CN1179105A

CN1179105A - α－促黑激素拮抗剂及相关方法

Info

Publication number: CN1179105A
Application number: CN 96192639
Authority: CN
Inventors: 小马克·奎伦; 钱纳K·杰亚威克里姆; 迈克尔R·勒纳
Original assignee: MARK QUILLAN J
Current assignee: MARK QUILLAN J
Priority date: 1995-01-17
Filing date: 1996-01-16
Publication date: 1998-04-15

Abstract

本文公开α－促黑激素的肽类拮抗剂以及抑制此激素对其敏感细胞或组织的作用的方法。具体地说,公开的是皮肤色素沉着的增白方法和治疗恶性黑色素瘤的方法,以及应用本发明的试剂盒。

Description

α-促黑激素拮抗剂及其相关方法

1.前言

本发明提供α-促黑激素的肽类拮抗剂，并提供抑制α-促黑激素对其敏感细胞或组织的作用的方法，包括增白皮肤、调节免疫应答和治疗恶性黑色素瘤。

2.发明背景

皮肤的色素沉着和颜色变深与表皮黑素小体中黑色素的含量及分布有关。表皮细胞群包括角化细胞和黑色素细胞，后者通过树状突起为角化细胞提供黑素小体，即含有黑色素的色素颗粒。黑色素即黑色色素，它是这样产生的：在酪氨酸酶的催化下，将酪氨酸氧化成多巴和多巴醌，其所生成的化合物再聚合成黑色素。

局部过度色素沉着有许多种，目前还缺乏安全有效的美容治疗方法。这些色素沉着包括色斑，如雀斑、太阳痣(亦称肝痣)、黑色棘皮病(一种黑色素过度性失调)、牛奶咖啡斑、痣、黄褐斑(产后局部皮肤变暗)。调节全身皮肤色调的方法一直是人们关注和需要的，其目的是为了美容，例如增白皮肤，或者阻止由内分泌失调引起的外观损害。到目前为止，还没有完全有效的方法用于调节表皮色素沉着的色调。

与色素沉着的调节有关的内源激素是α-促黑激素(“α-MSH”)(Lerner等，1961，Nature 189，176-179)。α-MSH还与下列因素有关：中枢神经***及免疫***功能的调节(De Weid，1993， Ann.NY Acad.Sci.680，20-28；Tatro，1990， Brain Res.536，124-132；Luger等，1993， Ann.NY Acad.Sci.680，567-570；Cannon等，1986， J. Immunol.137，2232-2236；Murphy等，1983， Science 221，192-193)，生长(Strand，F.l.等，1993， Ann.NY Acad.Sci.680，29-49)，细胞***(Halaban等，1993， J.Ann.NY Acad.Sci.689，290-300)，以及黑素瘤(Varga等，1974， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71，1590-1593)。

对α-促黑激素是皮肤基本色调的内源调节因子的假设的间接支持来自一些实验，在这些实验中，摘除鱼类、两栖类和低等哺乳类的垂体会诱导其色素沉着减轻(Chavin，1956， J.Exp.Zool.133，1-36；Smith，1916，Science 44，75-758；Allen，1916， Science 44，755-758；Rust，C.C.，1965， Gen. Comp.Endocrinol.5，222-231)。

此外，一些临床实例报道称，当人由于疾病或垂体切除而导致垂体功能丧失时会变得异常苍白(Felig等，1987. Endocrinology and MetabolismMcGraw-Hill Book Company，New York，1-26)。对人类，不仅垂体释放MSH，而且皮肤角化细胞在紫外光照射后也明显释放MSH(Luger等，1993， Ann.N.Y.Acad.Sci.680，567-570)。众所周知，将MSH注射给动物或人会使皮肤色调超出基本色调水平。内源α-MSH对基本色调的色素沉着的贡献，至今尚属未知。

已表明MSH可使培养的小鼠黑色素瘤细胞的酪氨酸酶活性增强。还发现同步化细胞只在细胞周期的G2期对MSH有响应。¹²⁵I标记的MSH的结合主要发生在G2期。因此，推测MSH可能通过结合到G2期细胞的MSH受体上激活黑色素瘤细胞腺苷酸环化酶(Varga等，1974，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，71(5)，1590-3)。

因此，实用的α-MSH活性拮抗剂可提供确认内源α-MSH作用的药剂，并提供调节α-MSH介导的全部生物功能(包括皮肤色素沉着色调和恶性黑色素瘤细胞)的方法。

最近，Jayawickreme等人在94年11月的 J.of Biol.Chem.269(47)，29846-29854中鉴定了一系列多肽类α-MSH拮抗剂，例如八肽和九肽拮抗剂。然而，较大肽分子透过使人感兴趣的组织的能力是有限的。因此需要小分子α-MSH拮抗剂，例如小于500道尔顿的拮抗剂，该拮抗剂最好易于扩散到组织结构中以调节α-MSH敏感组织。

3.发明概述

本发明提供α-MSH的肽类拮抗剂，进而为调节对α-MSH有响应的细胞和组织的功能提供了方法。本发明根据下面表1的活性α-MSH肽提供肽类拮抗剂。因此，本发明提供了α-MSH的这样的肽类拮抗剂，它包含R-S-T序列，其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。本发明还提供与所公开的肽类拮抗剂有类似结构的分子。

