CN117915964A - 6臂peg水凝胶随时间推移的溶胶-凝胶转换 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种6臂PEG水凝胶组合物，所述种6臂PEG水凝胶组合物的物理性质随时间推移在30分钟内从溶胶转换为凝胶。在本发明中，两种类型的PEG衍生物被包含作为水凝胶的主要组分，并且当所述PEG衍生物中的每种PEG衍生物都溶解在缓冲溶液中，然后将这两种溶液混合时，其在物理性质方面可在30分钟内转换为凝胶态。

Description

6臂PEG水凝胶随时间推移的溶胶-凝胶转换
[技术领域]
本发明涉及一种PEG水凝胶，所述PEG水凝胶的物理性质随时间推移从溶胶转换为凝胶。
[背景技术]
骨关节炎是由于围绕骨关节表面的关节软骨磨损导致的骨暴露、由于包裹和连接关节骨的滑膜发炎导致的疼痛以及关节的结构变形和退变而引起的关节疾病。这主要影响负载体重的关节，这会导致疼痛、限制活动、并导致身体变形，并且可由遗传易感性、主要关节创伤、职业性重复关节使用、肥胖等引起。特别地，这是老年人中的常见疾病，并且随着全球老龄化趋势而逐渐增多。到目前为止，治疗此类骨关节炎的目标并不是修复对关节的结构损伤，而是聚焦于缓解症状、减轻疼痛和延缓疾病进展，以维持关节功能和生活质量。作为一种用于骨关节炎的治疗，正在执行关节内注射疗法，所述关节内注射疗法的相应示例是类固醇注射和透明质酸注射。类固醇注射显示出80％至90％的暂时镇痛效应，但据报道频繁注射会加剧关节损伤，因此建议间隔4至6个月执行注射。已尝试注射透明质酸作为从外部补充因骨关节炎的炎症反应而耗竭的透明质酸的方式，并且被称为粘性补充剂(viscosupplement)。
透明质酸注射疗法(粘液补充疗法(Viscosuplementation))的历史始于20世纪70年代的赛马兽医用药，并且开发并销售了例如和Hylartil-/>的产品。随后，在1987年，/>(来自Seikagaku,Japan)和/>(来自来自FIDIA,Italy)被制造用于治疗关节炎患者。/>由Balazs等人在20世纪90年代作为使用透明质酸的稳步研发(R&D)的结果开发，并且由于使用各种低分子量的单次注射用透明质酸产品的销售，其此后在日本广泛用于关节炎患者延迟手术的辅助疗法，并且改进产品已在包括韩国和欧洲在内的世界各地开发并销售(非专利文件1)。
透明质酸是细胞外基质的天然组分，并且是其中β-D-N-乙酰葡萄糖胺和β-D-葡萄糖醛酸交替组合的直链聚合多糖。当关节内注射时，其充当润滑剂和减震剂以减轻骨关节炎的疼痛并改善膝盖功能。健康年轻人的滑液中的透明质酸的分子量为6,000,000Da，并且动态分析值(2.5Hz)的粘度为约45Pa并且弹性为约117Pa(非专利文件2)。目前，市售透明质酸注射产品可分为由直链透明质酸本身组成的产品和由通过使透明质酸交联而成的透明质酸凝胶形式组成的产品。透明质酸钠水溶液产品，例如和/>的分子量为约500,000Da至3,600,000Da，并且据说表现出在每次2ml重复3次时约3个月并且在每次2ml重复5次时约6个月的止痛效应。交联透明质酸形式的市售产品包括Gel-/>和/>并且这些是经由交联来增加透明质酸的分子量或保护透明质酸被酶分解的部位以增加效应的持续时间的产品。
专利文件1公开了一种方法，所述方法包括使透明质酸(HA)与二乙烯基砜(DVS)在碱性水溶液中反应以形成交联透明质酸凝胶，以及在反应期间根据各种条件(聚合物/DVS比率、透明质酸的分子量和浓度)控制凝胶的溶胀比和交联度。所述交联反应在pH 9和20℃下以15:1至1:5的HA/DVS重量比、50,000Da至8,000,000Da的透明质酸分子量和1％至8％的浓度进行。这种低反应温度是由于HA在高温和碱性溶液中快速分解，这降低分子量，从而减少对交联凝胶的性质的影响。Synvisc一种通过该发明获得的交联透明质酸凝胶注射产品，是商购可得的。
另外，专利文件2公开了一种用于制备生物相容性多糖凝胶组合物的方法，其中所述方法包括使透明质酸与作为多官能交联剂的含有环氧官能团的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)反应，以制备具有粘弹性的透明质酸水凝胶。在pH 9下用0.2％的交联剂和10％的透明质酸进行一次交联以形成醚后，通过添加乙酸将pH校正至2至6，以通过用于形成酯的二次反应形成凝胶。一种高分子量(9,000,000Da)交联透明质酸产品，是使用该发明的技术商购可得的。
