CN117904317A - 用于检测尼里-拉菲水牛繁殖性状的snp分子标记组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测尼里‑拉菲水牛繁殖性状的SNP分子标记组合及其应用。SNP分子标记组合由6个SNP分子标记组成，包括chr24_37929、chr17_2661880、chr24_430958、chr4_827220、chr18_197177和chr6_135119，该SNP分子标记可用于尼里‑拉菲水牛不同的繁殖性状鉴定，具有准确性高、稳定性好、成本低、操作简单、方便快速等优点，可用于尼里‑拉菲水牛分子标记辅助育种，加快选育良种尼里‑拉菲水牛，可显著提高选择效率，缩短育种年限，降低饲养和育种成本，提高育种效率，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及用于检测尼里-拉菲水牛繁殖性状的SNP分子标记组合及应用。
背景技术
繁殖性状是水牛经济性状的重要组成部分，提高水牛繁殖率是增加养殖业经济效益的关键环节。水牛是单胎动物，通常一胎产一犊，繁殖效率低、世代间隔长，导致种牛的培育和群体遗传改良需要很长的时间跨度。因此，提高水牛的繁殖力是新品种培育的主要目标之一。而水牛的繁殖性状表现出低到中等的遗传力，利用传统育种方法通常很难在短时间内在一个品种内进行遗传改良。因此，如何利用现代分子育种技术培育出具有优良经济性状的水牛品种具有深远意义。
尼里-拉菲水牛自巴基斯坦引入我国经过近50年的繁育，该品种在繁殖性能、生长发育、产肉和产奶性能方面均与原产地相当。在我国南方亚热带气候环境下，具有耐热、耐粗饲、抗病力强、生长正常、适应性强等特点，与本地沼泽型水牛相比具有较好的乳肉兼用性能。用尼里-拉菲水牛与本地水牛进行杂交改良，可大幅度提高杂交后代的产肉产奶性能。
目前，纯种尼里-拉菲水牛饲养数量少，规模化程度较低，种质资源匮乏，大部分牛场也只是通过传统的育种方法进行选种选育，造成水牛遗传改良进展缓慢。近些年来，随着科技的飞速发展，分子标记辅助育种已成为改良遗传性状的新方法。在早期关于畜禽复杂性状表型的研究中，主要利用QTL定位来寻找表型变异和基因组变异之间的关联。该方法虽然是一种经典的基因定位方法，但其更适用于单基因疾病或单基因控制性状的遗传研究，其对于复杂性状和遗传力低的性状，检测效果有限，获得的QTL置信区间较大，有可能包涵数以百计的基因，不利于后续功能基因的精准定位，同时，在不同群体中的可重复性较差。
相比QTL连锁分析的方法，全基因组关联分析(GWAS)是一种对全基因组范围内的常见遗传变异(单核苷酸多态性和拷贝数)总体关联分析的方法，该方法以自然群体为研究对象，以长期重组后保留下来的基因(位点)间连锁不平衡(LD)为基础，将目标性状表型的多样性与基因(或标记位点)的多态性结合起来分析，可直接鉴定出与表型变异密切相关且具有特定功能的基因位点或标记位点。采用GWAS技术在全基因组范围内进行研究，能够一次性对多个性状进行定位，适用于定位性状关联区间、功能基因研究、开发性状选育和功能标记等方面的研究，其得到的结果更具可靠性。GWAS技术作为一种新的方法必将在畜禽育种领域得到广泛应用。
发明内容
本发明的发明目的是，针对上述问题，提供了一种用于检测尼里-拉菲水牛繁殖性状的SNP分子标记组合及应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种检测尼里-拉菲水牛繁殖性状的SNP分子标记组合,所述SNP分子标记组合包括chr24_37929、chr17_2661880、chr24_430958、chr4_827220、chr18_197177和chr6_135119，其中：
Chr24_37929位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
Chr17_2661880位于如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第51位，多态性为T或G；
Chr24_430958位于如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
Chr4_827220位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第51位，多态性为C或T；
chr18_197177位于如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
chr6_135119位于如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或C；
所述繁殖性状为初配月龄和/或产犊间隔繁殖性状。
本发明的另一个目的在于提供用于扩增如如上所述的SNP分子标记组合的引物组。
进一步说明，所述的引物组，所述引物组包含Forwardprimer和Reverse primer；其中，
所述chr24_37929分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；
所述chr17_2661880分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；
所述chr24_430958分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
所述chr4_827220分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；
所述chr18_197177分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；
所述chr6_135119分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示。
本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，包括如上述所述引物组。
本发明的另一个目的在于提供所述的SNP分子标记组合或上述所述的引物组在尼里-拉菲水牛分子标记辅助育种中的应用。
本发明的另一个目的在于提供所述的SNP分子标记组合或上述所述的引物组在尼里-拉菲水牛品种繁殖性状鉴定中的应用。
