CN117915925A - 用于在动物中治疗骨关节炎的间充质干细胞 - Google Patents

用于在动物中治疗骨关节炎的间充质干细胞 Download PDF

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CN117915925A CN202280056503.3A CN202280056503A CN117915925A CN 117915925 A CN117915925 A CN 117915925A CN 202280056503 A CN202280056503 A CN 202280056503A CN 117915925 A CN117915925 A CN 117915925A
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Abstract

本发明涉及用于治疗犬科动物和猫科动物的骨关节炎的间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物。本发明还涉及包含从外周血分离的MSC的药物组合物。

Description

用于在动物中治疗骨关节炎的间充质干细胞
技术领域
本发明还涉及用于在犬科动物和猫科动物中治疗骨关节炎的间充质干细胞。
背景技术
骨关节炎(OA)是兽医实践中最常见的关节疾病之一，是关节代谢紊乱和炎症反应的结果。它在大约20％的一岁以上的狗中普遍存在，其特征是滑膜关节进行性退化和重塑，最终导致慢性疼痛、不适、关节肿胀和跛行。此外，近40％的猫显示出OA的临床病征，90％的12岁以上的猫显示OA的放射学证据。体重管理、量身定制的运动和OA的药物治疗，如非甾体抗炎药(NSAID)和皮质类固醇，主要侧重于疼痛缓解和炎症反应的治疗，但无法减缓疾病进展或逆转病理状况。持续高剂量的某些老一代非甾体抗炎药与胃肠道、肾脏和肝脏异常有关。皮质类固醇提供相当短的疼痛缓解，并可能诱导进一步的软骨损伤。因此，对犬和猫OA的有效和长期治疗方案的需求非常高。
间充质干细胞(MSC)因其免疫调节特性而被认为是一种潜在的替代品，可以抑制OA的炎症过程，在很短的时间内减缓其进展，甚至导致持续损伤的逆转。几项犬类研究已经调查了它们治疗骨关节炎的安全性和有效性，并显示出非常有趣的结果。
这些犬类研究大多使用来源于脂肪组织或骨髓(BM)的自体MSC，所述自体MSC通过在受影响的关节中的关节内注射进行施用。然而，由于骨关节炎经常影响狗和猫的多个关节，这种MSC治疗非常昂贵和耗时。关节内注射是一种侵入性手术，需要镇静、经验和有针对性的诊断。
在某些情况下，使用同种异体或异种MSC是更有利的选择，因为它们提供了健康和高质量干细胞供体的严格选择。它们允许生产现成的产品，避免了从每个患者身上侵入性地采集和耗时地培养MSC。由于犬和猫MSC的培养能力相对较低，异种(例如人或马)MSC可以有利地使用，特别是用于商业应用，例如用于治疗犬或猫的OA。此外，异种间充质干细胞不含可传播的物种特异性病原体。
在某些情况下，使用天然MSC是一个有利的选择，因为它们允许生产即用型产品，只需最少的制造和处理，从而降低生产成本。
本领域仍然需要改进MSC的使用，以减缓猫和狗家庭中OA的疾病进展和/或甚至逆转OA的病理状况。本发明旨在解决上述缺点中的至少一个。
发明内容
本发明及其实施方案用于提供对上述缺点中的一个或多个缺点的解决方案。为此，本发明涉及根据权利要求1所述的用于治疗犬科动物和猫科动物骨关节炎的间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物。在实施方案中，所述MSC是静脉内施用的。在实施方案中，所述MSC是天然MSC。在实施方案中，所述MSC是异种MSC。用于本发明的MSC的优选实施方案显示在权利要求2-19中的任一项中。在根据权利要求18的特别优选的实施方案中，所述治疗是治疗被诊断有或患有骨关节炎的犬科动物和猫科动物的跛行和/或关节疼痛。
在第二方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含天然的外周血来源的MSC，所述MSC是动物来源的，并且存在于根据权利要求20所述的无菌液体中。
与局部关节内注射的MSC相比，静脉内施用的MSC可能到达多个关节，局部关节内注射的MSC仅到达局部关节，并且必须分别应用于每个受影响的关节。静脉内施用是一种非侵入性程序，不需要镇静。这种侵入性手术和/或镇静可能涉及风险，尤其是对于已经有更高风险发展为骨关节炎的老年患者。因此，通过静脉内(IV)注射全身施用MSC在治疗应用中提供了显著的益处。
附图描述
图1显示了，三个时间点的狗跛脚评估的概述：第0天-用根据本发明的一个实施方案的天然MSC治疗当天，随访1——治疗后3周，以及随访2——治疗后6周。
图2显示了三个时间点的狗的运动范围(ROM)评分的概述：第0天-用根据本发明的一个实施方案的天然MSC治疗当天，随访1——治疗后3周，以及随访2——治疗后6周。
图3显示了三个时间点的狗的关节积液评分的概述：第0天-用根据本发明的一个实施方案的天然MSC治疗当天，随访1——治疗后3周，以及随访2——治疗后6周。
图4显示了用根据本发明的一个实施方案的天然MSC或对照产品治疗的不同组狗的跛行过程(A)、关节疼痛(B)、关节积液(C)评分、运动范围(D)、平均最大力(E)、对称指数(F)和平均力(G)(平均值±SD)。
图5显示了在使用伴刀豆球蛋白A刺激的犬外周血单个核细胞(PBMC)的混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，用根据本发明的一个实施方案的100.000个ePB-MSC(低剂量)、300.000个ePB-MSC(目标剂量)或1.500.000个ePB-MSC(高剂量)或生理盐水(对照)治疗患有手术诱导的骨关节炎的狗之前(第-7天，左)和之后(第28天，右)的PBMC增殖，*p值<0.05。
图6显示了在伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的犬外周血单个核细胞(PBMC)的混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，在接受不同剂量的根据本发明实施方案的ePB-MSC或安慰剂(即T1：安慰剂(对照组)之前(第-7天，左)和之后(第126天，右)的PBMC增殖，T2：单次注射推荐剂量(＝30.000ePB-MSC)，T3：单次注入3倍推荐剂量，T4：单次注射5倍推荐剂量，T5：以推荐剂量反复注射(n＝3)，和T6：以5倍推荐剂量反复注射(n＞3)。
图7显示了MLR测定的阴性对照、阳性对照和免疫调节样品上清液中TGF-β1的浓度(平均值±SD)。
图8显示了MLR的阴性对照、阳性对照和免疫调节样品的上清液中的TNF-α浓度(平均值±SD)。
图9显示了MLR测定的阴性对照、阳性对照和免疫调节样品上清液中的PGE2浓度(平均值±SD)。
图10显示了在第-21天、第14天、第28天和第42天对第0天归一化的HA浓度的箱形图可视化(*p值<0.017)。
图11显示了基于事后分析(*p值<0.05)的HA浓度(ng/mL)的箱形图可视化。填充的方框：对照；虚线框：案例。
图12显示了在第21天、第14天、第28天和第42天对第0天归一化的PGE2浓度的箱形图可视化(*p值<0.017)。
发明详述
本发明涉及用于治疗犬科动物和猫科动物骨关节炎(OA)的天然MSC，其中所述MSC可以通过静脉内注射施用。与必须分别应用于每个受影响关节的局部关节内注射相比，一次静脉内注射是到达多个关节的全身施用。此外，静脉内注射是一种非侵入性程序，不需要镇静。这种侵入性程序和/或镇静可能涉及风险，尤其是对于老年哺乳动物患者，他们发展骨关节炎的风险已经更高。因此，通过静脉内(IV)注射全身施用MSC在治疗应用中提供了显著的益处。
定义
除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术术语和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
如本文所用，以下术语具有以下含义：
除非上下文另有明确规定，否则本文中使用的“a”、“an”和“the”既指单数也指复数。例如，“acompartment”是指一个或多个区室。
此处所用的“约”指的是可测量值，如参数、量、持续时间等，是指包含特定值的+/-20％或更小，优选+/-10％或更小，更优选+/-5％或更小，甚至更优选+/-1％或更小，还更优选+/-0.1％或更小的变化，到目前为止，这样的变化适合于在所公开的发明中执行。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体公开。
此处使用的“包含”(“Comprise”、“comprising”、“comprises”和“comprised of”)和与“包括”(“include”、“including”、“includes”)或“含有”(“contain”、“containing”、“contains”)同义，并且是包括性或开放式术语，其规定了所跟随的内容的存在，例如组分，并且不排除或避免本领域已知或其中公开的附加的、未列举的组件、特征、元件、构件、步骤的存在。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似元件，而不一定用于描述先后顺序或时间顺序，除非另有说明。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施方案能够以除本文所描述或图示之外的其他顺序操作。
通过端点对数值范围的引用包括该范围内包含的所有数字和分数，以及所引用的端点。
尽管术语“一个或多个”或“至少一个”，例如一组成员中的一个或更多或至少一个成员，本身是明确的，但通过进一步的例证，该术语包括对所述成员中的任何一个或所述成员的任何两个或更多个的引用，例如，所述成员的≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等，直至所有所述成员。
除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术术语和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括说明书中使用的术语的定义，以更好地理解本发明的教导。此处使用的术语或定义仅用于帮助理解本发明。