专利文件3公开了一种制备透明质酸水凝胶的方法，所述透明质酸水凝胶在与肉桂酸合成光反应性透明质酸衍生物后，通过UV形成环丁烷环。在10Hz条件下用流变仪测量的动态粘弹性值表明，储能模量(G'；弹性)是50Pa至1,500Pa并且损耗模量(G”；粘度)是10Pa至300Pa，因此粘弹性优于现有产品的粘弹性。GEL-(其为使用该发明的技术商购可得的)据说由于对透明质酸的羧基(其为透明质酸降解酶的识别位点)的胺化而在体内具有延长的持久性，其被制备并且与其他市售产品相比透明质酸降解率较低。
因此，由于透明质酸具有在施加到体内后仅几个小时的短半衰期(在体内的持久性)，所以为了延长半衰期和增加持久性，已经尝试了增加组合物的剂量、透明质酸的浓度和分子量的方法。然而，当使用注射器来关节内注射透明质酸时，由于粘度增加，组合物的注射力增大，使得难以将所述组合物输注到组织中，这会引起疼痛并给患者和操作者带来负担。另外，交联透明质酸形式与非交联透明质酸相比具有增大的体内持久性，但仍会在6个月内降解并且具有低生物持久性。
为了解决上述问题，在本发明中，将含有6臂PEG衍生物且其物理性质随时间推移在30分钟内从溶胶转换为凝胶的水凝胶组合物关节内地施用。所述水凝胶组合物可以通过以溶胶态施用而以低粘度注射并降低注射力，并且可以在施用后30分钟内在物理性质方面转换为凝胶态。
[相关领域文件]
[专利文件]
(专利文件1)美国专利号4,582,865
(专利文件2)美国专利号5,827,937
(专利文件3)美国专利号6,031,017
[非专利文件]
(非专利文件1)Advancing Viscosupplementation.2007.Dr Ting Choon Meng
(非专利文件2)Disorders of the knee 2nd ed.JB Lippincott；1982
[技术问题]
本发明涉及提供一种PEG水凝胶组合物，所述PEG水凝胶组合物在物理性质方面随时间推移在30分钟内从溶胶转换为凝胶。
[技术方案]
本发明提供了一种注射剂，所述注射剂包含：第一溶液，所述第一溶液包含具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物；以及第二溶液，所述第二溶液包含具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物，其中所述第一聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8臂PEG-NHS)，所述第二聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)，并且所述第一溶液和所述第二溶液在混合后通过溶胶-凝胶反应形成水凝胶。
另外，本发明提供了一种注射用套件，所述注射用套件包括：第一溶液组，在所述第一溶液组中单独储藏有具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物粉末和pH为4至9的缓冲溶液；以及第二溶液组，在所述第二溶液组中单独储藏有具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物粉末和pH为4至9的缓冲溶液，其中所述第一聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6-臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8-臂PEG-NHS)，所述第二聚乙二醇衍生物包括6-臂聚乙二醇-硫醇(6-臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)，并且所述第一溶液和所述第二溶液在混合后通过溶胶-凝胶反应形成水凝胶。
[本发明的效果]
本发明提供了一种PEG水凝胶，所述PEG水凝胶在物理性质方面随时间推移在30分钟内从溶胶转换为凝胶。
在本发明中，两种类型的PEG衍生物被包含作为水凝胶的主要组分，并且当PEG衍生物中的每种PEG衍生物都溶解在缓冲溶液中，然后将这两种溶液混合时，其在物理性质方面可在30分钟内从溶胶态转换为凝胶态。PEG水凝胶易以液体(溶胶)态注射到体内，并且在注射后，组合物的粘度和弹性增大，并且其在物理性质方面转换为凝胶形式，因此其可以作为粘液补充疗法施加以用于缓解骨关节炎疼痛等。
[附图说明]
