；

(2)将化合物7与D-(+)-2-哌啶酸、DMF混合，分批加入醋酸硼氢化钠，用冰醋酸作催化剂进行反应，反应结束后经萃取、减压旋蒸、分离纯化、浓缩烘干，得到化合物8。

以上所述化合物1～9的结构如Ⅱ～Ⅹ所示

本发明所述甘草次酸-金配合物的合成路线如下所示：

本发明所述甘草次酸-金配合物对HMGB1具有显著的抑制作用，对肌腱病急性期、早期炎症具有效抗击作用，可延缓甚至逆转肌腱损伤，有可观的恢复肌腱功能效果，因此能够有望成为用于制备治疗肌腱病药物。

附图说明

图1为甘草次酸-金配合物(产物10)的核磁共振氢谱图；

图2为甘草次酸-金配合物(产物10)的核磁共振碳谱图；

图3为甘草次酸-金配合物(产物10)的质谱图；

图4为甘草次酸-金配合物(产物10)的高效液相色谱法纯度分析图；

图5表示甘草次酸-金配合物对肌腱干细胞存活率的影响，其中：A为不同浓度梯度的甘草次酸-金配合物给药对肌腱干细胞细胞存活率的影响结果；B为不同浓度梯度的甘草次酸-金配合物给药在氧化应激条件下对肌腱干细胞细胞存活率的影响结果；

图6表示甘草次酸-金配合物对HMGB1表达的抑制作用，其中：A为甘草次酸-金配合物给药在氧化应激条件下肌腱干细胞HMGB1的表达及核质分布情况的免疫荧光结果；B为甘草次酸-金配合物给药在氧化应激条件下肌腱干细胞HMGB1分泌情况的ELISA试剂盒检测结果。

图7表示甘草次酸-金配合物给药在氧化应激条件下对肌腱干细胞内脂质过氧化和炎症水平的影响，其中：A-C为甘草次酸-金配合物给药在氧化应激条件下肌腱干细胞抗氧化能力的评估结果；D为甘草次酸-金配合物给药在氧化应激条件下肌腱干细胞炎症因子IL-1β、IL-6的蛋白免疫印迹检测结果。

图8表示甘草次酸-金配合物对大鼠的肌腱病治疗作用，其中：A为各组大鼠麻醉后分离出的肌腱组织H&E染色和Masson染色结果图；B-C为各组大鼠血清GSH和MDA试剂盒检测结果；D为各组大鼠血清中炎症因子IL-1β水平检测结果；E为各组大鼠麻醉后分离出髌腱组织的免疫组化结果图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明所述中药复方制剂的制备以及治疗肝纤维化的功效。

相关定义：本发明所述“甘草次酸-金配合物”、“GA-Au”、“产物10”、“18β-甘草次酸金配合物”、“(1-(5-(((S)-1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟苯基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)(1-(5-(((2S,4aS,6aS,6bR,10S,12aS)-10-羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-13-氧-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-二十二氢吡啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟基戊基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)金(Ⅰ)”可以互换使用。

本发明所述的甘草次酸-金配合物的结构如Ⅰ所示：

本发明公开了该配合物的制备方法，以及该配合物在抑制HMGB1发挥抗炎作用治疗肌腱病药物中的应用。

本发明通过体内外实验对甘草次酸-金配合物GA-Au抗肌腱病的活性进行了评价并对其作用机制进行的初步探索，结果发现在体外，GA-Au预处理给药可以缓解TSCs的氧化损伤以及炎症水平，恢复其细胞活力，抑制HMGB1的表达；在肌腱病模型的大鼠中，GA-Au给药抑制了大鼠肌腱组织的的HMGB1的表达水平以及血清中炎症因子和脂质过氧化物的表达，同时免疫组化结果也表明，大鼠肌腱组织的胶原排列情况得到了恢复。