在整个说明书中，对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合实施方案描述的特定特点、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在本说明书的各个地方的出现不一定都指同一实施方案，而是可以指同一实施方案。此外，特定的特点、结构或特性可以以任何合适的方式组合，如本领域技术人员从本公开中，在一个或多个实施方案中显而易见的。此外，虽然本文所述的一些实施方案包括一些但不包括其他实施方案中包括的其他特征，但不同实施方案的特征的组合应在本发明的范围内，并形成不同的实施方案，如本领域技术人员所理解的。例如，在以下权利要求中，任何要求保护的实施方案都可以以任何组合使用。
术语“间充质干细胞”、“MSC”或“间充***”是指表达一组特定表面抗原并可分化为各种细胞类型的多能自我更新细胞，包括但不限于体外培养或体内存在的脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。
术语“分离”是指从细胞培养物或生物样品(如血液)中对细胞进行物理鉴定和分离，这可以通过应用适当的细胞生物学技术来进行，这些技术要么基于对细胞培养物的检查，要么基于与标准品相对应的细胞的表征(以及在可能和需要的情况下进行物理分离)，或根据抗原的存在/不存在和/或细胞大小对细胞进行自动分选(例如通过FACS)。在一些实施方案中，术语“分离”("isolating")或“分离”("isolation")可包括进一步的细胞物理分离和/或定量步骤，特别是通过进行流式细胞术。
本文中使用的术语“体外”表示身体以外或身体的外部。此处使用的术语“体外”应理解为包括“离体”("ex vivo")。术语“离体”通常指从体内移除并在体外(例如，在培养容器或生物反应器中)维持或繁殖的组织或细胞。
术语“传代”(passage)或“传代”(passaging)在本领域中是常见的，指的是将培养的(间充质干)细胞从培养底物上分离和解离以及培养的(间充质干)细胞彼此分离和解离。为了简单起见，在贴壁培养条件下第一次生长细胞后进行的传代通常称为“第一次传代”(或传代1，P1)。细胞可以传代至少一次，优选两次或多次。传代1之后的每个传代都用增加1的数字表示，例如传代2、3、4、5或P1、P2、P3、P4、P5等。
术语“细胞培养基”或“细胞培养基质”或“培养基”是指包含可用于细胞的维持或生长的营养物质的含水液体或凝胶状物质。细胞培养基可以含有血清或无血清。细胞培养基可以包含生长因子或补充生长因子。
本文所用的术语“生长因子”是指一种生物活性物质，其影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移，并可能单独或在被其他物质调节时影响生物体的发育、形态和功能变化。生长因子通常可以通过作为配体与细胞中存在的受体(例如，表面或细胞内受体)结合而起作用。
在本上下文中，MSC的“自体”施用是指来自供体的MSC被施用给受体，其中受体和供体都是相同的。
在本上下文中，MSC的“同种异体”施用是指将供体的MSC施用给受体，其中受体和供体都属于同一物种，但不是同一个。
本上下文中MSC的“异种”施用是指来自供体的MSC被施用给受体，其中受体和供体来自不同物种。
在本发明的上下文中，“天然MSC”(Native MSC)是指未暴露于刺激环境(如炎症介质)的MSC。如本文所用，“炎性环境”或“炎症状况”是指以(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子增加；和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的减少为特征的状态或状况。
术语“抗炎”、“抗炎症”和“免疫抑制”，“免疫抑制的”是指以局部炎症(如但不限于热、疼痛、肿胀、发红和功能丧失)的至少一种迹象减少和/或以全身状态变化为特征的任何状态或状况，所述全身状态变化的特征是(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子的减少；和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的增加。
本发明的“群体倍增时间”或“PDT”将通过以下公式计算：PDT＝T/(ln(Nf/Ni)/ln(2))，其中T是达到80％汇合的细胞培养时间(以天为单位)，Nf是细胞脱附后的最终细胞数，而Ni是时间点0时的初始细胞数。
术语“抗凝血剂”是指一种可以抑制血液凝固的组合物。本发明中使用的抗凝剂的实例包括EDTA或肝素。
本发明中的术语“血沉棕黄层”应理解为未凝固血液的级分，优选地通过密度梯度离心获得，而该级分富含白细胞和血小板。
术语“相间血液”(blood-inter-phase)应理解为血液的级分，优选地通过密度梯度获得，位于主要由红细胞和多形核细胞组成的底部级分和主要由血浆组成的上部级分之间。相间血液是血液单个核细胞(BMC)的来源，包含单核细胞、淋巴细胞和MSC。
本文中使用的术语“悬浮直径”被理解为细胞在悬浮液中的平均直径。测量直径的方法在本领域中是已知的。可能的方法是流式细胞术、共聚焦显微术、图像细胞仪或本领域中已知的其他方法。
术语“治疗有效量”是指对减轻症状或改善疾病状况有效的化合物或组合物的最小量或浓度。
术语“治疗”是指减少或防止病理状况或病症发展或进展的治疗、预防或防止性措施。
“骨关节炎”(OA)，也称为“退行性关节病”(DJD)，是由软骨退化引起的关节炎症进行性恶化。在健康的关节中，软骨起到垫子的作用，使关节在整个运动范围内平稳移动。在骨关节炎的情况下，由于年龄、损伤、重复压力或疾病等因素，这种软骨垫开始分解。失去这种保护垫会导致疼痛、炎症、活动范围减少和骨刺的发展。虽然身体的任何关节都可能发展成骨关节炎，但这种情况最常见的是影响四肢和下脊柱。对于狗和猫等动物来说，OA的典型视觉症状可能包括僵硬、跛脚或起床困难；无精打采、不愿奔跑、跳跃或玩耍；体重增加；易怒或行为变化；被抚摸或触摸时的疼痛；大小便姿势困难，或在家中发生事故；和/或四肢和脊椎上的肌肉质量损失。
术语“患者”、“对象”、“动物”或“哺乳动物”可互换使用，指的是待治疗的哺乳动物对象。优选地，哺乳动物是犬科动物或猫科动物，例如狗或猫。
本发明中的“猫科(feline)”或“猫科动物(felines)”是指猫科(Felidae)的猫。这个家族的成员也被称为猫科的动物(felid)。现存的猫科分为两个亚科：豹亚科(Pantherinae)和猫亚科(Felinae)。豹亚科包括五个豹属(Panthera)和两个云豹属(Neofelis)的种，而猫亚科包括10个属中的其他34个种，其中包括家猫、猎豹、薮猫(servals)、猞猁和美洲狮。
本发明中的“犬科(canine)”或“犬科动物(canines)”是指犬科(Canidae)的类狗食肉动物。这个家庭的成员被称为犬科动物(canid)。犬科中有三个亚科，分别是已灭绝的Borophaginae亚科和Hesperocyoninae亚科，以及现存的犬亚科(Caninae)。犬亚科被称为犬科动物，包括家养狗、狼、狐狸、郊狼、豺狼和其他现存和已灭绝的物种。
“混合淋巴细胞反应(MLR)”测定法传统上用于研究外部试剂是否刺激或抑制T细胞增殖。通过使用MLR测定，可以研究MSC的免疫调节特性。对于这种MLR测定，应答T细胞用荧光染料标记，当其暴露于特定的光频率时，荧光染料会亮起绿色。然后用植物促***原伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激这些应答T细胞以诱导或刺激增殖。ConA是一种不依赖抗原的促***原，可作为替代T细胞刺激物。这种凝集素经常在T细胞刺激实验中用作抗原呈递细胞的替代物。伴刀豆球蛋白A与细胞表面的糖蛋白不可逆地结合，使T细胞增殖。这是一种快速刺激转录因子和细胞因子产生的方法。当T细胞开始***时，染料会分布在其子细胞上，因此染料会随着每次细胞***而连续稀释。因此，可以通过观察颜色的减少来测量T细胞的增殖量。因此，为了研究MSC的免疫调节特性，将这些MSC添加到受刺激的应答T细胞中，并共同孵育几天。包括适当的阳性和阴性对照，以查看测试是否成功进行。在孵育期结束时，使用流式细胞术测量T细胞增殖量，从而能够观察MSC是否抑制T细胞增殖。
发明描述
在第一方面，本发明涉及间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其用于治疗犬科动物和猫科动物的骨关节炎(OA)，或用作治疗犬科动物和猫科动物OA的方法，或用于制备用于治疗犬科动物和猫科动物中OA的药物，其中所述MSC优选是天然的并且优选静脉内施用。
MSC由于其免疫调节特性而被提议用于治疗炎症相关疾病。这些免疫调节特性可以抑制骨关节炎(OA)等放大的炎症过程，在很短的时间内减缓其进展，甚至导致持续损伤的逆转。先前的(犬类)研究已经调查了它们治疗骨关节炎的安全性和有效性，并显示了非常有趣的结果。这些犬类研究大多使用来源于脂肪组织或骨髓(BM)的自体MSC，所述自体MSC通过关节内注射施用于受影响的关节中。然而，由于OA经常影响类狗和类猫哺乳动物的多个关节，这种MSC治疗非常昂贵和耗时。此外，关节内注射是一种侵入性手术，需要镇静、经验和有针对性的诊断。
因此，MSC的全身施用可以通过静脉内(IV)施用(例如通过注射或输注)有利地实现，在治疗应用中提供了显著的益处。
所述犬科和猫科动物可以是犬科的任何类狗食肉动物，优选犬亚科，更优选家犬(Canis familyaris)；或猫科的任何猫，优选猫亚科的猫，更优选家猫(Felis catus)。
在一个实施方案中，所述用于使用的MSC是天然的。这种天然MSC尚未首先在体外暴露于刺激剂，例如炎性介质或炎性环境。这种炎性环境是指以(i)至少一种促炎免疫细胞、促炎细胞因子或促炎趋化因子的增加；和(ii)至少一种抗炎免疫细胞、抗炎细胞因子或抗炎趋化因子的减少为特征的状态或病况。使用天然MSC有时是一个有利的选择，因为它们允许生产即用型产品，生产和处理最小化，从而降低生产成本。
优选地，MSC的细胞大小在10μm至100μm之间，更优选在15μm至80μm之间、更优选在20μm至75μm之间、更加优选在25μm至50μm之间。在一个实施方案中，根据本发明使用的MSC是通过过滤***按大小选择的，其中使用40μm过滤器使细胞通过双重过滤步骤过滤。优选两个或更多个过滤步骤。后者提供了大量的单细胞并避免了细胞聚集体的存在。这种细胞聚集体在通过冷冻保存细胞的过程中可能导致细胞死亡，并且都可能对细胞的进一步下游应用产生影响。例如，当静脉内施用时，细胞聚集体可能会增加发生毛细血管栓塞的风险。