本发明的另一个目的在于提供利用分子生物学技术检测尼里-拉菲水牛基因型的方法，包括以下步骤：根据权利要求1所述的6个SNP分子标记位点两侧翼的核苷酸序列分别设计扩增引物，以尼里-拉菲水牛个体DNA为模板扩增，将扩增产物进行一代测序，根据测序结果对尼里-拉菲水牛个体进行基因分型，从而鉴定待测尼里-拉菲水牛个体的基因型。
进一步说明，所述的方法在尼里-拉菲水牛分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供一种应用上述的SNP分子标记选育/辅助选育与尼里-拉菲水牛繁殖性状相关的尼里-拉菲水牛品种或品系的方法，所述方法是：
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测24号染色体的第37929位点的脱氧核苷酸，测出第37929位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于AG型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测17号染色体的第2661880位点的脱氧核苷酸，测出第2661880位点的脱氧核苷酸为T或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是TT型、GT或GG型，据育种需求，选择TT型、GT或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述GG型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于GT和TT型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测24号染色体的第430958位点的脱氧核苷酸，测出第430958位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、GA或GG型，据育种需求，选择AA型、GA或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于GA型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测4号染色体的第827220位点的脱氧核苷酸，测出第827220位点的脱氧核苷酸为T或C，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是TT型、CT或CC型，据育种需求，选择TT型、CT或CC型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述TT型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于TC和CC型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测18号染色体的第197177位点的脱氧核苷酸，测出第197177位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于AG型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测6号染色体的第135119位点的脱氧核苷酸，测出第135119位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、CA或CC型，据育种需求，选择AA型、CA或CC型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于CA和CC型。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明提供尼里-拉菲水牛繁殖性状表型相关的SNP分子标记组合，可用于尼里-拉菲水牛的分子标记辅助育种，运用全基因组关联分析筛选与尼里-拉菲水牛繁殖性状显著相关的SNP分子标记，可用于尼里-拉菲水牛分子标记辅助育种，加快选育良种尼里-拉菲水牛。本发明利用SNP分子标记对尼里-拉菲水牛繁殖性状进行鉴定，可显著提高选择效率，缩短育种年限，降低饲养和育种成本，提高育种效率，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明尼里-拉菲水牛繁殖性状全基因组关联分析的初配月龄曼哈顿图。附图标记说明：涉及尼里-拉菲水牛初配月龄性状，高于虚线上的为本发明筛选的3个SNP分子标记chr24_37929、chr17_2661880、chr24_430958，这些标记分别位于尼里-拉菲水牛24、17、24号染色体上。
图2是本发明尼里-拉菲水牛繁殖性状全基因组关联分析的初配月龄qq图。
图3是本发明尼里-拉菲水牛繁殖性状全基因组关联分析的产犊间隔曼哈顿图。附图标记说明：涉及尼里-拉菲水牛产犊间隔性状，高于虚线上的为本发明筛选的3个SNP分子标记chr4_827220、chr18_197177、chr6_135119，这些标记分别位于尼里-拉菲水牛4、18、6号染色体上。
图4是本发明尼里-拉菲水牛繁殖性状全基因组关联分析的产犊间隔qq图。
具体实施方式
以下结合附图对发明的具体实施进一步说明。
实施例1用于检测尼里-拉菲水牛繁殖性状的SNP分子标记组合的筛选与开发
1、群体选择与繁殖性状表型数据收集
在广西水牛研究所种牛场选取身体健康、发育良好的尼里-拉菲水牛142头，同时收集其初配月龄和1～2胎产犊间隔繁殖性状相关数据。
2、繁殖性状表型数据收集整理和统计分析
利用SPSS20软件对收集到的表型数据进行统计分析，包括最小值、最大值、平均值、标准差、变异系数，结果见表1。
表1尼里-拉菲水牛繁殖性状表型数据统计分析
| 表型 | 最小值 | 最大值 | 平均值 | 标准差 | 变异系数 |
| 初配月龄(月) | 18 | 56 | 31 | 7.66 | 24.71 |
| 产犊间隔(天) | 375 | 527 | 439.86 | 38.42 | 8.73 |
3、DNA提取和检测