其中，动物实验均按照南京中医药大学动物实验中心伦理委员会批准的指南和协议进行(审批号：202211A011)。

以下对本发明的实验过程及实验结果进行具体说明。

实施例1：甘草次酸-金配合物的制备方法

1、实验方法

(1)化合物2的制备：将化合物1溶于无水四氢呋喃中，冰盐浴冷却至0℃，分批加入纯度为60％的氢化钠，室温反应30min。加入5-溴戊醇，加热回流反应2h。降至室温，将反应液缓慢滴加入冰水中淬灭反应，依次用乙酸乙酯萃取、饱和食盐水润洗、无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去有机溶剂，柱层析纯化，浓缩，烘干，得白色固体，收率：92.7％。

(2)化合物3的制备：将化合物2溶于乙腈中，加入1，5-二溴戊烷，加热回流反应5天。自然降温至室温，减压旋蒸除去有机溶剂，柱层析纯化，浓缩，烘干，得白色固体，收率：74.5％。

(3)化合物4的制备：将化合物3溶于DMF中，依次加入碳酸钾和18β-甘草次酸，室温搅拌过夜。加入水、乙酸乙酯萃取，饱和食盐水润洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，柱层析纯化，浓缩，烘干，得白色固体，收率：76.5％。

(4)化合物7的制备：在氮气气氛下将化合物5、化合物6、三苯基膦依次加入无水四氢呋喃中，冰盐浴冷却至约0℃，将DIAD溶于无水四氢呋喃中并滴加入反应液中，室温反应过夜。TLC监测，反应完全后，减压旋蒸除去大部分溶剂，加入***，冰浴冷却约1h，抽滤将固体除去并用少量***润洗固体，***溶液浓缩(不能蒸干)，柱层析纯化，浓缩除去溶剂，烘干，得白色固体，收率：83.6％。

(5)化合物8的制备：在100ml单口圆底烧瓶中依次加入化合物7、D-(+)-2-哌啶酸和DMF，室温搅拌1h。分批加入醋酸硼氢化钠，加入冰醋酸作催化剂，室温搅拌过夜。TLC监测，反应完全后加入饱和氯化铵水溶液，室温搅拌10min，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水润洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，柱层析纯化，浓缩，烘干得淡黄色固体，收率：70.7％。

(6)化合物9的制备：将化合物3溶于DMF中，依次加入碳酸钾和化合物8，室温搅拌过夜。加入水、乙酸乙酯萃取，饱和食盐水润洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，柱层析纯化，浓缩，烘干，得白色固体，收率：80.0％。

(7)产物10的制备：在氮气保护下，向50ml单口圆底烧瓶中依次加入化合物9、Ag₂O和无水DCM，锡箔纸避光，室温反应12h后，加入Me₂SAuCl和NaBr固体，继续反应12h。TLC监测，反应完全后，硅藻土抽滤去除固体，少量无水DCM润洗固体，减压旋蒸去除溶剂，溶于少量DCM并滴加于适量正己烷中，析出白色固体，抽滤，烘干，得白色固体，无需进一步纯化直接投入下一步。将以上所得固体溶于无水丙酮中，在氮气保护下依次加入化合物4、K₂CO₃，锡箔纸避光，室温搅拌12h，最后加入KPF₆，室温继续搅拌48h。TLC监测，反应完全后直接减压旋蒸除去溶剂，柱层析纯化，浓缩，适量无水二氯甲烷溶解产品，缓慢滴加入适量无水正己烷中，析出固体，去除溶剂，烘干，得白色固体，即为本发明所述18β-甘草次酸金配合物((1-(5-(((S)-1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟苯基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)(1-(5-(((2S,4aS,6aS,6bR,10S,12aS)-10-羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-13-氧-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-二十二氢吡啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟基戊基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)金(Ⅰ))，收率：65％。