本发明还提供一种方法，即通过将本发明的α-MSH肽类拮抗剂与α-MSH响应细胞或组织相接触来抑制α-MSH活性。

本发明还提供使动物皮肤外观增白的方法，该方法是通过给需要此类治疗的动物，例如哺乳动物如人，施用有效量的本发明的α-MSH肽类拮抗剂而完成的。提供了若干方法用于治疗色素斑、痣、雀斑、黄褐斑，并可用于局部或全身的外观增白美容。

本发明还提供一种治疗恶性黑色素瘤的方法，该方法是通过给需要此类治疗的哺乳动物，例如人，施用有效量的本发明的α-MSH肽类拮抗剂而完成的。施用可以是局部的或全身性的。

本发明还提供一种调节免疫***的方法，该方法是通过给需要这种治疗的哺乳动物，例如人，施用有效量的本发明的α-MSH肽类拮抗剂而完成的。

在另一实施方案中，本发明提供一种根据下面表1中给出的活性α-MSH拮抗肽的肽类拮抗剂的药物组合物。因此本发明提供具有R-S-T氨基酸序列的α-MSH拮抗剂。其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。以及药用载体。

在一可选的实施方案中，本发明提供一种α-促黑激素的三肽拮抗剂，通过制备组合筛选文库来鉴定该三肽拮抗剂，文库中含有随机结构的三肽分子文库。该随机组合筛选文库再与α-促黑激素活性测试***接触，随后鉴定出拮抗α-促黑激素活性的三肽分子。

4.附图描述

图1显示由用于鉴定三肽拮抗剂的96个子文库形成的组合筛选文库的构成。缩写：Abu，2-氨基丁酸；γ-Abu，4-氨基丁酸；ε-Abx，6-氨基己酸；Aib，2-氨基异丁酸；β-Ala，3-氨基丙酸；Orn，鸟氨酸；Hyp，反式羟脯氨酸；Nle，正亮氨酸；Nva，正缬氨酸。

图2A和2B显示α-MSH拮抗剂反应的视频图像，这些图像在第一位包含D-Trp的组合子文库(即D-Trp子文库)中的微珠上产生的。左图(图2A)显示覆盖有爪蟾黑色素细胞的6厘米琼脂糖培养皿(Falcon产)，这些细胞在刚好应用大约600个D-Trp子文库的微珠之后，用褪黑激素(1Nm，30分钟)和α-MSH(15Nm，30分钟)预处理。60分钟后(图2B)，由于邻近微珠的局部释放而显示出白色环形图案。

图3提供待测定拮抗剂的剂量响应曲线，这些拮抗剂被用于测试其对α-MSH诱导培养的爪蟾黑色素细胞中色素扩散的抑制能力。曲线图显示对3个肽A₁(正方形)，A₄(实心三角形)和A₆(空心圆形)(见表1)的抑制曲线的实例，这三个肽是通过扩散实验鉴定的。在文库筛选中没有发现的另外两个肽A₉(实心圆)和A₁₁(实心三角形)也被包括在内作为比较。通过测量透过1nM褪黑激素与处理的培养黑色素细胞的光透过率(Potenza等，1992， Anal.Biochem 206，315-22)和相应的逻辑方程曲线可对黑色素反应进行定量(De Lean等，1978， Am.J.Physiol.235，E97-E102)。每一点代表4个相互独立的测量值的均值和样本标准差(SSD)，这些测量值是在加入α-MSH(15Nm)和所需浓度的游离肽之后进行2小时后得到的。所得结果用占相应的单独用α-MSH处理所得结果的百分数表示。

图4显示D-Trp-Arg-Leu-NH₂(dWRL)对α-MSH的竞争抑制作用。这个抑制作用通过Schild回归分析得到证实(Arunlakshana等，1959， Br.J.Pharm.14，48-58)。平衡解离常数(pKc)是7.2±0.1M，回归斜率是1.6±0.03。虚线显示置信度为99％。

图5显示图4的剂量比率(dr)，这些比率来自α-MSH中不加DWRL(空心圆形)，加入1μM(实心菱形)，10μM(空心三角形)和100μM(实心圆形)浓度的DWRL时的浓度响应曲线。(α-MSH单独存在时EC₅₀是2.5±0.3Nm，α-MSH与DWRL并存时EC₅₀是4.8±0.6μM)。每个点代表四个独立的透光率测试的均值和SSD。Ti＝初始透光率(2分钟)。Tf＝最终透光率(60分钟)。DWRL不引起血管活性肠肽(“VIP”)和8精加压催产素(“AVT”)的EC₅₀值的变化(此数据没有列出)。

图6显示D-Trp-Arg-Nle-NH₂(dW-R-Nle)在40μM时阻断α-MSH介导的cAMP第二信使刺激作用，但不阻断AVT(8nM)激活的cAMP刺激作用。催产素拮抗剂GVT([d(CH₂)₅，Tyr(Me)²，Orn⁸]-加压催产素；Peninsula产)在20μM时被用作阻断由8Nm AV激活的响应的对照。细胞内CAMP的测量是用在24孔组织培养平板(Falcon)中生长的汇合爪蟾黑色素细胞进行的。每个条线图代表4个独立测量值的均值和SSD。^*(T-测试；P＜0.001)对于全部测试组，带星号者除外。

图7显示人MSH受体受爪蟾成纤维细胞中dWRL的功能拮抗作用(Daniolos等，1990，Pigment Cell Res.3，38-43)。这些爪蟾成纤维细胞受到“Vector alone”(pcDNAI/NEO，Invitrogen产)或含有人黑色素瘤MSH受体***片段的“HMelMSHR”(pcDNAI/NEO)的转染。对照＝无附加药物，MSH＝5nMα-MSH，dWRL浓度＝10μM，毛喉素＝100μM毛喉素(7β-去乙酰基-7β-[g-(N-甲基哌嗪)-丁酰)；Calbiochem产)。