收集每头牛颈静脉血5mL，肝素钠抗凝，轻轻摇晃使其混匀，采用血液基因组DNA提取试剂盒提取水牛基因组DNA，通过核酸浓度测定仪检测DNA浓度，1％的琼脂糖凝胶电泳测定DNA样品质量。将检测合格的DNA样品送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组重测序，利用IlluminaHiSeq PE150测序平台，进行双末端(Paired-End)150测序，重测序的深度在5X以上，对测序下机数据进行过滤并获取有效信息，原始数据过滤方法：(1)需要过滤掉含有接头序列的reads；(2)当单端测序read中N的含量超过该条read长度比例的10％时，需要去除此对paired reads；(3)当单端测序read中含有的低质量(<＝5)碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对paired reads；经过对测序数据的严格过滤，得到高质量的clean data。对产出数据进行统计，包括测序数据产量，测序错误率，Q20含量，Q30含量，GC含量如表2所示，最后得到高质量的clean data数据量为102.69Gb。
表2尼里-拉菲水牛基因组DNA测序结果统计
4、基因组数据比对
有效的高质量测序数据通过BWA生物信息软件(参数：mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组。参考基因组下载地址：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/471/725/GCF_000471725.1_UMD_CASPUR_WB_2.0/GCF_000471725.1_UMD_CASPUR_WB_2.0_genomic.fna.gz群体样本平均比对率为99.39％，对基因组的平均测序深度为13.97X，平均1X覆盖度(至少有一个碱基的覆盖)3.62％，信息见表3。
表3尼里-拉菲水牛基因组数据比对结果统计
5、SNP质控及过滤
采用SAMTOOLS软件进行群体SNP的检测。利用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点。通过质控方法：(1)将质量值在20以上(错误率大于1％)的SNPs过滤掉；(2)若检测到两个SNP之间距离在5bp之内，将SNP去除；(3)SNP的覆盖深度需在平均深度的1/3-5倍之间。经过质控初步获得1972403个SNP位点，对获得的SNPs进行过滤，以获得高质量的SNPs，过滤条件为dp2、Miss0.2、Maf0.01，最后共获得205936个SNP位点用于后续的关联分析。
6、全基因组关联分析
采用GEMMA软件结合表型信息及基因组SNP信息进行关联分析，通过关联的显著性(P-value)，当-log10(P)>5时差异显著，筛选出潜在的候选SNPs。结果如图1～4所示，其中曼哈顿图，为遗传标记效应值即经F检验的全基因组P值按染色体上物理位置排序图，横坐标为基因组染色体上物理位置，纵坐标为-log10P，P值越小关联性越强，表现为纵坐标越大。Manhattan图中水平的虚线表示显著性水平，当-log10(P)>5时，认为该SNP与该性状显著关联。qq图(Quantile-quantileplot)，表示实际P值和无关联零假设期望P值的分布，用于检测群体分层和个体亲缘关系对关联分析的影响，如果观测到的P值与期望P值仅在分布最右端出现，表明性状并非由群体分层造成。QQ plot主要是用来估计数量性状观测值与预测值之间的差异。一般我们所取得的数量性状数据都为正态分布数据。在GWAS研究中QQplot的X和Y轴主要是代表各个SNP的-lgPvalues。预测的线是一条从原点发出的45°角的虚线。GWAS分析过程中，个体亲缘关系和群体分层是造成假关联的主要因素。因此，采用混合线性模型进行性状关联分析，群体遗传结构作为固定效应，个体亲缘关系作为随机效应，以校正群体结构和个体亲缘关系的影响：
y＝Xα+Zβ+Wμ+e
其中y为表型性状，X为固定效应的指示矩阵，α为固定效应的估计参数；Z为SNP的指示矩阵，β为SNP的效应；W为随机效应的指示矩阵，μ为预测的随机个体，e是随机残差，服从e～(0，δe2)。
7、筛选并提取与尼里-拉菲水牛初配月龄和1～2胎产犊间隔繁殖性状相关的SNP分子标记
利用PLINK的“--indep-pairwise 2550.2”参数获得基因组上独立的SNP位点数，以1/SNP位点数作为多重检验阈值。通过R软件提取达到显著关联水平的多态位点，优选出6个分别与尼里-拉菲水牛的初配月龄和1～2胎产犊间隔相关联的SNP分子标记位点，可以用于尼里-拉菲水牛初配月龄和1～2胎产犊间隔繁殖性状的选育。详细信息见表4。
表4筛选出的6个分子标记的信息
实施例2：6个SNP标记位点引物组在尼里-拉菲水牛繁殖性状检测中的应用
挑选尼里-拉菲水牛52头。颈静脉采集血液并采用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用核酸浓度测定仪检测DNA浓度，1％的琼脂糖凝胶电泳测定DNA样品质量。针对筛选出来的6个候选SNP位点设计扩增引物(如表5)。引物序列为：
表56个候选SNP位点引物设计
注：表中的F即上游引物Forwardprimer，R即下游引物Reverse primer
利用上述引物，以尼里-拉菲水牛血液基因组DNA为模板进行PCR扩增。采用50μLPCR反应体系：ddH2O 19μL，Premix TaqTM25μL，DNA模板2.0μL，引物(上游引物和下游引物均为10μmol/L)各2.0μL。
PCR反应条件：
95℃预变性4min；94℃变性10s，退火30s(温度为60℃)，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min。
用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒对上述PCR扩增产物进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。将上述获得的PCR纯化产物回收后直接送至华大基因(深圳)生物科技公司进行一代测序。根据测序结果对个体基因分型。基因分型结果见表6。
表6 6个候选SNP位点在尼里-拉菲水牛基因型频率和等位基因频率
从表6中可以看出突变位点chr24_37929和chr18_197177的A等位基因频率要明显大于G等位基因频率；chr17_2661880和chr24_430958位点的G等位基因频率要明显大于T和A等位基因频率；chr4_827220和chr6_135119位点的C等位基因频率明显大于T和A。