图1示出了水凝胶的胶凝时间根据pH的变化。
图2示出了水凝胶的胶凝时间根据6臂PEG衍生物的浓度的变化。
图3和图4示出了水凝胶的粘弹性测量结果。
图5示出了水凝胶的关节疼痛缓解效应的测量结果。
[具体实施方式]
本发明涉及一种注射剂，所述注射剂包含：第一溶液，所述第一溶液包含具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物；以及第二溶液，所述第二溶液包含具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物，其中所述第一聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8臂PEG-NHS)，所述第二聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)，并且所述第一溶液和所述第二溶液在混合后通过溶胶-凝胶反应形成水凝胶。
在下文中，将更详细地描述本发明。
在本发明中，使用两种类型的PEG衍生物，可以通过将所述两种类型的PEG衍生物交联来形成水凝胶。
具体地，根据本发明的注射剂包括单独的第一溶液和第二溶液，所述第一溶液包含第一聚乙二醇衍生物，并且所述第二溶液包含第二聚乙二醇衍生物。在这种情况下，所述第一聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6-臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8-臂PEG-NHS)，并且所述第二聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)。
在下文中，所述6臂PEG-NHS可以被称为第一6臂PEG衍生物，所述8臂PEG-NHS可以被称为第一8臂PEG衍生物，所述6臂PEG-SH可以被称为第二6臂PEG衍生物，并且所述8臂PEG-SH可以被称为第二8臂PEG衍生物。此外，在下文中，所述6臂PEG衍生物可以被理解为6臂PEG-NHS和6臂PEG-SH两者，并且所述8臂PEG衍生物可以被理解为8臂PEG-NHS和8臂PEG-SH两者。
在本发明中，所述“6臂PEG衍生物”或“8臂PEG衍生物”是分别具有来自核心的6个或8个直链PEG基团的衍生物，并且可以具有其中所述直链PEG基团从核心彼此连接的形式。
在本发明中，所述第一溶液可包含具有亲电反应基团的6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6-臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8-臂PEG-NHS)，以及第一溶剂。
在本发明中，“6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6臂PEG-NHS)”可以具有其中6臂PEG的各末端部分被N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)取代的结构。另外，“8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8臂PEG-NHS)”可以具有其中8臂PEG的各末端部分被N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)取代的结构。所述NHS可与硫醇基团反应。
在一个实施方式中，6臂PEG-NHS和/或8臂PEG-NHS可以是由以下化学式1表示的化合物。
[化学式1]
Core-[-(CH2CH2O)n-(CH2)m1-(L)p-(CH2)m2-R]q，
在化学式1中，L是连接基团，并且是
R是
Core(核心)是
n是10至2,500的整数，m1和m2各自独立地为0至3的整数，p是0至1的整数，并且q是为6或8的整数。
当其具有6臂结构时，Core(核心)可以是并且当其具有8臂结构时，核心可以是/>
具体地，所述第一聚乙二醇衍生物可以是6臂PEG-NHS，其中L可以是-(C＝O)-，R可以是并且核心可以是/>此外，n可以是20至400的整数，m1可以是0，m2可以是1至3的整数，p可以是整数1，并且q可以是整数6。
在一个实施方式中，6臂PEG-NHS可以是由以下化学式3表示的化合物。
[化学式3]
在化学式3中，n可以是20至400的整数。