根据本发明使用的MSC可以来源于各种组织或体液，特别是来自血液、骨髓、脂肪组织或羊膜组织。据报道，MSC的骨髓采集与出血、慢性疼痛、神经血管损伤甚至死亡有关。脂肪组织作为MSC的来源被认为是一种更安全的选择。然而，从脂肪组织中采集MSC仍然需要在供体动物身上切开，因此这仍然是一种侵入性手术。来源于血液的MSC显示出与来源于骨髓和脂肪组织的MSC相似的形态。因此，优选地，MSC来源于血液，包括但不限于脐带血和外周血。更优选地，MSC来源于外周血。血液不仅是一种无创、无痛的来源，而且采集简单、安全，因此易于获取。MSC或包含MSC的血液可以来源于所有哺乳动物，包括但不限于人类、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物、伴侣动物和实验动物，例如小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、马、猪和灵长类动物，例如猴子和猿；尤其是马、人、猫、狗、啮齿动物等。在一个实施方案中，所述的来源是马。特别地，MSC可以来源于外周血，优选马的外周血，其允许每年多次MSC采集，而供体动物的不适或病态最小。
在某些情况下，使用同种异体或异种MSC是更有利的选择，因为它们提供了健康和高质量干细胞供体的严格选择。它们允许生产现成的产品，避免了从每个患者身上侵入性地采集和耗时地培养MSC。由于与例如马或人MSC相比，犬和猫MSC的培养能力相对较低，异种(例如人或马)MSC的使用优选高于同种异体犬或猫MSC，特别是对于商业应用，例如用于治疗犬或猫的OA。
因此，在特定实施方案中，本发明的MSC可用于对对象进行同种异体或异种施用。如前所述，同种异体或异种使用允许更好地控制MSC的质量，因为可以筛选不同的供体，并且可以选择最佳供体。后者在制备功能性MSC方面是必不可少的。这与自体使用MSC形成对比，因为在这种情况下，更难确保细胞的质量。尽管如此，自体使用可能也有它的好处。在一种情况下，分离血液MSC，使用来自供体的血液，该供体后来也是分离的MSC的受体。在另一种情况下，使用来自供体的血液，其中供体优选与从供体的血液中分离的MSC的受体具有相同的家庭、性别或种族。特别是，将对这些供体进行常见的当前可传播疾病或病理学测试，以避免这些病理或疾病通过干细胞水平传播的风险。优选地，供体/供体动物被隔离。当使用供体马时，例如可以对其进行以下病理学、病毒或寄生虫的测试：马传染性贫血(EIA)、马鼻肺炎(EHV-1、EHV-4)、马病毒性动脉炎(EVA)、西尼罗河病毒(WNV)、非洲马疾病(AHS)、马锥虫病(锥虫属)、马梨浆虫病、马鼻疽(锤骨、马鼻疽)、马流感、莱姆病(LB)(伯氏疏螺旋体，莱姆病)。
在一个实施方案中，用于本发明的MSC的特征可在于以下标志物：CD29、CD44、CD90、CD105、波形蛋白、纤连蛋白、Ki67、CK18或其任何组合中的一种或多种的存在/被测量为阳性。在另一个实施方案中，用于本发明的MSC的特征可在于间充质标志物CD29、CD44和CD90的存在。通过后者，可以分析所获得的MSC的纯度，并可以确定MSC的百分比。
CD29是由整联蛋白β1基因编码的细胞表面受体，其中该受体与其他蛋白质形成复合物，以调节配体结合时的生理活性。CD44抗原是一种参与细胞-细胞相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。此外，CD44是透明质酸的受体，也可以与其他配体如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMP)相互作用。CD90抗原是一种保守的细胞表面蛋白，被认为是干细胞(如MSC)的标志物。本发明的MSC对CD29/CD44/CD90呈三阳性，使本领域技术人员能够快速而明确地选择MSC，并提供了对进一步下游应用感兴趣的MSC生物学特性。
在一个实施方案中，用于本发明的MSC的特征在于不存在主要组织相容性复合体(MHC)II类分子/主要组织相容性复合体(MHC)II类分子的测量为阴性，优选所有目前已知的MHC II类分子，将所述细胞分类为可用于哺乳动物细胞疗法(如猫或狗细胞疗法)的细胞。即使MSC部分分化，MSC对MHC II类分子仍呈阴性。可以使用流式细胞术进行检测MHC II分子的存在或不存在以及量化其表达。
在另一个和进一步的实施方案中，MSC对CD45抗原(造血细胞的标志物)的测量结果为阴性。
在一个实施方案中，MSC对MHC II类分子和CD45测量均为阴性。
在一个特别优选的实施方案中，用于本发明的MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90测量为阳性，对MHC II类分子和CD45测量为阴性。
MSC通常在其表面表达MHC I类抗原。在一个特定实施方案中，用于本发明的MSC具有低水平或检测不到的MHC I类标志物。在最优选的实施方案中，所述MSC对MHC II类标志物测量为阴性，并且具有低水平或检测不到的MHC I类标志物，其中所述细胞表现出极低的免疫原性表型。为了本发明的目的，所述低水平应理解为小于表达所述MHC I或MHC II的总细胞的25％，更优选小于15％。可以使用流式细胞术进行检测MHC I和MHC II分子的存在或不存在以及量化其表达。
MSC的这些免疫特性限制了受体免疫***在细胞移植后识别和排斥细胞，优选地同种异体或异种细胞的能力。MSC产生的调节免疫反应的因子，以及它们在局部刺激下分化为适当细胞类型的能力，使它们成为细胞疗法所需的干细胞。
在一个实施方案中，用于本发明的MSC在炎性环境或状况下存在时分泌免疫调节性***素E2细胞因子。
炎性环境或状况的特征是血液中免疫细胞的募集。炎症介质包括***素、炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-15、趋化因子如IL-8和其他炎性蛋白如TNF-α和IFN-γ。这些介质主要由单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞产生，在炎症部位募集白细胞，随后刺激刺激性和抑制性相互作用的复杂网络，同时破坏和治愈炎症过程中的组织。
***素E2(PgE2)是***素家族的一个亚型。PgE2是由膜磷脂释放的花生四烯酸(AA)通过连续的酶促反应合成的。环加氧酶-2(COX-2)被称为***素内过氧化物酶合酶，将AA转化为***素H2(PgH2)，而PgE2合酶将PgH2异构化为PgE2。作为一种限速酶，COX-2响应生理条件控制PgE2的合成，所述生理条件包括生长因子、炎性细胞因子和肿瘤启动子的刺激。
在一个特定的实施方案中，存在于炎性环境中的所述MSC分泌浓度在103至106皮克/ml之间的可溶性免疫因子***素E2(PgE2)，以诱导或刺激MSC调节的免疫抑制。
MSC在这些特定浓度范围内的PgE2分泌刺激体外抗炎过程，并且与它们分化为适当细胞类型的能力一起使它们成为细胞移植所需要的。
在优选实施方案中，用于本发明的MSC测量：
-间充质标志物CD29、CD44和CD90阳性；
-包含在由波形蛋白、纤连蛋白、Ki67或其组合组成的组中的一种或多种标志物呈阳性；
-MHC II类分子为阴性；
-造血标志物CD45阴性，以及
-优选地具有低水平或检测不到水平的MHC I类分子，其中所述低水平应理解为低于表达MHC I的总细胞的25％，更优选低于15％。
在最优选的实施方案中，用于本发明的MSC测量：
-间充质标志物CD29、CD44和CD90阳性；
-包含在由波形蛋白、纤连蛋白、Ki67或其组合组成的组中的一种或多种标志物呈阳性；
-MHC II类分子为阴性；
-造血标志物CD45阴性；和
-优选地具有低水平或检测不到水平的MHC I类分子，其中所述低水平应理解为小于表达MHC I的总细胞的25％，更优选小于15％，
其中当存在于炎性环境或状况中时，所述细胞分泌的免疫调节性PgE2细胞因子的浓度范围在103至106皮克/ml之间。
在另一个或进一步的实施方案中，当存在于炎性环境或状况中时，并与具有相同特征但不经受所述炎性环境或状况的MSC进行比较，根据本发明使用的MSC具有选自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合的至少一种分子的分泌的增加，并且IL-1的分泌减少。
在优选的实施方案中，当存在于炎性环境或状况中时，MSC具有IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合中的至少一种分子的增加的分泌，以及IL-1的减少的分泌。可以与具有与上述相同特征但不受所述炎性环境或状况影响的间充质干细胞进行比较。
优选地，MSC具有与两种或更多种上述因子组合的PgE2的增加的分泌。
PgE2、IL-6、IL-10、TGF-β和NO有助于抑制如T细胞和B细胞等主要免疫细胞群的增殖和功能。此外，MSC在其表面表达低水平的MHC I类分子和/或对MHC II类分子呈阴性，从而逃避免疫原性反应。此外，目前的MSC可以通过增加上述因子的分泌来抑制白细胞的增殖，再次有助于避免宿主的免疫原性反应。
在另一个或进一步的实施方案中，在外周血单个核细胞(PBMC)存在的情况下，MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的分泌和/或抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-13或其组合的分泌。在另一个或进一步的实施方案中，MSC在PBMC存在的情况下抑制TGF-β1的分泌。
在炎性环境中，MSC分泌多种调节宿主免疫反应的因子。此外，MSC具有诱导或刺激选自PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的一种或多种因子分泌的刺激作用。除了MSC在炎性环境中对PBMC的刺激作用外，MSC还对PBMC分泌具有抑制作用，导致一种或多种选自TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β1、IL-13或其组合的因子减少。MSC在炎性环境中具有调节作用，可用于治疗各种类型疾病，特别是免疫***病症。
通常，文献中发表的任何用于鉴定和表征特定细胞类型的细胞标志物(例如间充质、肝、造血、上皮、内皮标志物)或具有特定定位(例如细胞内、细胞表面或分泌的)的细胞标志物的技术都可被认为适合于表征MSC。此类技术可分为两类：一类是允许在分析过程中保持细胞完整性的技术，另一类是基于使用此类细胞产生的提取物(包括蛋白质、核酸、膜等)的技术。在鉴定这些标志物并将其测量为阳性或阴性的技术中，优选地免疫细胞化学或细胞培养基的分析，因为这些技术即使在低量细胞的情况下也允许标志物检测，而不会破坏它们(如在蛋白质印迹或流式细胞术的情况下)。
可以使用MLR测定法来测定MSC的免疫调节特性。对于这种MLR测定，应答T细胞用荧光染料标记，当其暴露于特定的光频率时，荧光染料会亮起绿色。然后用植物促***原(ConA)刺激这些应答T细胞以诱导或刺激增殖。当T细胞开始***时，染料会分布在其子细胞上，因此染料会随着每次细胞***而连续稀释。因此，可以通过观察颜色的减少来测量T细胞的增殖量。因此，为了研究MSC的免疫调节特性，将这些MSC添加到受刺激的应答T细胞中，并共同孵育几天。包括适当的阳性和阴性对照，以查看测试是否成功进行。在孵育期结束时，使用流式细胞术测量T细胞增殖量，使我们能够观察MSC是否抑制T细胞增殖。
