CN117907589A - 夹心法检测样本中目标分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及夹心法检测样本中目标分子的方法。本发明提出一种待测样本中目标分子的检测方法，主要通过夹心法检测，极大提高了血清中小分子检测的准确性。本发明方法利用特异性结合目标分子‑目标分子结合蛋白的复合物抗体，形成目标分子‑目标分子结合蛋白‑抗体三元复合物进行检测。检测含有目标分子‑目标分子结合蛋白的血液/血清样品时，本发明方法首先利用特定的解离液处理待测样本，以将待测样本中的目标分子‑目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，这样能够进一步提升目标分子检测的准确度。

Description

夹心法检测样本中目标分子的方法
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及夹心法检测样本中目标分子的方法。
背景技术
血液或血清样本中一些小分子通常以结合态的形式存在(例如小分子物质会与一些结合蛋白相结合形成复合物)，这导致临床检测时一些结合态的小分子并未检出，从而影响了临床上对小分子检测的准确性。例如，FA(叶酸)通常以结合态的形式存在于人体中，已发现的叶酸结合蛋白有三类：高亲和力叶酸结合蛋白(可溶性的FRs存在于血液中)、与膜有关的结合蛋白和细胞质结合蛋白。高亲和力叶酸结合蛋白(FRs)保护了叶酸在血液中的稳定存在，还可能控制了血浆中叶酸盐分布的专一性。
血清样本中小分子有机物的分析方法主要有：液相质谱(LC-MS)和气相质谱(GC-MS)。上述方法虽然灵敏度高，但同时也需要较高的专业技能，且耗费大量人力物力，不适合基层使用；最关键的一点为结果分析周期长。临床检测通常采用化学发光与免疫学相结合的方法，由于这类小分子表位较小，难以通过常规的双抗体夹心法进行检测。
竞争法为小分子检测的主要方法学，但竞争法相比夹心法存在以下缺陷：①灵敏度欠佳，低值样本检出率或重复性欠佳；②准确性不足，天然小分子和小分子类似物与抗体结合亲合力可能存在差异，影响准确度。
因此亟需开发一种能够准确、低成本地检测血液或血清样本中小分子物质的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种待测样本中目标分子的检测方法，主要通过夹心法检测，极大提高了血清中小分子检测的准确性。本发明方法利用特异性结合目标分子-目标分子结合蛋白的复合物抗体，形成目标分子-目标分子结合蛋白-抗体三元复合物进行检测。检测含有目标分子-目标分子结合蛋白的生物样品时，本发明方法首先利用特定的反应体系处理待测样本，以将待测样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，这样能够进一步提升目标分子检测的准确度。
为此，本发明第一方面提供一种待测样本中目标分子的检测方法。根据本发明的实施方案，所述检测方法包括：
S1：提供含有目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂，所述目标分子结合蛋白能够与待测样本中的目标分子结合形成目标分子-目标分子结合蛋白复合物，且所述复合物中目标分子诱导结合蛋白形成至少一个新的构象表位，所述抗体能够特异性结合所述至少一个新的构象表位；
S2：使得待测样本与含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂接触，以获得目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物；
S3：通过检测S2获得的所述目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物，用于检测样本中含有的目标分子。
本发明方法主要通过利用特异性结合目标分子-目标分子结合蛋白的复合物抗体，形成目标分子-目标分子结合蛋白-抗体三元复合物进行检测，以便提升目标分子检测的准确度。
根据本发明的实施方案，所述目标分子结合蛋白不为抗体。
根据本发明的实施方案，所述待测样本包括选自校准品、质控品、标准品、血清样本、血浆样本中的任一种。
根据本发明的实施方案，当待测样本中含有目标分子-目标分子结合蛋白复合物时，所述检测方法进一步包括，在S2之前，利用解离液处理待测样本，以便将待测样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来。
根据本发明的实施方案，所述解离液包括pH为12-14的碱性试剂以及还原剂。
通过提供碱性环境，使得血液中的目标分子结合蛋白(例如FA结合蛋白FABP)发生变性，二硫键打开生成巯基。再通过进一步添加还原剂，进一步使得二硫键被还原，而导致目标分子结合蛋白失去结合目标分子的能力，从而获得游离目标小分子。