2、结果

对所得甘草次酸-金配合物(产物10)的结构和纯度进行鉴定。

(1)核磁共振氢谱

图1为所得甘草次酸-金配合物(产物10)的核磁共振氢谱图。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.43(d,J＝5.9Hz,3H),7.36(dd,J＝23.1,7.0Hz,3H),7.19(d,J＝6.5Hz,8H),6.90(d,J＝6.6Hz,10H),6.28(d,J＝9.8Hz,2H),5.58(s,1H),5.13(s,2H),4.41(s,2H),4.24(d,J＝5.9Hz,10H),4.16(s,2H),3.98(d,J＝18.6Hz,2H),3.88(s,1H),3.82(d,J＝14.3Hz,20H),3.56(s,4H),3.45(s,1H),3.24(d,J＝6.1Hz,1H),2.94(d,J＝38.7Hz,2H),2.76(d,J＝12.6Hz,1H),2.35(s,2H),2.29(s,3H),2.14(s,1H),2.02(s,2H),1.94(d,J＝10.3Hz,2H),1.86(s,1H),1.83(s,1H),1.81(s,1H),1.79(s,2H),1.77(s,2H),1.76(s,2H),1.75–1.74(m,2H),1.73–1.72(m,1H),1.67(s,1H),1.64(s,2H),1.62(s,1H),1.61(s,2H),1.60–1.58(m,1H),1.54(s,1H),1.53(s,1H),1.52–1.51(m,1H),1.48(s,1H),1.46(s,2H),1.46–1.45(m,1H),1.44–1.42(m,2H),1.37(s,6H),1.34(s,3H),1.32(s,2H),1.20(d,J＝14.1Hz,2H),1.14–1.10(m,9H),1.03(s,1H),1.02(s,3H),0.99(s,1H),0.82(s,3H),0.78(s,3H),0.71(d,J＝11.5Hz,1H)。

(2)核磁共振碳谱

图2为所得甘草次酸-金配合物(产物10)的核磁共振碳谱图。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ200.58,182.48,176.47,160.40,160.18,143.09,141.85,134.65,134.56,131.96,131.76,130.49,129.38,128.47,128.27,128.11,126.90,125.68,119.54,114.38,91.35,78.68,69.53,62.21,62.04,61.86,55.95,55.29,54.89,48.84,48.51,45.46,43.97,43.28,41.05,39.14,37.69,37.09,32.73,31.93,31.84,31.35,31.15,31.02,28.59,28.33,28.09,27.27,26.46,26.35,23.38,23.02,22.91,18.68,17.47,16.39,16.27,15.59。

(3)质谱

图3为所得甘草次酸-金配合物(产物10)的质谱图：ESI-MS(+)[m/z]:2011.06[M-PF₆+H]⁺。

(4)高效液相色谱法(HPLC)

使用HPLC检测所得甘草次酸-金配合物(产物10)的纯度。采用Waters ACQUITYHPLC***(美国马萨诸塞州)进行高效液相色谱分析，配备RP-C18色谱柱(Inertex-C18，250mm×4.6mm，粒径5μm)，流速0.5mL/min，流动相为乙腈/水。梯度洗脱中流动相的比例随时间变化如下表所示：

图4所示，HPLC检测所得甘草次酸-金配合物(产物10)的纯度为96.25％。

实施例2：体外评价甘草次酸-金配合物抗炎和抗氧化应激的作用

1、实验过程

(1)细胞培养

大鼠肌腱干细胞(Tendon stem cells，TSCs)培养于37℃、5％ CO₂恒温培养箱中，待细胞长至80％～90％密度进行传代操作。为了保证干细胞的特性，2～6代的细胞用于实验研究。生长培养基：10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)+1％青霉素/链霉素混合液的DMEM/F-12培养基。

(2)细胞活力检测

以1×10⁵个/ml的细胞密度，将TSCs种于在96孔板中(每孔100μl)，按照实验设计进行分组给药，使用MTT测定细胞的活力。每孔加入20μl MTT，37℃孵育96孔板，孵育4h。使用酶标仪在490nm处检测每个孔的吸光度。

(3)蛋白免疫印迹检测

取上述实施例1制备的本发明甘草次酸-金配合物处理后，先用预冷PBS洗3遍。然后加入细胞裂解液(RIPA:PMSF:蛋白酶抑制＝100:1:1)，充分研磨后至于冰上裂解30min。离心，取上清测蛋白浓度。再加入蛋白上样缓冲液(5×SDS-PAGE)并在95℃金属浴中煮15min使蛋白变性。提取的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后用0.22μmPVDF膜进行转膜。接着封闭2h、敷一抗过夜，孵二抗2h。用ECL化学发光法显影，在化学发光凝胶成像仪上检测蛋白表达。