表7尼里-拉菲水牛初配月龄显著关联SNP验证
初配月龄表型值以“最小二乘均值±标准差”表示，同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)；SNP位点基因型按照突变型、杂合型、参考型依次排列。
结果表明，通过验证发现候选SNP chr24_37929、chr17_2661880、chr24_430958不同基因型与尼里-拉菲水牛初配月龄具有显著差异(表7)，AA型初配月龄显著小于GA型，GG型初配月龄显著小于GT型，TT型，AA型初配月龄显著小于GA型，说明初配月龄小，能够缩短繁殖间隔，可作为鉴定尼里-拉菲水牛繁殖性状初配月龄的分子标记辅助育种，应用到生产中。
表8尼里-拉菲水牛产犊间隔显著关联SNP验证
产犊间隔表型值以“最小二乘均值±标准差”表示，同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)；SNP位点基因型按照突变型、杂合型、参考型依次排列。
结果表明，通过验证发现候选chr4_827220、chr18_197177、chr6_135119不同基因型与尼里-拉菲水牛产犊间隔具有显著差异(见表8)，chr4_827220的TT型产犊间隔显著短于TC和CC型，TC和CC型差异不显著；chr18_197177的AA型产犊间隔显著短于AG，chr6_135119的AA型产犊间隔显著短于CA和CC型，CA和CC型差异不显著。说明产犊间隔短，则繁殖周期短，能显著缩短繁殖年限，可作为鉴定尼里-拉菲水牛繁殖性状产犊间隔的分子标记辅助育种，应用到生产中。
实施例4：
在尼里-拉菲水牛育种时，可以利用以上6个SNP分子标记，在其两侧翼的核苷酸序列上分别设计扩增引物，在尼里-拉菲水牛3～6月龄时采集水牛颈静脉血液，采用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以尼里-拉菲水牛个体DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物一代测序，根据测序结果进行基因分型，保留带有目的性状基因型的个体，可以缩短育种年限，加快育种速度。
可应用本申请的SNP分子标记选育/辅助选育与尼里-拉菲水牛繁殖性状相关的尼里-拉菲水牛品种或品系的方法，所述方法是：
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测24号染色体的第37929位点的脱氧核苷酸，测出第37929位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于AG。和/或
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测17号染色体的第2661880位点的脱氧核苷酸，测出第2661880位点的脱氧核苷酸为T或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是TT型、GT或GG型，据育种需求，选择TT型、GT或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述GG型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于GT和TT型。和/或
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测24号染色体的第430958位点的脱氧核苷酸，测出第430958位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、GA或GG型，据育种需求，选择AA型、GA或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于GA型。和/或
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测4号染色体的第827220位点的脱氧核苷酸，测出第827220位点的脱氧核苷酸为T或C，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是TT型、TC或CC型，据育种需求，选择TT型、TC或CC型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述TT型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于TC和CC型。和/或
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测18号染色体的第197177位点的脱氧核苷酸，测出第197177位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于AG型。和/或
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测6号染色体的第135119位点的脱氧核苷酸，测出第135119位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、CA或CC型，据育种需求，选择AA型、CA或CC型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于CA和CC型。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (9)
1.一种用于检测尼里-拉菲水牛繁殖性状的SNP分子标记组合,其特征在于：所述SNP分子标记组合包括chr24_37929、chr17_2661880、chr24_430958、chr4_827220、chr18_197177和chr6_135119，其中：
chr24_37929位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
chr17_2661880位于如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第51位，多态性为T或G；