根据本发明的实施方案，所述碱性试剂包括NaOH、KOH中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述还原剂包括选自DTT、TCEP、BME、DTE中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述还原剂为DTT。
根据本发明的实施方案，步骤S2进一步包括：
向经所述解离液处理的待测样本中加入所述含有抗体的检测试剂及含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂，获得反应体系1，
其中，所述含有抗体的检测试剂的加入量保证所述反应体系1的pH为7-10且使得经解离后样本中的目标分子不与所述待测样本中含有的目标分子结合蛋白结合，而与检测试剂中的目标分子结合蛋白结合。
向经所述解离液处理的待测样本中加入所述含有抗体的检测试剂，一方面能够中和解离液的强碱环境，解离液被进一步稀释，此时解离液无法发挥将目标分子-目标分子结合蛋白解离的作用，不会对下一步形成三元复合物有影响；另一方面，也能够保证含有抗体的检测试剂在进行检测时不受影响(例如一些信号生成物在强碱环境下发光信号会受到影响)。
根据本发明的实施方案，所述含有抗体的检测试剂的pH为5-7。
根据本发明的实施方案，含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂的pH为4-10。
根据本发明的实施方案，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂包括包被目标分子结合蛋白的载体。
根据本发明的实施方案，所述载体包括磁珠、微球中的任一种。
根据本发明的实施方案，所述含有抗体的检测试剂包括与所述抗体相连的信号生成物。
根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括非酶促发光化合物和/或酶促化学发光化合物。
根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括选自ABEI、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、AHEI、ITCI、光泽精、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述信号生成物为ABEI。
本发明第二方面提供一种目标分子检测试剂盒。根据本发明的实施方案，所述目标分子检测试剂盒包括：
1)含有目标分子结合蛋白的检测试剂；
2)含有抗体的检测试剂；
其中，所述抗体为能够与目标分子-目标分子结合蛋白复合物特异性结合，但与游离的目标分子或目标分子结合蛋白不结合的抗体，
所述含有抗体的检测试剂包括与所述抗体相连的信号生成物。
根据本发明的实施方案，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂包括包被目标分子结合蛋白的载体。
根据本发明的实施方案，所述载体包括磁珠、微球中的任一种。
根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括非酶促发光化合物和/或酶促化学发光化合物。
根据本发明的实施方案，所述信号生成物包括选自ABEI、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、AHEI、ITCI、光泽精、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述信号生成物为ABEI。
根据本发明的实施方案，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂的pH为4-10。
根据本发明的实施方案，所述含有抗体的检测试剂的pH为5-7。
本发明第三方面提供一种血液样本中目标分子检测试剂盒。根据本发明的实施方案，所述试剂盒包括第二方面所述的试剂盒中的试剂，以及
解离液，
其中，所述解离液用于将所述血液样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，
所述解离液包括pH为12-14的碱性试剂以及还原剂。
根据本发明的实施方案，所述碱性试剂包括NaOH、KOH中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述还原剂包括选自DTT、TCEP、BME、DTE中的至少之一。
根据本发明的实施方案，所述还原剂为DTT。
