CN117903955A - 生防菌黄暗青霉（Penicillium citreonigrum）JSNL-B16、生防菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于草莓生防技术领域，公开了生防菌黄暗青霉(Penicilliumcitreonigrum)JSNL‑B16、生防菌剂及其制备方法和应用。本发明鉴定的生防菌命名为黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL‑B16，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40490。本发明提供的生防菌黄暗青霉JSNL‑B16对B.cinerea和C.siamense均有很好拮抗活性，对于B.cinerea菌株的抑制率达到了66.85％，对于C.siamense菌株的抑制率达到了51.24％，同时，菌株JSNL‑B16分泌的胞外代谢物对B.cinerea和C.siamense均有抑制效果。此外，本发明提供的生防菌黄暗青霉JSNL‑B16显著降低草莓灰霉病和炭疽病的病害严重度，草莓的根长、株高、鲜重等指标均有增加，该生防菌对草莓植株存在促生作用，还能够诱导草莓对B.cinerea和C.siamense产生抗性。
Description
技术领域
本发明属于草莓生防技术领域，涉及生防菌黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16、生防菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
草莓是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物，具有结果早、生长周期短、适应性强和产量高等特点。草莓富含钙、钠、镁、铁等多种有益微量元素，具有较高的营养价值。另外，由于草莓色、香、味俱佳，深受消费者的喜爱，也带来了较高的经济效益。然而，在草莓生长过程中经常受到多种病害的侵染，其中草莓灰霉病和炭疽病是近年来草莓生产上发生较为广泛的病害。
草莓灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的，除侵染草莓外，还可为害葡萄、黄瓜、番茄、韭菜、辣椒等多种植物，寄主范围广泛。灰霉病分布广、扩展速度快、危害严重，给全球果蔬的产量和品质带来巨大损失，在全球十大植物病害中排名第二位。灰霉病是草莓开花后危害最严重的一种真菌性病害，该病害主要侵染果实，也侵染叶片、果梗、花萼、花瓣及叶柄，造成花及果实腐烂，感病品种的病果率一般在30％-60％，严重的情况下甚至绝收，给草莓生产造成巨大的损失。
草莓炭疽病是由炭疽菌(刺盘孢)属(Colletotrichum spp.)引起的，包括胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、尖孢炭疽菌(C.acuta tum)、草莓炭疽菌(C.fragariae)和暹罗炭疽菌(C.siamense)等。除了可侵染草莓，还可侵染葡萄、苹果、辣椒、芒果、柑橘、桃、梨和大豆等植物。草莓炭疽病发生时，草莓叶片、叶柄、托叶、匍匐茎、花瓣和果实均可受害。该病危害性大、毁灭性强，一般造成草莓减产25％-30％，严重时达80％，甚至毁灭性损失。草莓炭疽病是制约中国草莓产业的第三大病害。
现有技术中草莓灰霉病和炭疽病的防治主要是依赖嘧啶胺类、酰胺类、吡啶胺类、二甲酰亚胺类、***类和吡咯类等化学药剂，但大量使用化学药剂导致病原菌抗药性不断增强，其防治效果大大下降，并且给生态环境和食品安全带来极大威胁，危及人类健康，不利于我国绿色农业的可持续性发展。
因而，迫切需要一种高效、低毒的灰霉病和炭疽病防治措施。植物内生真菌栖息于无症状的宿主植物组织内，是影响植物生长、营养和健康的关键因素之一，可以帮助植物获得营养物质，抑制植物病原菌以及抵抗生物和非生物胁迫。由于植物内生真菌来源于植物，对植物安全、对环境友好且不易产生抗药性，能够克服化学农药防治的弊端，因此，植物内生真菌是促进有绿色农业可持续性发展的新型化合物的来源。
综上所述，现有技术还缺少一种预防草莓灰霉病和炭疽病的绿色、高效的生防菌。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了防治草莓灰霉病和炭疽病的生防菌黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16、生防菌剂及其制备方法和应用。
本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种防治草莓灰霉病和炭疽病的生防菌，所述生防菌为黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40490。
黄暗青霉JSNL-B16，分类命名为Penicillium citreonigrum，已于2023年1月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)登记保藏，保藏编号为CGMCC NO.40490，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
经过筛选鉴定，黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16基因组组DNA的ITS基因序列为SEQ ID NO.1，BenA基因序列为SEQ ID NO.2。