MSC的相关生物学特征可以通过使用诸如流式细胞术、免疫细胞化学、质谱、凝胶电泳、免疫测定法(例如免疫印迹、蛋白质印迹、免疫沉淀、ELISA)、核酸扩增(例如实时RT-PCR)、酶活性、组学技术(蛋白质组学、脂质组学、糖组学、翻译组学、转录组学、代谢组学)和/或其他生物活性的技术来鉴定。
本发明的MSC可通过本领域已知的任何标准方案衍生。在一个实施方案中，所述MSC可通过一种方法获得，其中所述MSC从血液或血相分离，并且其中所述细胞在基础培养基(优选地低葡萄糖培养基)中培养和扩增。
本领域已知的基础培养基制剂包括但不限于Eagle基本必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α改良的基本必需培养基(alpha-MEM)、基本基础培养基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、基本改良的Eagle培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth's 10MB 752/1或Williams培养基E，及其修改和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域中通常是已知的，并且根据培养的细胞的需要改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的范围内。优选的基础培养基制剂可以是商业上可获得的那些制剂之一，例如DMEM，据报道其可维持MSC的体外培养，并且包括生长因子的混合物以使其适当生长、增殖、维持所需标志物和/或生物活性，或长期储存。
这种基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。通过说明而非限制，这些成分可包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P以及可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲剂(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐例如丙酮酸钠、乙酸盐例如乙酸钠)等。还显而易见的是，许多培养基可以作为含有或不含有丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。
用于从血液或血相分离MSC并培养和扩增所述细胞的方法是本领域已知的并且例如描述于WO2014053418或WO2014053420中。
在一个实施方案中，这种用于从血液或血相分离MSC并在低葡萄糖培养基中培养和扩增所述细胞的方法可以包括以下步骤：
a)在涂有抗凝剂的样品瓶中收集来自供体的一份或多份血液样品；
b)离心血液样品以获得三相分布，包括血浆相、血沉棕黄层和红细胞相；
c)收集血沉棕黄层并将其上样到密度梯度上；
d)收集由步骤c)的密度梯度获得的相间血液；
e)通过离心从相间血液分离MSC；
f)在培养物中接种2.5x105/cm2和5x105/cm2之间的MSC，并将其保存在补充有***、抗生素和血清的低葡萄糖生长培养基中。
在一个实施方案中，可以向MSC补充抗凝剂。非限制性例子是EDTA或肝素。
接种数量对于最终获得可接受浓度的纯的且有活力的MSC群至关重要，因为接种太密会导致扩增过程中大量细胞死亡，并且MSC群不均匀，而过于分散的接种将导致MSC集落形成很少或没有形成，所以不能或几乎不可能扩增，或者会花费太多时间。在这两种情况下，细胞的活力都会受到负面影响。
在本发明的一个优选实施方案中，MSC具有高细胞活力，其中至少90％、更优选地至少95％、最优选地100％的所述细胞是有活力的。
相间血液是血液单个核细胞(BMC)的来源，包括单核细胞、淋巴细胞和间充质干细胞(MSC)。优选地，淋巴细胞在37℃下被洗掉，而单核细胞在缺乏维持其存活所需的细胞因子的情况下在2周内死亡。这样，MSC就被纯化了。从相间血液中分离MSC优选通过相间血液的离心来进行，之后用合适的缓冲液例如磷酸盐缓冲液洗涤细胞沉淀至少一次。
在进一步的实施方案中，本发明的MSC对于单核细胞和巨噬细胞是阴性的，两者都在0％和7.5％之间的范围内。
特别地，间充质细胞在生长培养基中保存至少2周。优选地，使用含有1％***的生长培养基，因为MSC的具体特征保留在所述培养基中。
最短2周(14天)、优选地3周(21天)后，培养瓶中将可见MSC集落。在随后的步骤g)中，将至少6×103干细胞/cm2转移至含有低葡萄糖、血清和抗生素的扩增培养基中，以扩增MSC。优选地，MSC的扩增将在最少五次细胞传代中发生。这样就可以获得足够的细胞。优选地，细胞在70％至80％汇合时***。MSC在培养中最多可维持50代。此后，就会出现活力丧失、衰老或突变形成的风险。
在另一个实施方案中，MSC扩增期间每次传代之间的群体倍增时间(PDT)应当在胰蛋白酶消化后0.7天至3天之间。MSC扩增期间每次传代之间的所述PDT优选在胰蛋白酶消化后0.7至2.5天之间。
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的MSC具有纺锤形形态。本发明的MSC的形态表征将该细胞分类为细长的成纤维细胞样纺锤形细胞。这种类型的细胞与其他具有小型自我更新细胞的MSC群体不同，这些小型自我更新细胞大多呈三角形或星形细胞形状，与具有大的、立方体或扁平的图案，并具有突出的细胞核的MSC群体也不同。具有该特定形态特征以及生物标记的MSC的选择使得本领域技术人员能够分离本发明的MSC。本领域技术人员可以使用相差显微镜容易地进行细胞的形态学分析。此外，MSC的大小和粒度可以使用流式细胞术中的前向和侧向散射图或本领域技术人员已知的其他技术来评估。
在另一个或进一步优选的实施方案中，MSC具有10μm至100μm之间的悬浮直径。用于本发明的MSC是根据大小/悬浮直径来选择的。优选地，MSC的细胞大小为10至100μm，更优选15至80μm，更优选20至75μm，更优选25至50μm之间。优选地，通过过滤步骤进行基于细胞大小的细胞选择。例如，通过过滤***按大小选择细胞浓度范围为每毫升103至107个MSC的MSC，其中所述细胞优选地在低葡萄糖DMEM培养基中稀释，其中细胞经过双重过滤步骤使用40μm过滤器过滤。优选双重或多重过滤步骤。后者提供大量的单细胞群体并避免细胞聚集体的存在。此类细胞聚集体可能在细胞冷冻保存期间导致细胞死亡，并且都可能对细胞的进一步下游应用产生影响。例如，静脉内施用时，细胞聚集体可能会增加发生毛细血管栓塞的风险。
在一个实施方案中，所述组合物中的所述治疗有效量的MSC在105–107MSC之间。
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的MSC被配制用于通过静脉内注射或输注的方式在对象中施用。
在一个实施方案中，将治疗有效量的MSC施用于犬科动物或猫科动物患者，优选地每位患者施用105-107个MSC的剂量。在一个实施方案中，施用单次剂量。
对对象产生治疗益处的最小治疗有效剂量是每次施用至少105个MSC。优选地，每次施用通过静脉内注射并且每次施用包含105到5x105个之间的MSC，其中所述MSC优选地是天然的和/或异种的。
在一个实施方案中，所述MSC施用至少两次、至少三次、至少四次、至少五次，优选地间隔施用。
在另一个或进一步的实施方案中，治疗进一步包括：多次施用MSC或包含MSC的组合物，例如多次静脉内施用每只犬科动物或猫科动物患者105–107个MSC的剂量，其中所述多次剂量在不同时间点施用，包括但不限于以下一个或多个时间点：间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔7天(1周)、间隔2周、间隔3周、间隔4周、间隔5周、间隔6周、间隔7周、间隔8周、间隔3个月、间隔6个月、间隔9个月和/或间隔1年。优选地，每次剂量间隔至少2周、更优选地间隔至少3周、甚至更优选地间隔至少4周、最优选地间隔至少6周施用。
在一个实施方案中，所述组合物包含存在于无菌液体中的所述MSC。这种无菌液体的非限制性例子是基本必需培养基(MEM)，例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。所述无菌液体对于静脉内施用(例如通过注射或输注)于哺乳动物患者应当是安全的。
作为非限制性实例，所述无菌液体是基本必需培养基，例如基础培养基。本领域已知的基础培养基制剂包括但不限于Eagle基本必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α改良的基本必需培养基(alpha-MEM)、基本基础培养基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、基本改良的Eagle培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth's 10MB 752/1或Williams培养基E，及其修改和/或组合。上述基础培养基的组成在本领域中通常是已知的，并且根据培养的细胞的需要改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的范围内。优选的基础培养基制剂可以是商业上可获得的那些制剂之一，例如DMEM，据报道其可维持MSC的体外培养，并且包括生长因子的混合物以使其适当生长、增殖、维持所需标志物和/或生物活性，或长期储存。
这种基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。通过说明而非限制，这些成分可包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P以及可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲剂(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐，例如丙酮酸钠、乙酸盐，例如乙酸钠)等。还显而易见的是，许多培养基可以作为含有或不含有丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。