本发明第四方面提供第二方面所述的目标分子检测试剂盒、第三方面所述的血液样本中目标分子检测试剂盒在利用化学发光法对待测样本中的目标分子进行检测中的用途。
本发明提供的待测样本中目标分子的检测方法，利用特异性结合目标分子(如FA)-目标分子结合蛋白(如FABP)的复合物抗体，能够实现目标分子的线性检测。且通过调节反应体系，能够在测试样本时，提高样本检测结果与质谱检测结果一致性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例1中利用本发明方法检测10个标准品获得的标准曲线；
图2显示了利用本发明最优方案扩大评估50例不同水平样本获得的曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种待测样本中目标分子的检测方法，包括：
S1：提供含有目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂，所述目标分子结合蛋白能够与待测样本中的目标分子结合形成目标分子-目标分子结合蛋白复合物，且所述复合物中目标分子诱导结合蛋白形成至少一个新的构象表位，所述抗体能够特异性结合所述至少一个新的构象表位；
S2：使得待测样本与含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂接触，以获得目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物；
S3：通过检测S2获得的所述目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物，用于检测样本中含有的目标分子。
需要说明的是，所述目标分子可以是任意一种临床上检测的小分子，优选地，所述目标分子的分子量小于1kDa，所述小分子是以结合态的形式存在于待测样本中的，例如叶酸、E2、睾酮、T3、rT3、T4、皮质醇等。也就是说，本发明提供的待测样本中目标分子的检测方法，可用于准确地检测临床上任意一种样本中含有的待测目标分子。
需要说明的是，关于所述目标分子结合蛋白的来源，可以是从动物体内提取获得的目标分子结合蛋白，也可以是通过体外表达或者直接合成获得的目标分子结合蛋白，检测试剂中含有的目标分子结合蛋白与样本中含有的目标分子结合蛋白可以是同一蛋白，也可以是不同蛋白。
本文所述的“诱导”是指待测样本中的目标分子与含有目标分子结合蛋白的检测试剂中的目标分子结合蛋白结合之后，使得结合复合物中目标分子结合蛋白的构象发生改变，形成新的构象表位，而含有抗体的检测试剂中的抗体正好能够特异性结合该新的构象表位。
本文所述的“新的构象表位”是指待测样本中的目标分子与含有目标分子结合蛋白的检测试剂中的目标分子结合蛋白结合之后，使得结合复合物中目标分子结合蛋白的构象发生改变，形成的新的构象表位，或者是目标分子和目标分子结合蛋白结合后，在结合位点目标分子和目标分子结合蛋白之间形成的新的构象表位。
根据本发明一个具体的实施方案，所述目标分子结合蛋白可以为任意一种蛋白，只要是与目标分子能够结合的所有类型的结合蛋白，都涵盖在上述目标分子结合蛋白范围内，但需要说明的是，目标分子结合蛋白不是抗体。
根据本发明一个具体的实施方案，当待测样本中含有目标分子-目标分子结合蛋白复合物时，所述检测方法进一步包括，在S2之前，利用解离液处理待测样本，以便将待测样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来。
根据本发明一个具体的实施方案，所述解离液包括pH为12-14的碱性试剂以及还原剂。
需要说明的是，解离液的成分并没有特别的限制，一方面需要保证解离液的pH为12-14，另一方面需要含有还原剂，所述还原剂能够使得在碱性条件下变性的目标分子结合蛋白中的一些化学基团进一步发生化学反应，从而获得游离目标小分子。
根据本发明一个具体的实施方案，所述待测样本可以是血液、血清、血浆等生物样本，也可以是标准品、质控品、校准品等。
目标分子(例如FA)通常以结合态的形式存在于生物样本中，当采用上述检测方法检测样本中结合态的目标分子时，如何将目标分子从血液中的结合蛋白中解离出来，再使游离的目标分子结合到试剂提供的结合蛋白上并且能够被复合物抗体识别，是实现本发明的难点。本发明提供的检测方法解决了此问题。
根据本发明一个具体的实施方案，所述碱性试剂包括但不限于NaOH、KOH中的至少之一。碱性试剂也可以是其他强碱类的化学试剂，这些种类也都涵盖在本发明保护范围之内。
根据本发明一个具体的实施方案，所述还原剂包括选自DTT、TCEP、BME、DTE中的至少之一。
根据本发明一个优选的实施方案，所述还原剂为DTT。