chr24_430958位于如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
chr4_827220位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第51位，多态性为C或T；
chr18_197177位于如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或G；
chr6_135119位于如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的第51位，多态性为A或C；
所述繁殖性状为初配月龄和/或产犊间隔繁殖性状。
2.用于扩增如权利要求1所述的SNP分子标记组合的引物组。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：所述引物组包含Forwardprimer和Reverse primer；其中，
所述chr24_37929分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；
所述chr17_2661880分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；
所述chr24_430958分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
所述chr4_827220分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；
所述chr18_197177分子标记的引物组中Forward primer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；
所述chr6_135119分子标记的引物组中Forwardprimer和Reverse primer引物的序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述引物组。
5.如权利要求1所述的SNP分子标记组合或权利要求2或3任一项所述的引物组在尼里-拉菲水牛分子标记辅助育种中的应用。
6.如权利要求1所述的SNP分子标记组合或权利要求2或3任一项所述的引物组在尼里-拉菲水牛繁殖性状鉴定中的应用。
7.利用分子生物学技术检测尼里-拉菲水牛基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据权利要求1所述的6个SNP分子标记位点两侧翼的核苷酸序列分别设计扩增引物，以尼里-拉菲水牛个体DNA为模板扩增，将扩增产物进行一代测序，根据测序结果对尼里-拉菲水牛个体进行基因分型，从而鉴定待测尼里-拉菲水牛个体的基因型。
8.权利要求7所述的方法在尼里-拉菲水牛分子标记辅助育种中的应用。
9.一种应用权利要求1所述的SNP分子标记选育/辅助选育与尼里-拉菲水牛繁殖性状相关的尼里-拉菲水牛品种或品系的方法，其特征在于，所述方法是：
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测24号染色体的第37929位点的脱氧核苷酸，测出第37929位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于AG；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测17号染色体的第2661880位点的脱氧核苷酸，测出第2661880位点的脱氧核苷酸为T或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是TT型、GT或GG型，据育种需求，选择TT型、GT或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述GG型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于GT和TT型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测24号染色体的第430958位点的脱氧核苷酸，测出第430958位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、GA或GG型，据育种需求，选择AA型、GA或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛初配月龄远低于GA型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测4号染色体的第827220位点的脱氧核苷酸，测出第827220位点的脱氧核苷酸为T或C，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是TT型、TC或CC型，据育种需求，选择TT型、TC或CC型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述TT型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于TC和CC型；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测18号染色体的第197177位点的脱氧核苷酸，测出第197177位点的脱氧核苷酸为A或G，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、AG或GG型，据育种需求，选择AA型、AG或GG型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于AG；
提取尼里-拉菲水牛的基因组DNA，检测6号染色体的第135119位点的脱氧核苷酸，测出第135119位点的脱氧核苷酸为A或C，确定待测尼里-拉菲水牛的基因型是AA型、CA或CC型，据育种需求，选择AA型、CA或CC型基因的尼里-拉菲水牛进行下一步的选种和/或育种，所述AA型基因的尼里-拉菲水牛产犊间隔远低于CA和CC型。
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