优选地，所述组合物包含至少75％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少85％、最优选地至少90％的单细胞，并且其中所述单细胞具有10μm至100μm之间，更优选地在15μm与80μm之间，更优选地在20μm与75μm之间，更优选地在25μm与50μm之间的悬浮直径。如前所述，细胞的直径及其单细胞性质对于任何下游应用(例如静脉内施用)并且对于细胞的活力都至关重要。
优选地，所述组合物包含至少90％的MSC，更优选地它将包含至少95％的MSC，更优选地至少99％，最优选地100％的MSC。
包含MSC的无菌液体形式的组合物的体积和浓度优选地适合于静脉内注射。在一个实施方案中，药物组合物可以以无菌液体的形式施用于动物，所述无菌液体在最终调整后包含浓度为105–107个细胞/mL的MSC。
在一个实施方案中，每次静脉内注射或输注施用治疗有效量的MSC，优选地每次注射或输注包含105至107个所述MSC的剂量。
在一个实施方案中，药物组合物包含每mL所述组合物105–107个MSC、优选地每mL所述组合物105至106个MSC、更优选地每mL所述组合物105-5x105个MSC的治疗有效量的MSC。
在一个实施方案中，将治疗有效量的MSC施用于犬科动物或猫科动物患者，优选地每位患者施用105–107个MSC的剂量。在一个实施方案中，施用单剂量。
在一个实施方案中，施用所述MSC至少两次、至少三次、至少四次、至少五次。
在一个实施方案中，所述组合物的一个剂量具有约0.5至5ml、优选地约0.5至5ml、优选地约0.5至3ml、优选地约0.5至2ml、更优选地约0.5至1.5ml、最优选地约1ml的体积。在另一个或进一步的实施方案中，所述组合物的一个剂量具有最大约5ml、优选地最大约4ml、更优选地最大约3ml、更优选地最大约2ml的体积，最优选地，所述体积为约1ml。该量适合静脉内施用。
所述剂量可以配制在小瓶或预装注射器中。
在一个实施方案中，所述组合物还包含选自由富血小板血浆(PRP)、透明质酸、基于透明质酸的组合物、葡糖胺聚糖或基于葡糖胺聚糖的组合物或其任何组合组成的组的组分。已知这些在根据本发明的组合物的下游应用期间具有额外的有益功能。在一些情况下，可能需要将MSC与此类载体物质混合以增加组合物的有效性或产生协同效应。例如，所述载体物质有助于细胞组合物中MSC的归巢能力和免疫调节作用。例如，PRP是一种富含生长因子的物质，可在植入后刺激干细胞。优选地，出于相容性原因，干细胞和PRP均从相同的供体收获。载体物质也可用于抵消重力：干细胞遵循重力定律，因此在没有可以迁移的载体的情况下难以到达更高的病变。此外，载体物质本身对病理环境也有有益作用，在所述病理环境中它们有助于组织自身修复，并提供良好的干细胞微环境，以帮助该区域的细胞分化。透明质酸、葡糖胺聚糖或基于此的组合物的实例包括和
在一个实施方案中，每次注射向患者施用的组合物的体积根据患者的体重进行调整。在另一个实施方案中，每位患者施用105–107个MSC、优选地105-106个MSC、更优选地105-5x105个MSC、最优选地3x105个MSC的固定剂量。
发明人还发现，特别有效的治疗通过包含至少两个剂量的如上所述的任何实施方案中所用的MSC或所用的药物组合物的给药方案来实现。
因此，另一个实施方案涉及用于治疗犬科动物和猫科动物的骨关节炎的药物组合物，其中：
-治疗包括施用(优选地静脉内)第一量的所述组合物的步骤，所述第一量的所述组合物包含每位患者105–107个MSC的总剂量，以及
-治疗还包括施用(优选地静脉内)第二量的所述组合物的步骤，所述第二量的所述组合物包含105–107个MSC的第二总剂量，其中所述MSC优选是天然的和/或异种的，并且
其中所述第二剂量在第一量后1天、第一量后2天、第一量后3天、第一量后4天、第一量后5天、第一量后6天、第一量后7天(1周)、第一量后2周、第一量后3周、第一量后4周、第一量后5周、第一量后6周、第一量后7周、第一量后8周、第一量后3个月、第一量后6个月、9个月，和/或第一量后1年施用。优选地，每个剂量在第一量之后至少2周、更优选地在第一量之后至少3周、甚至更优选地在第一量之后至少4周、最优选地在第一量之后至少6周施用。
在一个实施方案中，所述第二剂量与第一剂量相同。在另一个实施方案中，所述第二剂量低于第一剂量。在又一个实施方案中，所述第二剂量高于第一剂量。
在一个实施方案中，可以向所述患者施用第三、第四和/或甚至第五量的所述组合物，优选地静脉内施用，其中所述第三、第四和/或第五量包括第三、第四和/或第五个105–107个MSC的总剂量，其中所述MSC优选是天然的和/或异种的。
在一个实施方案中，可以向所述患者施用第六或更多量的所述组合物，优选地静脉内施用，其中所述第六或更多量包含第六或更多个105–107个MSC的总剂量，其中所述MSC优选是天然的和/或异种的。
许多被诊断有或患有骨关节炎的犬科动物和/或猫科动物表现出跛行和/或关节疼痛的(视觉)迹象。因此，本发明还涉及如前述实施方案中任一个所述的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其用于治疗被诊断有或患有骨关节炎的犬科动物和猫科动物的跛行和/或关节疼痛，或作为治疗诊断有或患有骨关节炎的犬科动物和猫科动物的跛行和/或关节疼痛的方法，或用于制备用于治疗诊断有或患有骨关节炎的犬科动物和猫科动物的跛行和/或关节疼痛的药物。所述MSC或组合物优选地静脉内施用，并且所述MSC优选是天然的和/或异种的。
跛行和/或关节疼痛的治疗包括预防、减少、缓解、改善和/或逆转被诊断有或患有骨关节炎的猫科动物的所述跛行和/或关节疼痛。
如前所述，犬科动物和猫科动物(例如家犬和家猫)骨关节炎的典型视觉病征可能包括僵硬、跛行或起身困难；昏睡；不愿意跑、跳或玩耍；体重增加；烦躁或行为改变；抚摸或触摸时疼痛；难以摆出小便或大便的姿势，或在家里发生意外；和/或四肢和脊柱肌肉质量损失。
由于骨关节炎经常影响多个关节，因此与关节内施用MSC相比(这是一种侵入性操作并且需要镇静、经验和有针对性的诊断)，通过静脉内施用MSC或包含MSC的药物组合物来治疗跛行和关节疼痛，在一次多个关节的治疗中提供了显著的益处。
在一个实施方案中，MSC或包含MSC的药物组合物如上述实施方案中任一个中所描述。
在第二方面，本发明涉及包含外周血来源的MSC的特定药物组合物。所述组合物包含天然外周血来源的MSC，所述MSC是动物来源的，优选地哺乳动物来源的，并且以每mL所述组合物105–107个MSC之间的浓度存在于无菌液体中，其中所述组合物的一个剂量具有约0.5至5ml的体积，其中所述MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90测量呈阳性，对MHC II类分子和CD45测量呈阴性，并且其中所述MSC具有在10μm和100μm之间的悬浮直径。
在一个实施方案中，所述药物组合物是静脉内施用的。在一个优选的实施方案中，所述MSC源自马。
在一个实施方案中，所述组合物的所述一个剂量的体积为约0.5至5ml，优选地约0.5至5ml，优选地约0.5至3ml，优选地约0.5至2ml，更优选地约0.5至1.5ml，最优选地约1ml。在另一个或进一步的实施方案中，所述组合物的一个剂量具有最大约5ml、优选地最大约4ml、更优选地最大约3ml、更优选地最大约2ml的体积，最优选地所述体积为约1ml。该量适合静脉内施用。
在另一个或进一步优选的实施方案中，MSC具有15至80μm、更优选地20至75μm、更优选地25至50μm的悬浮直径。
本领域技术人员将理解，用于治疗骨关节炎的MSC或药物组合物的各方面的要素，或用于治疗如上所述被诊断有或患有骨关节炎的犬科动物和猫科动物的跛行和/或关节疼痛的MSC或药物组合物回溯至本发明的药物组合物方面。因此，本发明的所有方面都是相关的。在如上所述的一个方面中描述的所有特征和优点可以涉及这些方面中的任何方面，即使它们是结合特定方面来描述的。
根据本发明使用的MSC或包含MSC的药物组合物，可能与如上所述的其他组分一起，将优选地被冷冻，以便允许长期储存MSC或组合物。优选地，MSC或组合物将在低温且恒定的温度下冷冻，例如低于-20℃的温度。这些条件允许安全保存MSC或组合物，并且使MSC能够保持它们的生物学和形态学特征，以及它们在储存期间和一旦解冻后的高细胞活力。
在更优选的实施方案中，用于本发明的MSC或包含MSC的药物组合物可以在-80℃的最高温度下，任选地在液氮中储存至少6个月。MSC冷冻的一个关键因素是低温介质，特别是包含DMSO的介质。DMSO防止冷冻过程中培养基中冰晶的形成，但高浓度时可能对细胞有毒。在优选实施方案中，冷冻剂中DMSO的浓度高达20％，更优选高达15％，更优选DMSO浓度包含10％。低温培养基还包含低葡萄糖培养基，例如低葡萄糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)。
然后，用于本发明的MSC或药物组合物优选地在施用前在室温附近的温度下解冻，优选地在20℃至37℃之间的温度下，更优选地在25℃至37℃之间的温度下，并且在最多20分钟、优选地最多10分钟、更优选地最多5分钟的时间跨度内解冻。
此外，MSC或组合物优选地在解冻后2分钟内施用，以保护MSC的活力。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明，这些实施例进一步说明本发明，并且不旨在也不应解释为限制本发明的范围。
实施例和/或附图说明
现在将参考以下实施例进一步举例说明本发明。本发明决不限于所给出的实施例。
实施例1：ePB-MSC用于治疗狗的骨关节炎
本研究的目的是评估单次静脉内注射ePB-MSC(马外周血来源的MSC)作为患有自然发生的关节疼痛且对当前标准疗法无反应的狗的治疗的潜力。据此评估该治疗的临床效果和安全性。
材料和方法
狗
共有50个犬类患者在多家兽医诊所接受了研究产品(IVP)的治疗(n＝10)。患者纳入受到以下纳入标准的限制：一个或多个关节的关节疼痛持续数天/周、对保守治疗无反应、确诊跛行、病史证实疼痛、通过射线照相(RX)或其他成像方式确认的关节疼痛相关体征，并完成犬短暂疼痛量表(CBPI)问卷，包括疼痛严重程度评分(PSS)≥3和疼痛干扰评分(PIS)≥3。患有以下病症和治疗的患者被排除在研究之外：扭伤、怀孕、可能影响临床研究的其他疾病、PSS<3和PIS<3、狗的常规医疗改变、清除期内皮质类固醇施用或正在进行的皮质类固醇治疗。在研究期间的三个评估点(治疗后第0天、第3周和第6周)，观察所有狗的不常见行为、姿势和潜在不良事件的发生，如跛行的恶化、关节扩张或注射部位皮肤过敏。评估由在犬骨科领域具有至少5年实践经验的兽医进行。知情的所有者负责报告评估点之间潜在不良事件的发生情况。研究期间继续进行所有常规医疗。这项动物研究得到了全球干细胞技术(Global Stem cell Technology)伦理委员会的批准。
ePB-MSC(IVP)的分离和培养