需要说明的是，关于还原剂的浓度以及向体系中加入的量并没有特别的限制，可根据待测样本中常规认知的目标分子含量的可能范围，加入稍过量的还原剂，以保证待测样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子完全解离出来。例如，当还原剂为DTT或TCEP时，工作浓度为0.75mg/μL-1mg/μL。
根据本发明一个具体的实施方案，步骤S2进一步包括：
向经所述解离液处理的待测样本中加入所述含有抗体的检测试剂及含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂，获得反应体系1，
其中，所述含有抗体的检测试剂的加入量保证所述反应体系1的pH为7-10且使得经解离后样本中的目标分子不与所述待测样本中含有的目标分子结合蛋白结合，而与检测试剂中的目标分子结合蛋白结合。
该步骤中样本处理后的强碱液体环境被含有抗体的检测试剂中和后，还原剂也被进一步稀释。此时，当含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂加入到样本时，因为不再具备强碱性环境，且还原剂的浓度被稀释，因此样本处理剂(解离液)难以再发挥解离作用，因此反应体系1中含有的目标分子与含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂中的目标分子结合蛋白结合，且被反应体系1中的抗体识别，从而形成目标分子-目标分子结合蛋白-抗体三元复合物。
根据本发明一个具体的实施方案，所述含有抗体的检测试剂的pH为5-7。
pH为5-7的含有抗体的检测试剂加入经所述解离液处理的待测样本中，能够中和强碱环境，且进一步稀释还原剂。
根据本发明一个具体的实施方案，含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂的pH为4-10。
根据本发明一个具体的实施方案，所述含有抗体的检测试剂中的抗体的结构并没有特别的限制，只要所述抗体能够特异性结合复合物(目标分子-目标分子结合蛋白复合物)中目标分子诱导结合蛋白形成的至少一个新的构象表位的所有的抗体类型，都涵盖在本发明保护范围制备，优选地，所述抗体与目标分子-目标分子结合蛋白复合物的亲和力常数KD值为1×10-10～9×10-9。
进一步的，所述抗体与单独的所述目标分子结合蛋白的亲和力常数为1×10-5～9×10-4。
进一步的，所述抗体与单独的所述目标分子结合蛋白不结合。
根据本发明一个具体的实施方案，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂包括包被目标分子结合蛋白的载体。
根据本发明一个具体的实施方案，所述载体包括磁珠、微球中的任一种。
需要说明的是，关于磁珠、微球的规格(例如粒径)、目标分子结合蛋白和微球的投料比以及目标分子结合蛋白-微球所在溶液的浓度并没有特别的限制，根据检测目标分子的不同，可进行更适宜的规格、投料比、浓度的探索和确定。
根据本发明一个具体的实施方案，含有目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂中通常含有常用的缓冲液，例如PBS缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液等，当然也可以是用于体外诊断的其他类型的缓冲液，都可用于其中。另外，含有目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂中通还可以含有其他的成分，例如，含有目标分子结合蛋白的检测试剂中除了缓冲液之外，还可以含有甘露醇、BSA、NaCl、MgCl2中的至少之一，提高蛋白在溶液中的稳定性；含有抗体的检测试剂中除了缓冲液之外，还可以含有乙二胺四乙酸二钾、PEG6000、BSA中的至少之一。
根据本发明一个具体的实施方案，所述含有抗体的检测试剂包括与所述抗体相连的信号生成物。
根据本发明一个具体的实施方案，所述信号生成物包括非酶促发光化合物和/或酶促化学发光化合物。
根据本发明一个具体的实施方案，所述信号生成物包括选自ABEI、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、AHEI、ITCI、光泽精、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的至少之一。
根据本发明一个具体的实施方案，所述信号生成物为ABEI。
需要说明的是，与所述抗体相连的信号生成物通常以溶液形式提供，关于与所述抗体相连的信号生成物中抗体、信号生成物的投料比并没有特别的限制，可根据检测的目标分子的不同进行适应性调整。关于与所述抗体相连的信号生成物的浓度也没有特别的限制，可根据需要进行调配，前提是需要保证抗体与信号生成物之间连接的稳定性。