(4)活性氧水平检测

将细胞载爬片置于24孔板中，并按照2×10⁴个/孔的密度将TSCs种于板中。经分组加药处理后，向每孔中加入1ml经无血清培养基稀释1000倍的DCFH-DA探针，避光至于培养箱中孵育20min，在荧光显微镜下观察并拍照。

(5)丙二醛(malondialdehyde，MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的测定采用丙二醛(MDA)检测试剂盒和还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒，按照说明书操作，在规定波长处测量吸光度。

(6)ELISA试剂盒检测细胞上清中HMGB1的水平

细胞按照分组进行给药处理后，收集细胞上清，按照酶联免疫检测试剂盒说明书进行处理。

2、结果

图5A为不同浓度梯度的本发明甘草次酸-金配合物GA-Au给药对TSCs细胞存活率的影响。结果显示，随着GA-Au浓度梯度的增加，TSCs各组细胞活力有所降低，但无显著性差异。图5B为用相同浓度梯度的GA-Au预处理TSCs 4h后再用H₂O₂(100μΜ)刺激24h，1、2μM的GA-Au预处理促进了细胞存活，结果表明，当GA-Au浓度低于2μM可以增强TSCs的在氧化应激条件下的存活率。

图6A为HMGB1的表达及核质分布情况的免疫荧光结果。结果显示，H₂O₂刺激后HMGB1的表达增加，且胞质中的表达量增加，而GA-Au给药后，HMGB1的表达荧光强度降低。图6B为ELISA试剂盒检测细胞上清液中HMGB1的含量，与对照组相比，H₂O₂刺激后，细胞分泌大量的HMGB1，GA-Au抑制了HMGB1的分泌。

图7为GA-Au预处理对于氧化应激条件下TSCs内脂质过氧化和炎症水平的影响。图7A-C的结果表明，与H₂O₂造模组相比，GA-Au预处理，缓解了TSCs由氧化应激引起的GSH耗竭和脂质过氧化产物MDA的蓄积，增强了细胞的抗氧化能力，同时细胞内ROS水平也被抑制。图7D的WB结果显示，GA-Au预处理组抑制了由于H₂O₂造模而引起的TSCs炎症因子IL-1β、IL-6的蛋白表达。

实施例3：体内评价甘草次酸-金配合物的治疗肌腱病作用

1、实验过程

(1)动物模型的建立及处理

选取体重为90～110g的Wistar大鼠15只，适应性饲养1周后，随机分为3组：对照组、肌腱病模型组、给药组，造模组和给药组以800mg/kg剂量的盐酸环丙沙星(0.5％ CMC-Na助溶)灌胃，空白对照组给以0.5％ CMC-Na灌胃，每日一次，持续两周。两周后给予药物治疗，其中给药组给予取上述实施例1制备的本发明甘草次酸-金配合物GA-Au(5mg/kg)腹腔注射，一天一次，空白对照组和造模组给予0.5％CMC-Na腹腔注射，治疗两周后将大鼠麻醉后进行腹主动脉取血并取大鼠肌腱组织。

(2)免疫组化检测

取大鼠髌腱组织，经4％多聚甲醛固定后，利用乙醇进行逐渐脱水处理，随后经过二甲苯透明化，再进行石蜡包埋，切片处理，并将蜡去除。接着进行抗原修复处理，然后进行封闭。随后加入对应一抗、二抗，最后进行DAB显色处理。完成后使用显微镜观察并拍摄图像。