图8是一幅照片，用来表明局部施用三肽DWRL(1mM水溶液)到爪蟾皮肤使沉着色素的皮肤增白而形成“白化病样”的肤色。

图9是一幅照片，用来表明给爪蟾作全身注射引起全身色素沉着皮肤的增白作用。给三只爪蟾注射了(40μM/kg)DWRL或D-Trp-Abu-Arg-NH₂(对照)，在20分钟内，呈现出白化病样的体表特征，如图所示。三个对照爪蟾仍是黑色皮肤。

图10显示6个活性最强的L-型分子在第3位置的结构功能的比较，这些分子是通过随机筛选的办法从第1位是D-Trp，第2位是精氨酸的子文库中鉴定出来的。在随机筛选中没有发现的另外3个在第3位取代的分子也列于此作为比较。拮抗剂的活性与第3位的R基团的疏水性和电荷特征相关。

5.发明详述

本发明涉及下面表1中活性α-MSH拮抗肽的肽类拮抗剂。因此，本发明提供调节响应α-MSH激素的细胞和组织的功能的α-MSH拮抗剂和方法。具体地说，本发明提供含有R-S-T序列的α-MSH肽类拮抗剂，其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。在优选的实施方案中，此多肽由10个，包括但不限于15个氨基酸。在另一实施方案中，此多肽包含不超过8个或不超过12个氨基酸残基(包括氨基酸残基衍生物或氨基酸类似物)。

在另一个优选实施方案中，此类肽分子含有作为三肽的3个连续的氨基酸残基(包括氨基酸残基的衍生物或氨基酸类似物)，其中这三个氨基酸残基是下面表1中给出的活性α-MSH拮抗剂。本发明还提供这些肽的类似物和衍生物。

本文所用术语“氨基酸”或“氨基酸残基”是指天然存在的、非天然存在的或衍生的氨基酸残基或具有氨基酸构象的分子。

术语“肽”是指任何含有肽键的分子，它由天然存在的、非天然存在的或衍生的氨基酸残基或具有氨基酸构象的分子组成。肽键是指连接两个相邻氨基酸残基的酰胺键。

在具体实施方案中，α-MSH拮抗剂是下述三肽分子之一：D-Trp-Arg-Leu；D-Trp-Arg-Nle；D-Trp-Arg-Nva；D-Trp-Arg-Met；D-Trp-Arg-D-Nle；D-Trp-Arg-Ile；D-Trp-Arg-Abu；D-Trp-Arg-Val；D-Trp-Arg-Arg；D-Trp-Arg-D-Arg；D-Trp-Lys-Nle；D-Trp-D-Arg-Nle；D-Trp-Leu-Nle；D-Trp-Nle-Nle；D-Trp-Ala-Nle；D-Trp-Met-Nle；D-Trp-Abu-Nle；D-Phe-Arg-Nle；D-Tyr-Arg-Nle；D-Ac-Trp-Arg-Nle；Trp-Arg-Nle和D-His-Arg-Nle。还提供了包含一个或多个上述三肽的组合物。

在另一实施方案中，肽的分子量小于500道尔顿。

在另一实施方案中，肽可以是从随机合成的组合文库中通过筛选α-MSH拮抗活性得到的三肽α-MSH拮抗剂。作为示例，组合文库可按Houghten等，1991， Nature354，84，Houghten等，1992， Biotechniques13，412或Jayawickreme等，1994， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，1614-1618的方法，文库中合成的肽类具有随机结构并且与α-MSH的同源性无关。限定“随机”是为了使所得的肽不具有任何可预言的大小和任何位置的结构。本领域已知的其他随机文库也可用于鉴定α-MSH拮抗肽。筛选可按任何本领域中已知方法进行，并优选按下面实施例中所述进行筛选。

这些肽以及构成肽的氨基酸不限于天然存在的20种氨基酸。非经典的氨基酸包括但不限于下述分子：普通氨基酸的D型异构体，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，设计者(designer)氨基酸如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，以及一般的氨基酸类似物。此外，氨基酸还包括：Abu，2-氨基丁酸；γ-Abu，4-氨基丁酸；ε-Abx，6-氨基己酸；Aib，2-氨基异丁酸；β-Ala，3-氨基丙酸；Orn，鸟氨酸；Hyp，反式羟脯氨酸；Nle，正亮氨酸；Nva，正缬氨酸。而且，氨基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)。而且，这些肽和/或氨基酸可以通过对基团的封闭而形成衍生物，包括但不限于乙酰化，在氨基末端羧基化，和在羧基末端酰胺化以提供被保护的衍生物。

通过组合筛选鉴定的α-MSH拮抗肽可用本领域中已知的方法制备。例如，简单地说，有固相合成法，包括将C末端氨基酸的羧基偶联到树脂上并不断加入N-α保护的氨基酸。保护基团可以是本领域中已知的任何一种。在每加入一个新的氨基酸到增长链之前，先前加入的氨基酸要脱保护。将氨基酸偶联到适当的树脂的方法见Rivier等，美国专利4,244,946号。此类固相合成见例如Merrifield，1964， J.Am.Chem.Soc.85：2149；Vale等，1981， Science 213：1394-1397；Marki等，1981， J.Am.Chem. Soc.103：3178和美国专利4,305,872和4,316,891号。在优选的方面中，使用自动肽合成仪。