需要说明的是，关于各个结合反应步骤中，孵育时间和反应温度并没有特别的限制，一方面，不同的目标分子类型，适宜的结合温度、反应时间不同，另一方面，针对规格的磁珠、微球，不同的信号生成物适合的条件也不同，可根据需要进行适应性调整。
根据本发明一个具体的实施方案，当待测样本中含有目标分子-目标分子结合蛋白复合物时，所述检测方法包括：
S1’:提供解离液，所述解离液用于将待测样本中含有的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，其中，所述解离液包括pH为12-14的碱性试剂以及还原剂；
S2’:提供包被目标分子结合蛋白的载体和信号检测试剂，其中，所述信号检测试剂含有与复合物抗体相连的化学发光化合物，所述复合物抗体为能够与目标分子-目标分子结合蛋白复合物形成的新的构象表位特异性结合，但与单独的目标分子结合蛋白不结合的抗体；
S3’:使待测样本与解离液接触，以便将目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，获得前处理后的待测样本；
S4’:将所述前处理后的待测样本与所述信号检测试剂、包被目标分子结合蛋白的载体混合，以便获得目标分子-包被目标分子结合蛋白的载体-复合物抗体-化学发光化合物的复合物，
其中，所述信号检测试剂的pH为4-8，
所述包被目标分子结合蛋白的载体置于第一溶液中，所述第一溶液的pH为5-7；
S5’:利用所述化学发光化合物的发光机理，对S4’获得的所述目标分子-包被目标分子结合蛋白的载体-复合物抗体-化学发光化合物的复合物进行光强度检测，以便检测待测样本中含有的目标分子。
根据本发明一个具体的实施方案，所述目标分子为FA，所述目标分子结合蛋白为FABP。
以检测FA为例，检测方案如下：
步骤一：样本处理剂中使用pH范围为12-14的碱性环境和适量的还原剂，获得游离的FA分子。
步骤一中调节PH的物质可以是：NaOH、KOH；还原剂可以是DTT、TCEP。
步骤二：将步骤一所得的混合物加入到连接有FABP的磁球试剂(pH5-7)和包被有复合物抗体的ABEI试剂(PH4-8)中，混合后的反应pH范围为8-10。所述的复合物抗体特异性识别FABP-FA复合物。步骤二中样本处理后的强碱液体环境被ABEI试剂以及磁球试剂中和后，还原剂也被进一步稀释。此时，当磁球试剂加入到样本时，因为不再具备强碱性环境，且还原剂的浓度被稀释，因此样本处理剂难以再发挥前一步的解离作用，因此步骤一中获得的小分子待测物能够与连接有FABP的磁球试剂结合形成FA-FABP复合物，并且被复合物抗体识别，形成FA-FABP-复合物抗体三元复合物。且由于ABEI本身是一种在强碱环境下进行发光的物质，因此在本方案中充当中和试剂的作用，在与强碱试剂混合后依旧能够发挥信号生成物的作用，不影响信号的检测。因此在本方案中其他能够在强碱环境性进行发光的信号生成物，均属于本方案的可替代方案，例如吖啶酯、鲁米诺等。
步骤二中其中FABP的来源可以从牛奶中提取。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
抗体制备过程：
抗FA-FABP复合物抗体(Ab2)制备过程
1.免疫小鼠
叶酸标准品5-MTHF(TRC)与叶酸结合蛋白FABP均透析到0.01M PBS中，按照摩尔比≥10：1的量37℃孵育2h，透析至0.01M PBS去除过量的抗原，作为免疫原。与等体积弗氏完全佐剂(Sigma)乳化均匀，取6-8周龄SPF级Balb/c小鼠，皮下多点注射200μg/只，间隔3周用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射150μg/只，加强免疫2次，融合前3天腹腔注射进行冲击。
2.细胞融合及亚克隆筛选
取免疫小鼠的脾脏，研磨分离获得分散的单个脾细胞，利用PEG将脾细胞和骨髓瘤细胞混合，培养基终止后离心复溶铺至96孔板中，一周后换液，取上清进行酶免间接法检测。
检测方法如下：酶标板奇数列包被FABP，偶数列包被FABP与5-MTHF按摩尔比≥10:1孵育形成的复合物；封闭后加入细胞上清37℃反应0.5h；清洗后加入羊抗鼠IgG二抗-HRP(Jackson)，37℃反应0.5h；清洗后加入TMB显色，再加入2M H2SO4终止；
挑取奇数列几乎无效价或低效价而偶数列有高效价的孔作为阳性孔，进一步通过有限稀释法进行亚克隆，培养一周后继续进行酶免检测，方法同上，挑选最优阳性孔进行亚克隆，重复3-4次直至所亚细胞全阳，挑取阳性单集落进行扩培，得到特异性细胞株3D10F1。
3.阳性细胞株腹水制备
对单集落细胞进行扩大培养，注射到提前接种IFA的小鼠体内制备腹水，收集腹水获得复合物抗体Ab2，经过SPA法亲和纯化。
抗体结合亲和力验证
