CN117871873A - 一种基于高分子微球的显微暗场生物检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于高分子微球的显微暗场生物检测方法，属于生物技术领域。解决现有技术中成本高，操作步骤较为繁琐的技术问题。本发明的方法采用待检生物标志物的特征性抗体修饰的基底和待检生物标志物的特征性抗体修饰的高分子微球来包夹待检生物标志物，通过暗场显微成像技术对待检生物标志物进行检测，可以通过高分子微球成像的颗粒数，可视化区别和鉴定待测生物标志物的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于高分子微球的显微暗场生物检测方法。
背景技术
显微暗场生物检测不需要额外标记的待检生物标志物的特征性抗体和光谱仪等，具有经济、操作简单、可视化、灵敏度高等优点。目前广泛采用的贵金属纳米粒子具有成本高、易聚集、技术路线商业化程度低等缺点。而高分子微球具有大规模制备、分散性好、技术路线更为成熟，在显微暗场生物检测方面具有更大的应用潜力和市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于高分子微球的显微暗场生物检测方法。该方法具有低成本、易操作、高灵敏度等优点。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种基于高分子微球的显微暗场生物检测方法，具体步骤如下：
S1:制备待检生物标志物的特征性抗体修饰的基底；
S2：制备待检生物标志物的特征性抗体修饰的高分子微球；
S3:制备三明治夹心结构；
S4：将S3中制备的三明治夹心结构进行显微暗场生物检测。
进一步地，步骤S1具体为：
将载玻片依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗15分钟，氮气吹干，备用。将清洗好的载玻片置于超高真空热蒸镀薄膜蒸设备，在压力小于10-5帕斯卡下，依次蒸镀5纳米的铬膜和50纳米的金膜，蒸镀速度分别为0.02纳米每秒和0.05纳米每秒。将上述制备的基底浸泡于11-巯基十一烷酸和6-巯基-1-己醇的乙醇混合溶液，二者浓度分别为0.001摩尔每升，室温置于摇床12小时，依次用乙醇和超纯水清洗干净，氮气吹干。然后在基底上滴加40微升每平方厘米的免疫球蛋白抗体溶液，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。接着滴加40微升每平方厘米的0.1毫克每毫升的牛血清蛋白磷酸盐缓冲溶液，置于室温1小时，超纯水冲洗，氮气吹干。然后依次将浓度分别为10-6、10-5、10-4、10-3、10-1毫克每毫升的人免疫球蛋白磷酸盐缓冲液滴加到上述免疫球蛋白抗体修饰的基底上，滴加量为40微升每平方厘米，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。
进一步地，步骤S2具体为：
将300nm的羧基修饰的聚苯乙烯微球用磷酸盐缓冲液稀释为0.25毫克每毫升。然后向1毫升特征性抗体修饰的高分子微球中加入免疫球蛋白抗体溶液，置于室温2小时，接着以6000转每分钟的速度离心3分钟，移去上清液，分散于1毫升的磷酸盐缓冲液。免疫球蛋白的抗体浓度为0.0006毫克每毫升。接着加入20微升的0.1毫克每毫升的牛血清蛋白磷酸盐缓冲溶液，待用。
进一步地，步骤S3具体为：
将免疫球蛋白抗体修饰的高分子微球滴加到已制备好的具有免疫球蛋白抗体和免疫球蛋白的基底上，滴加量为40微升每平方厘米，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。
进一步地，步骤S4具体为：
将制备好的三明治夹心结构的样品置于显微镜载物台上，以卤素灯为光源，在暗场模块下，通过50倍物镜和CCD相机采集信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用的高分子微球具有大规模制备、分散性好、技术路线更为成熟。采用此技术，既可以保证生物暗场检测的可视化、灵敏度高、操作简单等优点，又可以显著降低技术成本，非常有利于市场的规模化应用。
2.本发明采用待检生物标志物的特征性抗体修饰的基底和待检生物标志物的特征性抗体修饰的高分子微球包夹待检生物标志物的三明治夹心结构在显微暗场下对人的免疫球蛋白进行检测，高分子微球不仅聚集程度低、价格低廉，同时操作简单，信号可以可视化、高灵敏呈现。
3.本发明通过数据处理和分析信号发现人的免疫球蛋白的检测限为10-6毫克每毫升。
4.本发明提供的方法所绘制的标准曲线具有很好的线性关系，R2为0.97。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些具体实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为三明治夹心结构；
图2为基于高分子微球的显微暗场生物成像图；
图3为基于金纳米颗粒的显微暗场生物成像图；
图4为基于高分子微球的显微暗场生物检测方法人免疫球蛋白浓度与高分子微球信号数量关系图；
图5为基于金纳米颗粒的显微暗场生物检测方法人免疫球蛋白浓度与高分子微球信号数量关系图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
本发明提供一种基于高分子微球的显微暗场生物检测方法，方法如下：