在本发明中，所述第二溶液可以包含具有亲核反应基团的6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)，以及第二溶剂。
在本发明中，“6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)”可以具有其中6臂PEG的各末端部分被硫醇取代的结构。另外，“8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)”可以具有其中8臂PEG的各末端部分被硫醇取代的结构。硫醇可以与NHS反应。
在一个实施方式中，6臂PEG-SH和/或8臂PEG-SH可以是由以下化学式2表示的化合物。
[化学式2]
Core-[-(CH2CH2O)n-(CH2)m1-(L)p-(CH2)m2-R]q，
在化学式2中，L是连接基团，并且是
R是硫醇(SH)基团，
Core(核心)是
n是10至2,500的整数，m1和m2各自独立地为0至3的整数，p是0至1的整数，并且q是为6或8的整数。
当其具有6臂结构时，核心可以是并且当其具有8臂结构时，核心可以是/>
具体地，所述第二聚乙二醇衍生物可以是6臂PEG-SH，R可以是硫醇基团，并且核心可以是此外，n可以是20至400的整数，m1可以是0，m2可以是1至3的整数，p可以是0，并且q可以是整数6。
在一个实施方式中，6臂PEG-SH可以是由以下化学式4表示的化合物。
[化学式4]
在化学式4中，n可以是20至400的整数。
在本发明中，第一聚乙二醇衍生物的分子量可以是5,000Da至100,000Da，并且第二聚乙二醇衍生物的分子量可以是5,000Da至100,000Da。所制备的水凝胶的结构和物理性质可以通过控制分子量来控制。分子量越大，则水凝胶的结构越粗，并且分子量越小，则结构越细。
在本发明中，第一溶剂和第二溶剂中的每一者都可以是缓冲溶液。也就是说，第一聚乙二醇衍生物和第二聚乙二醇衍生物可以各自被包含在缓冲溶液中。可以使用磷酸盐缓冲液或生理盐水作为缓冲液。可以使用相同的溶剂作为第一溶剂和第二溶剂。
在一个实施方式中，第一溶液的pH可以是4至9，并且第二溶液的pH可以是4至9。
进一步，在一个实施方式中，第一溶液中第一聚乙二醇衍生物的浓度可以是1％(w/v)至10％(w/v)，并且第二溶液中第二聚乙二醇衍生物的浓度可以是1％(w/v)至10％(w/v)。随着第一聚乙二醇衍生物的浓度增大并且反应期间溶液的pH更接近碱性，可以缩短形成水凝胶所需的胶凝时间。也就是说，当浓度小于1％时，物理性质变得接近溶胶，并且当浓度超过10％时，由于其形成硬凝胶并表现出破碎形式的物理性质，因此其不适合用于在需要粘弹性的材料中使用。
在本发明中，第一溶液和第二溶液可以在临注射前混合并使用，并且所述第一溶液和所述第二溶液在混合时可以通过溶胶-凝胶反应在30分钟内形成水凝胶。也就是说，第一溶液和第二溶液的混合物可以在注射后形成水凝胶。
在一个实施方式中，具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物和具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物可以以1:0.5至1:2或1:0.7至1:1.1的重量比混合。
水凝胶被定义为在水溶液中膨胀但不溶解的天然或合成衍生物的结构。此外，它还具有可应用于生物医学领域的许多优点。也就是说，它可以吸收和封装水溶液，使其类似于活体组织并且对低分子物质(例如氧、营养物质和代谢物)具有渗透性。此外，由于溶胀的水凝胶的表面结构是柔软的，因此可以减少由于在体内与周围细胞或组织的摩擦而产生的刺激。本发明可提供一种包含两种类型的PEG衍生物的关节炎注射剂，所述关节炎注射剂在体内持久且具有高生物相容性。本发明的注射剂当一次注射到关节(软骨腔)时长时间持续，使得可以获得长期镇痛效应和对关节软骨的保护效应。另外，使用了两种类型的作为生物相容性聚合物的PEG衍生物，所述两种类型的PEG衍生物在中性或碱性水溶液中相互反应，并且因此所述两种类型的PEG衍生物可以在反应的30分钟内经由它们之间的交联和共价键结合在物理性质方面从溶胶转换为凝胶，并且可以形成水凝胶。
也就是说，当第一溶液和第二溶液混合时，具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物和具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物可形成共价键。具体地，具有硫醇基团(SH)的第二聚乙二醇衍生物的硫醇基团和具有NHS的第一聚乙二醇衍生物的NHS形成共价键以形成水凝胶(方案1)。