合成肽的纯化按标准方法进行，包括层析(例如离子交换，亲和层析，体积柱层析)，离心，差示溶解度法或任何其他纯化蛋白的标准技术。在优选实施方案中，可使用反相HPLC(高效液相层析)。

本文公开的三肽拮抗剂的结构与功能的关系详见附图。其第3位氨基酸如图10所示。参考此关系可制备有α-MSH拮抗剂活性的类似分子结构。因此，除了本文描述的肽类拮抗剂的结构、疏水性、电荷特征和侧链性质外，本发明还试图包括这些类似分子。

5.1α-MSH拮抗剂具有治疗和美容用途

α-MSH肽类拮抗剂因其对α-MSH介导的功能有作用而具有治疗和美容方面的用途。例如它可减轻皮肤色素沉着，调节免疫***和治疗黑色素瘤。

“增白(lightening)”意指减轻皮肤中黑色素造成的色调，使皮肤变白。不希望被任何具体的作用机制所限制，据信肽类拮抗剂是α-MSH对α-MSH受体的竞争性抑制剂，可阻断内源α-MSH的色素沉着作用。因此，存在于α-MSH响应细胞中的黑色素颗粒会在α-MSH拮抗肽的存在下由于对内源α-MSH受体的封闭而分散开。这会去除MSH对黑色素积累的增强效应。当局部施用这种肽时，施用肽的部位的皮肤就会变白。当全身施用这种肽时，全身皮肤表面的色调就会变浅。

α-MSH拮抗肽可用于治疗下述局部病症，包括但不限于色斑、色块如痣、胎记、雀斑、黄褐斑、炎症后色素过度沉着。若需要的话，也可以以美容为目的进行局部和全身肤色增白，如前所述。

通过将有效量的本发明的肽类拮抗剂给病人施用，α-MSH拮抗肽为治疗恶性黑色素瘤提供了方法。

通过给需要此治疗的动物或人施用有效量的α-MSH肽类拮抗剂，本发明还提供调节动物或人的免疫应答的方法。

此外，其他与不良α-MSH活性有关的疾病和临床症状可用本发明的α-MSH拮抗肽进行治疗。

5.2α-MSH肽类拮抗剂的鉴定

肽受体的药物开发的常规方法常常基于对改变的天然激动剂肽结构的筛选，而且一般鉴定的是大分子。相反，如实施例中所述，本发明的α-MSH的小分子肽类拮抗剂是按照对Jayawickreme等人的扩散测试法的改进方法，通过筛选大量随机小分子三肽鉴定的，这些小分子三肽是在多用途组合肽文库(“MUPL”)的微珠的表面制备的，如Jayawickreme等人1994年 J.Biol.Chem.269，29846-29854(“Jayawickreme I”)和1974年， Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)91，1614-1618(“Jayawickreme II”)所述，这两篇文献完整地在此引入作为参考。

正如具体实施例中所述，所使用的方法可对载有随机三肽分子的微珠的文库进行筛选。生物检测培养基由经过褪黑激素处理并在其上长有黑色素细胞的琼脂糖凝胶组成。将微珠与琼脂糖凝胶相接触。用Jayawickreme I和II(同上)的气相释放法进行肽分子从微珠上的受控释放。5或10分钟内观察到由释放的肽分子扩散诱导的色素分散，并用视频图像减除法监测。

5.3治疗和组合物

本发明提供通过给受试者施用有效量的本发明的α-MSH拮抗肽而进行的治疗。肽优选地是纯化的。受试者优选是动物，例如哺乳动物，最优选地是人。

已知有多种输送***，可用于施用本发明的α-MSH拮抗肽，例如水溶液、脂质体胶囊、微粒、微胶囊、受体介导的细胞噬粒作用(见Wu和Wu，1987， J.Biol.Chem.262，4429-4432)。施用方法包括但不限于直接用于皮肤、皮内、肌肉内、静脉内、鼻腔、硬膜外和口腔途径。本发明的肽类可通过任何适当的途径施用。例如输注或单次快速注射，通过上皮或粘膜衬里(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜)。

在具体的实施方案中，在需要任何上述方法治疗的局部区域施用本发明的肽，结果也可能是理想的。

本发明还提供药物组合物。该组合物包含治疗或化妆有效量的本发明的肽和药用载体或赋形剂。载体包括但不限于水、盐溶液例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇以及它们的结合物。该制剂应适于所施用的方法。

若需要的话，该组合物也可包含少量湿润剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。它可以是溶液剂、悬液剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释药剂、膏剂、凝胶剂或粉末剂。它也可被制成栓剂，使用传统结合剂和载体如甘油三酯。口服药可含有标准载体如药品级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁。

在具体实施方案中，该组合物可按常规方法制成适于给人静脉注射用的药物组合物。典型的静脉注射组合物是无菌等渗缓冲液。必要时，此组合物中还可包含助溶剂和局部麻醉剂，以消除注射部位的痛感。一般地，各成分以单独的或混合的单位剂量形式提供，比如装在密封的容器(如示明活性药剂量的安瓿或小袋)中的冻干粉末或无水浓缩物。用于输注时，它可分装到盛有药品级无菌水或盐水的输液瓶中。作为注射液时，需要一安瓿的注射用无菌水或盐水供注射前与药物成分混合。