利用BIAcore技术来检测叶酸抗体、叶酸-叶酸结合蛋白复合物与叶酸复合物抗体(Ab2)的结合亲和力(如表1所示)。实验过程按照BiacoreR 3000,Biacore AB说明书进行。平衡解离常数Kd(M)代表平衡状态下结合亲和力的解离程度，Kd(M)越小说明亲和力越强。
表1叶酸项目抗体针对复合物的平衡解离常数Kd(M)汇总
实施例1验证本发明提供的检测方法能够实现对FA的线性检测
1.检测试剂盒中含有的试剂的配制：
试剂1：0.5M NaOH溶液；
试剂2：DTT溶液(主要组分为598mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、10％甘露醇)，浓度为2mg/ml；
试剂3：磁球试剂，包被连接有FABP的磁球试剂，PH为7.0，其中FABP：磁球的投料比为1mg：12ug，磁球悬浮浓度：20mg/mL。缓冲液为：20mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钠(其他成分包括10％甘露醇、1％BSA、0.8％ NaCl、0.013％MgCl2)；
试剂4：连接有复合物抗体(Ab2)的ABEI试剂，PH为5.5，其中复合物抗体和ABEI的投料比为0.5mg：50ug；ABEI悬浮浓度：50ug/ml。缓冲液为:598mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(其他成分包括0.1％乙二胺四乙酸二钾、0.5％PEG6000、0.5％BSA)；
试剂5：校准品浓度为5ug/ml。
2.检测方法：
待测溶液：通过校准品稀释一系列浓度梯度的校准品，浓度分别为24ng/ml、16.132ng/ml、10.843ng/ml、7.289ng/ml、4.899ng/ml、3.293ng/ml、2.213ng/ml、1.488ng/ml、1ng/ml、0ng/ml；
检测过程：
向10μL样本中加入40μL试剂1和40μL试剂2，37℃10min孵育，之后向体系中加入40μL ABEI+20μL磁球，37℃10min，洗、清洗3次后，用Maglumi 4000P检测，检测时的PH为9.0，温育10min，清洗3次，检测。
验证结果如下：
提供体现线性结果如图1所示，图中显示线性y＝ax+b的函数及R2。以下表2展示了样本1-10这10个标准品的理论浓度、利用上述方法的检测实测浓度及实测浓度与理论浓度的差异度。
表2
图1以及表2数据说明：测定标准曲线，实测浓度与理论浓度相关性R2为0.9986，通过本发明提供的检测方法学能够实现对FA项目的准确检测。
实施例2对血清样本进行检测
样本来源：尼勒克县妇幼保健院，共50例样本。
本发明提供的检测方法的步骤以及试剂参照实施例1。质谱检测方法：样本前处理流程：
①向275μL样本中加入55μL的混合内标(叶酸-[13C5]、5-甲基四氢叶酸-[13C5]、5-甲酰基四氢叶酸-[13C5])和770μL SPE样本缓冲液(10g/L甲酸铵、1g/L抗坏血酸，pH3.2)；
②充分混匀并在4℃下平衡至少20min；
③固相萃取：小柱选用1mL phenyl SPE Cartridges(100mg BondElut)，分别用2mL乙腈、甲醇、SPE样本缓冲液活化色谱柱，然后加入1mL样本，平衡1min使样本和小柱填料充分接触，再加入3mL SPE淋洗液(0.5g/L甲酸铵，0.05g/L抗坏血酸，pH 3.4)洗脱杂质，加入1mL SPE洗脱液(400mL/L甲醇、100mL/L乙腈，10mL/L醋酸，1g/L抗坏血酸)洗脱并收集洗脱液混匀过滤后准备进行测试。
ID LC-MS/MS测试：
①色谱柱：Luna C-8(3mm×150mm,5-μm particle size)；
②进样量：20μL；
③流动相：400mL/L甲醇、100mL/L乙腈，10mL/L醋酸；
④梯度洗脱方式：等度；流速：0.25mL/min；
⑤质谱电离模式：ESI+；
⑥FA定量监测离子对：442→295；5甲基THF定量监测离子对：460→313；5甲酰基THF定量监测离子对：474→327
⑦13C5-FA内标定量监测离子对：447→295；5-甲基四氢叶酸-[13C5]内标定量监测离子对：465→313；5-甲酰基四氢叶酸-[13C5]内标定量监测离子对：479→327。
以下表3为实例2.1-2.6检测方法中所用试剂用量以及组分和体系pH设定，雅培竞争法作为对比例。
表3
各实例按照表3所示配制添加各成分，具体浓度比对结果信息如表4和5所示。
表4
表5
/>
表3-5结果表明：