第二方面，本发明提供了一种防治草莓灰霉病和草莓炭疽病的生防菌剂，所述生防菌剂包括黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16的菌丝或分生孢子、或黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16的发酵产物。
第三方面，本发明还提供了一种第二方面所述的生防菌剂的制备方法，所述制备方法采用以下任一步骤，
1)将保藏号为CGMCC NO.40490的黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16接种于PDA培养基培养制得；或
2)将保藏号为CGMCC NO.40490的黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16菌丝块接种至PDB液体培养基中发酵培养制得。
进一步地，所述发酵条件为，在22-26℃中，150-180rpm条件下黑暗培养4-6d。
第四方面，本发明还提供了第一方面所述的生防菌或第二方面所述的生防菌剂在防治草莓灰霉病和草莓炭疽病中的应用。
进一步地，所述草莓灰霉病由B.Cinerea引起，所述草莓炭疽病由C.siamens引起。
第五方面，本发明还提供了一种草莓灰霉病和炭疽病的防治方法，所述防治方法包括向植物生长环境中施用第一方面所述的生防菌或第二方面所述的生防菌剂。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1)本发明提供的生防菌黄暗青霉JSNL-B16与B.cinerea和C.siamense均有很好拮抗活性，对于B.cinerea菌株的抑制率达到了66.85％，对于C.siamense菌株的抑制率达到了51.24％，同时，菌株JSNL-B16分泌的胞外代谢物对B.cinerea和C.siamense均有抑制效果。
2)本发明提供的生防菌黄暗青霉JSNL-B16显著降低草莓灰霉病和炭疽病的病害严重度，其根长、株高、鲜重等指标增加，对草莓植株存在促生作用。
3)本发明提供的生防菌黄暗青霉JSNL-B16能够诱导草莓对B.Cinerea和C.siamense产生抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中黄暗青霉JSNL-B16在平板上抑制B.cinerea(左起第1-2平板)和C.siamense(右起第1-2平板)菌丝生长的效果图；
图2为实施例2中黄暗青霉JSNL-B16分泌的胞外代谢物对B.cinerea和C.siamense的影响；
图3为实施例3中黄暗青霉JSNL-B16对草莓植株的影响；
图4为实施例4中黄暗青霉JSNL-B16抑制B.cinerea侵染草莓果实的结果图；
图5为实施例4中黄暗青霉JSNL-B16抑制C.siamense侵染草莓叶片的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
如本发明中所述，术语“生防菌”指有益微生物，可以防治植物病害，主要有细菌、真菌和放线菌。
如本发明中所述，术语术语“灰霉病菌(B.cinerea)”分类地位：真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、锤舌菌纲(Leotiomycete)、柔膜菌目(Helotiales)、核盘菌科(Sclerotiniaceae)、孢盘菌属(Botryotini a)。主要分布在美国、瑞典、德国、法国、中国、巴西、日本、韩国、阿根廷、印度、智利等国家。
如本发明中所述，术语“炭疽病菌(C.siamense)”分类地位：真菌门(Eumycota)、半知菌亚门(Deuteromyeotina)、腔孢纲(Coelomycete s)、黑盘孢目(Melanconiales)、黑盘孢科(Melanconiaceae)、炭疽属(Colletotrichum)。主要分布在美国、加拿大、澳大利亚、日本、英国、中国、比利时、德国、印度、越南、韩国、巴西、巴拿马、墨西哥等国家。
实施例1黄暗青霉JSNL-B16的筛选
1、分离潜在的生防菌
1.1、获取试验材料：从田间(句容市边城镇)选取长势良好的健康草莓植株，取其根部组织。
1.2、草莓根部内生真菌的分离及培养：剪取草莓根部组织数块，加入100mL无菌水和2滴吐温20，25℃下220rpm震荡20min，无菌水处理20s，75％(v/v)乙醇浸泡30s，2.0％(v/v)次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水冲洗3-4遍，用无菌吸水纸吸干表面水分。在无菌条件下将根段进一步切成较短的小段(0.25cm)，每个样品随机选取5块放置在含有氨苄(50mg/L)和利福平(50mg/L)的PDA平板培养基上，设三个重复。将培养皿密封，在25℃、黑暗条件下培养1-2d。当菌丝体从根块组织中出现时，将生长在培养基边缘的小块培养基连同菌丝体一起小心地转移到一个新的PDA平板上。
2、平板对峙法筛选拮抗菌
采用PDA平板对峙法，在直径9cm的含有15mL的PDA培养基平板距离边缘2cm处对称接种培养3-5d的B.cinerea和C.siamense菌株菌饼(直径5mm)和供试内生真菌菌饼，以只接种B.cinerea和C.siamense菌株菌饼的平板作为对照。平板置于25℃、黑暗条件下培养。5d后测量B.cinerea和C.siamense菌落半径并计算抑制率。