本发明的α-MSH拮抗肽可制成中性或盐的形式。药用盐包括那些与游离氨基形成的盐，如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等形成的盐，和与游离羧基形成的盐，如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等形成的盐。

本发明的α-MSH肽类拮抗剂治疗具体的失调症或作为美容使用时的有效剂量取决于适于该失调症或美容状况的拮抗剂性质，并由标准临床技术决定。此外，体外或体内测试可有任选地用来帮助确定最佳剂量范围。制剂中所用的精确剂量还取决于施用途径、疾病的严重程度、美容状况并应当根据专业人员的判断和患者的病情决定。有效剂量可根据本文提供的体外或动物模型测试***所获得的剂量响应曲线来推断。

根据本发明及对预期效果的观察，按肽类拮抗剂的用药剂量等级很容易确定α-MSH的肽类拮抗剂的有效剂量。这部分数据在下面表1和附图2-9中给出。利用所提供的IC₅₀浓度，代表性肽类的剂量响应曲线和体内实例，这些数据将有助于确定使肤色增白所需要的有效剂量。

在一个实施方案中，在以例如肤色增白为目的局部制剂中，dWRL(D-Try-Arg-Leu)的有效浓度范围在1μM到10mM之间。在优选的实施方案中，局部制剂的有效dWRL浓度范围在100μM到5mM之间。在更优选的实施方案中，局部制剂的有效浓度范围在500μM到2mM之间。在一具体实施方案中，局部制剂的有效浓度是1mM左右。

在另一实施方案中，dWRL用于全身施用(例如皮肤增白)的有效剂量范围在每公斤体重1-4000μM之间。在优选实施方案中，dWRL用于全身施用(例如皮肤增白)的有效剂量范围是每公斤体重20-200μM。在更优选的实施方案中，dWRL用于全身施用(例如皮肤增白)的有效剂量范围在每公斤体重30-100μM之间。在另一实施方案中，dwRL作全身施用时的有效剂量范围是30-100μM。

通过例如参考表1给出的显示dWRL三肽的肽类拮抗剂相对效价的IC₅₀值，就容易确定各种其他示例性三肽拮抗剂的有效浓度和剂量。

在另一可选的实施方案中，本发明包括含有有效量的本发明的α-MSH拮抗肽的试剂盒。该试剂盒将含有一个或多个装有至少一种本发明的α-MSH拮抗肽的容器。作为示例，该试剂盒可含α-MSH拮抗肽或用于皮肤，或通过皮下、肌肉内、静脉内、鼻内、硬膜外给药或口腔给药的肽类。这种试剂盒可以含有溶液剂、悬液剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、膏剂、凝胶剂或粉末剂形式的α-MSH拮抗肽。该α-MSH拮抗肽可以预先混合或是分开存放的易于混合的成分。它也可配制成一种肽的形式或药物组合物，其中含有有效量的本发明的拮抗肽。

本发明在下述实施例中将被进一步描述，这些实施例对本发明范围没有限制。

6.实施例

6.1三肽组合文库的设计与构建

人工合成的三肽随机组合文库是用Fmoc(芴基甲氧羰基)与MBHA(4-甲基-二苯甲胺)的化学交联树脂(置换率＝9.5mM/g)，如JayawickremeI和II所述，同上，并同时进行多个肽合成(Lam等，1991， Nature 354，83-84和Houghten等， Nature354，84-86)制备的。合成微珠子文库中的三肽时要用到分离、偶联和重组方法。

每个子文库可能含有2304(1×48×48)种三肽或类三肽序列组合。Z96代表构成每个子文库的分子中第一个氨基酸位置(见图1)。这个位置上的分子也属于另2个位置中48种分子中的一种，或者是相应的乙酰化(Ac)化等价物。位置2和3中的AA₁和AA₃₇代表20种左旋(没有预固定化)氨基酸，除去半胱氨酸，加上18种相应的右旋(D)氨基酸异构体。再加上另外11种分子，总合为48。

在用于筛选的制备中，约4％的挂珠分子在受控气相三氟乙酸(TFA)裂解法作用下被分开。经过气化NH₃/H₂O处理后作为直接用于生物检测的无毒微珠。被分开的分子仍以非共价结合的状态保持在微珠上，直到检测时才被释放出来。

6.2功能性生物检测

按前述方法将爪蟾皮肤黑色素细胞保存在培养液中(Daniolos等，1990，Pigment Cell Res.3，38-43；Potenza等，1991， Pigment Cell Res.4，186-192和Karne等，1993， J.Biol.Chem.268，19126-19133)。将150万个细胞接种到含有5毫升成纤维细胞培养基的6厘米组织培养平板(Falcon产)中，27℃培养至少48小时。在每次检测时，要移除该培养基，换上3.5毫升0.9％的Sea Plaque琼脂糖。细胞要用褪黑激素(1nM，30分钟)和α-MSH(15mM，2分钟)预处理。每个子文库中使用600颗微珠。这些微珠由一层2毫米厚的琼脂糖与黑色素细胞隔开。只允许完全游离的分子与细胞表面发生作用。

三肽诱导的色素转移(扩散)有视频图像减除技术监测，此技术如McClintock等，1993， Anal.Biochem.209，298-305中所述。

6.3肽测序

将阳性区的微珠用N-甲基吡咯烷(“NMP”)，二氯甲烷(“DCM”)和甲醇(“MeOH”)清洗后用作第二轮筛选带有阳性反应信号的微珠。其间可将这些微珠零星散布在聚乙烯薄膜上进行筛选。从第一轮筛选得到的微珠用气相三氟乙酸/NH₃/H₂O方法裂解成单个微珠。将这些阳性标记的单个微珠收集在玻璃纤维滤膜上，用NMP、DCM和MeOH洗。并用Applied Biosystems 476A序列分析仪测序。

