CN117858906A - 与cldn18.2和cd3结合的双特异性结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含至少两个结合结构域的结合剂以及使用这些结合剂或编码其的核酸用于治疗癌症的方法，其中第一结合结构域对CLDN18.2具有特异性并且第二结合结构域对CD3具有特异性。

Description

与CLDN18.2和CD3结合的双特异性结合剂
技术领域
胃和食管(胃食管；GE)的癌症是医疗需求中最未得到满足的恶性肿瘤。胃癌是全世界癌症死亡的第三主要原因(Prz Gastroenterol.2019；14(1)：26-38)。近几十年来，食管癌的发病率提高，这与组织学类型和原发肿瘤位置的转变相符。在美国和西欧，食管腺癌现已比鳞状细胞癌更普遍，其中大多数肿瘤位于食管远端。尽管已建立的标准治疗的积极性与大量副作用相关，但GE癌的总体五年存活率为20％至25％。
大多数患者表现为局部晚期或转移性疾病并且必须进行一线化学治疗。治疗方案是基于铂和氟嘧啶衍生物的骨架，主要结合第三种化合物(例如紫杉烷或蒽环类)。尽管如此，5至7个月的中位无进展存活以及9至11个月的中位总存活是可预期的最佳状态。
针对这些癌症的多种较新一代的组合化学治疗方案的主要益处的缺乏刺激了对使用靶向剂的研究。最近，曲妥珠单抗已获批用于Her2/neu阳性胃食管癌。然而，由于仅约20％的患者表达靶标并且有资格接受这种治疗，因此医疗需求仍然很高。
紧密连接分子密蛋白18(CLDN18)是完整的跨膜蛋白(四次穿膜蛋白)，其具有四个跨越疏水区的膜和两个胞外环(被疏水区1和疏水区2包围的环1；被疏水区3和4包围的环2)。CLDN18以两种不同的剪接变体存在，其在小鼠和人中描述(Niimi，Mol.Cell.Biol.21：7380-90，2001)。剪接变体(Genbank登录号：剪接变体1(CLDN18.1)：NP_057453，NM_016369和剪接变体2(CLDN18.2)：NM_001002026，NP_001002026)具有约27.9/27.72kD的分子量。剪接变体CLDN18.1和CLDN18.2在包含第一跨膜(TM)区和环1的N端部分不同，而C端的主要蛋白质序列是相同的。
在正常组织中，除了胃之外没有可检测的CLDN18.2表达，其中CLDN18.2仅在短寿命分化的胃上皮细胞上表达。CLDN18.2在恶性转化过程中保持，并因此经常出现在人胃癌细胞表面。此外，这种泛肿瘤抗原(pan-tumoral antigen)在食管癌、胰腺癌和肺腺癌中以显著水平异位激活。CLDN18.2蛋白还定位于胃癌腺癌的***转移和远处转移，尤其是进入卵巢中的远处转移(所谓的克鲁肯伯格瘤(Krukenberg tumor))。
密蛋白(例如CLDN18.2)在癌细胞和正常细胞之间的差异表达、它们的膜定位和它们在绝大多数毒性相关的正常组织中的缺失使得这些分子成为用于癌症免疫治疗的有吸引力的靶标并且在癌症治疗中使用基于抗体的治疗剂以靶向CLDN18.2有望提供高水平的治疗特异性。
Ganymed Pharmaceuticals AG已开发出针对CLDN18.2的嵌合IgG1抗体IMAB362(Zolbetuximab(先前被称为Claudiximab))。IMAB362以高亲和力和特异性识别CLDN18.2的第一胞外结构域(ECD1)。IMAB362不与任何其他密蛋白家族成员(包括密蛋白18的密切相关的剪接变体1(CLDN18.1))结合。IMAB362显示出精确的肿瘤细胞特异性，并结合了两种独立的高度强效的作用机制。在靶结合之后，IMAB362主要通过ADCC和CDC介导细胞杀伤。因此，IMAB362在体外和体内有效裂解CLDN18.2阳性细胞，包括人胃癌细胞系。IMAB362的抗肿瘤效力在携带用CLDN18.2阳性癌细胞系接种的异种移植肿瘤的小鼠中得到证实。
IgG1抗体通常通过Fc结构域与在多种免疫细胞(包括自然杀伤细胞，其是ADCC的主要因素)上表达的Fcγ受体(FcγR)的相互作用来参与细胞免疫***。然而，触发ADCC的IgG1单克隆抗体(mAb)面临数个限制，包括低亲和力Fc受体变体在群体中的广泛分布(高至80％)以及降低mAb效力的体内IgG1修饰(Chames et al.，(2009)Br J Pharmacol，157(2)：220-233)。治疗性抗体还必须与患者IgG竞争，导致体内所必需的mAb的高剂量。此外，治疗性抗体可与FcγRIIb(由B细胞、巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞表达的抑制性FcγR)相互作用，导致降低其效力的负信号传导。
本发明的一个目的是提供用于癌症疾病治疗的新的药剂和方法。
构成本发明的基础的问题的解决方案基于产生结合剂的概念，所述结合剂包含对CLDN18.2(即癌细胞)具有特异性的至少一个结合结构域。结合剂还包含对T细胞特异性抗原CD3具有特异性的结合结构域，其允许与T细胞结合并将T细胞拉入到复合体中，因此使其能够靶向T细胞对癌细胞的细胞毒性作用。该复合体的形成可独自诱导或与辅助细胞组合诱导细胞毒性T细胞中的信号传导，这导致细胞毒性介质的释放。
本发明人首次报道了包含靶向CLDN18.2的Fab形式的至少一个结合结构域和靶向T细胞特异性抗原(例如CD3)的scFv形式的另一个结合结构域的结合剂可诱导强效的T细胞介导的裂解并且在***疾病中有效。
发明内容
本发明一般性地上提供了与CLDN18.2结合的结合剂，特别是与CLDN18.2和CD3结合的双特异性结合剂。
本发明提供了结合剂，其包含对CLDN18.2具有特异性的结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域，其中所述结合剂包含至少三条多肽链，其中第一多肽链包含来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的重链的可变区(VH)(VH(CLDN18.2))，第二多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的VH的可变区(VH(CD3))和来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链的可变区(VL)(VL(CD3))，以及第三多肽链包含来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的VL(VL(CLDN18.2))。
在一个实施方案中，本发明的结合剂是双特异性三聚体结合剂。
在一个实施方案中，第一多肽链包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的重链的恒定区1(CH1)。
在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的重链的恒定区2(CH2)和来源于免疫球蛋白或其功能性变体的重链的恒定区3(CH3)。
在一个实施方案中，第三多肽链包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的轻链的恒定区(CL)。
在一个实施方案中，第一多肽链上的VH以及CH1、CH2和CH3从N端至C端以VH(CLDN18.2)-CH1-CH2-CH3的顺序排列。
在一个实施方案中，第二多肽链上的VH、VL以及CH2和CH3从N端至C端以VH(CD3)-VL(CD3)-CH2-CH3或VL(CD3)-VH(CD3)-CH2-CH3的顺序排列。
在一个实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用并且与第三多肽链相互作用。在一个实施方案中，VH(CLDN18.2)与VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，并且VH(CD3)与VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域。
在一个实施方案中，第一多肽链上的CH2与第二多肽链上的CH2相互作用，和/或第一多肽链上的CH3与第二多肽链上的CH3相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链上的CH1与第三多肽链上的CL相互作用。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含对CLDN18.2具有特异性的另外的结合结构域，其中第二多肽链还包含VH(CLDN18.2)，并且其中所述结合剂包含与第三多肽链相同的第四多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合剂是双特异性四聚体结合剂。
在一个实施方案中，第二多肽链还包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的CH1。
在一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG1，优选人IgG1。在一个实施方案中，在本文中所述的结合剂中，VH(CLDN18.2)和/或VL(CLDN18.2)来源于IgG1，VH(CD3)和/或VL(CD3)来源于IgG1，和/或者CH1、CH2、CH3和/或CL来源于IgG1，其中IgG1优选为人IgG1。
在一个实施方案中，第二多肽链上的VH、VL以及CH1、CH2和CH3从N端至C端以VH(CLDN18.2)-CH1-VH(CD3)-VL(CD3)-CH2-CH3或VH(CLDN18.2)-CH1-VL(CD3)-VH(CD3)-CH2-CH3的顺序排列。
在一个实施方案中，第二多肽链与第四多肽链相互作用。
在一个实施方案中，第二多肽链上的VH(CLDN18.2)与第四多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用，以形成对CLDN18.2具有特异性的另外的结合结构域。
在一个实施方案中，第二多肽链上的CH1与第四多肽链上的CL相互作用。
在一个实施方案中，VH(CD3)包含选自SEQ ID NO：54、58和61的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，VH(CD3)包含：
(i)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列RIRSKANNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：50)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO：45)或其功能性变体的CDR3，
(ii)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：44)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列HGNFGDEYVSWFAY(SEQ ID NO：51)或其功能性变体的CDR3，或者
(iii)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：44)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO：45)或其功能性变体的CDR3。
在一个实施方案中，VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，VL(CD3)包含：含有氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：46)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：47)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：48)或其功能性变体的CDR3。
在一个实施方案中，VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，VH(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列SYWIN(SEQ ID NO：32)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列NIYPSDSYTNYNQKFQG(SEQ ID NO：33)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列SWRGNSFDY(SEQ ID NO：34)或其功能性变体的CDR3。
在一个实施方案中，VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，VL(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQID NO：35)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：36)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列QNDYSYPFT(SEQ ID NO：37)或其功能性变体的CDR3。
在一个实施方案中，
(i)VH(CD3)包含SEQ ID NO：58的CDR1、CDR2和CDR3，VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3，VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3，以及VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)VH(CD3)包含SEQ ID NO：61的CDR1、CDR2和CDR3，VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3，VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3，以及VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3，或
(iii)VH(CD3)包含SEQ ID NO：54的CDR1、CDR2和CDR3，VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3，VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3，以及VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，VH(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列或其功能性变体，VL(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列或其功能性变体，VH(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，和/或者VL(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，VH(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列或其功能性变体，VL(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列或其功能性变体，VH(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，和/或者VL(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，VH(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：54表示的氨基酸序列或其功能性变体，VL(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列或其功能性变体，VH(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，和/或者VL(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，在第一多肽链上，CH1通过肽接头与CH2连接。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：27)或其功能性变体。
在一个实施方案中，VH(CD3)或VL(CD3)通过肽接头与CH2连接。在一个实施方案中，VH(CD3)或VL(CD3)通过肽接头与CH1连接。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)2(SEQ ID NO：26)或其功能性变体。在一个实施方案中，连接VH(CD3)或VL(CD3)与CH2的肽接头包含氨基酸序列KTHTCPPCP(SEQ ID NO：21)或其功能性变体。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(G4S)2KTHTCPPCP(SEQ ID NO：23)或其功能性变体。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：22)或其功能性变体。
在一个实施方案中，VH(CD3)与VL(CD3)通过肽接头相互连接。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(GKPGS)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6。在一个实施方案中，肽接头包含氨基酸序列(GKPGS)4(SEQ ID NO：11)或其功能性变体。
在某些实施方案中，本发明结合剂的CH1、CH2和/或CH3结构域在对应于根据EU编号的人IgG1位置的位置中包含一个或更多个氨基酸修饰，特别是替换和/或缺失。在一个实施方案中，第一多肽链和/或第二多肽链上的CH1包含含有根据EU编号的第208位处的天冬氨酸残基的氨基酸序列。在一个实施方案中，第一多肽链上的CH1包含含有根据EU编号的第208位处的天冬氨酸残基的氨基酸序列，并且第二多肽链上的CH1包含含有根据EU编号的第208位处的天冬酰胺残基的氨基酸序列。
此外，在某些实施方案中，本发明的结合剂基本上不(例如不可检测地)与人FcγRI、IIa、IIb和/或IIIa结合。在一个实施方案中，第一多肽链和/或第二多肽链上的CH2包含含有以下中的一个或更多个的氨基酸序列：根据EU编号的第233位处的脯氨酸残基、第234位处的缬氨酸残基、第235位处的丙氨酸残基、第236位处的缺失、第267位处的赖氨酸残基和第295位处的谷氨酸残基。在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链上的CH2包含含有以下的氨基酸序列：根据EU编号的第233位处的脯氨酸残基、第234位处的缬氨酸残基、第235位处的丙氨酸残基、第236位处的缺失和第267位处的赖氨酸残基，并且其中第一多肽链上的CH2还包含根据EU编号的第295位处的谷氨酸残基，以及第二多肽链上的CH2还包含根据EU编号的第295位处谷氨酰胺残基。
在一个实施方案中，第一多肽链和/或第二多肽链上的CH3包含含有以下中的一个或更多个的氨基酸序列：根据EU编号的第357位处的谷氨酰胺残基、第364位处的赖氨酸残基、第368位处的天冬氨酸残基、第370位处的丝氨酸残基、第384位处的天冬氨酸残基、第418位处的谷氨酸残基和第421位处的天冬氨酸残基。在一个实施方案中，第一多肽链上的CH3包含含有以下的氨基酸序列：根据EU编号的第357位处的谷氨酸残基、第364位处的丝氨酸残基、第368位处的天冬氨酸残基、第370位处的丝氨酸残基、第384位处的天冬氨酸残基，第418位处的谷氨酸残基和第421位处的天冬氨酸残基，并且第二多肽链上的CH3包含含有以下的氨基酸序列：根据EU编号的第357位处的谷氨酰胺残基、第364位处的赖氨酸残基、第368位处的亮氨酸残基、第370位处的赖氨酸残基、第384位处的天冬酰胺残基、第418位处的谷氨酰胺残基和第421位处的天冬酰胺残基。
在一个实施方案中，第一多肽链包含由SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个实施方案中，第二多肽链包含由SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个实施方案中，第二多肽链包含由SEQ ID NO：29表示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个实施方案中，第三多肽链包含由SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个实施方案中，第二多肽链包含以下或由以下组成：选自SEQ ID NO：74、75、76和77的氨基酸序列或其功能性变体。在一个实施方案中，第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
优选地，在一个实施方案中，(i)第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ IDNO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
优选地，在一个实施方案中，(i)第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ IDNO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：74表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
优选地，在一个实施方案中，(i)第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ IDNO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：76表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
优选地，在一个实施方案中，(i)第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ IDNO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
本发明还提供了包含对CLDN18.2具有特异性的结合结构域的结合剂，所述结合结构域包含来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区(VH)(VH(CLDN18.2))和来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区(VL)(VL(CLDN18.2))，其中VH(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列SYWIN(SEQ ID NO：32)或其功能性变体的CDR1；含有氨基酸序列NIYPSDSYTNYNQKFQG(SEQ ID NO：33)或其功能性变体的CDR2，以及含有氨基酸序列SWRGNSFDY(SEQ ID NO：34)或其功能性变体的CDR3，并且VL(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：35)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：36)或其功能性变体的CDR2，以及含有氨基酸序列QNDYSYPFT(SEQ ID NO：37)或其功能性变体的CDR3。在一个实施方案中，结合剂还包含对CD3具有特异性的结合结构域。在一个实施方案中，对CD3具有特异性的结合结构域包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的VH(VH(CD3))和来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的VL(VL(CD3))，其中VH(CD3)包含选自SEQ ID NO：54、58和61的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，氨基酸序列NIYPSDSYTNYNQKFQG(SEQ ID NO：33)的功能性变体包含氨基酸残基QG或保留氨基酸残基QG。
在一个实施方案中，结合剂是全长抗体或抗体片段的形式。在一个实施方案中，对CLDN18.2具有特异性的结合结构域是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段的形式。在一个实施方案中，对CD3具有特异性的结合结构域是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段的形式。
在一个实施方案中，结合剂是双特异性分子，例如双特异性抗体。在一个实施方案中，结合剂是双特异性单链抗体。在一个实施方案中，结合剂能够一价或二价地与CLDN18.2结合。在一个实施方案中，结合剂包含对CLDN18.2具有特异性的两个结合结构域。在一个实施方案中，对CLDN18.2具有特异性的结合结构域是Fab片段的形式并且对CD3具有特异性的结合结构域是scFv片段的形式。在一个实施方案中，VH(CLDN18.2)通过肽接头与VL(CLDN18.2)连接，和/或VH(CD3)通过肽接头(例如选自SEQ ID NO：2至20的肽接头)与VL(CD3)连接。
本发明还提供了结合剂，其包含对CLDN18.2具有特异性的两个结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域，其中所述结合剂包含至少四条多肽链，其中第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：74表示的氨基酸序列或其功能性变体，第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体，并且第四多肽链与第三多肽链相同。在一个实施方案中，结合剂的多肽链和/或结合剂多肽链上的结构域如本文中所述相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链与第二多肽链以及与第三多肽链相互作用，以及第二多肽链与第四多肽链相互作用。