(3)试剂盒检测大鼠血清中GSH、MDA的表达水平

大鼠取材后，将血浆常温静止4h，离心(3000rmp、15min)后取上清，按照对应的试剂盒操作步骤进行处理。

2、结果

图8A的结果表明，对照组大鼠肌腱组织结构完整，胶原排列紧密；模型组的胶原纤维排列紊乱，出现空泡化，细胞核呈现圆形；与模型组比较，GA-Au给药组胶原排列较为紧密，虽较空白组疏松但未出现断裂变形。图8B-C的GSH和MDA试剂盒结果显示，造模组的大鼠血清GSH被消耗以及脂质过氧化产物MDA蓄积，给药之后这一现象得到了缓解，说明GA-Au抑制了肌腱病进展中氧化应激。图8D的结果表明，与造模组相比，给药组的大鼠血清中炎症因子IL-1β水平也被抑制。图8E的免疫组化结果显示，造模组的HMGB1高表达，给药之后HMGB1的表达被抑制。以上结果说明GA-Au抑制了HMGB1的表达，改善了大鼠肌腱病的进展。

综上所述，本发明所述18β-甘草次酸金配合物可以在体内外抑制HMGB1的表达，具有抗氧化应激和抗炎作用，这为其发挥治疗肌腱病的药理作用提供了依据。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种甘草次酸-金配合物，其特征在于，为18β-甘草次酸-金配合物，其结构如Ⅰ所示：

2.如权利要求1所述甘草次酸-金配合物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

(1)以化合物1为起始原料经两步反应合成关键中间体化合物3，化合物1的化学名为4,5-二(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑，化合物3的化学名为3-(5-溴戊基)-1-(5-羟基戊基)-4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-3-鎓溴化物；

(2)化合物3分别与甘草次酸和化合物8酯化反应制备化合物4和和化合物9，化合物8为BMS-1，化学名为(S)-1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酸)；化合物4的化学名为3-(5-(((1S,4R)-3-((4bS,7S,10aR)-7-羟基-1,1,4b,8,8,10a-六甲基-4-氧-1,4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9,10,10a-十二氢菲-2-基)-1,(4-二甲基环己烷-1-甲酰氧基)戊基)-1-(5-羟基戊基)-4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-3-鎓溴化物；化合物9的化学名为(S)-3-(5-((1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-甲酰)氧基)戊基)-1-(5-羟基戊基)-4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-3-鎓溴化物；

(3)化合物9经银转移法制备氮杂环卡宾溴化金，不处理或经简单处理后，与化合物4反应生成最终的产物10，产物10即18β-甘草次酸金配合物,其化学名为1-(5-(((S)-1-(2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟苯基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)(1-(5-(((2S,4aS,6aS,6bR,10S,12aS)-10-羟基-2,4a,6a,6b,9,9,12a-七甲基-13-氧-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-二十二氢吡啶-2-羰基)氧)戊烷基)-3-(5-羟基戊基)-4,5-二(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-咪唑-2-亚基)金(Ⅰ)。

3.如权利要求1所述甘草次酸-金配合物，其特征在于，制备方法中化合物3的制备方法包括以下步骤：

(1)以化合物1与5-溴戊醇为原料进行回流反应，分离纯化得到中间体化合物2，化合物2的化学名为5-(4,5-双(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-1-基)戊-1-醇；

(2)将化合物2溶于乙腈中与1，5-二溴戊烷进行回流反应，分离纯化得到化合物3。

4.如权利要求1所述甘草次酸-金配合物，其特征在于，制备方法中所述化合物8的制备方法包括以下步骤：

(1)以化合物5与化合物6为原料，在氮气保护下将二者和三苯基膦溶于无水四氢呋喃中反应，分离纯化得到中间体化合物7，化合物5的化学名为3-(氯甲基)-2-甲基-1,1'-联苯；化合物6的化学名为4-羟基-2,6-二甲氧基苯甲醛，化合物7的化学名为2,6-二甲氧基-4-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基)苯甲醛；

(2)将化合物7与D-(+)-2-哌啶酸、DMF混合，分批加入醋酸硼氢化钠，用冰醋酸作催化剂进行反应，分离纯化得到化合物8。

5.如权利要求1所述甘草次酸-金配合物在制备HMGB1抑制剂药物中的应用。

6.如权利要求1所述甘草次酸-金配合物在制备抗非外源感染性炎症药物中的应用。

7.如利要求1所述甘草次酸-金配合物在制备治疗肌腱病药物中的应用。