根据先前描述的方法，ePB-MSC是从从一匹供体马的颈静脉采集的静脉血中分离的。在培养ePB-MSC之前，如Broeckx等人2012所述，测试血清中是否存在多种可传播疾病。随后，根据良好生产规范(GMP)指南，在GMP认证的生产场所培养干细胞，直到传代(P)5，并对其活力、形态、细胞表面标志物的存在和群体倍增时间进行表征。特定细胞表面标志物的存在(分化簇CD29、CD44和CD90)和不存在(主要组织相容性复合体(MHC)II和CD45)的评估通过使用流式细胞术如前所述(Spaas等人，2013)完成。然而，详细的表达和分泌模式先前已在WO 2020/182935中描述。
使用锥虫蓝评估细胞活力。然后，将细胞进一步培养至P10，用胰蛋白酶消化并以最终浓度300000个细胞/mL重悬于含有10％二甲基亚砜(DMSO)的低葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。ePB MSC在-80℃下储存在冷冻小瓶中，直至进一步使用。通过不存在需氧细菌、厌氧细菌、真菌、内毒素和支原体来测试最终产品的无菌性。所有患者均使用同一批ePB-MSC进行治疗。
研究设计
所有纳入的犬类患者注射一小瓶含有1mL ePB-MSC悬浮液的IVP。小瓶在手掌中解冻并静脉内注射。随后，由经验丰富的兽医在三个评估点(第0天：治疗施用日，随访1：治疗后3周，和随访2：治疗后6周)对狗进行临床评估，并由充分知情的主人随时进行彻底观察。在评估点，通过矫形检查、跛行评估、运动范围(ROM)测定(主观评分+角度测定法测量)和对一般临床状况的影响的评估来调查和评分治疗效果(表1)。通过将中心放置在肢体轴上，并将透明臂与肢体上的解剖标志对齐，来应用角度计，以确定ROM的度数。根据Jaegger等人(2002)(表2)，将测量值与正常值进行比较。此外，此外，根据Brown(2017)的，主人在每个随访点使用CBPI对疼痛严重程度、疼痛干扰和生活质量进行评分。CBPI由11个问题组成，评分***从0到10不等。因此，前四个问题用于对疼痛的严重程度进行评分，接下来的六个问题用于确定疼痛干扰，最后一个问题用于衡量狗的整体生活质量(表3)。最后，在所有三个时间点，兽医通过触诊受影响的关节来评估和评分关节热、关节疼痛和关节积液(表4)。
表1：骨科和一般临床检查中使用的评分***概述。
表2：正常犬关节活动度的角度测定法测量。
表3：犬类短暂疼痛量表
表4：关节评估评分***概述
统计分析
使用R(版本3.6.3)中提供的nparLD包执行非参数纵向分析。该方法是混合模型的非参数对应方法。时间被列为分类固定效应因素，狗(或狗内的损伤)被列为分层因素。主要时间效应通过基于秩的稳健检验以全局5％显著性水平进行检验。此外，三个时间点之间的事后成对比较是使用非参数Wilcoxon秩和检验进行的，并通过Bonferroni技术进行多重比较调整(比较显著性水平＝0.05/3＝0.0133)。还针对时间点之间的差异导出非参数95％置信区间。
结果
狗
从50名接受治疗的犬类患者中，有5名无法获得随访1和/或随访2时间点的数据，导致整个研究期间数据缺失。此外，有9只狗不符合预设的纳入和排除标准。最后，一只狗在研究结束前因胃扩张扭转引起胃破裂而被安乐死。其余35只符合预设纳入和排除标准且具有完整随访数据集的犬纳入本研究的数据分析。这些狗在以下一个或多个关节遭受疼痛：肘部、后肢膝关节或髋部。在这35名纳入的患者中，18只狗有1个关节受影响(肘部：12只，后肢膝关节：4只，髋部：2只)，11只狗双侧关节受影响(肘部：1只，后肢膝关节：3只，髋部：6只，肩部：1只)，6只狗有多个双侧受影响的关节(肘部+髋部：1只，后肢膝关节+髋部：3只，肘部+后肢膝关节：1只和肘部+后肢膝关节+髋部：1只)(表5)。表5：纳入的患者的概述。
y：年份；m：月份；M.D.：缺少数据；M：公；F：母；MC：雄性***的；FC：雌性***的；CV：普通犬；0：无关节受影响；1：单侧关节受影响；2：双侧关节受影响。
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骨科检查
图1展示了所有三个后续点的跛行评估概览。在研究开始时(第0天)，23％的狗在5分上得分为5分，26％的狗在5分上得分为3分或4分，17％的狗在5分上得分为2分，9％的狗在5分上得分为1分。治疗施用后三周(随访1)，跛行得分显著下降，44％的狗的跛行得分为5分上得1或2分(26％得分1和18％得分2)，相比之下，26％的狗在基线(第0天)得分为1或2(P＝0.002)。治疗施用后六周后(随访2)，50％的狗在5分中的跛行得分为1或2分(24％得分1和26％得分2)，与基线情况相比明显更好(P＝0.004)。随访1和随访2之间没有检测到跛行得分的显著差异(P＝0.484)。此外，对个别患者跛行的评估显示，62％的病例在六周内跛行有所减轻。其余38％的狗在治疗后六周表现出稳定(26％)或恶化(12％)程度的跛行。
骨科检查期间测试的第二个参数是受影响关节的ROM。评分结果如图2所示。在第二次随访期间，与基线条件(第0天)相比，对关节活动度的影响显著下降(P<0.001)。50％的狗得分为0或1，而第0天的得分为33％。第0天和随访1之间也发现显著差异(P＝0.002)，但在随访1和随访2之间没有显著差异(P＝0.455)。此外，治疗后六周对每个关节ROM的评估显示，34％的关节的ROM有所改善。分别有61％和5％的关节ROM保持不变或恶化。
还使用测角仪测量度数变化百分比来评估关节活动度。治疗三周后(随访1)，与基线相比，关节活动度(以度为单位)显著升高(P＝0.001)，中位值增加9.0(95％CI：[3.5；16.0])。六周后(随访2)，与基线相比，关节活动度(以度为单位)显著升高(P＝0.004)，中位值增加8.5(95％CI：[2.5；13.5])，但两次随访期没有显著差异(P＝0.964)。
考虑到对临床状况的影响，三个时间点之间没有发现显著差异。
犬类简要疼痛清单
在患者前往兽医诊所的3次就诊期间(第0天、随访1和随访2)，主人完成CBPI，评估疼痛严重程度得分、疼痛干扰得分和生活质量。该调查问卷显示，第0天和随访1之间PSS显著下降(中位数＝-1；95％CI：[-1.5，-0.5]，P＝0.005)，但第0天和随访2之间(中位数＝-1)；95％CI:[-1.0,0.0]，P＝0.073)以及两个随访期之间没有显著下降。关于PIS，在第0天和随访1之间(中位数＝-1.4；95％CI：[-2.4，-0.9]，P<0.001)，和在第0天和随访2之间(中位数＝-2.15；95％CI：[-3.1，-1.4]，P<0.001)发现显著下降，但在随访1和随访2之间没有显著下降(中位数＝-0.5；95％CI：[-1.0,0.1]，P＝0.016)。最后，在治疗施用后的六周研究期内，观察到66％的狗的生活质量得到了提高。在六周的研究期间，分别有23％和11％的病例生活质量保持相同或下降。
关节评估
最后，在治疗施用后进行关节评估。热感觉评分没有发现显著差异。第0天和随访1之间关节疼痛显著减轻(中位数＝-1.0；95％CI：[-1.5，-0.5]，P＝0.005)。第0天和随访2之间(P＝0.073)以及两个随访期之间(P＝0.429)没有发现显著差异。治疗施用后发现关节积液评分下降。第0天和随访1之间(中位数＝-1.0；95％CI：[-1.5；-1.0]，P<0.001)以及第0天和随访2之间(中位数＝-1.0；95％CI:[-1.5；-1.0]，P<0.001)，关节积液评分显著下降，但两个随访期没有显著差异(P＝0.023)(图3)。对每个关节的关节积液的评估显示，ePB-MSC施用后六周，38％的关节积液量减少。分别在56％和6％的关节中检测到等量或增加量的关节液。
讨论
据我们所知，这是首次调查静脉内注射的异种马外周血来源的间充质干细胞在患有关节疼痛的狗身上的潜力的研究。干细胞疗法的耐受性良好，因为本研究期间没有报告与治疗施用相关的疑似药物不良反应或严重不良事件。此外，关节评估显示关节热感或关节疼痛没有增加。相比之下，治疗后三周检测到关节疼痛显著减轻。治疗施用后三周和六周关节积液显著减少。
先前的研究已经调查了使用自体MSC治疗OA时MSC的安全性和有效性。然而，这项研究首次描述了在狗身上异种使用马间充质干细胞作为关节疼痛的治疗选择。此前，曾描述过使用关节内施用马软骨形成性诱导的MSC来治疗OA，根据主人的评价，减少了接受治疗的狗的跛行和疼痛。在目前的研究中，天然MSC通过静脉内注射而不是关节内注射，这可能具有显著的全身抗炎作用，从而减少多个受影响关节的疼痛和炎症。此外，MSC已被证明能够迁移到炎症区域，有助于额外的局部抗炎作用。这种类型的施用还提供了以即用制剂形式静脉内注射的优点。这项研究表明，使用单次静脉内注射ePB-MSC是犬关节疼痛和跛行的一种有前途且安全的治疗。
随访期间，骨科检查未检测到跛行和关节活动度的恶化，甚至有改善趋势。与基线条件相比，跛行评分在两个随访时间点均显著下降。使用评分***和测角仪测量，与第0天相比，在随访1和2中发现对关节活动度的影响显著降低。然而，两次随访之间没有发现显著差异。犬类简要疼痛清单的结果显示狗所经历的疼痛有所改善。与第0天相比，第一次随访时疼痛严重程度评分显著下降以及两次随访时干扰评分显著降低就说明了这一点。在随访1和2之间没有发现显著差异，尽管可以观察到进一步的降低。66％的狗的生活质量显示出提高。
结论
总之，这项研究的结果表明，对于患有关节疼痛和跛行的犬类患者来说，单次静脉内注射ePB-MSC的耐受性非常好。注射ePB-MSC后关节疼痛和跛行没有加重，并且有改善的趋势。
实施例2：用于治疗猫的骨关节炎的ePB-MSC
还进行了一项类似的实验，以评估单次静脉内注射ePB-MSC(马外周血来源的MSC)作为患有自然发生的关节疼痛且对当前疗法无反应的猫的治疗的潜力。据此评估该治疗的临床效果和安全性。
材料与方法
猫
一组猫科动物患者接受研究产品(IVP)的治疗。应用类似的纳入和排除标准。具体而言，纳入标准为：一个或多个关节的关节疼痛持续数天/周、对保守疗法无反应、确诊跛行、通过既往病史确诊疼痛、通过放射线照相(RX)或其他成像方式证实关节疼痛相关体征。排除标准是：扭伤、怀孕、其他可能影响临床研究的疾病、猫常规医疗的改变、清除期内的皮质类固醇施用或正在进行的皮质类固醇治疗。在研究期间的三个评估点(注射后第0天、第3周和第6周)观察到所有猫的异常行为、姿势和潜在不良事件的发生，例如注射部位跛行恶化、关节肿胀或皮肤过敏。评估由在猫科动物骨科领域具有至少5年实践经验的兽医进行。良好知情的主人有责任报告评估点之间潜在不良事件的发生情况。研究期间继续所有常规医疗。
ePB-MSC(IVP)的分离和培养、研究设计和统计分析