本发明还提供了包含对CLDN18.2具有特异性的结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂，其中所述结合剂包含至少三条多肽链，其中第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列或其功能性变体，并且第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个实施方案中，结合剂的多肽链和/或结合剂多肽链上的结构域如本文中所述相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用和并且与第三多肽链相互作用。
本发明还提供了结合剂，其包含对CLDN18.2具有特异性的两个结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域，其中所述结合剂包含至少四条多肽链，其中第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：76表示的氨基酸序列或其功能性变体，第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体，并且第四多肽链与第三多肽链相同。在一个实施方案中，结合剂的多肽链和/或结合剂多肽链上的结构域如本文中所述相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用并且与第三多肽链相互作用，以及第二多肽链与第四多肽链相互作用。
本发明还提供了结合剂，其包含对CLDN18.2具有特异性的两个结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域，其中所述结合剂包含至少四条多肽链，其中第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列或其功能性变体，第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体，并且第四多肽链与第三多肽链相同。在一个实施方案中，结合剂的多肽链和/或结合剂多肽链上的结构域如本文中所述相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用并且与第三多肽链相互作用，以及第二多肽链与第四多肽链相互作用。
在一个实施方案中，VH(CLDN18.2)、VL(CLDN18.2)、VH(CD3)和/或VL(CD3)是人源化的。
在一个实施方案中，CD3在T细胞的表面上表达。在一个实施方案中，本发明的结合剂与CD3的ε链结合。在一个实施方案中，结合剂与T细胞上CD3的结合导致T细胞的增殖和/或活化。在一个实施方案中，T细胞的增殖和/或活化包括CD4和/或CD8 T细胞(优选CD107a+T细胞)的增殖和/或活化。在一个实施方案中，所述增殖和/或活化的T细胞能够脱颗粒。在一个实施方案中，所述活化的T细胞释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶，并启动癌细胞的细胞溶解和/或凋亡。
在一个实施方案中，CLDN18.2在癌细胞中表达。在一个实施方案中，CLDN18.2在癌细胞的表面上表达。在一个实施方案中，结合剂与CLDN18.2的胞外部分结合。在一个实施方案中，结合剂诱导针对表达CLDN18.2的癌细胞的T细胞介导的细胞毒性。
在一个实施方案中，癌细胞来自选自以下的癌症：胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
在一些实施方案中，本发明的结合剂或者本发明的结合剂的一条或更多条多肽链包含或不包含分泌信号(例如N端分泌信号，特别是免疫球蛋白例如IgG分泌信号(例如序列MGWSCIILFLVATATGVHS))，和/或者包含或不包含标签，特别是C端标签，例如His标签，特别是序列Gly-Gly-Ser-(His)6或(His)6，或者Strep标签。
在一些实施方案中，本发明的结合剂包含一种或更多种翻译后修饰。本发明还提供了一种结合剂，其来源于本文中所述结合剂的一种或更多种翻译后修饰。在一个实施方案中，一种或更多种翻译后修饰选自一种或更多种VH(CLDN18.2)N端的焦谷氨酰化、VH(CD3)N端的焦谷氨酰化、第一多肽链C端赖氨酸的缺失和第二多肽链C端赖氨酸的缺失。
本发明还提供了编码本发明结合剂的多肽链的核酸。本发明还提供了编码本发明结合剂的核酸。本发明还提供了共同编码本发明结合剂的核酸组。
本发明还提供了包含本发明的核酸或核酸组的载体。本发明还提供了包含本发明核酸的载体组。在一个实施方案中，核酸组中的每个核酸均包含在载体组的一个载体中。在一个实施方案中，载体或载体组能够表达结合剂。
在一个实施方案中，核酸与任意数目的调节元件(启动子、复制起点、选择性标志物、核糖体结合位点、诱导物等)可操作地连接。载体可以是表达载体，并且也可以是染色体外载体或整合载体。在一些实施方案中，编码本发明结合剂的多肽链的核酸各自包含在单个表达载体中。核酸可以在不同或相同的启动子控制下。在这样的实施方案中，可以使用不同的载体比例来驱动本发明的结合剂的形成。
本发明还提供了宿主细胞，其包含所述核酸、核酸组、载体或载体组。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，优选选自CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞等。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞或昆虫细胞。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的结合剂、本发明的核酸、本发明的核酸组、本发明的载体、本发明的载体组或本发明的宿主细胞。在一个实施方案中，药物组合物还包含可药用载体和/或赋形剂。
本发明还提供了本发明的结合剂、本发明的核酸、本发明的核酸组、本发明的载体、本发明的载体组、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗。
本发明还提供了本发明的结合剂、本发明的核酸、本发明的核酸组、本发明的载体、本发明的载体组、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗或预防癌症。
本发明还提供了治疗或预防癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用本发明的结合剂、本发明的核酸、本发明的核酸组、本发明的载体、本发明的载体组、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物。在一个实施方案中，癌症涉及表达CLDN18.2的癌细胞。
本发明还提供了本发明的结合剂、本发明的核酸、本发明的核酸组、本发明的载体、本发明的载体组、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物用于制备药物的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗或预防癌症。在一个实施方案中，癌症涉及表达CLDN18.2的癌细胞。
在一个实施方案中，所述癌症选自胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
本发明还提供了用于本文中所述治疗方法的本文中所述的结合剂、核酸、核酸组、载体、载体组、宿主细胞或药物组合物。在一个实施方案中，提供了治疗或预防疾病例如癌症的方法，其包括将本发明的结合剂、本发明的核酸、本发明的核酸组、本发明的载体、本发明的载体组、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物施用于患有疾病的对象(例如患有癌症的对象)。优选地，所述疾病涉及细胞，例如表达CLDN18.2的患病细胞。优选地，所述疾病是癌症，并且所述癌症涉及表达CLDN18.2的癌细胞。
根据本发明，CLDN18.2优选地具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽链不包含VL(CLDN18.2)。在一些实施例中，第三多肽链不包含VH(CLDN18.2)。
在一些实施方案中，对CLDN18.2具有特异性的结合剂的结合结构域是Fab片段的形式。在一些实施方案中，对CD3具有特异性的本发明结合剂的结合结构域是scFv部分的形式。
在一些实施方案中，本发明的结合剂不与CLDN18.1结合。优选地，结合剂不与人、小鼠或食蟹猴的CLDN18.1结合。在一些实施方案中，本发明的结合剂不与CLDN9(例如人CLDN9)结合。
在一些实施方案中，本发明的结合剂与一种以上物种的CLDN18.2(例如人、小鼠和食蟹猴的CLDN18.2)结合。
在一些实施方案中，用本文中所述的结合剂治疗患者导致所述患者延长的存活。在一些实施方案中，本文中所述的结合剂表现出一种或更多种免疫效应物功能。在一些实施方案中，所述一种或更多种免疫效应物功能选自补体依赖性细胞毒性(complementdependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependentcell mediated cytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，ADCP)、凋亡诱导和增殖抑制。本文中所述的结合剂优选地能够重定向T细胞以攻击癌细胞，并因此通过重定向T细胞细胞毒性(redirected T cell cytotoxicity，RTCC)来发挥作用。在一些实施方案中，结合剂不能或基本上不能诱导ADCC。在一些实施方案中，结合剂不能或基本上不能诱导CDC。在一些实施方案中，结合剂不能或基本上不能诱导ADCP。在一些实施方案中，结合剂能够降低，优选地显著降低对象(例如患者)的肿瘤的生长和/或体积。
本发明还提供了产生本发明的结合剂的方法。在一个实施方案中，产生本发明的结合剂的方法包括用本发明的核酸、本发明的核酸组、本发明的载体或本发明的载体组转染宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞表达编码本发明的结合剂的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞共表达编码本发明结合剂的第一多肽链的核酸和编码本发明结合剂的第二多肽链的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞还表达编码本发明结合剂的第三多肽链的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞还表达编码本发明结合剂的第四多肽链的核酸。在一个实施方案中，所述核酸包含在载体或载体组中。在一个实施方案中，宿主细胞表达本发明结合剂的所有多肽链。在一个实施方案中，在转染之后，宿主细胞优选地当在用于产生结合剂的合适条件(例如本文中所述或本领域已知的条件)下生长时产生本发明的结合剂。在一个实施方案中，本发明的结合剂可以从宿主细胞获得。
因此，在一个实施方案中，产生本发明结合剂的方法包括以下步骤：用编码本发明结合剂的第一多肽链的核酸、编码本发明结合剂的第二多肽链的核酸、编码本发明结合剂的第三多肽链的核酸，和任选地编码本发明结合剂的第四多肽链的核酸感染宿主细胞，在宿主细胞中表达所述核酸并获得本发明的结合剂。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，优选地选自CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、HEK293细胞、HEK293 T细胞等。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞或昆虫细胞。在一个实施方案中，结合剂在体外产生。在一个实施方案中，结合剂在体内(例如在待治疗的对象(例如患有疾病(特别是与表达CLDN18.2的细胞相关的疾病，例如癌症)的对象))中产生。在一个实施方案中，本发明结合剂的第一多肽链和/或第二多肽链在例如一种宿主细胞中产生，并且第三多肽链在例如另一种宿主细胞中产生。在一个实施方案中，本发明结合剂的所有多肽链均在同一宿主细胞中产生。
在一个实施方案中，本发明结合剂的多肽链相互连接，例如共价连接。在一个实施方案中，结合剂的多肽链作为包含结合剂所有多肽链的一种多肽而产生。在一个实施方案中，结合剂的至少两条多肽链连接在一起，并作为一条多肽产生。在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链连接在一起并作为一种多肽产生，以及第三多肽链作为单独的多肽产生。在一个实施方案中，第三和第一多肽链连接在一起并作为一种多肽产生，以及第二多肽链作为单独的多肽产生。在一个实施方案中，第二和第三多肽链连接在一起并作为一种多肽产生，以及第一多肽链作为单独的多肽产生，或者与第四多肽链连接并且二者作为一种多肽一起产生。优选地，本发明的结合剂的多肽链是单独产生的，即例如在相同或不同的细胞中作为单独的多肽产生，并且在产生时或产生后例如在细胞内或不在细胞内相互作用以形成结合剂。优选地，多肽链作为单独的多肽产生，即第一多肽链作为一种多肽产生，第二多肽链作为一种多肽产生，第三多肽链作为一种多肽产生，以及任选地第四多肽链作为一种多肽产生，并且本发明的多肽链相互作用以形成本发明的结合剂。在一个实施方案中，施用本发明的结合剂包括施用在载体中配制的第一、第二、第三和任选的第四多肽链，所述载体例如脂质纳米粒、脂质体、脂质复合物等。在一个实施方案中，一起施用了例如配制在相同或不同载体中的第一多肽链和第二多肽链，并且施用了例如单独配制(例如在载体中)的第三多肽链。在一个实施方案中，还施用了例如单独配制(例如在载体中)的第四多肽链。在一个实施方案中，一起施用了例如配制在相同或不同的载体中的第三多肽链和第四多肽链。在一个实施方案中，本发明结合剂的所有肽链在同一载体中一起配制。在一个实施方案中，本发明结合剂的每条多肽链在单独的载体中配制，其中所述载体可以是相同的或不同的。
从下面的详细描述和所附权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图说明
图1描绘了A)“Fab-scFv”形式，该形式包含与异二聚体Fc的一侧重组融合的VH(本文中所述的第一多肽链)、与异二聚体Fc的另一侧重组融合的单链Fv(“scFv”)(本文中所述的第二多肽链)和轻链(LC；本文中所述的第三多肽链)，其分开转染，使得与第一多肽链的VH形成Fab结构域；以及B)“Fab2-scFv”形式，该形式包含与异二聚体Fc的一侧重组融合的VH(本文中所述的第一多肽链)，与和异二聚体Fc的另一侧融合的scFv重组融合的VH(本文中所述的第二多肽链)，和LC(本文中所述的第三多肽链和第四多肽链)，其分开转染，使得用第一多肽链的VH和第二多肽链的另外的VH形成Fab结构域。
图2描绘了具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体与A)KP-4细胞和B)NUGC-4细胞的结合。对照包括抗RSV×抗CD3 bsAb、仅细胞和仅二抗。数据显示，抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb剂量依赖性地与NUGC-4细胞结合，在所有测试浓度下几乎不与KP-4细胞结合。值得注意的是，与“Fab-scFv”形式的bsAb(即XENP24645和XENP24646)相比，“Fab2-scFv”形式的bsAb(即XENP24647、XENP24648和XENP24649)与NUGC-4细胞的结合更有效得多，这可能是由于“Fab2-scFv”形式传递了另外的亲合力。
图3描绘了具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb对A)KP-4细胞和B)NUGC-4细胞的RTCC的诱导。数据示出了原型抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb剂量依赖性地在NUGC-4上诱导RTCC，而在KP-4细胞上未诱导RTCC。
图4描绘了如通过流式细胞术确定的A)NUGC-4细胞和B)SNU-601细胞上的表达水平。数据表明SNU-601比NUGC-4表达更多的CLDN18.2。
图5描绘了具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体与A)NUGC-4细胞和B)SNU-601细胞的结合。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅细胞和仅二抗。数据示出了每种双特异性抗体剂量依赖性地与NUGC-4和SNU-601二者结合，其中SNU-601细胞比NUGC-4的最大结合更高，这与每种细胞系上各自的CLDN18.2表达水平一致。
图6描绘了在用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育24小时之后，A)NUGC-4和B)SNU-601细胞上RTCC的诱导(如通过活靶细胞的减少所示)。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了双特异性抗体增强了对靶细胞(即NUGC-4和SNU-601细胞)的杀伤，如通过活细胞的减少所示。
图7描绘了在用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育24小时之后，A)NUGC-4和B)SNU-601细胞上RTCC的诱导(如死靶细胞的增加所示)。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了双特异性抗体增强了对靶细胞(即NUGC-4和SNU-601细胞)的杀伤，如通过死亡/垂死细胞的增加所示。
图8描绘了在用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育48小时之后，A)NUGC-4和B)SNU-601细胞上RTCC的诱导(如通过活靶细胞的减少所示)。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了双特异性抗体增强了对靶细胞(即NUGC-4和SNU-601细胞)的杀伤，如通过活细胞的减少所示。
图9描绘了在用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育48小时之后，A)NUGC-4和B)SNU-601细胞上RTCC的诱导(如通过死靶细胞的增加所示)。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了双特异性抗体增强了对靶细胞(即NUGC-4和SNU-601细胞)的杀伤，如通过死亡/垂死细胞的增加所示。
图10描绘了在NUGC-4细胞用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育48小时之后，表达A)CD69、B)CD25和C)CD107a的CD4+T细胞的百分比。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了与RTCC一致的趋势，即，例如，更高亲和力的CD3结合和/或二价CLDN18.2结合增强了T细胞活化和脱颗粒。
图11描绘了在NUGC-4细胞用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育48小时之后，表达A)CD69、B)CD25和C)CD107a的CD8+T细胞的百分比。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了与RTCC一致的趋势，即，例如，更高亲和力的CD3结合和/或二价CLDN18.2结合增强了T细胞活化和脱颗粒。
图12描绘了在SNU-601细胞用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育48小时之后，表达A)CD69、B)CD25和C)CD107a的CD4+T细胞的百分比。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了与RTCC一致的趋势，即，例如，更高亲和力的CD3结合和/或二价CLDN18.2结合增强了T细胞活化和脱颗粒。
图13描绘了在SNU-601细胞用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育48小时之后，表达A)CD69、B)CD25和C)CD107a的CD8+T细胞的百分比。对照包括抗RSV×抗CD3双特异性抗体、仅靶细胞以及仅靶细胞与效应细胞。数据示出了与RTCC一致的趋势，即，例如，更高亲和力的CD3结合和/或二价CLDN18.2结合增强了T细胞活化和脱颗粒。
图14描绘了如通过流式细胞术确定的A)SNU-601细胞和B)SNU-601(2E4)细胞(富集CLDN18.2表达群体)的表达水平。数据示出了SNU-601(2E4)包含显著更高的CLDN18.2+细胞群体。本节中的实验使用SNU-601(2E4)细胞进行。
图15描绘了具有人源化CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体与SNU-601(2E4)细胞的结合。所使用的对照是XENP24644(H0L0CLDN18.2；二价mAb)、XENP29470(HIL1CLDN18.2；二价mAb)、XENP29471(H2L1CLDN18.2；二价mAb)、XENP24645(Fab-scFv)、XENP24647(Fab2-scFv)、仅细胞和仅二抗。数据示出了具有人源化CLDN18.2 ABD的双特异性抗体与具有鼠CLDN18.2 ABD的双特异性抗体对SNU-601(2E4)细胞具有相似的结合，这表明人源化保留了抗体的结合效力。值得注意的是，“Fab2-scFv”形式的双特异性抗体显示出与二价抗CLDN18.2mAb相似的结合。另外，数据示出了基于H1L1人源化变体的双特异性抗体(例如，XENP29472、XENP29474、XENP29476和XENP29478)比基于H2L1人源化变体的双特异性抗体(例如XENP29473、XENP29475、XENP29477和XENP29479)更好地保留了结合。
图16描绘了SNU-601(2E4)细胞上RTCC的诱导，如通过在经CFSE标记的SNU-601(2E4)用针对SNU-601(2E4)细胞的具有人源化CLDN18.2ABD的CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体和人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为10∶1)孵育24小时之后A)CFSE+SNU-601(2E4)数目的减少所示，B)用Zombie Aqua染色的CFSE+SNU-601(2E4)细胞的百分比所示，以及C)CFSE+SNU-601(2E4)细胞上的Zombie Aqua MFI所示。使用的对照是XENP24645(Fab-scFv)、XENP24647(Fab2-scFv)、仅细胞和仅二抗。与结合数据一致，人源化保留了具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb对RTCC的诱导。
图17描绘了在SNU-601(2E4)用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为10∶1)和具有人源化CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育24小时之后，如通过A)CD4+T细胞上的CD69MFI，和B)表达CD69的CD4+T细胞的百分比所示的活化CD4+T细胞所示。使用的对照是XENP24645(Fab-scFv-Fc)、XENP24647(Fab2-scFv)、仅细胞和仅二抗。与结合数据一致，人源化保留了具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb对T细胞的活化。
图18描绘了CD4+T细胞的脱颗粒，如通过在SNU-601(2E4)用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为10∶1)和具有人源化CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育24小时之后，A)CD4+T细胞上的CD107a MFI，和B)表达CD107a的CD4+T细胞的百分比所示。使用的对照是XENP24645(Fab-scFv-Fc)、XENP24647(Fab2-scFv)、仅细胞和仅二抗。
图19描绘了CD8+T细胞的活化，如通过在SNU-601(2E4)用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为10∶1)和具有人源化CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育24小时之后A)CD8+T细胞上的CD69MFI，和B)表达CD69的CD8+T细胞的百分比所示。使用的对照是XENP24645(Fab-scFv-Fc)、XENP24647(Fab2-scFv)、仅细胞和仅二抗。与结合数据一致，人源化保留了具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb对T细胞的活化。
图20描绘了CD8+T细胞的脱颗粒，如通过在SNU-601(2E4)用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为10∶1)和具有人源化CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育24小时之后A)CD8+T细胞上的CD107a MFI，和B)表达CD107a的CD8+T细胞的百分比所示。使用的对照是XENP24645(Fab-scFv-Fc)、XENP24647(Fab2-scFv)、仅细胞和仅二抗。