6.4剂量响应研究

为进行剂量响应研究，用标准Fmoc化学法在0.25mmol的Rink AmideMBHA树脂上合成全部三肽。合成后，用HPLC和C18柱反相层析法纯化这些肽。用微量滴定板测定剂量响应曲线(Potenza等，1992， Pigment Cell Res.5，372-378)。将黑色素细胞(18,000/孔)放入96孔组织培养板(Falcon产)。检测后，培养基用含有1nMα-MSH，1nM褪黑激素和不同浓度的三肽补充此培养基。测定对照组中，用Bombesin-[8-14]片段，催产素代替1nMα-MSH或将α-MSH置为空白。通过改变不同浓度三肽中的α-MSH浓度测出α-MSH剂量响应曲线或竞争抑制曲线。

6.5结果

按上述方法进行多用途肽文库筛选法并以每颗微珠10pM释放水平进行(占总量4％)。以便使低至100μM的分子反应效价也能被观察到。这个有221，186种组分的文库由96个子文库组成，每个子文库有2,304种肽分子组合。这些子文库按其肽的氨基末端来区分。以D-色氨酸、右旋苯丙氨酸、左旋酪氨酸和乙酰右旋色氨酸为N末端的子文库产生的反应曲线表明存在多种拮抗剂样分子，其中具有右旋色氨酸末端的子文库微珠产生的信号最多也最强(图4)。当加入8nM AVT([精氨酸⁸]-催产素，Sigma产；EC₅₀≈2nM)或4nM VIP(血管肠肽，Sigma产；EC₅₀≈1nM)而不是15nM α-MSH(Peninsula产；EC₅₀≈2nM)时，没有从这些子文库中观察到类似反应信号。

经过扩散测试鉴定后，对待选拮抗剂进行再合成和纯化(JayawickremeI和II，同上)，并进行测定(图2-9)。结果在表1中给出。对α-MSH来说，两个最强的拮抗剂D-Trp-Arg-Leu-NH₂(DWRL)和D-Trp-Arg-Nle-NH₂的IC₅₀值分别是620±150nM(均值±SE)和930±220Nm。这些拮抗剂属于竞争性抑制并专一阻断两栖类内源α-MSH的诱导活性并对人类MSH受体起封闭作用(图2-9)。三肽DWRL的平衡解离常数(Ke)是63±15Nm(图2C)，若按所预期的α-MSH的IC₅₀值约是96Nm的话，测试中的α-MSH已达到其EC₅₀值。

表1

肽序列 IC₅₀(μM)A D-Trp -Arg -X -NH₂A₁ Leu 0.62±0.15A₂ Nle 0.93±0.22A₃ Nva 3.3±1.1A₄ Met 5.6±2.6A₅ D-Nle 9.9±1.8A₆ Ile 49±9A₇ Abu 82±41A₈ Val 237±100A₉ Arg 261±68A₁₀ D-Arg 664±397A₁₁ γAbu 无活性A₁₂ εAhx 无活性A₁₃ Ala 无活性A₁₄ βAla 无活性B D - Trp -X -Nle -NH₂B₁ Lys 15±1B₂ D-Arg 30±11B₃ Leu 48±2.2B₄ Nle 59±12B₅ Ala 65±18B₆ Met 121±27B₇ Abu 405±69B₈ Asp 无活性C X -Arg -Nle -NH₂C₁ D-Phe 4.4±1.2C₂ D-Tyr 28±2C₃ Ac-D-Trp 43±8C₄ Trp 100±2C₅ D-His 318±105

6.6结构-功能相关性

除了鉴定那些易于对全身或局部的α-MSH活性起阻断作用的分子量小于500Da的三肽拮抗剂外，同时还对各子文库产生的多样型拮抗剂信号进行了测试。从而有可能对拮抗剂结构的异同进行比较。通过比较可以确定和受体相互作用以及封闭作用相关的成分，而这方面的资料对进一步开发非肽类拮抗剂具有潜在应用价值。对右旋色氨酸子文库的次级库的筛选可推导出活性序列。

例如，扩散测试反应曲线表明反应最强的分子的第2位氨基酸是精氨酸，而在第2位是其他氨基酸的次级子文库中(如赖氨酸、右旋精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、正亮氨酸)则表现出较低的MSH受体拮抗剂样活性。表1中，A₁到A₆显示了筛选D-Trp-Arg-X子库得到的6个反应最强的分子。

经过扩散测试的鉴定之后，对待选拮抗剂进行再合成和纯化(Jayawickreme I和II，同上)并进行测定(图2-9)。相对于15nMα-MSH来说，两个最强的拮抗剂D-Trp-Arg-Leu-NH₂(dWRL)和D-Trp-Arg-Nle-NH₂的IC₅₀值分别是620±150nM(均值±SE)和930±220Nm。这些拮抗剂属于竞争性抑制并专一阻断两栖类内源α-MSH的诱导活性并对人类MSH受体起封闭作用(图7-9)。肽dWRL的平衡解离常数(Ke)是63±15nM(图5)，若按所预期的α-MSH的IC₅₀值约是96的话，测试中的α-MSH已达到其EC₅₀值。