如实施例1中那样分离和培养ePB-MSC。研究设计与实施例1中的狗非常相似。所有纳入的猫患者均注射一小瓶含有1mLePB-MSC悬浮液的IVP。小瓶在手掌中解冻并静脉注射。随后，由经验丰富的兽医在三个评估点(第0天：治疗施用日，随访1：治疗后3周，和随访2：治疗后6周)对猫进行临床评估，并由良好知情的主人随时进行彻底观察。在评估点，通过矫形检查、跛行评估、关节活动度(ROM)测定(主观评分+角度测量)和对一般临床状况的影响评估，对治疗效果进行调查和评分。通过将中心放置在肢体轴上，并将透明臂与肢体上的解剖标志对齐，来应用角度计，以确定ROM(以度数表示)。将测量值与正常值进行比较。此外，以与实施例1中类似的方式，由主人对疼痛严重程度、疼痛干扰和生活质量进行评分。应用实施例1的统计分析方法。
结果
治疗六周后，跛行评分明显优于基线情况。在这六周的时间里，一些个别患者的跛行程度有所减轻，而另一些患者的跛行程度则保持稳定，只有少数猫的跛行程度恶化。其次，治疗三周后整体关节活动度值显著改善。治疗六周后，一些患者的关节ROM有所改善。此外，根据猫主人完成的调查问卷，从基线到治疗后三周，疼痛严重程度评分显著下降。此外，疼痛干扰评分在基线和治疗后三周之间以及基线和治疗后六周之间有所下降。此外，在六周的研究中，大多数猫的生活质量得到改善，而只有少数猫的生活质量恶化。最后，治疗后的关节评估显示，与基线相比，三周后关节疼痛减轻。此外，与基线相比，三周和六周后关节积液评分也显著降低。
讨论
据我们所知，这是调查静脉内注射异种马外周血间充质干细胞在患有关节疼痛的猫中的潜力的首次研究。干细胞疗法被证明具有良好的耐受性，因为在本研究期间没有报告与治疗施用相关的疑似药物不良反应或严重不良事件。此外，关节评估显示关节热感或关节疼痛没有增加。相比之下，治疗后三周检测到关节疼痛显著减轻。治疗施用后三周和六周关节积液显著减少。
先前的研究已经调查了MSC在猫科动物中的安全性。然而，这项研究首次描述了马间充质干细胞在猫体内的异种应用，通过静脉内注射作为关节疼痛的治疗选择。在目前的研究中，未诱导/天然MSC是通过静脉内注射而不是关节内注射，这可能具有显著的全身抗炎作用，导致减轻多个受影响关节的疼痛和炎症。此外，间充质干细胞已被证明能够迁移到炎症区域，有助于额外的局部抗炎作用。这种类型的施用也提供了以即用制剂静脉内注射的优点。这项研究表明，单次静脉内注射ePB-MSC是一种有前途且安全的治疗猫关节疼痛和跛行的方法。
目前，ePB-MSC注射的安全性是根据临床参数进行评估的。随访期间，骨科检查未发现跛行和关节活动度恶化并且甚至有改善趋势。与基线条件相比，跛行评分在两个随访时间点均显著下降。与第0天相比，在第三周和第六周时发现对关节活动度的影响显著降低。结果还表明猫所经历的疼痛有所改善。与第0天相比，第一次随访时疼痛严重程度评分显著下降，并且两次随访时干扰评分显著下降就说明了这一点。大多数猫的生活质量也有所提高。
结论
总之，这项研究的结果表明，在患有关节疼痛和跛行的猫患者中，单次静脉内注射ePB-MSC的耐受性非常好。ePB-MSC注射后关节疼痛和跛行不会加重，并且有改善的趋势。
实施例3：IV施用的ePB-MSC的剂量功效和安全性
为了验证静脉内施用的最佳剂量，进行了一项研究，将32只目的饲养的狗分为四个治疗组，静脉内接受推荐剂量3x105ePB-MSC的0.2倍、1倍或5倍剂量，或不含本发明的ePB-MSC的对照注射。
方法
在治疗施用前两周(第-14天)，通过手术完全横断颅十字韧带并在股骨髁的承重表面上产生双侧软骨缺损，在32只狗的每只的右后膝关节中手术诱发骨关节炎(OA)。在治疗当天(第0天)，将狗随机分为四个治疗组，每组8只狗(T1、T2、T3和T4)。治疗组T1、T2和T3的狗分别接受推荐剂量3x105ePB-MSC的0.2倍(0.2ml)、1倍(1ml)和5倍(5ml)的IV(静脉内)注射。治疗组T4(对照组)的狗被静脉内注射5ml 0.9％NaCl溶液(Vetivex 9mg/mL)。所有狗每天都要接受临床观察，以评估不良事件的发生情况。此外，在研究期间直至治疗后42天对骨科、临床、血液学、病理学和组织学参数进行评估。
结果
一般临床和身体评估
在整个研究期间，没有报告不良临床事件或一般身体健康的改变。此外，根据常规血液分析，没有检测到有意义的血液学和生化变化。
骨科评估
在OA引入之前，没有动物表现出跛行、关节疼痛或关节积液。在每次基线后访视中，与三个研究兽医产品(IVP)组(T1、T2、T3)相比，对照组(T4)中没有、有轻度或中度关节跛行、关节疼痛和关节积液的动物更少。此外，T2组的所有骨科评分在每次基线后访视时都比基线有显著改善。此外，与T1和T3相比，T2组在第42±4天的跛行评分、关节疼痛评分和关节积液评分显著降低(图4a、4b和4c)。在第-21天和第0天，所有组的平均关节活动度(ROM)相似。从第14±1天开始的每次基线后访视中，与T4组相比，三个IVP组的ROM值更高。T2组显示，在所有基线后访视中，ROM的增加最高(图4d)。
第0天时，所有组的平均力(MF)和平均最大力(MMF)相似。然而，在第28±1天，各组之间的MF和MMF显著不同(MF：P＝0.031和MMF：P＝0.037)，与T4组相比，三个IVP组的平均值更高。MF和MMF从第0天到第42±4天的变化在组间有显著差异(MF：P＝0.018和MMF：P＝0.045)。与T4组相比，三个IVP组的每组中发现较大的增加，其中T2组增加最高(图4e和4g)。平均对称性指数也发现了类似的结果(图4f)。
CBPI评估
纳入时，所有动物的疼痛严重程度评分(PSS)和疼痛干扰评分(PIS)均为零。在第0天，所有四组的平均PSS和PIS分数相似。在每次基线后访视时，三个IVP组的平均PSS和PIS评分均显著低于安慰剂组(P≤0.001)。此外，此外，与第42±4天的T1(PSS:-1.9±0.35；PIS:-2.0±0.44)、T3(PSS:1.6±0.38；PIS:1.7±0.27)和T4(PSS:0.8±0.30；PIS:-0.28±0.33)相比，T2组的PSS和PIS得分下降幅度最大(PSS:3.0±0.55；PIS:-3.1±0.72)(数据未显示)。
所有动物在第-21天的生活质量评分(QOL)均为1分(＝优秀)，在第0天的评分为4分(＝一般)。从第7±1天开始的每次基线后访视时，与T4组相比，所有三个IVP组中得分为2(＝非常好)或3(＝好)的动物更多。在第42±4天，与T1(12.5％)和T3(0％)相比，T2组得分为2的动物百分比最高(75.0％)，并且显著好于T4(0％)(P≤0.001)(数据未显示)。
病理学、组织学和免疫组织化学
在第42±4天，与T1组(75.0％和50.0％)和T3组(62.5％和75.0％)相比，T2组中观察到滑膜炎和软骨评分1分的发生率最高(87.5％和87.5％)。与T4组相比，所有三个IVP组中每个半月板的平均总分均较低。除了T3组与T4组相比内侧半月板(P＝0.092)之外，这种差异对于所有组比较都是显著的(P≤0.035)。与T1组(0.3±0.7)和T3组(1.0±1.2)相比，T2组两个半月板的平均得分最低(0)(补充数据)。关节表面和滑膜的组织病理学评估显示所有组的结果相似。此外，治疗组之间软骨寡聚基质蛋白(COMP)、II型胶原、葡糖胺聚糖和血管性血友病因子(vWF)的免疫组织化学评估没有发现显著差异。最后，在注射部位、股骨内侧髁(MFC)、股骨外侧髁(LFC)、胫骨内侧平台和胫骨平台外侧均未发现异位组织。
实施例4：目标动物安全性
为了评估单次和重复静脉内施用ePB-MSC对狗的安全性，在本实施例中评估了几个临床安全性参数。
方法
48只健康的专门饲养的比格犬被随机分配接受测试项目(n＝40)或参考项目(n＝8)的静脉内注射。用测试项目治疗的狗在第0天接受3x105ePB-MSC(1mL)(n＝8)、9x105ePB-MSC(3mL)(n＝8)和15x105ePB-MSC(5mL)(n＝8)(单次注射治疗组)或第0、42和84天接受3x105ePB-MSC(1mL)(n＝8)和15x105ePB-MSC(5mL)(n＝8)(重复注射治疗组)。注射后，所有狗都要接受为期252天的评估。所有狗每天都要接受临床观察，以评估不良事件的发生情况。采集血液和尿液样本进行血液学、凝血和生化分析。在研究期结束时，对所有动物实施安乐死，以进行彻底的尸检和组织学分析，并分析ePB-MSC的保留情况。
结果
除了几个MSC治疗组中暂时性网织红细胞增加之外，对照组和治疗组之间没有观察到临床安全参数的明显差异。然而，这与任何不良事件无关，总体平均值在参考范围内。在体检、临床和注射部位观察期间，没有一只狗表现出任何临床异常。体重没有发生明显下降。没有观察到与研究药物相关的不良事件，并且实验室结果没有表明研究期间有任何明显的异常。根据文献研究，整个研究中的异常发现(网织红细胞增多除外)可被认为是偶然的且与测试项目无关。在尸检和组织病理学评估过程中未观察到异位组织。此外，观察到的所有(轻微)异常不太可能与测试项目相关。PCR分析发现分析的样品中不存在eMSC，这表明MSC不会长期驻留在组织或循环中。
结论
该测试项目被证明对于静脉内使用/施用是安全的。
实施例5：用ePB-MSC治疗之前和之后狗的混合淋巴细胞反应(MLR)：
设置：
为了研究在狗中诱导OA后的细胞免疫反应，在给狗注射ePB-MSC之前和之后，用从狗身上分离的外周血单个核细胞(PBMC)进行了混合淋巴细胞反应(MLR)测定。
为了确认狗中ePB-MSC的免疫调节特性，在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，将ePB-MSC与伴刀豆球蛋白A(conA)刺激的犬外周血单个核细胞(PBMC)共孵育。因此，使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯7-氨基放线菌素D(CFSE-7AAD)标记，用流式细胞术评估PBMC增殖(％)。该测定在两项不同临床研究(概念验证和安全性研究)中包含的所有狗的治疗前后进行。
在诱导手术OA模型两周后，概念验证研究中的32只狗被分配到四个治疗组(即低剂量(T1)(100,000个ePB-MSC)、标准剂量(T2)(300,000个ePB-MSC)和高剂量(T3)(1,500,000个ePB-MSC)和使用盐水的对照组(T4)。为此，使用导致关节退化和软骨缺损的前十字韧带(ACL)软骨缺损模型。
纳入安全性研究的48只狗被分为6个相等的组，每组8只狗，并接受不同剂量的ePB-MSC或安慰剂(即T1：安慰剂(对照组)，T2：单次注射推荐剂量(＝300,000ePB-MSC)，T3：单次注射3倍推荐剂量，T4：单次注射5倍推荐剂量，T5：以推荐剂量重复注射(n＝3)，T6：重复注射(n＝3)5倍推荐剂量)。
结果：
概念验证研究
与所有治疗组的阳性对照相比，在治疗前(第-7天)和治疗后(治疗后第28天)，共孵育样品的PBMC增殖(％)显著较低(P<0.001)。此外，治疗前与治疗后(各治疗组)的PBMC增殖(％)之间没有发现显著差异(P≥0.061)(图5)。