[方案1]
在本发明中，第一溶液的pH和第二溶液的pH可以彼此不同。在具有相同pH的溶液中，存在注射期间由于快速胶凝而堵塞注射针的风险，因此可以通过使用不同pH条件的缓冲溶液来控制胶凝时间。
在本发明中，当使用6臂PEG-NHS作为第一聚乙二醇衍生物时，可以使用6臂PEG-SH作为第二聚乙二醇衍生物。另外，当使用8臂PEG-NHS作为第一聚乙二醇衍生物时，可以使用8臂PEG-SH作为第二聚乙二醇衍生物。
在一个实施方式中，水凝胶的结构和物理性质可以通过第一聚乙二醇衍生物和/或第二聚乙二醇衍生物的分子量、浓度和反应条件来控制。
根据本发明的注射剂可以关节内地(软骨内地)施用，并且可以在注射后形成水凝胶。
在一个实施方式中，当注射注射剂，具体地，第一溶液和第二溶液的混合物时，300秒内的粘度(损耗模量，G”)可以是1Pa或更小。
另外，在一个实施方式中，当注射注射剂，具体地，第一溶液和第二溶液的混合物时，2,000秒后的弹性(储能模量，G')可以是1,000Pa或更大。
弹性和粘度(G'、G”；Pa)值可指示在凝胶态下的高粘度(1,000Pa或更大)，其中共价键在接近溶胶的低粘度(1Pa或更低)下形成。
根据本发明的注射剂可以减少现有产物由于其高粘度而在关节内注射时因注射力高而引起疼痛的缺点。另外，通过控制交联时间，注射时很容易从注射器以低粘度注射，并且在注射后，两种类型的PEG衍生物可以反应以形成具有优异粘弹性的水凝胶，与此同时缓慢形成共价键。
另外，本发明还提供了一种用于储藏注射剂的套件，即注射用套件。
根据本发明的注射套件可包括：第一溶液组，在所述第一溶液组中单独储藏有具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物粉末和pH为4至9的缓冲溶液；以及第二溶液组，在所述第二溶液组中单独储藏有具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物粉末和pH为4至9的缓冲溶液。
在这种情况下，所述第一聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6-臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8-臂PEG-NHS)，并且所述第二聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)，并且当第一溶液和第二溶液混合后，可通过溶胶-凝胶反应形成水凝胶。
在所述套件中，通过在临使用前将第一聚乙二醇衍生物粉末溶解在第一溶液组的缓冲溶液中来制备第一溶液，通过将第二聚乙二醇衍生物粉末溶解在第二溶液组的缓冲溶液中来制备第二溶液，并且第一溶液和第二溶液可以在混合后使用。
在下文中，将以举例方式详细描述本发明。以下实施例仅说明本发明，而非限制本发明的范围。提供实施例仅是为了完整地公开本发明并向本领域技术人员充分阐明本发明的范围，并且本发明仅由权利要求书的范围来限定。
[发明实施例]
实施例
制备例1.6臂PEG-琥珀酰亚胺基戊二酸酯(6臂PEG-SG)的合成
<方案2>
根据以上方案2合成6臂PEG-琥珀酰亚胺基戊二酸酯(6臂PEG-SG)。
在室温下将化学式5的化合物溶解在二氯甲烷中后，添加三乙胺以制备反应溶液。在向反应溶液中添加戊二酸酐后，将所述反应溶液在室温下搅拌20小时至24小时。用14％氯化铵水溶液洗涤反应溶液，并且当各层分离时，收集下层有机溶液层。使用二氯甲烷萃取水溶液层。用硫酸镁去除水分后，将合并的有机溶液层在二***中沉淀，并浓缩溶剂。将沉淀物过滤出并在室温下真空干燥24小时，以获得化学式6的化合物。
将化学式6的化合物溶解在二氯甲烷中，并向其中添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)以制备反应溶液。将反应溶液在室温下搅拌15小时至20小时。在反应后，使用玻璃过滤器过滤作为副产物的二环己基脲(DCU)，并将过滤出的溶液在浓缩溶剂后在二***中沉淀。在过滤出沉淀后，在55±5℃下将所述沉淀溶解在乙酸乙酯中并在0℃至5℃下重结晶15小时至17小时。将重结晶物过滤出，用二***洗涤3次，并在室温下真空干燥24小时，以获得重均分子量为40,000的化学式3的化合物(n＝151)。