图21描绘了在SNU-601(2E4)用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为10∶1)和具有人源化CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体孵育24小时之后的T细胞分泌的A)IFNγ和B)TNFα。使用的对照是XENP24645(Fab-scFv-Fc)和XENP24647(Fab2-scFv)。与结合数据一致，人源化保留了具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb对细胞因子分泌的诱导。
图22描绘了具有鼠和人源化(变体H1L1)CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体与经瞬时转染以表达A)人、B)食蟹猴和C)小鼠CLDN18.2的HEK293细胞的结合。数据示出了抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体剂量依赖性地结合用人、食蟹猴和小鼠CLDN18.2中的每种转染的细胞。值得注意的是，与“Fab-scFv”形式的双特异性抗体(即XENP24645和XENP29472)相比，“Fab2-scFv”形式的双特异性抗体(即XENP24647和XENP29476)结合经CLDN18.2转染的细胞更有效得多，并且具有与二价mAb形式(即XENP24644)类似的效力。
图23描绘了具有鼠和人源化(变体H1L1)CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体与HEK293细胞结合的EC50，所述HEK293细胞经瞬时转染以表达人、食蟹猴和小鼠CLDN18.2。
图24描绘了具有鼠和人源化(变体H1L1)CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体与HEK293细胞的结合，所述HEK293细胞经瞬时转染以表达A)人CLDN18.1，B)食蟹猴CLDN18.1，C)小鼠CLDN18.1，和D)人CLDN9。数据示出了抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体未显示出脱靶结合。
图25描绘了使用来自A)第一供体和B)第二供体的PBMC，通过双特异性抗体和比较抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体(AMG 910)对NUGC-4细胞上RTCC的诱导。数据示出了与比较双特异性抗体相比，XENP32461诱导的RTCC具有相似的效力，以及XENP31726诱导的RTCC具有增强的效力。
图26描绘了在BxPC3细胞(具有600k CLDN18.2结合位点)和效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)RTCC的诱导，B)CD4 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)，和C)CD8 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)。
图27描绘了在BxPC3细胞(具有600k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)IFNγ、B)TNFα和C)IL2分泌的诱导。
图28描绘了在GSU细胞(具有70k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)RTCC的诱导，B)CD4 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)，和C)CD8 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)。
图29描绘了在GSU细胞(具有70k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)IFNγ、B)TNFα和C)IL2分泌的诱导。
图30描绘了在NUGC4细胞(具有50k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)RTCC的诱导，B)CD4 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)，和C)CD8 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)。
图31描绘了NUGC4细胞(具有50k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)IFNγ、B)TNFα和C)IL2分泌的诱导。
图32描绘了在KatoIII细胞(具有30k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)RTCC的诱导，B)CD4 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)，和C)CD8 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)。
图33描绘了在KatoIII细胞(具有30k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以10∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)TNFα和B)IL2分泌的诱导。
图34描绘了在KatoIII细胞(具有30k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以3∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)RTCC的诱导，B)CD8 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)，和C)TNFα分泌的诱导。
图35描绘了在HGC27细胞(具有20k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以3∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)RTCC的诱导，B)CD4 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)，和C)CD8 T细胞活化的诱导(如通过表达CD107a的细胞的百分比所示)。
图36描绘了在HGC27细胞(具有20k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以3∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)IFNγ、B)TNFα和C)IL2分泌的诱导。
图37描绘了在KatoIII细胞(具有30k CLDN18.2结合位点)与效应细胞以1∶1的E∶T比率存在的情况下，抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体对A)RTCC的诱导和B)TNFα分泌的诱导。
图38描绘了用ASP2138(XENP31726)给药的NUGC-4 10cF7_5_3E10荷瘤人PBMC移植NOG小鼠中肿瘤体积的变化和体重的变化。将人PBMC以5×106个细胞静脉注射。在人PBMC注射之后一周，将NUGC-410cF7_5_3E10细胞以1×106个细胞于第-8天皮下接种到小鼠的胁腹部中。NOG小鼠在第0天和第7天接受每周一次的PBS或ASP2138腹膜内施用。将A)每组的肿瘤体积和B)每组的体重在每个时间点绘制为平均值±SEM(n＝10)。C)散点图表示第14天的单个肿瘤体积，并且平均值±SEM以短水平线和误差棒表示。对第14天的值进行统计分析。ns：不显著，**：p＜0.01，与PBS组的值相比(Dunnett多重比较检验)。
具体实施方式
尽管下面详细描述了本发明，但应理解本发明不限于本文中所描述的具体的方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
下面将描述本发明的要素。这些要素以具体实施方案列出，然而，应理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以形成另外的实施方案。多方面描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指明，否则本申请中的所有描述的要素的任何排列和组合应被视为通过本申请的说明书公开。
优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，and H.Eds.，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland，(1995)中所述定义。
除非另有指明，否则本发明的实践将使用在本领域文献中说明的生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Edition，J.Sambrook et al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文中另有要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式将被理解为意指包括所陈述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可被排除，即，主题在于包括所陈述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。然而，预期作为本公开内容的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在另一些成员的可能性，即，出于该实施方案的目的，“包含/包括”应理解为具有“由......组成”或“基本上由......组成”的含义。
除非本文中另外指明或者与上下文明显矛盾，否则描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。本文中数值范围的记载仅旨在作为单独地指落入该范围内之各独立值的速记方法。除非本文中另外指明，否则各单独的值均并入说明书中，如同其在本文中单独记载。除非本文中另外指明或者与上下文明显相矛盾，否则可以以任何合适的顺序进行本文中所描述的所有方法。除非另外要求，否则本文中提供的任意和全部实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而并不对本发明的范围进行限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为表示对实施本发明而言必要的任何非要求保护之要素。
术语“约”意指大约或接近，并且在本文中所列的数值或范围的情况下在一个实施方案中意指所记载或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％、或±3％。
在本说明书的整个文本中引用了若干文献。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、生产商说明书、用法指导等)均在此通过引用其整体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这样的公开内容
本发明涉及双特异性结合剂，其中所述结合剂通过单个抗原结合结构域来一价地结合其靶分子，或通过两个各自独立的与抗原结合的抗原结合结构域来二价地结合其靶分子。
本文中所述结合剂的第一靶分子是CLDN18.2。
密蛋白是紧密连接中最重要组分的一个蛋白质家族，在紧密连接中，密蛋白建立了控制上皮细胞之间的细胞间空隙中分子流动的细胞旁屏障。密蛋白是4次跨膜的跨膜蛋白，N端和C端均位于细胞质中。第一胞外环(称为EC1或ECL1)平均由53个氨基酸组成，而第二胞外环(称为EC2或ECL2)由约24个氨基酸组成。密蛋白家族的细胞表面蛋白质(例如CLDN18.2)在多种来源的肿瘤中表达，并且由于其选择性表达(在毒性相关的正常组织中不表达)和定位于质膜而特别适合作为与抗体介导的癌症免疫治疗相关的靶结构。
已经鉴定CLDN18.2在肿瘤组织中差异表达，其中表达CLDN18.2的唯一正常组织是胃。CLDN18.2在胃黏膜的分化的上皮细胞中的正常组织中选择性表达。CLDN18.2在多种来源的癌症中表达，例如胰腺癌、食管癌、胃癌、支气管癌、乳腺癌和ENT肿瘤。CLDN18.2是预防和/或治疗原发性肿瘤的有价值的靶标，所述肿瘤例如胃癌、食管癌、胃食管连接部的癌(cancer of the gastroesophageal junction，GEJ)、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌，及其转移，特别是胃癌转移，例如克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和***转移。术语“密蛋白18”或“CLDN18”涉及密蛋白18并包括任何变体，包括密蛋白18剪接变体1(密蛋白18.1(CLDN18.1))和密蛋白18剪接变体2(密蛋白18.2(CLDN18.2))。
术语“密蛋白18.2”或“CLDN18.2”优选涉及人CLDN18.2，并且特别涉及包含根据序列表的SEQ ID NO：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体、优选由其组成的蛋白质。CLDN18.2的第一胞外环优选包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的第27至81位氨基酸，更优选第29至78位氨基酸。CLDN18.2的第二胞外环优选包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的第140至180位或第144至167位氨基酸。所述第一和第二胞外环优选地形成CLDN18.2的胞外部分。
本文中所述的结合剂的第二靶分子是CD3(分化簇3)。CD3复合体表示作为多分子T细胞受体(T-cell receptor，TCR)复合体的一部分在成熟人T细胞、胸腺细胞和自然杀伤细胞亚群上表达的抗原。T细胞共受体是蛋白质复合体，并且由四条不同的链构成。在哺乳动物中，该复合体包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与称为T细胞受体(T-cellreceptor，TCR)的分子和ζ链缔合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ-链和CD3分子一起构成TCR复合体。
人CD3ε以GenBank登录号NM_000733表示。人CD3γ以GenBank登录号NM_000073表示。人CD3δ以GenBank登录号NM_000732表示。CD3负责TCR的信号转导。如Lin和Weiss，Journal of Cell Science 114，243-244(2001)所述，通过结合MHC呈递的特异性抗原表位激活TCR复合体导致Src家族激酶对基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM)的磷酸化，引发另外的激酶的募集，这导致T细胞活化，包括Ca2+释放。CD3例如通过固定化的抗CD3抗体而簇聚在T细胞上，导致T细胞活化，其类似于T细胞受体的接合，但与其克隆典型特异性无关。
如本文中所用，“CD3”包括人CD3并且表示作为多分子T细胞受体复合体的一部分在人T细胞上表达的抗原。关于CD3，本发明的结合剂优选识别CD3的ε链。在一些实施方案中，其识别对应于CD3ε的前27个N端氨基酸或该27个氨基酸区段(stretch)的功能性片段的表位。
根据本发明，术语“变体”特别地是指突变体、剪接变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其意义通常不清楚。全基因测序通常确定给定基因的许多等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应涵盖任何经翻译后修饰变体和构象变体。
根据本发明，术语“CLDN18.2阳性癌症”或类似术语意指涉及表达(优选在所述癌细胞的表面上)CLDN18.2之癌细胞的癌症。
“细胞表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括易于被蛋白质和其他分子结合的细胞外部。
如果CLDN18.2位于细胞的表面并且易于被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体结合，则CLDN18.2在所述细胞的表面上表达。
如果CD3位于细胞的表面并且易于被添加至细胞的CD3特异性抗体结合，则CD3在所述细胞的表面上表达。
在本发明的上下文中，术语“胞外部分”是指面对着细胞的胞外空间的分子(例如蛋白质)的一部分，并且优选例如通过位于细胞外的抗原结合分子(例如抗体)而可接近所述细胞的外部。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。
术语“部分”或“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续的元件。例如，结构(例如氨基酸序列或蛋白质)的一部分是指所述结构的连续元件。结构的份(portion)、部分(part)或片段优选包含所述结构的一个或更多个功能特性。例如，表位或肽的份、部分或片段优选与从其来源的表位、肽在免疫学上等同。氨基酸序列的一部分或片段优选包含所述蛋白质序列的至少4个，特别是至少6个、至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续的氨基酸的序列。
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框3’端之截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框5’-末端之截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。
本文中氨基酸序列的“变体”或类似表达意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(wild type，WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的经修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10个或1至约5个氨基酸修饰。
本文中关于氨基酸序列使用的“野生型”或“WT”或“天然的”意指在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸***变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体(confbrmation)、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别包括氨基酸序列的片段。
氨基酸***变体包含特定氨基酸序列中***单个或两个或更多个氨基酸。在具有***的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基***到氨基酸序列中的特定位点中，但是随机***并对所产生的产物进行合适的筛选也是可能的。
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或更多个氨基酸，例如除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。包含蛋白质N端和/或C端末端处的缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。
氨基酸替换变体的特征在于除去序列中的至少一个残基，并且在其位置***另一个残基。优选在氨基酸序列中同源蛋白质或肽之间非保守的位置处进行修饰和/或将氨基酸用具有类似特性的其他氨基酸替代。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即，替换带有类似电荷的或不带电荷的氨基酸。保守氨基酸改变涉及替换与其侧链相关的氨基酸家族之一。天然存在氨基酸一般分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起被归类为芳香族氨基酸。
在本发明的上下文中，保守替换可通过下表中反映的氨基酸类别内的替换来限定：
优选地，给定的氨基酸序列和所述给定的氨基酸序列之变体的氨基酸序列之间的相似性(优选同一性)程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。相似性或同一性的程度优选针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸(在一些实施方案中的连续氨基酸)给出。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可以用本领域已知的工具进行，优选使用最佳序列比对，例如使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS：：needle，Matrix：Blosum62，GapOpen 10.0，Gap Extend 0.5。
“序列相似性”表明相同的或表示保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同的核苷酸的百分比。
术语“相同％”、“同一性％”或类似术语旨在特别地是指待比较的序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计学上的，并且两个序列之间的差异可以是但不一定是随机分布在待比较序列的全长上。两个序列的比较通常在关于区段或“比较窗口”的最佳比对以确定相应序列的局部区域之后通过比较所述序列来进行。用于比较的最佳比对可人工进行，或者借助于Smith and Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法，借助于Neddleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法，借助于Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法，或借助于使用所述算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis.)来进行。在一些实施方案中，使用可在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(例如，可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq)上获得的BLASTN或BLASTP算法来确定两个序列的同一性百分比。在一些实施方案中，在NCBI网站上用于BLASTN算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)匹配/不匹配评分设置为1，-2；(v)空位成本(Gap Cost)设置为线性；以及(vi)针对正在使用的低复杂性区域的筛选程序(filiter)。在一些实施方案中，在NCBI网站上用于BLASTP算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)空位成本设置为存在11：延伸：1；以及(vi)条件组成评分矩阵调整。
百分比同一性通过确定待比较序列所对应的相同位置的数目，将该数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将该结果乘以100来获得。
在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对为参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则同一性的程度针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施方案中的连续核苷酸)给出。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考序列的全长给出。
根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，并且优选地至少95％，至少98％或至少99％同一性。
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组DNA操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、***或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作在例如Sambrooket al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可在已知肽合成技术(例如如通过固相合成和类似方法)的帮助下容易地制备。
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一种或更多种功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。关于包含功能性VH和VL变体的抗原结合结构域，一种特定的功能是保留所述结合结构域的结合。本文中使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或更多个氨基酸的氨基酸序列，并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种或全部功能，例如，形成对特定抗原具有特异性的结合结构域。例如，包含功能性VH和VL变体或功能性CDR变体序列的结合结构域与亲本分子相比具有相同或相似的结合特征。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不会显著地影响或改变分子或序列的特征。在不同的实施方案中，包含功能性片段或功能性变体的分子的特征(例如结合特征，例如结合结构域的结合强度)可降低但仍显著存在，例如结合特征(例如包含功能性变体的结合结构域的结合强度)可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。例如，与亲本分子相比，功能性变体可包含1、2、3、4、5或更多个氨基酸***、氨基酸添加、氨基酸替换和/或氨基酸缺失。然而，在另一些实施方案中，包含功能性变体或功能性片段的分子的特征，例如包含功能性片段或功能性变体的结合结构域的结合特征，与亲代分子相比可能得到增强。在一些实施方案中，“功能性变体”是“功能性片段”，例如，如上所述与亲本分子相比在N端和/或C端末端缩短但保留了亲本分子的一种或更多种或全部功能，并且特别是与亲本分子功能等同的氨基酸序列。