多样型MSH受体拮抗剂分子是从D-Trp-Arg-X次级子库中筛选出的，后者形成一系列结构上相关的肽分子(图10)。它们构成了可替换的结构，其活性不会由于第3位氨基酸的结构差异而退化。在这组肽中，IC(抑制浓度)测量值反映出拮抗剂效价与碳氢侧链长度正相关，即正亮氨酸＞正缬氨酸＞2-氨基丁酸＞丙氨酸，并与β-甲基的存在负相关，如正缬氨酸＞异亮氨酸；2-氨基丁酸＞缬氨酸。从亮氨酸中去除γ-甲基使拮抗剂效价比正缬氨酸低50％。当甲硫氨酸在第3位时要比有类似R基团但是非硫化的正亮氨酸效价减少6倍。在电荷取代试验中，亲水性最强的是精氨酸，其效价比正亮氨酸低300倍(见表1，A)。右旋异构体子库反应也是阳性，但与左旋异构体子库相比，其效价已经降低了。右旋正亮氨酸比在第3位的左旋异构体的效价高10倍。

大部分从扩散测试中筛选到的三肽没有表现出类似的α-MSH拮抗活性。虽然预计受体和配体之间有高度专一性，但大部分得到的是阴性结果。大部分测试的文库缺乏活性说明位置1的改变不能很好地服从受体作用范畴。除右旋色氨酸外，在非乙酰化文库中就只有右旋丙氨酸和更小程度上右旋酪氨酸显示出类似α-MSH拮抗剂活性。在发现它们也是X-Arg-Nle-NH₂通式中位置1的2个最有效可替换氨基酸之后，这个观察结果得到确认(见表1，C1和C2)。此处X代表图1中全部48种非乙酰化组合物。

因此，在筛选时观察到阳性信号的增加可能是由于其结构上类似于右旋色氨酸文库中的阳性反应分子而不是其他无关结构。在右旋色氨酸文库的子文库中也明显观察到类似的阳性增加现象。在D-Trp-X-Nle-NH₂结构中将X换成赖氨酸，右旋精氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和正亮氨酸可产生有拮抗剂活性的多肽(见表1，B1和B5)而且正如所预期的，其效价要比用精氨酸低。因此，随机筛选所得到的肽由于其具有最强的信号，而成为事实上这个文库中最有效力的MSH受体拮抗剂。组合筛选中各种变化因素，例如，微珠的大小对信号强度差异的影响要比不同效价氨基酸的次序改变的影响要小。

6.7环腺苷酸的定量

测试前2天，将黑色素细胞铺到24孔组织培养板(Falcon产)中。在临测试前，用含有0.05％小牛血清白蛋白的70％L-15培养基(Sigma产)清洗细胞。然后用在同样培养基中的1nM褪黑激素处理细胞。再用70％L-15+0.05％小牛血清白蛋白+0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Aldrich产)+1nm褪黑激素的混合物洗5分钟，再用配有测试药剂的同样培养基处理30分钟。经药剂处理后的细胞用70％磷酸盐缓冲的盐水洗2次。

如图6所示，D-Trp-Arg-Nle-NH₂(dW-R-Nle)，在40μM下，封闭α-MSH(10nM)介导的cAMP第二信使刺激作用，但不封闭由AVT(8nM)激活的cAMP刺激作用。催产素拮抗剂GVT([d(CH₂)₅，Tyr(Me)²，Orn₈]-加压催产素；得自Peninsula)，在20μM下，被用作8nM AVT激活的封闭应答的对照。

6.8爪蟾成纤维细胞中dWRL对人MSH受体的功能性拮抗作用

为证明人MSH受体受三肽拮抗剂的抑制，将爪蟾成纤维细胞用表达人MSH受体的载体转染，在三肽存在和不存在时，测定cAMP反应，如图7所示。

爪蟾成纤维细胞(Daniolos等，1990， Pigment Cell Res.3，38-43)用“Vector alone”(pcDNAI/NEO，Invitrogen产)转染或用“HMelMSHR”(pcDNAI/NEO含***的人黑色素瘤受体)转染(Mountjoy等，1992， Science 257，1248-1251；Roger Cone赠送)。对照＝无附加药剂。MSH＝5nM μM α-MSH。dWRL浓度是10μM。毛喉素＝100μM毛喉素(7β-脱乙酰基-7β-[g-(N-甲基哌嗪子基)-丁酰；Calbiochem产)。

转染是用电穿孔进行的(≈5×10^-6细胞/400μl 70％磷酸盐缓冲的盐水中，pH7.0，加10μg待测cDNA)使用BTX ECM-600(475V，720 ohm，400μF)的0.2厘米试管。转染48小时后，平铺在12孔组织培养板(Falcon产)的融合细胞用含有0.5％小牛血清白蛋白BSA(Sigma产)的70％L-15培养基洗5分钟。再用加有0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Aldrich产)洗5分钟。在IBMX存在时，加入测试药剂，每孔加1毫升60％乙醇抽提cAMP。cAMP来自cAMP结合蛋白(21；Amersham产试剂盒)。每个条线代表三次独立测定的均值和SSD，而对照-HMelMSHR测试组n＝6。除带有单星号的其他组外，对所有组均为^*(T-Test；p＜0.006)，对其他组均为^**(T-Test；p＜0.006)。