制备例2.6臂PEG-SH的合成
<方案3>
根据以上方案3合成6臂PEG-SH。
在室温下将化学式7的化合物溶解在二氯甲烷中后，添加三乙胺以制备反应溶液。将对甲苯磺酰氯添加到反应溶液中并在室温下搅拌20小时至24小时。用14％氯化铵水溶液洗涤反应溶液，并且当水溶液层分离时，收集下层有机溶液层。使用二氯甲烷萃取水溶液层。用硫酸镁去除水分后，将合并的有机溶液层在二***中沉淀，并浓缩溶剂。将沉淀物过滤出并在室温下真空干燥24小时，以获得化学式8的化合物。
将化学式8的化合物溶解在水中后，添加硫脲以制备反应溶液。将反应溶液在回流温度下搅拌15小时至20小时。在此之后，添加1N NaOH溶液并在回流温度下搅拌2小时。将二氯甲烷添加到反应溶液中并萃取两次。使用硫酸镁去除水分后，将合并的有机层在二***中沉淀，并浓缩溶剂。将沉淀物过滤出并在室温下真空干燥24小时以获得重均分子量为40,000的化学式4的化合物(n＝151)。
实施例1至实施例5
将制备例1中制备的6臂PEG-SG和制备例2中制备的6臂PEG-SH分别添加到PBS缓冲溶液中以制备溶液1和溶液2，并且根据通过下表1的方法制备水凝胶的条件调节缓冲溶液的pH。
[表1]
实验例1.根据溶液1的pH测量胶凝时间
将各1ml的实施例1至实施例5的溶液1和溶液2放入玻璃试管中，并涡旋10秒，然后在室温下确认胶凝时间。此时，当玻璃试管翻转时测量胶凝时间，混合溶液无流动，并且固定至试管底部并硬化而不移动。重复测试3次，并将平均值和标准差绘制成图表。
图1示出了水凝胶的胶凝时间根据pH的变化。
如图1所示，实施例1至实施例5显示出胶凝时间根据溶液1的pH而缩短的趋势，并且特别地在实施例3至实施例5中，可以看出，随着溶液1的pH升高，胶凝时间大大缩短。实施例1至实施例3的胶凝时间测量为约15分钟，实施例4的胶凝时间测量为小于12分钟，并且实施例5的胶凝时间测量为小于10分钟。
实施例6和实施例7
将制备例1中制备的6臂PEG-SG和制备例2中制备的6臂PEG-SH分别添加到PBS缓冲溶液中以制备溶液1和溶液2，并且通过下表2的方法制备水凝胶。
[表2]
实验例2.根据6臂PEG衍生物的浓度测量胶凝时间
使用实施例3、实施例6和实施例7的溶液1和溶液2，以与实验例1相同的方式测量胶凝时间。
图2示出了水凝胶的胶凝时间根据6臂PEG衍生物的浓度的变化。
如图2所示，可以看出随着6臂PEG衍生物浓度增大，胶凝时间缩短。
实验例3.物理性质测试-流变测试
“粘性”是指粘性，并且“弹性”是指某种东西恢复到原始状态的力，也就是弹簧被拉动时恢复到其原始状态的力。这两种性质的组合被称为粘弹性。当对物体施加力时，会发生具有弹性和粘性两者的流动现象，并且一般来说，聚合物溶液具有粘性和弹性(恢复力)两者，即粘弹性。
如实施例中那样使用6臂PEG衍生物制备水凝胶，并执行流变仪分析以测量水凝胶的粘弹性。使用DHR1(Discovery混合流变仪，TA Instruments Ltd.,USA)设备在37℃下，使用40mm板执行分析，并以0.5mm间隙、1％应变和2.5Hz频率振荡模式执行流变测试。
图3和图4示出了水凝胶的粘弹性测量结果。
在图3中，G'是作为储能模量或弹性模量的指示弹性的数值，并且样品的强度越高并且抗变形性越大，则该值越高。G”是指示粘度的数值。Tanδ是G"/G'，并且该值越大，则粘度比弹性越大。此外，复数粘度是反映粘度和弹性两者的数值，并且表示相对于外力的变形程度。
图3的(A)和(B)是用实施例7的组合物制备的水凝胶，(C)和(D)示出作为对照组的1％透明质酸(HA；高粘度3.3，3,500,000Da至4,200,000Da；Bioland)的流变仪分析结果。
如图3所示，作为对照组的1％透明质酸的G'弹性值是约33Pa至35Pa，G”粘度值是13Pa至16Pa，tanδ值是0.4，并且复数粘度是2.3Pa s至2.5Pa s。也就是说，1％透明质酸表现出不随时间推移变化的恒定粘度和弹性。
另一方面，在实施例7的水凝胶的情况下，最初6秒内的G'弹性值为0.32Pa，并且G”粘度值是0.09Pa(水在10℃下的粘度，0.001Pa)，指示低粘度。然而，随着时间推移，粘度和弹性显著增大，其中G'是10,000Pa或更大，G"是1,000Pa或更大，tanδ值是0.03，并且1500秒(25分钟)时的复数粘度是2,000Pa·s。
另外，图4示出了实施例7的水凝胶与作为对照组的1％ HA的复数粘度比较结果。