术语氨基酸序列的“功能性变体”包括所述氨基酸序列的“功能性”片段。
功能性变体的特征，例如结合特征，可通过已知的方法进行分析，例如，使用本文中所述的ELISA测定法来分析相互竞争的结合剂。
“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽，例如VH、VL、CH1、CH2或CH3)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽，例如VH、VL、CH1、CH2或CH3)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体，优选如本文中所述的其功能性变体，包括功能性片段。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的氨基酸序列可被改变，使得它们在序列上(包括氨基酸***、氨基酸缺失、氨基酸添加和/或氨基酸替换)与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留或基本保留天然序列的期望活性。例如，本发明的结合剂的肽链上的VH、VL、CH1、CH2和/或CH3结构域的氨基酸序列来源于免疫球蛋白的VH、VL、CH1、CH2和/或CH3结构域的氨基酸序列，但是与它们所来源的结构域相比可以改变。例如，根据本发明，来源于免疫球蛋白的VH或VL包含可与其来源的相应VH或VL的氨基酸序列相同，或者与相应亲本VH或VL的序列相比，可在一个或更多个氨基酸位置上不同的氨基酸序列。例如，本发明结合剂的VH结构域可包含与其来源的VH结构域的氨基酸序列相比含有一个或更多个氨基酸***、氨基酸添加、氨基酸缺失和/或氨基酸替换的氨基酸序列。例如，本发明结合剂的VL结构域可包含与其来源的VL结构域的氨基酸序列相比含有一个或更多个氨基酸***、氨基酸添加、氨基酸缺失和/或氨基酸替换的氨基酸序列。优选地，具有亲本VH或VL的氨基酸序列的功能性变体的氨基酸序列的VH或VL提供与亲本VH或VL的氨基酸序列相同或基本相同的功能，例如在结合特异性、结合强度等方面。然而，如本领域普通技术人员所知，在一些实施方案中，也可以优选提供氨基酸序列的功能性变体，例如VH或VL的功能性变体，其与亲本分子的氨基酸序列相比具有改变的特性。相同的考虑适用于例如CDR的氨基酸序列，以及另外的氨基酸序列，例如CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的氨基酸序列。
当将双特异性结合剂描述为包含“来源于”免疫球蛋白的VH和“来源于”相同或不同免疫球蛋白的VL时，术语“来源于”表明双特异性结合剂是通过任何已知方法将来自所述免疫球蛋白的所述VH和VL重组到所得双特异性结合剂中而产生的。在本文中，“重组”不旨在受任何特定重组方法的限制，并因此包括以下本文中描述的或本领域已知的用于产生双特异性结合剂的所有方法，包括例如通过在相同细胞中共表达不同分子和/或在核酸水平上的重组。
术语“双特异性抗体”或“bsAb”是指具有由不同氨基酸序列限定的两个不同抗原结合结构域的结合剂。在一些实施方案中，所述不同的抗原结合结构域结合同一抗原上的不同表位。然而，在优选的实施方案中，所述不同的抗原结合结构域结合不同的靶抗原。双特异性结合剂可以是任何形式，包括本文中所述的任何双特异性形式。结合剂可用一个、两个或更多个结合结构域结合每种不同的抗原或不同的表位，即，以一价、二价(或二价(bivalently))、三价、四价并且甚至以更高价结合每种不同的抗原或不同的表位。
根据本发明，如果与胃细胞或胃组织中的表达相比表达水平更低，则CLDN18.2基本上不在细胞中表达。优选地，表达水平低于胃细胞或胃组织中的表达的10％，优选低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％或甚至更低。优选地，如果表达水平超过胃以外的非癌组织中的表达水平不超过2倍、优选1.5倍，并且优选不超过所述非癌组织中的表达水平，则CLDN18.2基本上不在细胞中表达。优选地，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不允许被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体结合，则CLDN18.2基本上不在细胞中表达。
根据本发明，如果表达水平超过胃以外的非癌组织中的表达水平，优选超过2倍，优选10倍、100倍、1000倍或10000倍，则CLDN18.2在细胞中表达。优选地，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平足够高以允许被添加至细胞的CLDN18.2特异性抗体结合，则CLDN18.2在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的CLDN18.2在所述细胞的表面上表达或暴露。
根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括癌症，特别是本文中所描述的那些形式的癌症。任何本文中提及的癌症或癌症的特别形式还包括其癌症转移。在一个优选实施方案中，根据本教导，待治疗的疾病涉及表达CLDN18.2的细胞。
根据本发明，“与表达CLDN18.2的细胞相关的疾病”或类似的表述意指CLDN18.2在患病组织或器官的细胞中表达。在一个实施方案中，与健康组织或器官中的状态相比，患病的组织或器官之细胞中的CLDN18.2表达提高。提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％，或甚至更多。在一个实施方案中，表达仅见于患病的组织中，而健康组织中的表达被抑制。根据本发明，与表达CLDN18.2之细胞相关的疾病包括癌症疾病。根据本发明，癌症疾病优选地为其中癌细胞表达CLDN18.2的那些。
如本文中所用，“癌症疾病”或“癌症”包括具有如下特征的疾病：异常调节性细胞生长、增殖、分化、黏附和/或迁移。“癌细胞”意指通过迅速、不受控制的细胞增殖而生长并且在起始新生长的刺激停止后继续生长的异常细胞。优选地，“癌症疾病”以表达CLDN18.2的细胞为特征并且癌细胞表达CLDN18.2。表达CLDN18.2的细胞优选是癌细胞，优选本文中所述的癌症。
根据本发明，术语“癌症”包括白血病、***瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、***、肠癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、***癌、食管癌、胃食管连接部的癌(GEJ)、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、***癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌、及其转移。其实例为肺癌、***癌、***癌、结肠癌、肾细胞癌、***或上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移。
根据本发明，“上皮癌”是来源于上皮细胞的恶性肿瘤。该组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、***癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“腺癌”为源自腺组织的癌症。该组织也是称为上皮组织的一大类组织的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体以及内衬于机体的腔和器官的多种其他组织。在胚胎学上，上皮来源于外胚层、内胚层和中胚层。被归类为腺癌的细胞并不一定必须是腺体的一部分，只要它们具有分泌特性即可。该形式的癌可发生在一些包括人在内的高等哺乳动物中。良好分化的腺癌趋向于与其所来源的腺组织类似，而不良分化的腺癌则可以不是这样。通过对来自组织活检物的细胞进行染色，病理学家将确定肿瘤是腺癌还是一些其他类型的癌症。由于腺体在体内普遍存在的性质，腺癌可在机体的许多组织中产生。尽管每种腺体可不分泌相同的物质，但只要细胞具有外分泌功能，它就可被认为是腺性的，并且因而它的恶性形式被命名为腺癌。只要有充足的时间，恶性腺癌就侵袭其他组织并且常常转移。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。其包括浆液性和黏液性腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
“转移”意指癌细胞从其初始部位扩散至机体的其他部位。转移的形成是非常复杂的过程，并依赖于恶性细胞从原发肿瘤脱离，侵袭胞外基质，穿透内皮基底膜进入体腔和血管，并随后在通过血液运输后，浸润靶器官。最后，新肿瘤在靶部位的生长依赖于血管生成。由于肿瘤细胞或组分可残留并发展出转移潜力，因此即使在去除原发肿瘤后仍经常发生肿瘤转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”是指“远处转移”，其指远离原发肿瘤和局部******的转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”是指***转移。可使用本发明的治疗或治疗的方法来治疗的一种特定形式的转移是来源于作为原发部位的胃癌的转移。在一些优选的实施方案中，这样的胃癌转移是克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
克鲁肯伯格瘤是卵巢的不常见转移性肿瘤，占所有卵巢肿瘤的1％至2％。克鲁肯伯格瘤的预后仍然很差，并且对克鲁肯伯格瘤没有已建立的治疗。克鲁肯伯格瘤是卵巢的转移性印戒细胞腺癌。胃是大多数克鲁肯伯格瘤病例(70％)的主要部位。结肠癌、阑尾癌和乳腺癌(主要是浸润性小叶癌)是其次最常见的原发部位。已经报道了源自胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、小肠癌、法特壶腹(ampulla of Vater)癌、***和膀胱/脐尿管癌的罕见克鲁肯伯格瘤病例。
“治疗”意指向对象施用化合物或组合物或者化合物或组合物的组合以预防或消除疾病，包括降低对象中肿瘤的尺寸或肿瘤数目；阻止或减缓对象中的疾病；抑制或减缓对象中新疾病的发生；降低目前患有或先前患有疾病的对象中症状和/或复发的频率或严重程度；和/或延长，即提高对象的寿命。
特别地，术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减缓或抑制进展或恶化，或者预防或延缓疾病或其症状的发作。
在本发明的上下文中，术语例如“保护”、“预防”、“预防的”、“预防性的”，或“保护性的”涉及对象中疾病发生和/或传播的预防或治疗或者这二者，并且特别地涉及使对象将发生疾病的机会最小化或延迟疾病的发生。例如，处于癌症风险中的人将是用于治疗以预防癌症的候选者。
“处于风险中”意指与一般群体相比，被鉴定为具有比正常发病机会更高的发病(特别是癌症)机会的对象。此外，曾患有或目前患有疾病(特别是癌症)的对象具有发生疾病之提高的危险，因为这样的对象可继续发生疾病。目前患有或曾经患有癌症的对象也具有提高的癌症转移风险。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。其是指可受疾病或病症(例如癌症)折磨或易于患有所述疾病或病症但是可患有或可未患有所述疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
根据本发明，术语“患者”意指治疗对象，特别是患病的对象，包括人、非人灵长类或其他动物，特别是哺乳动物，例如，牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一个特别优选的实施方案中，患者是人。
“靶细胞”应意指任何不期望的细胞，例如癌细胞。在一些优选的实施方案中，靶细胞表达CLDN18.2。
术语“免疫学上等同的”意指例如关于免疫作用类型表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或者发挥相同或基本上相同的免疫学作用的免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于抗原或抗原变体用于免疫接种的免疫学作用或特性而使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫***时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，特别是T细胞的刺激、致敏和/或扩增，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列是免疫学上等同的。因此，与抗原在免疫学上等同的分子在T细胞的刺激、致敏和/或扩增方面表现出与T细胞所靶向的抗原相同或基本上相同的特性和/或者发挥相同或基本上相同的作用。
本文中使用的“活化”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞(例如T细胞)的状态。活化也可与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关。术语“活化的免疫效应细胞”尤其是指正在进行细胞***的免疫效应细胞。
术语“致敏”是指其中免疫效应细胞例如T细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化成效应细胞例如效应T细胞的过程。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选地在免疫应答的背景下使用，在所述免疫应答中免疫效应细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。
术语“抗原”涉及优选地用于诱导免疫应答的包含药剂所针对和/或待针对之表位的分子，例如蛋白质或肽。在一个实施方案中，抗原或其加工产物例如T细胞表位，通过T或B细胞受体或者通过免疫球蛋白分子例如抗体结合。因此，抗原或其加工产物可与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一个优选的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原(例如，CLDN18.2)，即可来源于胞质、细胞表面和细胞核的癌细胞组成，特别是细胞内或作为癌细胞上的表面抗原优选大量产生的那些抗原。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤相关抗原”或“癌症相关抗原”优选涉及在正常条件下在有限数目的组织和/或器官中或在特定发育阶段中特异性表达以及在一个或更多个肿瘤或癌症组织中表达或异常表达的蛋白质。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原优选与癌细胞的细胞表面缔合，并且优选不在或仅很少在正常组织中表达。
术语“表位”指分子中的抗原决定簇，例如，指分子中被免疫***识别(例如，被抗体识别)的部分。例如，表位是被免疫***识别的抗原上之离散的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如，氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位与非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失，而与后者的结合则不丧失。蛋白质的表位优选包含所述蛋白质的连续或不连续部分，并且长度优选为5至100、优选5至50、更优选8至30、最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
如本文中所用，术语“结合剂”是指能够结合所期望抗原的任何药剂。在本发明的某些实施方案中，结合剂是抗体、抗体片段或其构建体。结合剂还可包含合成的、经修饰的或非天然存在的部分，特别是非肽部分。这样的部分可例如连接所期望的抗原结合官能团或区域，例如抗体或抗体片段。在一个实施方案中，结合剂是包含抗原结合CDR或可变区的合成构建体。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，优选涉及抗原受体，例如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征在于结构域，即免疫球蛋白结构域，其具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠。该术语涵盖膜结合的免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。可溶性免疫球蛋白通常被称为抗体。免疫球蛋白通常包含数条链，通常两条相同的重链和两条相同的轻链，它们通过二硫键连接。这些链主要由免疫球蛋白结构域构成，例如VL(可变轻链)结构域、CL(恒定轻链)结构域、VH(可变重链)和CH(恒定重链)结构域CH1、CH2、CH3和CH4。有五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，它们负责了不同类别的免疫球蛋白，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。免疫球蛋白类别也被称为“同种型”(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)，指的是由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别。当本文中提及特定同种型例如IgG1时，该术语不限于特定同种型序列例如特定IgG1序列，而是用于表示该抗体在序列上更接近该同种型例如IgG1而不是其他同种型。与可溶性免疫球蛋白的重链相对，膜或表面免疫球蛋白的重链在其羧基末端包含跨膜结构域和短的胞质结构域。哺乳动物中有两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白不同的同种型内基本上是保守的，其中可变部分是高度多样的并且负责抗原识别。
术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白或其抗原结合部分。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区(根据EU编号的人IgG1的第118至447位氨基酸残基)构成，所述重链恒定区包含CH1、CH2和CH3结构域，其中CH1通常通过肽接头(也称为“铰链”)与CH2-CH3连接。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL)构成。术语“区”和术语“结构域”在本文中可互换使用。VH和VL结构域可进一步细分为高变区，称为互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)，其间散布着更保守的区域，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196，901-917(1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本文中的CDR序列根据Kabat编号***来鉴定并且本发明中对恒定区中氨基酸位置的引用根据EU编号来进行(Edelman et al.，(1969)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1)：78-85；Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Edit.1991 NIH Publication No.91-3242)。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)。
本文中使用的术语“对应于......的位置的氨基酸”是指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。其他免疫球蛋白中相应的氨基酸位置可通过与人IgG1的比对找到。因此，一个序列中“对应于”另一序列中的氨基酸或区段的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序(例如ALIGN、ClustalW或类似程序，其通常以默认设置)与另一氨基酸或区段比对，并且与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸或区段。如何比对序列或序列中的区段并由此确定序列中对应于根据本发明的氨基酸位置的位置在本领域中被认为是公知的。
本文中使用的术语“IgG Fc配体”是指与IgG免疫球蛋白的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合体的分子，优选多肽。Fc配体包括但不限于FcγRIs、FcγRIIs、FcγRIIIs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋白和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(Fc receptor homolog，FcRH)，它是与FcγR同源的Fc受体的家族(Davis et al.，(2002)Immunol.Rev.190：123-136)。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。本文中使用的“Fc配体”可来自任何生物体，例如小鼠、人和食蟹猴。
“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcγR”使指结合IgG Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，该家族包括但不限于：FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis et al.，(2002)Immunol.Lett.82：57-65)。FcγR可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)。
本文中使用的“FcRn”或“新生Fc受体”涉及结合IgG Fc区并至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。功能性FcRn蛋白包含两种多肽，通常称为重链(由FcRn基因编码)和轻链(β-2-微球蛋白)。除非另有说明，否则“FcRn”或“FcRn蛋白”是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合体。本文中使用的“FcRn变体”是指提高与FcRn受体结合的变体并且其可提高血清半衰期。
本文中使用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”是指包含IgG分子的CH2和CH3结构域以及任选的肽接头例如铰链的多肽。人IgG1的CH2-CH3结构域包含根据EU编号的第231至447位氨基酸，并且铰链包含根据EU编号的第216至230位氨基酸。因此，提及IgG，本文中使用的术语“Fc结构域”包括根据EU编号的第231至447位氨基酸(CH2-CH3)和第216至447位氨基酸(铰链-CH2-CH3)，及其功能性变体(包括其功能性片段)。“Fc片段”可包含较少的氨基酸，例如N端或C端截短变体，但仍保留与另一Fc结构域或Fc片段形成二聚体的能力，这可使用标准方法检测，例如基于尺寸(例如非变性色谱、尺寸排阻色谱等)，并因此是功能性变体。根据本发明，IgG Fc结构域优选地是人IgG Fc结构域，其包括来自人IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域。
本文中使用的术语“铰链”、“铰链区”、“抗体铰链区”或“铰链结构域”是指包含免疫球蛋白(例如IgG)的CH1和CH2之间的氨基酸的肽接头。在结构上，在天然存在的IgG(例如IgG1)分子中，CH1在根据EU编号的第215位氨基酸处结束，并且CH2在根据EU编号的第231位氨基酸处开始。因此，对于IgG，铰链包含根据EU编号的第216至230位氨基酸。
“变体Fc结构域”与亲本Fc结构域相比包含氨基酸修饰。因此，“变体IgG1Fc结构域”，例如变体人IgG1Fc结构域，在对应于IgG1Fc结构域(例如人IgG1Fc结构域，并且优选是亲本Fc结构域的功能变体)位置的位置中包含氨基酸修饰(例如氨基酸替换和/或缺失)。这样的变体IgG Fc结构域与相应的亲本人IgG Fc结构域保留至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。任选地，变体Fc结构域与亲本Fc结构域相比可具有高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。优选地，变体Fc结构域保留了与另一Fc结构域形成二聚体的能力，如使用本文中所述或本领域已知的技术例如非变性凝胶电泳所测量的。
Fc修饰