最终筛选得到1株在平板上对B.cinerea和C.siamense均有很好拮抗活性的菌株，具体表现为强烈的抑制病原菌菌丝生长，编号为JSNL-B16。
如图1所示，左起第1-2平板为JSNL-B16与B.cinerea菌株对峙，与对照相比，实验组B.cinerea菌株的菌落明显更小，抑制率达到了66.85％，右起第1-2平板为JSNL-B16与C.siamense菌株对峙，与对照相比，实验组C.siamense菌株的菌落明显更小，抑制率达到了51.24％，说明B.cinerea和C.siamense菌株的菌丝生长均受到了抑制。
3、筛选所得菌株的分子生物学鉴定
3.1、采用TIANGEN公司的试剂盒(DP320-03)提取菌株JSNL-B16的基因组DNA。
3.2、分别扩增基因组DNA的ITS和BenA基因。DNA扩增采用30μL的反应体积，包含15μL 2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)，引物F/R各1μL(10μM)，2μL模板DNA和11μL ddH2O，PCR扩增程序条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
3.3、扩增所得PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果为：步骤2筛选得到的菌株JSNL-B16的ITS基因序列为SEQ ID NO.1，BenA基因序列为SEQ ID NO.2。
3.4、在NCBI数据库网站上比对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条序列。比对结果如表1所示。根据表1结果可以推定本发明的生防菌JSNL-B16为黄暗青霉(Penicilliumcitreonigrum)，命名为黄暗青霉JSNL-B16。
表1 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条序列比对结果
实施例2黄暗青霉JSNL-B16胞外代谢物对B.cinerea和C.siamense的影响
1、将B.cinerea和黄暗青霉JSNL-B16分别接种于直径9cm的含有15mLPDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d。待B.cinerea和C.siamense菌株长满培养皿，用打孔器(直径5mm)在菌落边缘打孔，制备菌碟。
2、菌株JSNL-B16分泌的胞外代谢物的获取
在直径6cm的PDA培养基平板上覆上一层水系滤膜(孔径0.22μm，直径5cm)，使滤膜与PDA平板表面紧贴。随后在滤膜上接黄暗青霉JSNL-B16菌碟(直径5mm)，对照用空白PDA培养基代替JSNL-B16菌碟(直径5mm)，25℃黑暗条件下培养。
3、培养1d后用镊子小心将滤膜连同其上黄暗青霉JSNL-B16培养物移除，对照撕掉滤膜和空白PDA块。制得含黄暗青霉JSNL-B16胞外代谢物的平板和空白PDA平板。
4、在超净工作台中用接种针挑取B.cinerea和C.siamense菌碟(直径5mm)接种于上述制得的平板中，注意菌丝面朝下，各设3个重复。
5、将接种后的平板放入25℃培养箱，避光培养3-5d，用十字交叉法测量菌落大小。抑制率按照公式计算：抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。
结果表2所示。
表2 JSNL-B16分泌的胞外代谢物对B.cinerea和C.siamense抑制率
其中，表中菌落直径的数值表达方式为：平均值±标准误差。
从图2和表2数据可知，菌株JSNL-B16分泌的胞外代谢物对B.cinerea和C.siamense均有抑制效果。
实施例3黄暗青霉JSNL-B16对草莓自身生长的影响
1、将菌株黄暗青霉JSNL-B16接种于直径9cm的培养皿中，25℃、避光培养5d。
2、在黄暗青霉JSNL-B16菌落边缘切取3mm×3mm的菌丝块，无菌条件下将30块菌丝块转移到200mLPDB液体培养基中，25℃、黑暗、160rpm条件下培养5d，菌株充分发酵后，将菌株连同发酵液进行破碎处理制成菌悬液。
3、选择直径为12cm的盆钵，试验设置2组，实验组为：每个盆钵加入50mL黄暗青霉JSNL-B16的菌悬液和灭菌的蛭石混合均匀，加入盆钵到1/3处，向每个盆钵中移栽3株长势一致的健康草莓苗(品种为红颜)，再覆盖一层薄的菌悬液与蛭石的混合物。对照组为：每个盆钵加入50mL PDB液体培养基和灭菌的蛭石混合均匀，加入盆钵到1/3处，向每个盆钵中移栽3株长势一致的健康草莓苗(品种为红颜)，再覆盖一层薄的PDB液体培养基与蛭石的混合物。每个处理设置3个重复。
4、用无菌水浇灌各组草莓，10d后统计草莓的根长、株高和鲜重。
结果如图3和表3所示。
表3草莓根长、株高及鲜重统计结果
其中，表中根长、株高和鲜重的数值表达方式为：平均值±标准误差。
从表3数据可知，实验组的株高和鲜重优于对照组，根长显著增加。以上结果表明黄暗青霉JSNL-B16对草莓植株存在促生作用。
实施例4黄暗青霉JSNL-B16诱导草莓产生抗性
1、黄暗青霉JSNL-B16对由B.cinerea引起的草莓灰霉病的影响
1.1、将B.cinerea和黄暗青霉JSNL-B16分别接种于直径9cm的含有15mLPDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d。用打孔器(直径5mm)在B.cinerea和JSNL-B16菌落边缘打孔，制备菌碟。