如图4所示，与1％ HA的恒定值相比，实施例7的水凝胶在初始分析的约300秒内表现出比对照组更低的粘弹性，但据证实其在约300秒后表现出更高的粘弹性。
实验例4.确认减轻关节疼痛的效应
使用通常用作关节炎模型的大鼠MIA关节炎诱导模型，确认了实施例7和阳性对照组的注射剂的减轻关节炎疼痛的功效。
首先，在将大鼠的右后膝盖周围脱毛后，将50μl(60mg/ml)的骨关节炎诱导物质MIA(碘乙酸单钠，Sigma Chemical Co.Ltd，目录号I9148)使用Hamilton注射器注射到膝关节腔中以诱发骨关节炎(Corinne guingamp等人,Mono-iodoacetate-inducedexperimental Osteoarthritis,Arthritis&Rheumatism,1997,40(9),1670-1679，KaiGong等人,Journal of the Formosan medical association,2011,110(3),145-152)。
在MIA注射后1周时，将各50μl的实施例7的注射剂和作为阳性对照组的1％(10mg/ml)透明质酸钠注射到膝关节腔中。
通过以下方式来评估减轻关节疼痛的效应：在骨关节炎诱导前(第0周)并且在骨关节炎诱导后第1周、第2周、第3周和第4周使用失能测试仪(Stoelting Co.,Wood Dale,IL)作为脚秤测量左后爪和右后爪中每一者的重量(g)，以及根据以下等式1计算右后爪重量分布的变化(HPWD，％)。每只动物测量爪子重量3次。
右后爪的重量变化率是通过计算由于右腿关节炎引起的右膝疼痛而施加在左后爪上的重量的百分比来表示的值，并且为测量值的约50％被认为是正常没有关节炎的。
[等式1]
右后爪重量(％)＝[右后爪重量/(右后爪重量+左后爪重量)]×100
通过计算右后爪的重量与两个后爪的重量的比率，将测量值表示为平均值(％)±标准误差。
测量结果显示在表3和图5中。
[表3]
在表3中，各值表示为平均值±标准偏差(S.D)，并且通过单因素方差分析或学生t检验((N＝7).*P<0.05，**P<0.01：赋形剂对照组(G2))执行参数比较。
如表3和图5所示，在赋形剂对照组(在关节炎诱导后未进行水凝胶处理的组，G2)的情况下，右后爪的重量变化率从第1周到第4周保持低至26-33％，而在实施例7的注射剂(G3)的情况下，在施用测试物质后右后爪上的承载的重量变化率在第3周恢复到38％并且在第4周恢复到40％，并且因此观察到显著的药效。阳性对照组(G4)的右后爪上承载的重量比也在第3周时增大至34％并且在第4周时增大至36％，由此表明根据本发明的注射剂具有与阳性对照组类似或比阳性对照组更好的疼痛缓解效应。
[工业实用性]
在本发明中，两种类型的PEG衍生物被包含作为水凝胶的主要组分，并且当PEG衍生物中的每种PEG衍生物都溶解在缓冲溶液中，然后将这两种溶液混合时，其在物理性质方面可在30分钟内从溶胶态转换为凝胶态。PEG水凝胶易以液体(溶胶)态注射到体内，并且在注射后，组合物的粘度和弹性增大，并且其在物理性质方面转换为凝胶形式，因此其可以作为粘液补充疗法等施加以用于缓解骨关节炎疼痛。

Claims (17)

1.一种注射剂，所述注射剂包含：
第一溶液，所述第一溶液包含具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物；以及
第二溶液，所述第二溶液包含具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物，
其中所述第一聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6-臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8臂PEG-NHS)，
所述第二聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)，并且
所述第一溶液和所述第二溶液在混合后通过溶胶-凝胶反应形成水凝胶。
2.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺和/或所述8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺是由以下化学式1表示的化合物：
[化学式1]