本文中所述的结合剂包含至少三种不同的多肽链，其中两条多肽链，例如第一多肽链和第二多肽链，包含CH2-CH3区，优选地来源于IgG，例如IgG1，特别是人IgG1。优选地，包含CH2-CH3区的所述第一多肽链和所述第二多肽链能够相互作用(例如二聚化)从而形成包含本文中所述结合剂的所述第一多肽链和所述第二多肽链的异二聚体。优选地，本发明的结合剂的CH2-CH3区来源于IgG1，更优选地来源于人IgG1，但也可使用如本文中所述的来源于其他血清型的CH2和CH3。此外，如本文中所讨论，本发明的结合剂将例如在生成宿主细胞内自组装。例如，设想第一多肽链上的CH2与第二多肽链上的CH2相互作用，和/或第一多肽链上的CH3与第二多肽链上的CH3相互作用，从而形成Fc片段。这些Fc片段可包含一个或更多个氨基酸修饰或“Fc修饰”，如本文中关于人IgG1所讨论，以促进第一多肽链和第二多肽链上的CH2和/或第一多肽链和第二多肽链上的CH3之间的相互作用，和/或者使得与仅包含一种类型多肽链的同多聚体相比，易于纯化包含彼此相互作用的第一多肽链和第二多肽链的异多聚体，例如异二聚体，和/或者赋予本文中所讨论的另外的有益功能。本文中讨论的氨基酸修饰也可包含在CH1结构域中，例如，在本发明结合剂的第一多肽链和/或第二多肽链中。另外，肽接头例如scFv部分内的肽接头或连接结合剂的另外结构域(例如CH1和scFv，或CH2和scFv，或CH1和CH2)的肽接头可包含一个或更多个如本文中所述的氨基酸修饰。例如，将CH2-CH3区与另一区域或结构域(例如VH(CD3)、VL(CD3)或CH1)连接的肽接头，可在对应于天然存在的IgG1中根据EU编号的第220位的氨基酸位置处具有丝氨酸(通常可在该位置存在半胱氨酸)。使用在对应于人IgG1的第220位的所述位置处包含丝氨酸的肽接头降低了包含CH2-CH3区域的两条链之间的二硫键形成。
因此，本发明的结合剂的形成是基于使用包含含有氨基酸替换的CH1、CH2和/或CH3的不同单体(例如，本文中所述的第一多肽链和第二多肽链)，所述氨基酸替换例如以下：相对于本文中所述的同二聚体而“扭曲(skew)”形成由所述单体形成的异二聚体，优选地与“pI修饰”结合，所述“pI修饰”允许相对于同二聚体而简单纯化异二聚体，并且任选与本文中所讨论的“消融修饰”和另外的Fc修饰结合。技术人员将理解，本文中讨论的关于CH1、CH2和/或CH3结构域和肽接头的任何氨基酸修饰，例如铰链变体，可与本文中讨论的或本领域已知的另外的氨基酸修饰组合。例如，任何扭曲和pI修饰可独立地与消融和其他Fc修饰组合。根据本发明的Fc修饰可以是氨基酸***、添加、缺失或替换。
本文中讨论的Fc修饰是根据组成它们的氨基酸修饰来限定的。例如，N434S是相对于亲本人IgG1Fc多肽且根据EU编号在434位处用丝氨酸取代天冬酰胺的Fc修饰。亲本氨基酸的身份可能是未指定的，在这种情况下，前述变体被称为434S，即包含所述Fc修饰的CH2-CH3区在对应于根据EU编号的人IgG1中第434位的氨基酸位置处包含丝氨酸。
pI修饰
pI修饰提高了单体之间的等电点(pI)差异，其允许同多聚体和异多聚体蛋白质的等电点纯化。一般来说，pI修饰提高多肽链的pI(碱性改变)，或降低多肽链的pI(酸性改变)。
如本文中所讨论，两条多肽链之间的至少0.1，例如0.2、0.3、0.4或0.5的pI差异可允许通过离子交换色谱或等电聚焦或本领域已知的对等电点敏感的其他方法进行分离。因此，包含改变彼此相互作用的每条多肽链(例如本文所述的第一多肽链和第二多肽链)的pI的pI的修饰，使得每条所述多肽链具有不同的pI，并且由所述多肽链形成的异多聚体也具有不同的pI，有利于包含所述异多聚体的结合剂的等电点纯化。这些替换也有助于确定和监测任何污染的不想要的同多聚体或异多聚体的形成。
pI修饰可包含在含有重链恒定区的异多聚体的一条或两条链内，例如本发明结合剂的第一多肽链和第二多肽链内，以及CH1、CH2和/或CH3内和/或肽接头内，所述接头例如连接scFv部分的VH和VL结构域的接头。例如，pI变体可包含在本发明结合剂的第一多肽链和/或第二多肽链中，以降低或阻止同多聚体的形成。通常来说，当包含在第一多肽链和第二多肽链二者中时，将使用pI变体，使得一条多肽链的pI提高而第二多肽链的pI降低。如本文中所讨论，这可通过例如用带正电荷或负电荷的氨基酸残基替代中性氨基酸残基或者反之亦然，或者通过将带正电荷的氨基酸残基变为负电荷或者反之亦然来实现。因此，在本发明的某些实施方案中，在本文中所述结合剂的至少一条多肽链中提供了足够的pI变化，使得可以从同多聚体中纯化出例如第一多肽链和第二多肽链的异多聚体。在某些实施方案中，在本发明中使用了小至0.1、0.2、0.3、0.4或0.5或更大的pH单位的pI差异。为了获得良好的分离，本发明结合剂的一条或更多条多肽链上包含的pI修饰的量将部分取决于多肽链的起始pI、CH区、Fv支架区等的pI，如本领域技术人员将理解的。可以通过本领域已知的任何方法例如基于CH区，例如，使用Sillero和Maldonado所述的方法(Sillero，Maldonado，(2006)Comput.Biol.Med.36(2)：157-166)计算pI的变化。或者，可比较每条多肽链的pI。另外，异多聚体可根据它们的尺寸进行分离。
在某些实施方案中，pI修饰、扭曲修饰、另外的Fc修饰或消融修饰等不包括在本发明结合剂的可变区中。
在某些实施方案中，pI修饰来源于不同的IgG同种型，使得相应多肽链的pI改变而不引入免疫原性(参见，U.S.2014/0370013)。优选地，pI修饰来源于人IgG同种型，以降低引入免疫原性的风险。本文中讨论的修饰是关于人IgG1描述的，但所有IgG同种型都可以这种方式改变，以及同种型杂交体也是如此。在重链恒定区来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。
出于多种原因，包括高效应物功能，IgG1是治疗性抗体的常见同种型。然而，IgG1的CH区具有比IgG2更高的pI。通过将IgG2来源的残基在特定位置引入到IgG1主链中，所得单体的pI降低或提高，并且另外，血清半衰期可提高。例如，根据EU编号，人IgG1在第137位处具有甘氨酸(pI为约5.97)，并且人IgG2在相应位置处具有谷氨酸(pI为约3.22)；用谷氨酸残基替换甘氨酸残基将影响所得多肽的pI。降低抗体恒定区的pI也可提高体内血清半衰期(参见USSN 13/194,904；Ghetie and Ward，1997，Immunol Today.18(12)：592-598)。此外，具有较低pI的可变区可提高更长的血清半衰期(参见Igawa et al.，(2010)PEDS 23(5)：385-392)。
在pI修饰的优选组合中，一条多肽链(例如，本发明结合剂的第一多肽链，例如包含VH(CLDN18.2)、CH1、CH2和CH3)包含根据EU编号的第208位处的天冬氨酸残基、第295位处的谷氨酸残基、第384位处的天冬氨酸残基、第418位处的谷氨酸残基和第421位处的天冬氨酸残基(即，对应于IgG1的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)和另一条多肽链(例如，所述结合剂的第二多肽链，例如包含VH(CD3)和VL(CD3)、CH2和CH3，以及任选的VH(CLDN18.2)和CH1)包含连接VH(CD3)和VL(CD3)的带正电荷的肽接头(“scFv接头”)，例如包含氨基酸(GKPGS)4或其功能性变体或者由该氨基酸或其功能性变体组成的多肽接头。
在不包含CH1并因此不包含对应于根据EU编号的第208位的氨基酸位置的多肽链中，可以使用以下负pI修饰：根据EU编号的第295位处的谷氨酸残基、第384位处的天冬氨酸残基、第418位处的谷氨酸残基和第421位处的天冬氨酸残基(人IgG1：Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
在一些实施方案中，一条多肽链，即第一多肽链，包含本文中所讨论的一组变体，并且与之相互作用的多肽链，例如第二多肽链，包含带电荷的scFv接头，例如选自SEQ IDNO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12或其功能性变体的带正电荷的scFv接头，或者选自SEQ IDNO：13、14、15、16、17、18、19和20的带负电荷的scFv接头。
扭曲修饰
“扭曲修饰”是促进包含这样的修饰的多肽链的相互作用的空间修饰。一种利用空间修饰的策略在本领域中被称为“钮(knob)和孔(hole)”，是指氨基酸工程，其中在第一重链多肽上，典型地在Fc区(CH2-CH3)中引入突起，并且在第二重链多肽中，典型地在Fc区(CH2-CH3)引入相应的空腔，使得突起可以位于这两条重链界面处的空腔中，以促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成(参见USSN 61/596,846，Ridgway et al.，(1996)ProteinEngineering 9(7)：617；Atwell et al.，(1997)J.Mol.Biol.270：26；美国专利No.8,216,805)。“突起”是通过用更大的侧链替代第一重链多肽界面的小氨基酸侧链而构建的。通过用较小的氨基酸侧链替代较大的氨基酸侧链，在第二重链多肽的界面上产生了与突起尺寸相同或相似的补偿性“空腔”(美国专利5,731，168)。“钮和孔”修饰可与二硫键组合，以使形成偏向异源多聚化，例如所述第一和第二重链多肽的异源二聚化(参见Merchant et al.，(1998)Nature Biotech.16：677)。
有用的扭曲修饰包括但不限于以下双修饰对，其中每个双修饰对的一部分将存在于本发明结合剂的一条多肽链(例如，本文中所述的第一多肽链)中，并且第二部分将存在于本发明结合剂的另一条多肽链(例如，本文中所述的第二多肽链)中：根据EU编号的并且关于人IgG1的S364K/E357Q：L368D/K370S；L368D/K370S：S364K；L368D/K370S：S364K/E357Q；L368E/K370S：S364K；T411E/K360E/Q362E：D401K；L368D/K370S：S364K/E357L；K370S：S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V：T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C。优选地，L368D/K370S：S364K/E357Q用于本发明的结合剂中。
本文中所述的扭曲修饰也可对pI有作用(参见Gunasekaran et al.，(2010)J.Biol.Chem.285(25)：19637)，并因此对纯化有作用，并因此也可被认为是pI变体。
消融修饰
本文中的“消融”意指活性的降低或去除。“消融FcγR结合”意指与不包含特定修饰的Fc区相比，包含一个或更多个消融修饰的Fc区具有超过50％的FcγR结合活性损失。优选地，包含一个或更多个消融修饰的Fc区具有超过70％、80％、90％、95％、98％或甚至更多的FcγR结合活性损失。优选地，与不包含特异性修饰的Fc区相比，包含一个或更多个消融修饰的Fc区的FcγR结合活性低于Biacore、SPR或BLI测定中可检测的结合水平。
如已知的，人IgG1的Fc结构域对Fcγ受体具有最高的结合，并此当结合剂的恒定结构域来源于IgG1时，可使用消融修饰。替代地，或者除了消融修饰之外，例如，糖基化第297位处的突变(通常为A或S)可显著地消融与FcγRIIIa的结合。人IgG2和IgG4与Fcγ受体的结合天然地较低(Parren et al.，1992，J.Clin Invest.90：1537-1546；Bruhns et al.，2009，Blood 113：3716-3725)，并因此来源于IgG2或IgG4的CH1、CH2和CH3结构域可在本发明的结合剂中进行或不进行消融修饰的情况下使用。消融FcγR结合的氨基酸修饰已描述于例如Dall′Acqua WF等人的J Immunol.177(2)：1129-1138(2006)和Hezareh M，JVirol.；75(24)：12161-12168(2001)中。
因此，本发明结合剂的Fc部分可包含一个或更多个“FcγR消融修饰”或“Fc敲除(FcKO或KO)修饰”。在某些实施方案中，期望降低或去除Fc结构域与一种或更多种或所有Fcγ受体(例如，FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的结合。在一些实施方案中，期望消融与CD3单价结合的结合剂例如本发明的结合剂的FcγRIIIa结合，以消除或显著降低ADCC活性。因此，在本发明的结合剂中，本发明结合剂的一条或更多条多肽链，例如第一多肽链和第二多肽链，包含一个或更多个FcγR消融变体。在优选的实施方案中，一种或更多种消融变体选自根据EU编号且关于人IgG1的以下：
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其中“del”表示所示位置的氨基酸缺失。优选地，根据EU编号且关于人IgG1的修饰E233P/L234V/L235A/G236_/S267K用于本发明结合剂的第一多肽链和第二多肽链二者中。应当注意，本文中公开的消融修饰消融了FcγR结合，但通常不消融FcRn结合。然而，用于减少或提高与FcRn的结合以减少或增加结合剂的血清半衰期的技术是已知的并且可使用(参见例如Dall’Acqua et al.2006，J.Biol.Chem.，281：23514-24；Hinton et al.2006，J.Immunol.，176：346-56；and Zalevsky et al.2010 Nat.Biotechnol.，28：157-9)。
例如，在本发明的结合剂中，第一多肽链包含根据SEQ ID NO：28的氨基酸序列，并且第二多肽链包含根据SEQ ID NO：30的氨基酸序列，其中第一多肽链和第二多肽链包含L368D/K370S：S364K/E357Q扭曲修饰组，第一多肽链还包含N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI修饰组，并且第一多肽链和第二多肽链二者均还包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融修饰组，例如其中第一多肽链包含VH(CLDN18.2)和CH1，并且第二多肽链包含scFv(CD3)，以及任选的VH(CLDN18.2)和CH1。当然，另外的修饰可包含在相应结合剂的氨基酸序列中；例如，除了以上讨论的修饰之外，结合剂可包含另外的氨基酸修饰，例如替换。
另外的Fc修饰
除了本文中所述的其他修饰，例如pI、扭曲和消融修饰之外，可使用改变一种或更多种FcγR受体的结合，改变与FcRn受体的结合等的许多可用的修饰。
因此，可以进行许多可用的氨基酸替换来改变本发明的结合剂与一种或更多种FcγR受体的结合。导致结合增加以及结合减少的替换可以是可用的。例如，已知增加与FcγRIIIa的结合导致ADCC增加。类似地，降低与FcγRIIb的结合也是有益的。可用于本发明的氨基酸替换包括在USSN11/124,620、11/174,287、11/396,495、11/538,406中列出的那些，所有这些均通过引用整体并入本文。可并入到本发明结合剂中的特别可用的氨基酸替换包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D/332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。
另外，如USSN 12/341,769(其在此通过引用整体并入)中所公开的，还存在可用于提高与FcRn的结合并提高血清半衰期的另外的修饰，包括但不限于根据EU编号的434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I/434S、436V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。
另外，在一条或两条多肽链上，优选在形成Fc异二聚体的两条多肽链上的CH3可包含导致更长血清半衰期的修饰M428L/N434S。
如本领域技术人员将理解的，本文中讨论的修饰可独立地与其他修饰组合。在一个实施方案中，本发明结合剂的一条多肽链(例如，第一多肽链)包含根据EU编号的N208D、Q295E、N384D、Q418E和N481D，并且结合剂的另一条多肽链(例如，第二多肽链)包含本文中所述的带正电荷的scFv接头。优选地，结合剂的第一多肽链还包含根据EU编号的K370S和L368D，并且结合剂的第二多肽链还包含根据EU编号的E357Q和S364K。另外，在优选的实施方案中，第一多肽链和第二多肽链二者还包含根据EU编号的E233P、L234V、L235A、G236del和S267K。最优选地，本发明的结合剂的第一多肽链包含N208D、E233P、L234V、L235A、G236del、S267K、Q295E、L368D、K370S、N384D、Q418E和N481D，并且结合剂的第二多肽链包含E233P、L234V、L235A、G236del、S267K、E357Q和S364K以及任选的C220S，以去除通常与轻链配对的半胱氨酸。
本文中使用的术语“单克隆结合剂”包括“单克隆抗体”并且是指具有单一分子组成的结合剂分子的制剂。单克隆结合剂组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的结合剂，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆结合剂可由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因或跨染色体非人动物例如转基因小鼠获得的B细胞，所述杂交瘤具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文中使用的术语“重组结合剂”包括“重组抗体”并且包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有结合剂，例如(a)从免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的结合剂，(b)从转化以表达结合剂的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的结合剂，(c)从重组的、组合的抗体文库分离的结合剂，以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的结合剂。
本文中使用的术语“人结合剂”包括“人抗体”并且旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列之可变区和恒定区的结合剂。人结合剂可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
本文中使用的术语“人源化结合剂”包括“人源化抗体”并且是指具有基本来源于非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。这可通过例如将共同形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人接受体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植(graft)到可变结构域中适当框架区上的互补决定区(CDR)。为了完全重建亲本结合剂的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本结合剂(即非人结合剂，例如鼠抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可帮助鉴定框架区域中对于结合剂的结合特性重要的氨基酸残基。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或更多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以使其与人免疫球蛋白更类似。一些形式的人源化结合剂保留了全部CDR序列(例如含有来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式具有一个或更多个相对于原始结合剂(例如抗体)而言发生了改变的CDR。因此，人源化结合剂可包含非人CDR序列，主要人框架区(其任选地包含针对非人氨基酸序列的一个或更多个氨基酸回复突变)，以及完全人恒定区。
本文中使用的术语“嵌合结合剂”包括“嵌合抗体”并且是指这样的结合剂，其中每个重链和轻链氨基酸序列的一部分与来源于特定物种或者属于特定类别的结合剂(例如抗体)中的相应序列同源，而该链的其余区段则与其他物种或属于其他类别的相应序列同源。通常来说，轻链和重链的可变区均模拟来自一个哺乳动物物种之抗体的可变区，而恒定部分则与来自其他物种的抗体序列同源。这种嵌合形式的一个明显优点是可使用易于获得的B细胞或来自非人宿主生物体的杂交瘤从目前已知的来源方便地产生可变区，而与其组合的恒定区来自例如人细胞制备物。所述可变区具有易于制备的优点，并且特异性不受来源的影响，而由于恒定区为人的，因此该结合剂在注射时引发人对象免疫应答的可能性将比恒定区来自非人来源时更低。然而，定义不限于此特定实例。
结合剂或其片段，例如可变区和/或恒定区可来源于不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。
本文中所述的免疫球蛋白包括IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG1(包括根据EU编号的第356位(D或E)和第358位(L或M)的氨基酸处具有多态性的同种异型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在多个实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG1抗体，更特别是IgG1，κ或IgG1，λ同种型(即IgG1，κ、λ)、IgG2a抗体(例如IgG2a，κ、λ)、IgG2b抗体(例如IgG2b，κ、λ)、IgG3抗体(例如IgG3，κ、λ)或IgG4抗体(例如IgG4，κ、λ)。本文中所述的关于IgG1同种异型356D/358M的氨基酸序列也包括同种异型356E/358L。
术语“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的、对齐的IgG同种型的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为IgG1包含酪氨酸并且IgG2包含根据EU编号的第296位氨基酸处的苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y替换被认为是IgG亚类修饰。
本文中使用的“异源结合剂”包括“异源抗体”并且相对于产生这样的结合剂的转基因生物体进行定义。该术语是指这样的结合剂，其具有对应于不由所述转基因生物体组成的生物体中可见的那些的氨基酸序列或编码核酸序列，并且通常来自与所述转基因生物体不同的物种。
本文中使用的“异源结合剂”包括“异源杂合抗体(heterohybrid antibody)”并且是指具有不同生物来源的轻链和重链的结合剂。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异源杂合抗体。
本文中所述的结合剂(包括抗体)优选是分离的。本文中使用的“分离的”旨在指基本不含具有不同抗原特异性之其他药剂的结合剂(例如，与CLDN18.2特异性结合的分离的结合剂并且CD3基本上不含特异性结合除CLDN18.2和CD3之外的抗原的结合剂)。分离的结合剂与人CLDN18.2的表位、同种型或变体特异性结合，然而，其可具有对其他相关抗原(例如，来自其他物种(例如，CLDN18.2物种同源物))的交叉反应性。此外，分离的结合剂可基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
术语结合剂(例如抗体)的“抗原结合部分”(或简称为“结合部分”)或者结合剂(例如抗体)的“抗原结合片段”(或简称为“结合片段”)或者类似的术语是指结合剂的保留与抗原特异性结合之能力的一个或更多个片段。已表明，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。术语结合剂(例如抗体)的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、HL、CL和CH结构域组成的一价片段；(ii)F(ab’)2片段，其包含通过铰链区处二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其来源于F(ab’)2片段并包含游离巯基，该游离巯基可被烷基化或用于与酶、毒素或其他目的蛋白质结合，其中Fab’可包含Fc的一小部分；(iv)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vii)分离的互补决定区(CDR)以及(viii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可使用重组方法通过合成接头将它们连接，使之可成为单个蛋白质链，其中VL和VH结构域配对以形成一价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体还旨在涵盖于术语结合剂的(例如抗体)的“抗原结合片段”内。另一个实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与所述铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。所述结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003/0118592和US 2003/0133939中进一步公开。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式针对用途对片段进行筛选。
单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与通常10至约30个氨基酸的短接头肽(例如scFv接头，例如由SEQ ID NO：2至20所示)连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，并且富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可使VH的N端与VL的C端连接，反之亦然。可通过连接两个scFv来改造二价单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)。这可通过产生具有两个VH和两个VL结构域的单肽链来完成，产生串联scFv。本发明还包括含有多于一个scFv结合结构域的多特异性分子。一种常见的柔性连接肽是(G4S)x，其中x可以是2、3、4、5或6。优选地，连接scFv的VH和VL结构域的接头包含氨基酸序列(GKPGS)x或其功能性变体，优选地由氨基酸序列(GKPGS)x或其功能性变体组成，其中x可以是2、3、4、5或6。任选地，VH与VL的缔合可通过一个或更多个分子间二硫键来稳定化。