第一步采用40μL DTT与40μL NaOH处理样本，调节DTT的加样量为30μL时，样本浓度与质谱平均偏差在11.3％，继续调整加样量为40μL和50μL时，样本浓度与质谱相当，此时DTT体系最优添加量为40μL，此时样本浓度与质谱平均偏差在3.1-4.1％。由此可见，实例2.1-2.3优于对比例1样本浓度与质谱平均偏差14.5％。
验证体系PH对检测区分度的影响
待测样本：医院提供梯度血清样本
试剂配制和检测过程，与实施例1区别在于：通过调整ABEI加样量优化体系PH值，从而达到提升区分度的作用。
体系pH对区分度的影响结果如下表6所示：
表6
各实例按照表3所示配制添加各成分，具体区分度结果信息如上表6所示。
结果表明，第一步处理样本后，第二步加入pH为6.5的ABEI和磁球将反应体系pH调节至9.0，通过调整体系pH提高区分度，当体系pH达9.0时，此时J/A、J/I、B/A分别为84、1.38、2.14(A指样本16，B指样本17，I指样本18，J指样本19)，区分度最优，调整体系pH，样本浓度与质谱结果不受影响，平均偏差均在3％左右，采用上述配套检测***进行评估，其余各实例均可按此工艺进行制备。
对50例样本利用本发明方法进行检测，以质谱检测结果作为阳性对照。
样本来源：尼勒克县妇幼保健院
本发明检测方法按照实例2.5的试剂按照实施例1中方法进行检测。
质谱检测方法：
样本前处理流程：
①向275μL样本中加入55μL的混合内标(叶酸-[13C5]、5-甲基四氢叶酸-[13C5]、5-甲酰基四氢叶酸-[13C5])和770μL SPE样本缓冲液(10g/L甲酸铵、1g/L抗坏血酸，pH3.2)；
②充分混匀并在4℃下平衡至少20min；
③固相萃取：小柱选用1mL phenyl SPE Cartridges(100mg BondElut)，分别用2mL乙腈、甲醇、SPE样本缓冲液活化色谱柱，然后加入1mL样本，平衡1min使样本和小柱填料充分接触，再加入3mL SPE淋洗液(0.5g/L甲酸铵，0.05g/L抗坏血酸，pH 3.4)洗脱杂质，加入1mL SPE洗脱液(400mL/L甲醇、100mL/L乙腈，10mL/L醋酸，1g/L抗坏血酸)洗脱并收集洗脱液混匀过滤后准备进行测试。
ID LC-MS/MS测试：
①色谱柱：Luna C-8(3mm×150mm,5-μm particle size)；
②进样量：20μL；
③流动相：400mL/L甲醇、100mL/L乙腈，10mL/L醋酸；
④梯度洗脱方式：等度；流速：0.25mL/min；
⑤质谱电离模式：ESI+；
⑥FA定量监测离子对：442→295；5甲基THF定量监测离子对：460→313；5甲酰基THF定量监测离子对：474→327
⑦13C5-FA内标定量监测离子对：447→295；5-甲基四氢叶酸-[13C5]内标定量监测离子对：465→313；5-甲酰基四氢叶酸-[13C5]内标定量监测离子对：479→327。
测试指标介绍：y＝ax+b，a为斜率，代表夹心法方案和质谱检测结果的整体偏差1，其越接近于1，说明偏差越小；b为截距，代表夹心法方案和质谱检测结果的整体偏差2，其越接近于0，说明偏差越小。
图2展示了分别采用本发明方法和质谱法检测50例血样(C1-C50)的FA浓度与质谱法检测结果的相关性。
图2结果表明，按实例2.5的最优方案扩大评估50例不同水平样本，相关性R2达0.9846图2)。表明本发明的方法能够准确的检测出血清样本中的小分子物质(FA)，且检测结果与质谱检测结果一致性较高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (17)

1.一种待测样本中目标分子的检测方法，其特征在于，包括：
S1：提供含有目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂，所述目标分子结合蛋白能够与待测样本中的目标分子结合形成目标分子-目标分子结合蛋白复合物，且所述复合物中目标分子诱导结合蛋白形成至少一个新的构象表位，所述抗体能够特异性结合所述至少一个新的构象表位；
S2：使得待测样本与含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂和含有抗体的检测试剂接触，以获得目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物；
S3：通过检测S2获得的所述目标分子-目标分子结合蛋白-抗体的复合物，用于检测样本中含有的目标分子。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述目标分子结合蛋白不为抗体。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本包括选自校准品、质控品、标准品、血清样本、血浆样本中的任一种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，当待测样本中含有目标分子-目标分子结合蛋白复合物时，所述检测方法进一步包括，在S2之前，利用解离液处理待测样本，以便将待测样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述解离液包括pH为12-14的碱性试剂以及还原剂；