1.2、选取健康草莓果实(品种为红颜)，用自来水洗净，再用70％(v/v)乙醇表面消毒2次，最后用无菌水冲洗果实表面3次，用灭菌的接种针在果面轻刺3-5下。将上述JSNL-B16的菌碟贴放在果面伤口处，菌丝面朝下，对照用PDA空白培养基打菌碟代替JSNL-B16，用无菌湿脱脂棉保湿。接种过的果实放在消过毒的托盘中，托盘内铺两层无菌纱布并用无菌水淋湿，用保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置24h。
1.3将果实上的JSNL-B16和PDA空白培养基菌碟去掉，换上B.cinerea菌碟，菌丝面朝下，换上新的无菌湿脱脂棉，保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置3d。
1.4查看草莓果实发病情况，用十字交叉法记录病斑直径，计算平均值。
结果如图4和表4所示。
表4 B.cinerea接种果实病斑直径统计结果
其中，表中菌落直径的数值表达方式为：平均值±标准误差。
如图4所示，右侧为接种菌株JSNL-B1624 h后又接种B.cinerea菌株，左侧为接种空白PDA24 h后又接种B.cinerea菌株，可见实验组的病斑明显小于对照组，说明实验组的草莓果实产生了对B.cinerea的抗性。
2、黄暗青霉JSNL-B16对由C.siamens引起的草莓炭疽病的影响
2.1、将C.siamense和黄暗青霉JSNL-B16分别接种于直径9cm的含有15mL PDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5d。用打孔器(直径5mm)在C.siamense和JSNL-B16菌落边缘打孔，制备菌碟。
2.2、选取健康草莓叶片(品种为红颜)，用自来水洗净，再用70％(v/v)乙醇表面消毒2次，最后用无菌水冲洗叶片表面3次，用灭菌的接种针在叶背左右两侧各轻刺3-5下，将上述JSNL-B16的菌碟贴放在叶片右侧伤口上，菌丝面朝下，左侧用PDA空白培养基打菌碟(直径5mm)作为对照，同时在叶片左右两侧均放置PDA空白培养基作为空白对照，用无菌湿脱脂棉保湿。接种过的叶片放在消过毒的托盘中，托盘内铺两层无菌纱布并用无菌水淋湿，用保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置24h。
2.3将叶片两侧的JSNL-B16和PDA空白培养基菌碟去掉，换上C.siamense菌碟，菌丝面朝下，换上新的无菌湿脱脂棉，保鲜膜覆盖密封托盘保湿。25℃、黑暗条件下放置6d。
2.4查看草莓叶片发病情况，用十字交叉法记录病斑直径，计算平均值。
结果如图5和表5所示。
表5 C.siamense接种叶片病斑直径统计结果
其中，表中菌落直径的数值表达方式为：平均值±标准误差。
如图5所示，叶片正面左侧为接种菌株JSNL-B1624 h后又接种C.siamense菌株，右侧为接种空白PDA24 h后又接种C.siamense菌株，可见实验组的病斑明显小于对照组，说明实验组的草莓叶片产生了对C.siamense的抗性。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (7)
1.一种防治草莓灰霉病和炭疽病的生防菌，其特征在于，所述生防菌为黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40490。
2.一种防治草莓灰霉病和草莓炭疽病的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂包括黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16的菌丝或分生孢子、或黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16的发酵产物。
3.一种权利要求2所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用以下任一，
1)将保藏号为CGMCC NO.40490的黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16接种于PDA培养基培养；或
2)将保藏号为CGMCC NO.40490的黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)JSNL-B16菌丝块接种至PDB液体培养基中发酵培养。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵条件为，在22-26℃中，150-180rpm条件下黑暗培养4-6d。
5.权利要求1所述的生防菌或权利要求2所述的生防菌剂在防治草莓灰霉病和草莓炭疽病中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述草莓灰霉病由B.cinerea引起，所述草莓炭疽病由C.siamens引起。
7.一种草莓灰霉病和炭疽病的防治方法，其特征在于，所述防治方法包括向植物生长环境中施用权利要求1所述的生防菌或权利要求2所述的生防菌剂。
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