另一种可能性是产生具有接头肽的scFv，所述接头肽太短(约5个氨基酸)而不能使两个可变区折叠在一起，迫使了scFv二聚化。这种类型被称为双抗体。更短的接头(一个或两个氨基酸)导致三聚体即所谓的三抗体(triabody或tribody)的形成。还产生了四抗体。它们表现出比双抗体更高的亲和力。
除非与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语“特异性”旨在具有以下含义。如果两种结合剂与相同的抗原和相同的表位结合，则它们具有“相同的特异性”。
本文中使用的术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”是指例如结合剂(例如抗体)的位点，其与抗原结合并且包括结合剂的抗原结合部分。结合结构域可包含重链和轻链可变结构域(VH和VL)，其各自包括四个保守框架区(FR)和三个CDR。CDR在序列上变化并确定对特定抗原的特异性。VH和VL结构域一起可形成特异性结合特定抗原的位点。如果包含所述结合结构域的结合剂在标准测定中通过所述结合结构域例如以约10-7M或更小KD与所述抗原结合，则抗原的“具有特异性的结合结构域”对所述抗原是特异性的，而它不通过所述结合结构域与不同于标准测定中所述结合结构域特异性针对的指定抗原的抗原显著结合，特别是不可检测地结合。当然，如本文中所述，如果结合剂包含多于一个具有不同特异性的结合结构域，则它将与具有特异性的多于一个抗原结合。可例如使用生物层干涉术(Bio-Layer Interferometry，BLI)或者例如使用表面等离子体共振(surface plasmonresonance，SPR)技术，在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体并且结合剂作为分析物来确定结合剂与抗原的结合。
Fab(抗原结合片段(fragment antigen binding))抗体片段是免疫反应性多肽，其包含由以下构成的抗体单价抗原结合结构域：由重链可变区(VH)和重链恒定区1(CH1)部分组成的多肽，以及由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成的多肽(其中CL和CH1部分结合在一起，例如通过Cys残基之间的二硫键)。优选地，在本文中所述的Fab片段中，CH1和CL是人来源的。在一个实施方案中，CL是κ型CL。在一个实施方案中，CH1来源于IgG1，优选来源于人IgG1。
出于本发明的目的，术语“抗体”涵盖如本文中所述的所有抗体和抗体衍生物(例如抗体片段)。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何经修饰形式(例如，抗体与其他药剂或抗体的缀合物)或抗体片段。此外，如本文中所述的抗体和抗体衍生物可用于产生本发明的结合剂。
天然存在的抗体通常是单特异性的，即它们与单一抗原结合。本发明提供了与细胞毒性细胞(例如T细胞(通过接合CD3受体))和靶细胞(例如癌细胞(通过接合CLDN18.2))结合的结合剂。本发明的结合剂与至少两种不同类型的抗原结合，并且至少是双特异性或多特异性的，例如三特异性、四特异性等。
本发明的结合剂可以是至少二价的。在一个实施方案中，本发明的结合剂至少是三价的。如本文中所用，“价”意指结合剂中抗原结合位点或结合结构域的数目。与相同抗原结合的抗原结合位点可识别不同的表位或优选相同的表位。三价双特异性抗体和四价双特异性抗体是本领域中已知的。本发明的结合剂也可具有高于4的价。
本文中所述的结合剂优选是人工蛋白质(包括蛋白质复合体)，其可由至少两种不同抗体的片段构成(所述至少两种不同抗体的片段形成至少两个不同的结合结构域)并因此与至少两种不同类型的抗原结合。根据本发明的结合剂经改造以同时与免疫细胞(例如免疫效应细胞，特别是T细胞，例如细胞毒性细胞(例如通过与CD3结合))和待被破坏的靶细胞(例如癌细胞(通过与肿瘤相关抗原CLDN18.2结合))结合。
已经开发了数种类型的二价和三价抗体，并且所有类型均在本发明的范围内。双特异性全长抗体可通过共价连接两种单克隆抗体或通过常规杂交瘤技术获得。两种单克隆抗体的共价连接描述于Anderson，Blood 80(1992)，2826-34中。双特异性抗体片段的另一实例是双抗体(Kipriyanov，Int.J.Cancer 77(1998)，763-772)，其是小的二价和双特异性抗体片段。双抗体包含通过肽接头连接的同一多肽链上与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL)，所述肽接头太短而不能允许同一链上的两个结构域之间的配对。这迫使与另一条链的互补结构域配对，并促进具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子的组装。
在包含两个Fab片段的双特异性分子中，每个单独的Fab片段可以排列成单链，优选以VL-CL-CH-VH排列，并且单独的可变结构域和恒定结构域可用肽接头，例如本文中讨论的肽接头连接。通常来说，单个单链和Fab片段可通过二硫键、黏附结构域、化学连接的接头和/或肽接头连接。双特异性分子也可包含多于两个Fab片段，具体地，该分子可以是对2、3、4个或更多个不同抗原具有特异性的Fab3、Fab4或多聚体Fab复合物。本发明还包括化学连接的Fab。
三联体(triplebody)或单链三联抗体(single-chain triple antibody，sctb)由通过接头序列连接的三个不同的scFv区构成。此外，重链(CH1)和轻链(CL)的天然体内异源二聚化可用于形成可在其上添加多种scFv的支架。例如，对一种抗原具有特异性的scFv可与CH1连接，所述CH1还与对另一种抗原具有特异性的scFv连接，并且该链可与另一条链相互作用，所述另一条链包含对连接至CL的任一抗原具有特异性的scFv(scFv3-CH1/CL)。三价结构的另一个实例涉及使用对一个表位具有特异性的Fab片段，所述表位C端连接至对另一表位具有特异性的两个scFv，每条链上有一个(Fab-scFv2)。三价结构的另一实例涉及使用对一个抗原或表位具有特异性的两个Fab片段，其中一个Fab片段的C端与对另一抗原或表位具有特异性的一个scFv连接(Fab2-scFv)。三价(或四价)分子的又一个实例包括多种形式，其包含附接至抗体的N端或C端的另外的结合实体。例如，一种形式由对一种抗原具有特异性的完整抗体分子组成，其中单链Fab(single chain Fab，scFab)与分子的C端连接(IgG-scFab)。对接和锁定(dock-and-lock，DNL)方法也已用于产生三价抗体(DNL-F(ab)3)(Chang，C.-H.et al.在Bispecific Antibodies.Kontermann R.E.(ed.)中，SpringerHeidelberg Dordrecht London New York，pp.199-216(2011))。前述抗体中的每一种均在本发明的范围内。
还已构建了四价抗体，并且所有类型均在本发明的范围内。四价抗体的实例包括但不限于scFv2-Fc、F(ab’)2-scFv2、scFv2-H/L和scFv-dhlx-scFv分子。双特异性scFv2-Fc构建体具有Fc结构域，其中两个scFv对与Fc链的N端连接的一个分子具有特异性，并且另外两个scFv对与Fc链的C端连接的另一个分子具有特异性。双特异性F(ab’)2-scFv2构建体包括与F(ab’)2片段的C端连接的scFv片段。scFv2-H/L构建体具有对与重链连接的一个分子具有特异性的scFv，而对另一个分子具有特异性的scFv与轻链连接。最后，scFv-dhlx-scFv构建体包含一种类型的与螺旋二聚化结构域连接的scFv，然后是另一种类型的scFv。这种类型的两条链可二聚化，从而产生四价抗体。
本发明的结合剂可以是以下形式：抗体分子或抗体样分子，或具有抗体样特性的蛋白质支架，或具有至少两种结合特异性的环肽。因此，结合剂可包含一种或更多种如本文中所述的抗体或其功能性片段。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含Fab片段的重链(Fd片段)和轻链(L)，其能够相互作用并且可在其上并入另外的结合功能或结构域。这样的另外的结合结构域可独立地选自包含两个抗体可变区的结合结构域，例如scFv结合结构域，即VH-VL或VL-VH，以及包含一个抗体可变区的结合结构域，例如VH结合结构域和VHH结合结构域。
在一个实施方案中，本发明的结合剂是Fab-scFv构建体的形式，即包含Fab片段(其包含一条多肽链上的VH和CH1结构域和另一条多肽链上的相应VL和CL结构域，其中抗原结合结构域通过所述多肽链的相互作用形成)和scFv部分(其包含通过同一多肽链上的多肽接头相互连接的VH和VL结构域，其中VH和VL相互作用以形成抗原结合结构域)的构建体。在一个实施方案中，本发明的结合剂是由三条多肽链构成的三聚体，其中第一多肽链包含来源于免疫球蛋白(例如具有第一特异性的免疫球蛋白)的VH，第二多肽包含含有来源于免疫球蛋白(例如具有第二特异性的免疫球蛋白)的VH和来源于免疫球蛋白(例如具有第二特异性的免疫球蛋白)的VL的scFv部分，并且第三多肽链包含来源于免疫球蛋白(例如具有第一特异性的免疫球蛋白)的VL。在一个实施方案中，第一多肽链还包含来源于免疫球蛋白的CH1，并且第三多肽链还包含来源于免疫球蛋白的CL。在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链还包含来源于免疫球蛋白的CH2和CH3(CH2-CH3)结构域，例如分别位于Fab片段和scFv部分的C端。因此，在一个实施方案中，本发明的结合剂包含含有与CH2-CH3连接的VH-CH1的第一多肽链，含有与CH2-CH3连接的scFv部分(VH-VL或VL-VH)的第二多肽链，和含有VL-CL的第三多肽链。在一些实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用。在一些实施方案中，第一多肽链与第三多肽链相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链相互作用，并且第一多肽链还与第三多肽链相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链上的CH2与第二多肽链上的CH2相互作用，和/或第一多肽链上的CH3与第二多肽链上的CH3相互作用。在一些实施方案中，第一多肽链上的VH与第三多肽链上的VL相互作用以形成结合结构域，和/或第一多肽链上的CH1与第三多肽链上的CL相互作用。在一些实施方案中，二硫键在CL中的半胱氨酸残基与CH1中的半胱氨酸残基之间形成。包含CH2-CH3的一条或两条多肽链可包含一个或更多个氨基酸修饰，例如本文中所述的Fc修饰，例如pI、扭曲、另外的Fc和消融修饰，例如，以促进多肽链相互作用。根据本发明，scFv部分的VH和VL优选通过肽接头(“scFv接头”)连接。在一些实施方案中，第一多肽链上的CH1通过肽接头与同一多肽链上的CH2连接。在一些实施方案中，scFv通过肽接头与CH2连接。
在一个实施方案中，本发明的结合剂是Fab2-scFv构建体的形式，即包含两个Fab片段(各自包含一条多肽链上的VH和CH1结构域和另一条多肽链上的相应VL和CL结构域，其中抗原结合结构域通过所述一组多肽链中的每一条的相互作用而形成)和scFv部分(其包含通过同一条多肽链上的多肽接头相互连接的VH和VL结构域，其中VH和VL相互作用以形成抗原结合结构域)的构建体。在一个实施方案中，本发明的结合剂是由四条多肽链构成的四聚体，其中第一多肽链包含来源于免疫球蛋白(例如具有第一特异性的免疫球蛋白)的VH，第二多肽包含来源于免疫球蛋白(例如具有第一特异性的免疫球蛋白)的VH，和包含来源于免疫球蛋白(例如具有第二特异性的免疫球蛋白)的VH的scFv部分，和来源于免疫球蛋白(例如具有第二特异性的免疫球蛋白)的VL，第三多肽链包含来源于免疫球蛋白(例如具有第一特异性的免疫球蛋白)的VL，并且第四多肽链与第三多肽链相同。在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链还包含来源于免疫球蛋白的CH1，例如位于具有第一特异性的免疫球蛋白的VH的C端，并且第三多肽链和第四多肽链还包含来源于免疫球蛋白的CL。在一个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链还包含来源于免疫球蛋白的CH2和CH3(CH2-CH3)结构域，例如分别位于Fab片段和scFv部分的C端。因此，在一个实施方案中，本发明的结合剂包含含有与CH2-CH3连接的VH-CH1的第一多肽链，含有与和CH2-CH3连接的scFv部分(VH-VL或VL-VH)连接的VH-CH1的第二多肽链，以及各自含有VL-CL的第三多肽链和第四多肽链。在一些实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用。在一些实施方案中，第一多肽链与第三多肽链相互作用。在一些实施方案中，第二多肽链与第四多肽链相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链与第二多肽链相互作用，第一多肽链还与第三多肽链相互作用，并且第二多肽链还与第四多肽链相互作用。在一个实施方案中，第一多肽链上的CH2与第二多肽链上的CH2相互作用，和/或第一多肽链上的CH3与第二多肽链上的CH3相互作用。在一些实施方案中，第一多肽链上的VH与第三多肽链上的VL相互作用以形成结合结构域，和/或第一多肽链上的CH1与第三多肽链上的CL相互作用。在一些实施方案中，第二多肽链上的VH(其不是scFv部分的一部分)与第四多肽链上的VL相互作用以形成结合结构域，和/或第二多肽链上的CH1与第四多肽链上的CL相互作用。在一些实施方案中，CL中的半胱氨酸残基和CH1中的半胱氨酸残基之间形成二硫键。包含CH2-CH3的一条或两条多肽链可包含一个或更多个氨基酸修饰，例如本文中所述的Fc修饰，例如pI、扭曲、另外的Fc和消融修饰，例如，以促进多肽链相互作用。根据本发明，scFv部分的VH和VL优选通过肽接头(“scFv接头”)连接。在一些实施方案中，第一多肽链和/或第二多肽链上的CH1通过肽接头与同一多肽链上的CH2连接。在一些实施方案中，scFv通过肽接头与CH2连接。
在本发明的二价结合剂(Fab-scFv形式)的优选实施方案中，第一多肽链上的VH与第三多肽链上的VL相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，并且第二多肽链上scFv的VH和VL相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域。然而，在一些实施方案中，由第一多肽链上的VH和第三多肽链上的VL形成的结合结构域对CD3具有特异性，并且由第二多肽链上的scFv的VH和VL形成的结合结构域对CLDN18.2具有特异性。在本发明的三价结合剂(Fab2-scFv形式)的另一个优选的实施方案中，第二多肽链上的不是scFv一部分的另外的VH与第四多肽链上的VL优选相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域。然而，同样地，以下结合剂在本申请的范围内：其中由第二多肽链上的scFv以及由第一多肽链与第三多肽链上的VH和VL形成的结合结构域对CLDN18.2具有特异性，并且其中由第二多肽链上的不是scFv的一部分的VH以及由第四多肽链上的VL形成的结合结构域对CD3具有特异性。
术语“接头”是指用于连接两个不同功能单元(例如多肽链上的结构域和区域)的任何工具。接头的类型包括但不限于化学接头、肽和多肽接头。肽和多肽接头的序列不受限制。肽接头优选是非免疫原性和柔性的，例如包含丝氨酸和甘氨酸序列的那些。取决于具体的构建体，接头可以长或短。
在一些优选的实施方案中，scFv接头，即连接形成scFv部分的VH和VL的接头，优选包含以下并且优选由以下组成：本文中所述的柔性肽接头，优选氨基酸序列(GKPGS)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6。在一个甚至更优选的实施方案中，scFv接头包含氨基酸序列(GKPGS)4(SEQ ID NO：11)或其功能性变体，并且优选由氨基酸序列(GKPGS)4(SEQ IDNO：11)或其功能性变体组成。优选地，scFv部分通过肽接头与第二多肽链上的CH2连接，所述肽接头包含选自EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：27)、EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：22)和(G4S)2KTHTCPPC(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列，或其功能性变体。其他可用的接头包含具有根据SEQ ID NO：24和25的氨基酸序列的接头。
根据本发明，连接scFv和CH1的接头，优选在CH1的C端处连接scFv和CH1的接头，优选包含氨基酸序列(G4S)x或其功能性变体，优选由氨基酸序列(G4S)x或其功能性变体组成，其中x是2、3、4、5或6，所述氨基酸序列(G4S)x或其功能性变体优选(G4S)2(SEQ ID NO：26)或其功能性变体。根据本发明，连接CH2和scFv的接头，优选在CH2的N端处连接CH2和scFv的接头优选包含以下，并优选由以下组成：选自EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：27)、EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：22)和(G4S)2KTHTCPPC(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列，或其功能性变体。根据本发明，连接CH1和CH2的接头优选包含以下并且优选由以下组成：氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP或其功能性变体。根据本发明，CH1和scFv，例如在第二多肽链上的CH1和scFv通过肽接头连接，所述肽接头优选包含以下，优选由以下组成：氨基酸序列(G4S)2(SEQ ID NO：26)或其功能性变体。然而，可使用本领域已知的其他接头。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含第一、第二和第三多肽链，其中
i)第一多肽链从N端至C端包含下列结构域：
VH(CLDN18.2)-CH1-CH2-CH3，
ii)第二多肽链从N端至C端包含下列结构域：
VH(CD3)-VL(CD3)-CH2-CH3或VL(CD3)-VH(CD3)-CH2-CH3，以及
iii)第三多肽链从N端至C端包含下列结构域：
VL(CLDN18.2)-CL，
优选地其中VH(CLDN18.2)与VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，VH(CD3)与VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域，并且多肽链上的结构域优选地通过本文中所述的肽接头相互连接。
在另一个实施方案中，本发明的结合剂包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中
i)第一多肽链从N端至C端包含下列结构域：
VH(CLDN18.2)-CH1-CH2-CH3，
ii)第二多肽链从N端至C端包含下列结构域：
VH(CLDN18.2)-CH1-VH(CD3)-VL(CD3)-CH2-CH3或VH(CLDN18.2)-CH1-VL(CD3)-VH(CD3)-CH2-CH3
iii)第三多肽链从N端至C端包含下列结构域：
VL(CLDN18.2)-CL，以及
iv)第四多肽链与第三多肽链相同，
优选地，其中第一多肽链上的VH(CLDN18.2)与第三多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，第二多肽链上的VH(CLDN18.2)与第四多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，VH(CD3)和VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域，并且多肽链上的结构域优选地通过本文中所述的肽接头相互连接。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含VH(CLDN18.2)和CH1、CH2和CH3，其包含以下：根据EU编号的第208位处的天冬氨酸残基、第233位处的脯氨酸残基、第234位处的缬氨酸残基、第235位处的丙氨酸残基、第236位处的缺失、第267位处的赖氨酸残基、第295位处的谷氨酸残基、第368位处的天冬氨酸残基、第370位处的丝氨酸残基，第384位处的天冬氨酸残基、第418位处的谷氨酸残基和第421位处的天冬氨酸残基；b)第二多肽链，所述第二多肽链包含通过具有氨基酸序列(GKPGS)4(SEQ ID NO：11)的带电荷的scFv接头相互连接的VH(CD3)和VL(CD3)，以及CH2和CH3，其包含以下：根据EU编号的第233位处的脯氨酸残基、第234位处的缬氨酸残基、第235位处的丙氨酸残基、第236位处的缺失、第267位处的赖氨酸残基、第357位处的谷氨酰胺残基和第364位处的赖氨酸残基；以及c)第三多肽链，其包含VL(CLDN18.2)和CL。在一个实施方案中，第二多肽链还包含本文中所述的VH(CLDN18.2)和CH1，并且结合剂还包含与第三多肽链相同的第四多肽链。
另一些实施方案包括Fab2-scFv形式，其包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包含VH(CLDN18.2)以及CH1和CH2和CH3，其包含扭曲修饰L368D/K370S、pI修饰N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融修饰E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、另外的Fc修饰M428L/N434S；b)第二多肽链，所述第二多肽链包含VH(CD3)和VL(CD3)以及CH2和CH3，其包含扭曲修饰S364K/E357Q、消融修饰E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、另外的Fc修饰M428L/N434S和VH(CLDN18.2)，和c)包含VL(CLDN18.2)和CL的第三多肽链；和d)与第三多肽链相同的第四多肽链。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含第一、第二和第三多肽链，其中
i)第一多肽链从N端至C端包含：
VH(CLDN18.2)-CH1-接头-CH2-CH3，
ii)第二多肽链从N端至C端包含：
VH(CD3)-接头-VL(CD3)-接头-CH2-CH3或VL(CD3)-接头-VH(CD3)-接头-CH2-CH3，并且
iii)第三多肽链从N端至C端包含：
VL(CLDN18.2)-CL，
优选地，其中VH(CLDN18.2)与VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，并且VH(CD3)和VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含第一、第二和第三多肽链，其中
i)第一多肽链从N端至C端包含：
VH(CLDN18.2)-CH1-接头1-CH2-CH3，
ii)第二多肽链从N端至C端包含：
VH(CD3)-接头3-VL(CD3)-接头4-CH2-CH3或VL(CD3)-接头3-VH(CD3)-接头4-CH2-CH3，以及
iii)第三多肽链从N端至C端包含：
VL(CLDN18.2)-CL，
其中接头1包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP或其功能性变体，接头3包含氨基酸序列(GKPGS)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6，优选地其中x是4，并且接头4包含选自EPKSCDKTHTCPPCP、EPKSSDKTHTCPPCP和(G4S)2KTHTCPPCP的氨基酸序列或其功能性变体，并且
优选地，其中VH(CLDN18.2)与VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，并且VH(CD3)与VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中
i)第一多肽链从N端至C端包含：
VH(CLDN18.2)-CH1-接头-CH2-CH3，
ii)第二多肽链从N端至C端包含：
VH(CLDN18.2)-CH1-接头-VH(CD3)-接头-VL(CD3)-接头-CH2-CH3或VH(CLDN18.2)-CH1-接头-VL(CD3)-接头-VH(CD3)-接头-CH2-CH3，
iii)第三多肽链从N端至C端包含下列结构域：
VL(CLDN18.2)-CL，以及
iv)第四多肽链与第三多肽链相同，
优选地，其中第一多肽链上的VH(CLDN18.2)与第三多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，第二多肽链上的VH(CLDN18.2)与第四多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，并且VH(CD3)与VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域。
在一个实施方案中，本发明的结合剂包含第一、第二、第三和第四多肽链，其中
i)第一多肽链从N端至C端包含：
VH(CLDN18.2)-CH1-接头1-CH2-CH3，