任选地，所述碱性试剂包括NaOH、KOH中的至少之一；
任选地，所述还原剂包括选自DTT、TCEP、BME、DTE中的至少之一；
任选地，所述还原剂为DTT。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤S2进一步包括：
向经所述解离液处理的待测样本中加入所述含有抗体的检测试剂及含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂，获得反应体系1，
其中，所述含有抗体的检测试剂的加入量保证所述反应体系1的pH为7-10且使得经解离后样本中的目标分子不与所述待测样本中含有的目标分子结合蛋白结合，而与检测试剂中的目标分子结合蛋白结合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述含有抗体的检测试剂的pH为5-7。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，含有所述目标分子结合蛋白的检测试剂的pH为4-10。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂包括包被目标分子结合蛋白的载体；
任选地，所述载体包括磁珠、微球中的任一种。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含有抗体的检测试剂包括与所述抗体相连的信号生成物；
任选地，所述信号生成物包括非酶促发光化合物和/或酶促化学发光化合物；
任选地，所述信号生成物包括选自ABEI、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、AHEI、ITCI、光泽精、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的至少之一；
任选地，所述信号生成物为ABEI。
11.一种目标分子检测试剂盒，其特征在于，包括：
1)含有目标分子结合蛋白的检测试剂；
2)含有抗体的检测试剂；
其中，所述抗体为能够与目标分子-目标分子结合蛋白复合物特异性结合，但与游离的目标分子或目标分子结合蛋白不结合的抗体，
所述含有抗体的检测试剂包括与所述抗体相连的信号生成物。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂包括包被目标分子结合蛋白的载体；
任选地，所述载体包括磁珠、微球中的任一种。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述信号生成物包括非酶促发光化合物和/或酶促化学发光化合物；
任选地，所述信号生成物包括选自ABEI、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、AHEI、ITCI、光泽精、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的至少之一；
任选地，所述信号生成物为ABEI。
14.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述含有目标分子结合蛋白的检测试剂的pH为4-10；
任选地，所述含有抗体的检测试剂的pH为5-7。
15.一种血液样本中目标分子检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求11-14中任一项所述试剂盒中的试剂，以及
解离液，
其中，所述解离液用于将所述血液样本中的目标分子-目标分子结合蛋白复合物中的目标分子解离出来，
所述解离液包括pH为12-14的碱性试剂以及还原剂。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性试剂包括NaOH、KOH中的至少之一；
任选地，所述还原剂包括选自DTT、TCEP、BME、DTE中的至少之一；
任选地，所述还原剂为DTT。
17.权利要求11-14中任一项所述的目标分子检测试剂盒、权利要求15或16所述的血液样本中目标分子检测试剂盒在利用化学发光法对待测样本中的目标分子进行检测中的用途。
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