如图7所示，与仅用MSH处理hMel MSHR转染的细胞相比，三肽对hMel MSHR(人黑色素瘤MSH受体)转染的细胞中cAMP形成有更明显的抑制作用。

6.9皮肤增白的局部效果

为表明色素增白是在皮肤水平被局部诱导的，dWRL(1mM水溶液)被局部施加到爪蟾的皮肤表面(图8)。在施加部位出现较轻的白化病样皮肤色调。这些结果表明本发明的肽可以透皮作用，并在暗适应的正常条件下，在体内由内源促黑激素介导增强的着色作用，这种影响的去除赋予青蛙较轻的“白化病样”状态。

6.10皮肤增白的全身性效应

为确证α-MSH对增强皮肤色调的作用，给暗适应的爪蟾注射dWRL(40μM/Kg)或D-Trp-Abu-Arg-NH₂(对照组)。dWRL在20分钟内引起每只受试爪蟾(n＝8)全身增白作用，但在对照组(n＝8)则无变化(图9)。

本发明不受本文描述的具体实施方案范围的限制。实际上，除本文描述的之外，根据前面描述及相关数据作出本发明的各种改动对本领域技术人员也是显而易见的。这些改动也属于权利要求的范围。本文引述了不同的出版物，其公开内容在此完整地引入作为参考。

Claims

1.α-促黑激素的肽类拮抗剂，其具有包含R-S-T的氨基酸序列，其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。

2.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它是一种三肽。

3.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Leu。

4.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Nle。

5.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Nva。

6.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Met。

7.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Arg-D-Nle。

8.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Lys-Nle。

9.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-D-Arg-Nle。

10.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Leu-Nle。

11.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Trp-Nle-Nle。

12.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列D-Phe-Arg-Nle。

13.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列Tyr-Arg-Nle。

14.权利要求1的α-促黑激素的拮抗剂，它具有氨基酸序列Ac-D-Trp-Arg-Nle。

15.一种在α-促黑激素响应细胞或组织中抑制α-促黑激素活性的方法，其包括将所述细胞或组织与有效剂量的α-促黑激素的肽类拮抗剂接触，其中所述肽类拮抗剂包含氨基酸序列R-S-T，其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。

16.一种使动物肤色增白的方法，其包括给动物施用有效量的α-促黑激素的肽类拮抗剂，其中所述肽类拮抗剂包含氨基酸序列R-S-T，其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。

17.权利要求16的方法，其中所述动物是人。

18.权利要求16的方法，其中所述肽类拮抗剂是局部施用的。

19.权利要求16的方法，其中所述拮抗剂是通过选自局部施用、全身性注射和口服施用的方法施用的。

20.权利要求16的方法，其中所述肽类拮抗剂是三肽。

21.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Leu。

22.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Nle。

23.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Nva。

24.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg-Met。

25.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Arg-D-Nle。

26.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Lys-Nle。

27.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-D-Arg-Nle。

28.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Leu-Nle。

29.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Trp-Nle-Nle。

30.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列D-Phe-Arg-Nle。

31.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列Tyr-Arg-Nle。

32.权利要求20的方法，其中所述三肽具有氨基酸序列Ac-D-Trp-Arg-Nle-NH₂。

33.一种治疗恶性黑色素瘤的方法，其包括给动物施用有效量的肽，所述肽具有包含R-S-T的氨基酸序列，其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。

34.一种包含肽的药物组合物，所述肽具有包含R-S-T的氨基酸序列，其中R、S和T是氨基酸残基，R选自D-Trp、D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp和D-His，只是当S是Arg且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Phe、D-Tyr、Ac-D-Trp、Trp或D-His；当S是Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met或Abu，且T是Nle或其酰胺化物时，R是D-Trp；当S是Arg，且T是Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg或D-Arg或其酰胺化物时，R是D-Trp；S选自Arg、Lys、D-Arg、Leu、Nle、Ala、Met和Abu；T选自Leu、Nle、Nva、Met、D-Nle、Ile、Abu、Val、Arg、D-Arg及其酰胺化物。

35.权利要求32的药物组合物，其中所述药用载体选自适于局部应用的溶液、乳油或洗液，适于全身性注射的生理盐或缓冲剂，适于口服施用的缓释载体和组合物。

36.α-促黑激素的肽类拮抗剂，它是用包括如下步骤的方法鉴定的：

a.制备一种组合文库，该文库包含随机序列三肽分子的文库；

b.筛选所述组合文库，以检测拮抗促黑激素的活性；

c.鉴定具有所述拮抗α-促黑激素的活性的三肽分子。

37.一种试剂盒，其在一个或多个容器中包含α-促黑激素的肽类拮抗剂，所述肽类拮抗剂选自D-Trp-Arg-Leu，D-Trp-Arg-Nle，D-Trp-Arg-Nva，D-Trp-Arg-Met，D-Trp-Arg-D-Nle，D-Trp-Arg-Ile，D-Trp-Arg-Abu，D-Trp-Arg-Val，D-Trp-Arg-Arg，D-Trp-Arg-D-Arg，D-Trp-Lys-Nle，D-Trp-D-Arg-Nle，D-Trp-Leu-Nle，D-Trp-Nle-Nle，D-Trp-Ala-Nle，D-Trp-Met-Nle，D-Trp-Abu-Nle，D-Phe-Arg-Nle，D-Tyr-Arg-Nle，D-Ac-Trp-Arg-Nle，Trp-Arg-Nle和D-His-Arg-Nle或其酰胺化物。

38.权利要求37的试剂盒，其在一个或多个容器中还包含适于施用所述α-促黑激素的肽类拮抗剂的药用载体。