S1:制备待检生物标志物的特征性抗体修饰的基底：将载玻片依次用超纯水、无水乙醇、超纯水超声清洗15分钟，氮气吹干，备用。将清洗好的载玻片置于超高真空热蒸镀薄膜蒸设备，在压力小于10-5帕斯卡下，依次蒸镀5纳米的铬膜和50纳米的金膜，蒸镀速度分别为0.02纳米每秒和0.05纳米每秒。将上述制备的基底浸泡于11-巯基十一烷酸和6-巯基-1-己醇的乙醇混合溶液，二者浓度分别为0.001摩尔每升，室温置于摇床12小时，依次用乙醇和超纯水清洗干净，氮气吹干。然后在基底上滴加40微升每平方厘米的免疫球蛋白抗体溶液，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。接着滴加40微升每平方厘米的0.1毫克每毫升的牛血清蛋白磷酸盐缓冲溶液，置于室温1小时，超纯水冲洗，氮气吹干。然后依次将浓度分别为10-6、10-5、10-4、10-3、10-1毫克每毫升的人免疫球蛋白磷酸盐缓冲液滴加到上述免疫球蛋白抗体修饰的基底上，滴加量为40微升每平方厘米，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。
S2：制备待检生物标志物的特征性抗体修饰的高分子微球：将300nm的羧基修饰的聚苯乙烯微球用磷酸盐缓冲液稀释为0.25毫克每毫升。然后向1毫升特征性抗体修饰的高分子微球中加入免疫球蛋白抗体溶液，置于室温2小时，接着以6000转每分钟的速度离心3分钟，移去上清液，分散于1毫升的磷酸盐缓冲液。免疫球蛋白的抗体浓度为0.0006毫克每毫升。接着加入20微升的0.1毫克每毫升的牛血清蛋白磷酸盐缓冲溶液，待用。
S3:制备三明治夹心结构：将免疫球蛋白抗体修饰的高分子微球滴加到已制备好的具有免疫球蛋白抗体和免疫球蛋白的基底上，滴加量为40微升每平方厘米，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。
S4：将S3中制备的三明治夹心结构进行显微暗场生物检测：
将制备好的三明治夹心结构的样品置于显微镜载物台上，以卤素灯为光源，在暗场模块下，通过50倍物镜和CCD相机采集信号。
CCD相机采集的图像如图1所示，颗粒可视化程度高且分散性较好。通过ImageJ软件对图像中的高分子微球的成像数量进行统计分析，浓度分别为10-6、10-5、10-4、10-3、10-1毫克每毫升的人免疫球蛋白与微球成像数量呈正相关变化，微球成像数量分别为150、175、292、320、490。线性分析所得数据图如图3所示，人的免疫球蛋白的检测限为10-6毫克每毫升，且具有很好的线性关系，R2为0.97。
对比例1
本对比例提供一种基于贵金属金纳米粒子的显微暗场生物检测方法，包括以下步骤：
S1:制备待检生物标志物的特征性抗体修饰的基底：依次用去离子水、无水乙醇、去离子水超声清洗15分钟，干燥氮气吹干备用。接着将清洗好的载玻片置于超高真空热蒸镀薄膜蒸发仪，在压力小于10-5帕斯卡下，依次蒸镀5纳米的铬膜和50纳米的金膜，蒸镀速度分别为0.02纳米每秒和0.05纳米每秒。将上述制备的基底浸泡于11-巯基十一烷酸和6-巯基-1-己醇的乙醇混合溶液，二者浓度分别为0.001摩尔每升，室温置于摇床12小时，依次用乙醇和超纯水清洗干净，氮气吹干。然后在基底上滴加40微升每平方厘米的免疫球蛋白抗体溶液，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。接着滴加40微升每平方厘米的0.1毫克每毫升的牛血清蛋白磷酸盐缓冲溶液，置于室温1小时，超纯水冲洗，氮气吹干。然后依次将浓度分别为10-6、10-5、10-4、10-3、10-1毫克每毫升的人免疫球蛋白磷酸盐缓冲液滴加到上述免疫球蛋白抗体修饰的基底上，滴加量为40微升每平方厘米，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。
S2：待检生物标志物的特征性抗体修饰的金颗粒制备：向500微升60nm的金纳米颗粒中加入30微升的巯基聚乙二醇羧基的水溶液，室温置于摇床30分钟，然后加入60微升的巯基聚乙二醇的水溶液。室温置于摇床12小时。巯基聚乙二醇羧基和巯基聚乙二醇的水溶液的浓度都为10微摩尔每升。接着以6000转每分钟的速度离心3分钟，移去上清液，重新分散于500微升的磷酸盐缓冲液。然后在500微升特征性抗体修饰的金纳米颗粒中加入免疫球蛋白抗体溶液，置于室温2小时。然后以6000转每分钟的速度离心3分钟，移去上清液，重新分散于500微升的磷酸盐缓冲液。免疫球蛋白的抗体浓度为0.0006毫克每毫升。接着加入10微升的0.1毫克每毫升的牛血清蛋白磷酸盐缓冲溶液，待用。
S3：制备三明治夹心结构，三明治结构从下到上依次为待检生物标志物的特征性抗体修饰的基底、待检生物标志物和待检生物标志物的特征性抗体修饰的金纳米颗粒。具体通过将免疫球蛋白抗体修饰的金纳米颗粒滴加到已制备好的具有免疫球蛋白抗体和免疫球蛋白的基底上，滴加量为40微升每平方厘米，置于室温2小时，超纯水冲洗，氮气吹干。
S4:将S3中制备的三明治夹心结构进行显微暗场生物检测：
将制备好的三明治夹心结构的样品置于显微镜载物台上，以卤素灯为光源，在暗场模块下，通过100倍物镜和CCD相机采集信号。
CCD相机采集的图像如图2所示，颗粒可视化程度差且分散性不好。通过ImageJ软件对图像中的高分子微球的成像数量进行统计分析，浓度分别为10-6、10-5、10-4、10-3、10-1毫克每毫升的人免疫球蛋白分别与微球成像数量基本呈正相关变化，微球成像数量分别为356、467、640、635、1336。线性分析所得数据图如图3所示，人的免疫球蛋白的检测限为10-6毫克每毫升，但线性关系相对较差，R2为0.89。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (1)
1.一种基于高分子微球的显微暗场生物检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1：制备待检生物标志物的特征性抗体修饰的基底；
S2：制备待检生物标志物的特征性抗体修饰的高分子微球；
S3：制备三明治夹心结构；
S4：将S3中制备的三明治夹心结构进行显微暗场生物检测。
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