Core-[-(CH2CH2O)n-(CH2)m1-(L)p-(CH2)m2-R]q，
在所述化学式1中，L是连接基团，并且是
R是
Core是
n是10至2,500的整数，m1和m2各自独立地为0至3的整数，p是0至1的整数，并且q是为6或8的整数。
3.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺是由以下化学式3表示的化合物：
[化学式3]
在所述化学式3中，n是20至400的整数。
4.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述6臂聚乙二醇-硫醇和/或所述8臂聚乙二醇-硫醇是由以下化学式2表示的化合物：
[化学式2]
Core-[-(CH2CH2O)n-(CH2)m1-(L)p-(CH2)m2-R]q，
在所述化学式2中，L是连接基团，并且是
R是硫醇(SH)基团，
Core是
n是10至2,500的整数，m1和m2各自独立地为0至3的整数，p是0至1的整数，并且q是为6或8的整数。
5.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述6臂聚乙二醇-硫醇是由以下化学式4表示的化合物：
[化学式4]
在所述化学式4中，n是20至400的整数。
6.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述第一溶液中的所述第一聚乙二醇衍生物的分子量是5,000Da至100,000Da，并且
所述第二溶液中的所述第二聚乙二醇衍生物的分子量是5,000Da至100,000Da。
7.根据权利要求1所述的注射剂，其中在所述第一溶液和第二溶液中，溶剂均为缓冲溶液，
所述第一溶液的pH是4至9，并且
所述第二溶液的pH是4至9。
8.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述第一溶液中的所述第一聚乙二醇衍生物的浓度是1％(w/v)至10％(w/v)，并且
所述第二溶液中的所述第二聚乙二醇衍生物的浓度是1％(w/v)至10％(w/v)。
9.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述第一溶液和所述第二溶液在临注射前混合，并且
所述第一溶液和所述第二溶液的混合物在注射后形成水凝胶。
10.根据权利要求1所述的注射剂，其中所述第一聚乙二醇衍生物与所述第二聚乙二醇衍生物的重量比是1:0.5至1:2。
11.根据权利要求9所述的注射剂，其中当所述第一溶液和所述第二溶液混合时，所述第一聚乙二醇衍生物和所述第二聚乙二醇衍生物形成共价键。
12.根据权利要求9所述的注射剂，其中当注射所述第一溶液和所述第二溶液的所述混合物时，300秒内的粘度(损耗模量，G”)是1Pa或更小。
13.根据权利要求9所述的注射剂，其中当注射所述第一溶液和所述第二溶液的所述混合物时，2,000秒后的弹性(储能模量，G')是1,000Pa或更大。
14.根据权利要求1所述的注射剂，所述注射剂是关节内注射剂。
15.根据权利要求1所述的注射剂，所述注射剂具有抑制由关节炎疾病引起的疼痛或保护关节软骨的效应。
16.一种注射用套件，所述注射用套件包括：
第一溶液组，在所述第一溶液组中单独储藏有具有亲电反应基团的第一聚乙二醇衍生物粉末和pH为4至9的缓冲溶液；以及
第二溶液组，在所述第二溶液组中单独储藏有具有亲核反应基团的第二聚乙二醇衍生物粉末和pH为4至9的缓冲溶液，
其中所述第一聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(6-臂PEG-NHS)和/或8臂聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(8臂PEG-NHS)，
所述第二聚乙二醇衍生物包括6臂聚乙二醇-硫醇(6臂PEG-SH)和/或8臂聚乙二醇-硫醇(8臂PEG-SH)，并且
第一溶液和第二溶液在混合后通过溶胶-凝胶反应形成水凝胶。
17.根据权利要求16所述的套件，其中通过在临使用前将所述第一聚乙二醇衍生物粉末溶解在所述第一溶液组的所述缓冲溶液中来制备第一溶液，
通过将所述第二聚乙二醇衍生物粉末溶解在所述第二溶液组的所述缓冲溶液中来制备第二溶液，以及
将所述第一溶液和所述第二溶液混合。
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