ii)第二多肽链从N端至C端包含：
VH(CLDN18.2)-CH1-接头2-VH(CD3)-接头3-VL(CD3)-接头4-CH2-CH3或VH(CLDN18.2)-CH1-接头2-VL(CD3)-接头3-VH(CD3)-接头4-CH2-CH3，
iii)第三多肽链从N端至C端包含：
VL(CLDN18.2)-CL，以及
iv)第四多肽链与第三多肽链相同，
其中接头1包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP或其功能性变体，接头2包含氨基酸序列(G4S)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6，优选地其中x是2，接头3包含氨基酸序列(GKPGS)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6，优选地其中x是4，并且接头4包含选自EPKSCDKTHTCPPCP、EPKSSDKTHTCPPCP和(G4S)2KTHTCPPCP的氨基酸序列或其功能性变体，并且
优选地，其中第一多肽链上的VH(CLDN18.2)与第三多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，第二多肽链上的VH(CLDN18.2)与第四多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，并且VH(CD3)和VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域。
本文中所述的结合剂，和/或本文中所述的所述结合剂的第一、第二和第三(以及任选的第四)多肽链还可包含用于促进结合剂或多肽链分泌的氨基酸序列(例如N端分泌信号)，和/或者促进分子的结合、纯化或检测的一个或更多个表位标签。优选地，分泌信号是信号序列(例如氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS)，其允许足够的通过分泌途径和/或结合剂或其多肽链分泌到胞外环境中。优选地，分泌信号序列是可切割的并且从成熟结合剂或多肽链中除去。优选地，相对于在其中产生结合剂或多肽链的细胞或生物体选择分泌信号序列。
表位标签的氨基酸序列可引入至结合剂或多肽链的氨基酸序列内的任何位置，并且可在编码的蛋白质结构内呈环状，或者可在N端或C端与结合剂或多肽链融合。优选地，表位标签在C端与结合剂或多肽链融合。表位标签可包含切割位点，其允许从结合剂或多肽链中除去标签。所述表位标签可以是在天然和/或变性条件下具有功能的任何种类的表位标签，优选组氨酸标签，最优选包含六个组氨酸的标签。
除了所述第一、第二和任选地第三结合结构域之外，本发明的结合剂还可包含一个或更多个其他结合结构域，其用于例如增强对肿瘤细胞的选择性。这可例如通过提供与肿瘤细胞上表达的其他抗原结合的结合结构域来实现。
术语“翻译后修饰”或类似术语是指蛋白质生物合成后发生的蛋白质修饰，例如共价修饰和酶修饰。如本领域通常已知的，在细胞中表达的结合剂如抗体通常在翻译后被修饰。例如，结合剂例如抗体的翻译后修饰可发生在氨基酸侧链或者重链或轻链(例如本文中所述的第一多肽链和/或第二多肽链)的N或C端处。本文中所述结合剂中可发生的翻译后修饰的实例包括但不限于，例如通过羧肽酶在重链(例如第一多肽链和/或第二多肽链)的C端处切割赖氨酸；通过焦谷氨酰化将重链(例如第一多肽链和/或第二多肽链)N端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸；通过焦谷氨酰化将轻链(例如第三和/或第四多肽链)的N端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸；糖基化；氧化；脱酰胺作用；和糖化。已知这样的翻译后修饰发生在多种结合剂中(Liu et al.，2008，J.Pharmacol.Sci.97(7)：2426-2447)。由于N端处的焦谷氨酰化和C端处的赖氨酸缺失引起的翻译后修饰通常对结合剂的活性没有任何影响(Lyubarskaya et al.，2006，Analyt.Biochem.348(1)：24-39)。
因此，在一个实施方案中，本文中所述的结合剂可包含一种或更多种翻译后修饰。在一个实施方案中，一种或更多种翻译后修饰包含结合剂的一条或更多条多肽链的N端处的焦谷氨酰化。在一个实施方案中，一种或更多种翻译后修饰包含一个或更多个VH(CLDN18.2)的N端处的焦谷氨酰化。在一个实施方案中，一种或更多种翻译后修饰包含VH(CD3)的N端处的焦谷氨酰化。在一个实施方案中，一种或更多种翻译后修饰包含第一多肽链的C端处赖氨酸的缺失。在一个实施方案中，一种或更多种翻译后修饰包含第二多肽链的C端处的赖氨酸缺失。
在本发明的上下文中，产生的结合剂优选能够引发如本文中所述的一种或更多种免疫效应物功能。优选地，所述免疫效应物功能针对在其表面上携带癌症相关抗原CLDN18.2的细胞。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应物功能”包括由免疫***的组分介导的任何功能，其导致例如抑制癌症生长和/或抑制癌症发生，包括抑制癌症播散和转移。优选地，免疫效应物功能导致杀伤癌细胞。免疫效应物功能包括补体依赖性细胞毒性(complementdependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，ADCP)、诱导携带癌症相关抗原之细胞的凋亡、携带癌症相关抗原之细胞的细胞溶解，和/或抑制携带癌症相关抗原之细胞的增殖。本文中所述的结合剂优选地能够将T细胞例如CD4和/或CD8T细胞，特别是CD107a+T细胞募集并重定向至疾病相关的细胞例如癌细胞，并因此通过重定向的T细胞细胞毒性(RTCC)发挥作用，即重定向后的T细胞优选杀伤疾病相关细胞，例如癌细胞。已知CD107a表达与CD4和CD8 T细胞的溶细胞性潜力相关。优选地，所述CD107a+T细胞能够脱颗粒，即它们能够释放细胞毒性分子(例如穿孔素、颗粒酶等)并且还可释放细胞因子，例如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-2(IL2)、干扰素γ(IFNγ)等中的一种或更多种，从而导致靶细胞(例如通过本发明的结合剂T细胞被重定向至该细胞的癌细胞)的死亡。结合剂还可通过与癌细胞表面上的癌症相关抗原结合来发挥作用。例如，结合剂可只是通过与癌细胞表面上的肿瘤相关抗原结合来阻断癌症相关抗原的功能或诱导凋亡。
本发明上下文中的术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指在免疫反应中发挥效应物功能的细胞。例如，免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)，其包含细胞溶解性T细胞。术语“MHC依赖性T细胞”或类似术语涉及当存在于MHC环境中时识别抗原并优选发挥T细胞的效应物功能(例如，杀伤表达抗原的靶细胞)的T细胞。
T细胞属于被称为淋巴细胞的一组白细胞，并且在细胞介导的免疫中发挥中心作用。它们可通过其细胞表面上被称为T细胞受体(TCR)的特殊受体的存在而与另一些淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)区分开。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了数种不同的T细胞亚群，其各自均具有独特的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞等功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面表达CD4糖蛋白。当辅助T细胞通过在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)表面上表达的MHC II类分子而被呈递有肽抗原时，其通常被活化。一旦活化，其迅速***并分泌被称为细胞因子的小蛋白，这些小蛋白调节或协助主动免疫应答。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和癌细胞，并且还参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通常通过结合与存在于几乎机体的每个细胞的表面上的MHC I类缔合的抗原来识别它们的靶标。
所有T细胞均具有作为数种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。T细胞的TCR能够与同主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子结合并呈递在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖和分化成成熟的效应T细胞。在大多数T细胞中，实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，它们由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α-TCR链和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)是很不常见(总T细胞的2％)的T细胞组，其表面上具有由一条γ链和一条δ链构成的独特T细胞受体(TCR)。
所有的T细胞均来源于骨髓中的造血干细胞。来源于造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺中并通过细胞***扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并因此分类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们在发育过程中的进展，它们变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最终成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放到外周组织。
本文中使用的术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体的缺失限定的外周血淋巴细胞亚群。
人体内MHC分子通常称为HLA(人白细胞抗原)分子。有两类主要的MHC分子：I类和II类。几乎在机体的所有有核细胞上都发现了MHC I类抗原。这类MHC分子的主要功能是向CTL展示(或呈递)胞内蛋白质的肽片段。基于这种展示，CTL将攻击展示MHC结合的肽(包括疾病相关肽(抗原)，例如癌症抗原)的那些。CD8阳性T细胞通常具有细胞毒性(因此称为细胞毒性T细胞＝CTL)，识别由具有任何亚细胞定位的蛋白质在胞内加工并由MHCI类分子呈递在细胞表面的9至10个氨基酸的肽。因此，MHC I类分子的表面表达在决定靶细胞对CTL的敏感性方面发挥着至关重要的作用。
本文中所述的结合剂可与治疗性部分或药剂(例如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性同位素)缀合。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害且特别地杀伤细胞的任何药剂。实例包括：泰素(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素(anthracin)二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素，及其类似物或同源物。适于形成缀合物的治疗剂包括但不限于：抗代谢物(例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷基化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司丁(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如，更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春碱)。在一个优选实施方案中，治疗剂为细胞毒剂或放射性毒剂。在另一个实施方案中，治疗剂为免疫抑制剂。在又一个实施方案中，治疗剂为GM-CSF。在一个优选实施方案中，治疗剂为多柔比星、顺铂、博来霉素、硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒蛋白A。
结合剂还可与放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)缀合以产生细胞毒性放射性药物。
用于将这样的治疗部分与结合剂缀合的技术是公知的，参见例如Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，在ControlledDrug Delivery(2nd Ed.)中，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview″，在Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications中，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，中Baldwinet al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)和Thorpe et al.，″The PreparationAnd Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。
根据本发明，在标准测定中，如果药剂(例如抗体)对预定靶标具有显著的亲和力并且与所述预定靶标结合，则其能够与所述预定靶标结合。“亲和力”或“结合亲和力”一般通过平衡解离常数(KD)来测量。优选地，术语“显著亲和力”是指以10-5M或更低、10-6M或更低、10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低或者10-12M或更低的解离常数(KD)与预定靶标结合。
在标准测定中，如果药剂对靶标不具有显著的亲和力并且不与所述靶标显著地结合，特别是不与之可检出地结合，则所述药剂(基本上)不能与所述靶标结合。优选地，如果以高至2μg/ml、优选10μg/ml、更优选20μg/ml、特别是50或100μg/ml或更高的浓度存在，则所述药剂不能与所述靶标可检出地结合。优选地，如果药剂与靶标以与预定靶标(所述药剂能够与其结合)结合之KD相比至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍的KD结合，则所述药剂对所述靶标不具有显著的亲和力。例如，如果药剂与所述药剂能够结合的靶标结合的KD为10-7M，则所述药剂与对其无显著亲和力的靶标结合的KD为至少10-6M、10-5M、10-4M、10- 3M、10-2M或10-1M。
在标准测定中，如果结合剂(例如抗体)能够与所述预定靶标结合同时不能够与其他靶标结合，即对其他靶标不具有显著亲和力并且不与其他靶标显著结合，则所述结合剂对所述预定靶标具有特异性。根据本发明，如果结合剂能够与CLDN18.2结合，但(基本上)不能够与其他靶标结合，则所述结合剂对CLDN18.2具有特异性。优选地，如果结合剂与这样的其他靶标的亲和力和结合没有显著超过与CLDN18.2不相关的蛋白质(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(HSA)或非密蛋白跨膜蛋白(例如MHC分子或转铁蛋白受体)或任何其他指定的多肽)的亲和力或结合，则所述结合剂对CLDN18.2具有特异性。优选地，如果结合剂与靶标以与非特异性靶标结合之KD相比低至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍的KD结合，则所述结合剂对所述预定靶标具有特异性。例如，如果结合剂与其特异性靶标结合的KD为10-7M，则结合剂与其无特异性的靶标结合的KD会为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M或10-1M。
本文中使用的术语“Kd”(秒-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也被称为koff值。
本文中使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
可使用任何合适的方法实验性测定结合剂与靶标的结合；参见例如Berzofsky etal.，″Antibody-Antigen Interactions″在Fundamental Immunology中，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press New York，N Y(1984)，Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and CompanyNew York，N Y(1992)和本文中描述的方法。可使用常规技术容易地测定亲和力，例如，通过平衡透析；通过使用BIAcore 2000仪器，使用制造商所描述的通用方法；通过使用放射标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。例如，可通过Scatchard等，Ann N.Y.Acad.ScL，51：660(1949)的方法分析亲和力数据。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下测量，则所测量的结合剂与抗原之间的具体相互作用的亲和力可以不同。因此，亲和力和其他抗原-结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选地用结合剂与抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液进行。
术语“竞争”是指两种结合剂(例如抗体)之间对于与靶抗原结合的竞争。如果两种结合剂不为了与靶抗原结合而相互阻断，则这样的结合剂是非竞争性的，并且这表明所述结合剂不与相同部分(即靶抗原的表位)结合。本领域技术人员公知如何测试结合剂对于与靶抗原结合的竞争。这样的方法的实例是所谓的交叉竞争测定，其可例如作为ELISA或通过流式细胞术进行。
例如，可通过用每种结合剂包被ELISA板孔来进行基于ELISA的测定；添加竞争性结合剂和抗原/靶标的His标记的胞外结构域并孵育；可通过添加生物素化的抗His抗体，然后添加链霉亲和素-聚-HRP，并进一步使与ABTS的反应显色并测量405nm处的吸光度来检测所添加的结合剂是否抑制His-标记的蛋白质与包被的结合剂的结合。例如，可通过用过量的未标记结合剂孵育表达抗原/靶标的细胞，用亚最佳(sub-optimal)浓度的生物素标记的抗体孵育细胞，然后用荧光标记的链霉亲和素孵育并通过流式细胞术进行分析来进行流式细胞术测定。
如果两种结合剂例如抗体与相同的抗原和相同的表位结合，则它们具有“相同的特异性”。这样的结合剂将在竞争结合测定中竞争结合。在一个实施方案中，与相同表位结合的结合剂被认为与靶分子上的相同氨基酸结合。抗体与靶抗原上相同表位结合可通过本领域技术人员已知的标准丙氨酸扫描实验或抗体-抗原结晶实验来确定。
结合剂竞争与抗原结合的能力表明，这些结合剂可与抗原的相同表位区域结合，或者当与另一个表位结合时在空间上阻碍结合剂与该特定表位区域的结合。基于竞争性结合剂在标准结合测定中与一种或更多种结合剂竞争的能力，可容易地鉴定出竞争性结合剂，所述标准结合测定例如表面等离子体共振分析、ELISA测定或流式细胞术(参见WO2013/173223)。例如，结合剂之间的竞争可通过交叉阻断测定来检测。例如，可以通过在微量滴定板的孔中包被靶抗原并添加抗原结合剂和候选竞争性测试结合剂来进行竞争性ELISA测定。与孔中的抗原结合的抗原结合剂的量与和其竞争(例如与相同表位的)结合的候选竞争性测试结合剂的结合能力间接相关。具体地，候选竞争性测试结合剂对相同表位的亲和力越大，则与抗原包被孔结合的抗原结合剂的量就越小。与孔结合的抗原结合剂的量可通过用可检测或可测量的标记物质标记结合剂来测量。如WO2013/173223中所述和本领域中已知的，表面等离子体共振分析(例如使用Biacore仪器)可用于鉴定由结合剂识别的重叠和不同表位区域。或者，可以使用生物层干涉术来确定竞争。
用于与另一种结合剂(例如包含如本文中所述的重链和轻链可变区的结合剂)竞争与抗原结合的结合剂，或对另一种结合剂(例如包含如本文中所述的重链和轻链可变区的结合剂)的抗原具有特异性的结合剂，可以是包含如本文中所述的所述重链和/或轻链可变区的变体的结合剂，例如如本文中所述的CDR中的修饰和/或一定程度的同一性。
本文中所用的“同种型”是指由重链恒定区基因所编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
本文中所用的“同种型转换(isotype switching)”的指抗体的类别或同种型从一个Ig类别变成其他Ig类别之一的现象。
本文中所用的术语“天然存在的”当应用于物体时是指该物体可见于自然界这一事实。例如，存在于可从自然界来源分离的生物体(包括病毒)中并且未经人在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文中使用的术语“重排”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段在编码基本完整VH或VL结构域的构象中分别位于紧邻D-J或J区段的位置。重排的免疫球蛋白(抗体)基因座可通过与种系DNA进行比较来鉴定；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。
涉及V区段时，本文中使用的术语“未重排的”或“种系构型”是指其中V区段未重组从而未与D或J区段紧邻的构型。
在一个实施方案中，本发明的结合剂具有与CLDN18.2结合的能力，即与CLDN18.2中存在的表位(优选位于CLDN18.2的细胞外结构域内的表位，特别是第一胞外环，优选CLDN18.2的第29至78位氨基酸)结合并且优选与其结合的能力。在一些特别的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的药剂与CLDN18.2上的表位(其不存在于CLDN18.1上)结合。
具有与CLDN18.2结合之能力的药剂优选地与CLDN18.2结合，优选地与人、小鼠和/或食蟹猴的CLDN18.2结合，但不与CLDN18.1结合，优选地不与人、小鼠和/或食蟹猴的CLDN18.1结合。优选地，与CLDN18.2结合的药剂不与CLDN9结合，优选地不与人、小鼠和/或食蟹猴的CLDN9结合。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的药剂对CLDN18.2具有特异性。优选地，具有与CLDN18.2结合之能力的药剂与细胞表面上表达的CLDN18.2结合。在一些特别优选的实施方案中，具有与CLDN18.2结合之能力的药剂与存在于活细胞表面上的CLDN18.2的天然表位结合。
术语“片段”特别是指重链可变区(vH)和/或轻链可变区(vL)的一个或更多个互补决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或更多个互补决定区(CDR)选自一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。在一个特别优选的实施方案中，术语“片段”是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，如本文中所述包含一个或更多个CDR、一组CDR或CDR组之组合的结合结构域包含所述CDR及其间插框架区(intervening framework region)。优选地，该部分还将包含至少约50％的第一和第四框架区之一或二者，所述50％为第一框架区的C端50％和第四框架区的N端50％。通过重组DNA技术进行的结合剂构建可导致将残基N端或C端引入至由引入的接头所编码的可变区，以有助于克隆或其他操作步骤，包括引入接头以连接本发明的可变区与其他蛋白质序列，包括免疫球蛋白重链、其他可变区或蛋白质标签。
在一个实施方案中，如本文中所述的包含一个或更多个CDR、一组CDR或CDR组之组合的结合结构域包含人抗体框架中的所述CDR。
CDR区的准确鉴定取决于用于确定所涉及的氨基酸残基的计算方法。例如，根据Kabat等人(同上)，可变区通常涵盖VL中的第24至34位(CDR1)、第50至56位(CDR2)和第89至97位(CDR3)，以及VH中的约第31至35位(CDR1)、第50至65位(CDR2)和第95至102位(CDR3)氨基酸残基；可变区也可涵盖形成高变环的那些残基(例如VL中的第26至32位(CDR1)、第50至52位(CDR2)和第91至96位(CDR3)残基以及VH中的第26至32位(CDR1)、第53至55位(CDR2)和第96至101位(CDR3)残基(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917))。
本领域技术人员将理解，本文中公开的序列中CDR位置的准确鉴定可能略有不同，这取决于如下表1所示使用的编号***(参见Lafranc et al.，Dev.Comp.Immunol.27(1)：55-77(2003))。
表1
因此，本文中公开的CDR序列还包含根据不同编号***来源的变体。因此，每个VH的公开内容是可来源于其的CDR(例如，CDR1、CDR2和CDR3)的公开内容，并且每个VL的公开内容是可来源于其的CDR(例如，CDR1、CDR2和CDR3)的公开内容。