安全性研究
与所有治疗组的阳性对照相比，在治疗前(第-7天)和治疗后(第126天)，共孵育样品的PBMC增殖(％)显著较低(P≤0.002)。此外，与治疗前相比，治疗后共孵育样品的PBMC增殖(％)下降。然而，这仅对六组中的三组是显著的(图6)。
结论：
两项研究中所有治疗组的PBMC增殖在治疗前后均显著低于阳性对照，证实了ePB-MSC具有降低受刺激的犬PBMC炎症反应的免疫调节能力。此外，在治疗前后都发现了ePB-MSC的强大的免疫调节特性。此外，重复注射不会降低ePB-MSC的免疫调节特性。相反，在六组中的三组中，静脉内注射后发现这些免疫调节特性显著更高。免疫调节特性证实了异种ePB-MSC可用于治疗狗的骨关节炎。
实施例6：MLR上清液中的免疫调节和促炎标志物
设置：
使用商业ELISA试剂盒测试在MLR测定期间收集的上清液中免疫调节和促炎标志物，所述MLR测定中将ePB-MSC与conA刺激的犬PBMC共孵育4天。这是为了进一步研究马外周血来源的间充质干细胞(ePB-MSC)对犬PBMC的免疫调节特性，并确定ePB-MSC分泌的何种旁分泌因子可能参与该免疫调节过程。
结果：
结果显示，与阴性对照样品相比，阳性对照样品中的TGF-β1浓度大幅增加。然而，与阳性对照相比，免疫调节样品中发现了很大的下降，这与阴性对照相当。TGF-β1的促炎特性先前已被描述，并且可能诱导或刺激T细胞分化为炎症T辅助17细胞。这些结果表明TGF-β1的产生可以通过ePB-MSC的免疫调节特性下调至基线水平(图7)。
此外，与阴性对照相比，在阳性对照样品上清液中发现TNF-α浓度显著增加。这表明，ConA刺激犬PBMC诱导或刺激促炎细胞因子TNF-α的释放。免疫调节样品的ELISA结果显示ePB-MSC能够将TNF-α浓度降低至阴性对照的水平，表明ePB-MSC能够通过其免疫调节特性逆转这种炎性环境(图8)。
最后，PGE2结果表明，与阳性和阴性对照样品相比，免疫调节与上清液中PGE2的强烈增加相关。这些结果表明PGE2在ePB-MSC的免疫调节作用中的重要性(图9)。
结论：
免疫调节上清液样品的ELISA显示，ePB-MSC能够将TNF-α和TGF-β1浓度降低至阴性对照的水平，表明ePB-MSC能够通过其免疫调节特性逆转这种炎性环境。此外，与阳性和阴性样品相比，发现免疫调节上清液样品中的PGE2强烈增加，这进一步加强了PGE2在ePB-MSC的免疫调节作用中的重要性。
实施例7：IV ePB-MSC治疗对犬血液中炎症标志物和软骨代谢物的影响
设置：
为了更深入地了解ePB-MSC在狗OA病理过程中的体内免疫调节特性，对32只狗治疗前后不同时间点(第-21天、第0天、第14天、第28天和第48天)的血清中的不同炎症标志物和感兴趣的软骨代谢物进行了评估。32只狗在诱导手术OA模型两周后被分配到四个治疗组(即低剂量(T1)(100,000ePB-MSC)、标准剂量(T2)(300,000ePB-MSC)、高剂量(T3)(1,500,000ePB-MSC)和使用盐水的对照组(T4)。为此，使用导致关节退化和软骨缺损的前十字韧带(ACL)软骨缺损模型。研究的炎症标志物和软骨代谢物为转化生长因子β1(TGF-β1)、***素E2(PGE2)、干扰素-γ(IFN-γ)、补体因子C3a、II型胶原蛋白裂解(C2C)和透明质酸(HA)。
在一项单独的事后分析中，本研究中的所有狗根据研究结束时(第42天)的滑膜炎和软骨评分被重新细分为对照和病例(对照：评分≤2；病例：评分>2)。使用单变量统计方法来查看基于上述标志物的这些组之间是否存在显著差异。
结果：
用300,000个ePB-MSC(T2)治疗的狗的结果显示，与对照组相比，治疗后第28天的HA血清水平显著增加(图10)。此外，事后分析显示病例和对照群体之间的HA血清水平也存在显著差异(图11)。此外，在治疗施用后的所有时间点，与对照组(T4)相比，用300,000个ePB-MSC(T2)治疗的狗中发现PGE2血清水平较高。然而，这仅在治疗后第14天有显著差异(图12)。在评估的时间点，未发现ePB-MSC施用对其他测试的体内标志物产生显著影响。
结论：
HA水平增加表明ePB-MSC潜在地引起软骨退化减少，并表明ePB-MSC具有软骨保护作用。事后分析显示软骨和滑膜炎评分与HA血清浓度之间存在明确的联系，这强化了ePB-MSC具有软骨保护作用这个结论。此外，PGE2水平的增加证实了我们的体外研究发现，即PGE2参与ePB-MSC的免疫调节模式。
实施例8：ePB-MSC向患有OA的关节的生物分布
设置：
使用OA模型在实验室犬中进行99mTc标记的ePB-MSC的生物分布研究，以研究ePB-MSC向损伤区域的归巢行为。在生物分布研究开始前四天，三只专门饲养的狗接受手术以诱导犬OA模型。通过完全横断颅十字韧带并在股骨髁的承重表面上产生双侧软骨缺损，在每只狗的右后膝关节中诱发OA。手术前三天和手术后四天，进行能量多普勒检查，以评估手术对关节血管化的影响。接下来，使用99mTc标记的ePB-MSC检查注射后24小时ePB-MSC在受伤和健康后膝关节中的生物分布。使用在全身扫描的侧面视图上手动绘制的目的区域(ROI)对两个后膝关节(对照和病变)的放射性进行量化。病变关节中ePB-MSC的相对摄取表示为相对于对照病变上的测量计数的增加倍数。
主要结果：
研究犬OA模型中99mTc标记的ePB-MSC的生物分布显示，注射后24小时，与对照关节(n＝3)相比，手术后后膝关节的摄取量高出13.0±3.9倍。手术后四天进行的超声检查表明，手术肢体后膝关节处的灌注轻微增加，而健康后膝关节水平仅观察到灌注的轻微增加(数据未显示)。
结论：
这些结果证明了静脉内注射后ePB-MSC向损伤区域的自然归巢行为，并为它们在犬OA治疗中的作用模式提供了更多见解。
本发明决不限于实施例中描述的和/或附图中所示的实施方案。相反，根据本发明的方法可以以许多不同的方式实现而不背离本发明的范围。

Claims (20)

1.间充质干细胞(MSC)或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，用于在犬科动物和猫科动物中治疗骨关节炎。
2.用于权利要求1所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是静脉内施用的。
3.用于权利要求1-2中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是天然的。
4.用于权利要求1-3所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是源自血液的，优选地是源自外周血的。
5.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是同种异体或异种MSC，优选地异种MSC。
6.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC是源自动物的，优选地是源自哺乳动物的，更优选地是源自马的。
7.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中对每只犬科动物或猫科动物施用105-107个MSC的剂量。
8.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中施用单剂量。
9.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中施用多个剂量，每个剂量在不同时间点施用。
10.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述组合物的一个剂量具有最大约5ml的体积，优选地所述体积为约1ml。
11.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC对于MHC II类分子和/或CD45测量为阴性。
12.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC对于间充质标志物CD29、CD44和CD90测量为阳性，并且对于MHC II类分子和CD45测量为阴性。
13.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC当存在于炎性环境或状况中时分泌免疫调节性***素E2细胞因子。
14.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中当存在于炎性环境或状况中并且与具有相同特征但未经受所述炎性环境或状况的细胞相比时，所述MSC具有至少一种选自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其组合的分子的分泌增加；和/或IL-1的分泌减少。
15.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中当存在PBMC时，所述MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其组合的表达和/或当存在PBMC时，所述MSC抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β、IL-13或其组合的分泌。
16.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC存在于无菌液体中。
17.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC或所述组合物还包含选自由以下组成的组的组分：富血小板血浆(PRP)、透明质酸、基于透明质酸的组合物、葡糖胺聚糖或基于葡糖胺聚糖的组合物或其任何组合。
18.用于前述权利要求中任一项所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述治疗是在诊断有或患有骨关节炎的犬科动物和猫科动物中治疗跛行和/或关节疼痛。
19.用于权利要求18所述用途的MSC或包含治疗有效量的MSC的药物组合物，其中所述MSC或组合物是静脉内施用的。
20.包含外周血来源的MSC的药物组合物，所述MSC是动物来源的，优选地是哺乳动物来源的，并且以每mL所述组合物105-107个MSC之间的浓度存在于无菌液体中，其中一个剂量的所述组合物具有约0.5至5ml的体积，其中所述MSC对间充质标志物CD29、CD44和CD90测量呈阳性，并且对MHC II类分子和CD45测量呈阴性，并且其中所述MSC具有在10μm和100μm之间的悬浮直径。
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