在本说明书通篇，当涉及对CD3或CLDN18.2具有特异性的结合结构域的可变区中的残基(约是轻链的第1至107位残基和重链的第1至113位残基)时，使用Kabat编号***，而如本文中所述对于CH1和CH2-CH3(任选地包括铰链)区，使用EU编号***。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含VH，所述VH包含鉴定为在选自SEQ ID NO：38、39和40的氨基酸序列中的互补决定区CDR1、CDR2和/或CDR3。更优选地，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含VH，所述VH包含鉴定为在SEQ ID NO：39所示氨基酸序列中的互补决定区CDR1、CDR2和/或CDR3。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含VL，所述VL包含鉴定为在选自SEQ ID NO：41和42的氨基酸序列中的互补决定区CDR1、CDR2和/或CDR3。更优选地，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含VL，所述VL包含鉴定为在SEQ ID NO：42所示氨基酸序列中的互补决定区CDR1、CDR2和/或CDR3。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含下列CDR组：
VH包含CDR3，其包含SEQ ID NO：34中所示的序列或其功能性变体，以及
VL包含CDR3，其包含SEQ ID NO：37中所示的序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，VH还包含含有SEQ ID NO：32所示序列或其功能性变体的CDR1，和/或者包含含有SEQ ID NO：33所示序列或其功能性变体的CDR2；以及/或者VL还包含含有SEQ ID NO：35所示序列或其功能性变体的CDR1，和/或者包含含有SEQ ID NO：36所示序列或其功能性变体的CDR2。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含下列CDR组：
VH包含含有SEQ ID NO：32所示序列或其功能性变体的CDR1，包含含有SEQ ID NO：33所示序列或其功能性变体的CDR2，和包含含有SEQ ID NO：34所示序列或其功能性变体的CDR3，以及VL包含含有SEQ ID NO：35所示序列或其功能性变体的CDR1，包含含有SEQ IDNO：36所示序列或其功能性变体的CDR2和包含含有SEQ ID NO：37所示序列或其功能性变体的CDR3。优选地，VH包含SEQ ID NO：32、33和34的CDR1、2和3，而VL包含SEQ ID NO：35、36和37的CDR1、2和3。
在一个实施方案中，所述重链和轻链可变区包含散布在框架区内的所述互补决定区。在一个实施方案中，每个可变区包含三个互补决定区(CDR1、2和3)和四个框架区(FR1、2、3和4)。在一个实施方案中，所述互补决定区和所述框架区从氨基端至羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含VH(CLDN18.2)，所述VH(CLDN18.2)包含选自SEQ ID NO：38、39、40的氨基酸序列，或其功能性变体，优选由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含VL(CLDN18.2)，所述VL(CLDN18.2)包含选自SEQ ID NO：41、42的氨基酸序列，或其功能性变体，优选由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含以下VH(CLDN18.2)与VL(CLDN18.2)的组合：
VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含以下VH(CLDN18.2)与VL(CLDN18.2)的组合：
VH(CLDN18.2)包含由SEQ ID NO：40表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL(CLDN18.2)包含由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个特别优选的实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含以下VH(CLDN18.2)与VL(CLDN18.2)的组合：
VH(CLDN18.2)包含由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL(CLDN18.2)包含由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，存在于本发明的结合剂中的VH和VL结构域的框架区可包含氨基酸变化，但与人种系序列保持至少80％、85％或90％的同一性。
在另一些实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域包含抗体的重链和轻链可变区，其(i)与包含如上所述的重链和轻链可变区的抗体竞争CLDN18.2结合和/或(ii)对包含如上所述的重链和轻链可变区的抗体的CLDN18.2具有特异性。
在一个实施方案中，本发明结合剂的对CLDN18.2具有特异性的结合结构域具有如本文中所述的Fab分子的形式。在该实施方案中，VH(CLDN18.2)是一条多肽链(例如本发明结合剂的第一多肽链)的一部分，而VL(CLDN18.2)是另一条多肽链(例如本发明结合剂的第三多肽链)的一部分。在一个实施方案中，VH(CLDN18.2)是本文中所述的第一多肽链和第二多肽链的一部分，而VL(CLDN18.2)是本发明结合剂的第三多肽链和与第三多肽链相同的第四多肽链的一部分。
应当理解，Fab2-scFv形式的本发明结合剂的与CLDN18.2结合的结合结构域可以是相同的或基本上相同或不同的，并因此可与相同或基本相同的表位或不同的CLDN18.2的表位结合。因此，Fab2-scFv形式的本发明结合剂的与CLDN18.2结合的这两种结合结构域可对应于或基本上对应于与本文中所述的CLDN18.2结合的结合结构域之一，或者它们可独立地选自与本文中所述的CLDN18.2结合的结合结构域。
通常来说，本领域已知的任何CD3结合结构域或其片段可用于本发明的结合剂，例如抗CD3抗体的CD3结合结构域。可用于提供根据本发明的结合剂的抗CD3抗体包括但不限于UCHT1-HS(人源化mAB)、UCHT1-MM(鼠mAB)、CLB-T3、TR66、145-2C11。
UCHT1是单克隆IgG1抗CD3抗体，其检测人和灵长类动物样品类型中的CD3。CLB-T3是小鼠单克隆抗CD3抗体，其针对CD3抗原并与80％至90％的人外周T淋巴细胞和髓胸腺细胞反应。TR66是小鼠IgG1单克隆抗CD3抗体，其识别人CD3的ε链。145-2C11是亚美尼亚仓鼠单克隆抗小鼠CD3抗体。
优选地，对CD3具有特异性的结合结构域的VH和VL结构域来源于抗体/抗体分子和抗体样分子，在其他TCR亚基的情况下，其能够特异性识别人CD3，所述TCR亚基存在于表达天然构型的TCR的活化的原代人T细胞上。来源于对CD3-ε链具有特异性的抗体的VH和VL结构域是最优选的，并且所述(亲本)抗体应该能够特异性结合反映天然或接近天然结构的表位或在TCR复合体的情况下存在的人CD3中的构象表位。在本发明的一个实施方案中，对CD3具有特异性的结合结构域的VH和VL结构域来源于选自UCHT1-HS、UCHT1-MM、CLB-T3和TR66的CD3特异性抗体。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含VH，所述VH包含鉴定为在选自SEQ ID NO：54、58、61、64、67和70的氨基酸序列中的CDR1、CDR2和/或CDR3。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含VH，所述VH包含选自以下实施方案(i)至(vi)的CDR1、CDR2和CDR3组：
(i)CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：45或其功能性变体，
(ii)CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：50或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：45或其功能性变体，
(iii)CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：51或其功能性变体，
(iv)CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：52或其功能性变体，
(v)CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：53或其功能性变体，以及
(vi)CDR1：SEQ ID NO：49或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：45或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含VL，所述VL包含鉴定为在根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列中的CDR1、CDR2和/或CDR3。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含VL，所述VL包含下列CDR1、CDR2和CDR3组：
CDR1：SEQ ID NO：46或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：47或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：48或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含VH与VL的组合，所述VH和VL各自包含选自以下实施方案(i)至(vi)的CDR1、CDR2和CDR3组：
(i)VH：CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：45或其功能性变体，VL：CDR1：SEQ ID NO：46或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：47或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：48或其功能性变体，
(ii)VH：CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：50或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：45或其功能性变体，VL：CDR1：SEQ ID NO：46或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：47或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：48或其功能性变体，
(iii)VH：CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：51或其功能性变体，VL：CDR1：SEQ ID NO：46或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：47或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：48或其功能性变体，
(iv)VH：CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：52或其功能性变体，VL：CDR1：SEQ ID NO：46或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：47或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：48或其功能性变体，
(v)VH：CDR1：SEQ ID NO：43或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：53或其功能性变体，VL：CDR1：SEQ ID NO：46或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：47或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：48或其功能性变体，以及
(v)VH：CDR1：SEQ ID NO：49或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：44或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：45或其功能性变体，VL：CDR1：SEQ ID NO：46或其功能性变体，CDR2：SEQ ID NO：47或其功能性变体，CDR3：SEQ ID NO：48或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，对CD3具有特异性的结合结构域包含选自以下实施方案(i)至(vi)的VH和VL：
(i)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：54的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：58的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体，
(iii)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：61的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体，
(iv)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：64的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体，
(v)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：67的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体，和
(v)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：70的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个实施方案中，对CD3具有特异性的结合结构域包含以下或由以下组成：选自SEQ ID NO：56、57、59、60、62、63、65、66、68、69、71和72的氨基酸序列或其功能性变体。当然，包含在所述序列中的scFv接头可被任何另外的scFv接头(例如这样的scFv接头，所述scFv接头选自SEQ ID NO：2至20，或其功能性变体)替代。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO：54、58和61的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含VL，其包含SEQ ID NO：55中所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的对CD3具有特异性的结合结构域包含选自以下实施方案(i)至(iii)的VH和VL：
(i)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：54的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：58的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体，和
(iii)VH包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：61的氨基酸序列或其功能性变体，以及VL包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO：55的氨基酸序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，包含对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂以高亲和力与CD3结合，即其为强CD3结合剂(例如，这样的结合剂，其包含以下：SEQ ID NO：56或57；或者SEQ ID NO：54，或其中鉴定出的CDR1，2和3，和55，或其中鉴定出的CDR1，2和3)。在一些实施方案中，包含对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂以中等亲和力与CD3结合，即，其为中等CD3结合剂。在一些实施方案中，包含对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂以低亲和力与CD3结合，即其为低CD3结合剂。在一些实施方案中，对CD3的较高结合亲和力增强了RTCC。在一个实施方案中，与单价结合相比，与CLDN18.2的二价结合增强了RTCC。
在某些实施方案中，如本文中所述，本发明结合剂的一条或更多条多肽链包含CH1。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第一多肽链包含CH1。在另一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第一多肽链和第二多肽链包含CH1。优选地，本发明结合剂的第一多肽链和/或第二多肽链的CH1来源于IgG，优选IgG1，更优选人IgG1。在某些实施方案中，本发明结合剂的一条或更多条多肽链包含CH2和CH3结构域。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第一多肽链和/或第二多肽链包含CH2和CH3结构域。优选地，本发明结合剂的第一多肽链和/或第二多肽链的CH2和CH3结构域来源于IgG，优选IgG1，更优选人IgG1。在一个优选的实施方案中，包含VH(CLDN18.2)的本发明结合剂第一多肽链包含CH1、CH2和CH3，以及包含VH(CD3)和VL(CD3)的本发明结合剂第二多肽链包含CH2和CH3，其中所述结构域优选地来源于IgG，例如IgG1，例如人IgG1。在另一个优选的实施方案中，包含VH(CLDN18.2)的本发明结合剂第一多肽链包含CH1、CH2和CH3，并且包含VH(CLDN18.2)、VH(CD3)和VL(CD3)的本发明结合剂第二多肽链包含CH1、CH2和CH3，其中所述结构域优选地来源于IgG，例如IgG1，例如人IgG1。
在某些实施方案中，本发明结合剂的多肽链，例如包含VL(CLDN18.2)的第三(和任选的第四)多肽链包含CL，例如来源于Igκ或Igλ(优选Igκ，更优选人Igκ)的CL。
在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第一多肽链包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第二多肽链包含SEQ ID NO：29或30所示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，结合剂的第三多肽链和任选的第四多肽链包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列或其功能性变体。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂包含第一、第二、第三和任选的第四多肽链，所述多肽链包含选自以下实施方案的氨基酸序列：
(i)第一多肽链包含SEQ ID NO：28或其功能性变体，第二多肽链包含SEQ ID NO：29或其功能性变体，以及第三多肽链包含SEQ ID NO：31或其功能性变体，或
(ii)第一多肽链包含SEQ ID NO：28或其功能性变体，第二多肽链包含SEQ ID NO：30或其功能性变体，以及第三多肽链包含SEQ ID NO：31或其功能性变体，
其中第四多肽链(如果存在的话)与第三多肽链相同。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合剂包含至少一个对CLDN18.2具有特异性的结合结构域和至少一个对CD3具有特异性的结合结构域。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第一多肽链包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第二多肽链包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第三多肽链包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，包含至少一个对CLDN18.2具有特异性的结合结构域和至少一个对CD3具有特异性的结合结构域的本发明的结合剂包含以下的第一、第二和第三多肽链组：SEQ ID NO：73、75和78，或其功能性变体。
在另一个优选的实施方案中，本发明的结合包含至少两个对CLN18.2具有特异性的结合结构域和至少一个对CD3具有特异性的结合结构域。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第一多肽链包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第二多肽链包含以下或由以下组成：选自SEQ ID NO：74、76和77的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，本发明结合剂的第三多肽链包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列或其功能性变体。在一个优选的实施方案中，包含至少两个与CLDN18.2结合的结合结构域和至少一个对CD3具有特异性的结合结构域的本发明的结合剂包含选自以下的第一、第二、第三和第四多肽链组：(i)SEQ ID NO：73、74和78；(ii)SEQ ID NO：73、76和78；(iii)SEQ ID NO：73、77和78，或其功能性变体，其中第四结合结构域与第三结合结构域相同。
应理解，本文中所述的结合剂可通过施用核酸(例如编码药剂的RNA)和/或通过施用包含核酸(例如编码药剂的RNA)的宿主细胞而递送至患者。如果结合剂包含多于一条多肽链，则不同的多肽链可在相同的核酸上或在不同的核酸(例如核酸组)上编码。因此，待施用的核酸可以是不同核酸分子(例如核酸组)的混合物。例如当向对象(例如患者)施用时，编码结合剂的核酸或核酸组可以以裸露的形式或以合适的递送载剂(例如以脂质体或纳米粒或病毒颗粒的形式)存在，或在宿主细胞内。经过长时间，提供的核酸或核酸组可以以持续的方式产生药剂从而减轻对于治疗性抗体至少部分地观察到的不稳定性。可通过重组的方式产生递送至患者的核酸或核酸组。如果将宿主细胞内不存在的核酸或核酸组向患者施用，则优选被表达由所述核酸编码之药剂的患者的细胞摄取。如果在宿主细胞内存在核酸或核酸组时向患者施用核酸或核酸组，优选由患者中的宿主细胞进行表达以产生由所述核酸编码的药剂。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过遗传改造制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组对象”(例如重组核酸)不是天然存在的。
本文中所用的术语“天然存在的”是指该物体可见于自然界这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从自然界来源分离并且未经人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
本文中所用的术语“核酸”旨在包括DNA和RNA，例如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。
核酸或核酸组可包含在载体中。核酸组也可包含在载体组中，使得核酸组中的每个核酸均包含在载体中。如本文中所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，其包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如腺病毒或杆状病毒载体)，或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒和病毒载体且一般含有用于在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或者在体外表达***中可操作地连接的编码序列之表达所必需的期望编码序列和合适的DNA序列。克隆载体一般用于改造和扩增某期望DNA片段，并可缺乏表达所期望DNA片段所需要的功能性序列。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2’-位上具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰的RNA。这样的改变可包括例如向RNA的末端或内部(例如在RNA的一个或更多个核苷酸处)添加非核苷酸材料。在RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”，其意指“信使RNA”并且涉及可使用DNA作为模板而产生且编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、蛋白质或肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。mRNA在细胞中和体外具有有限的半衰期。优选地，使用DNA模板通过体外转录来产生mRNA。在本发明的一个实施方案中，RNA通过在体外转录或化学合成来获得。体外转录方法是技术人员已知的。例如，有多种市售的体外转录试剂盒。
在本发明的一个实施方案中，RNA是自我复制的RNA，例如单链自我复制的RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是正义单链RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是病毒RNA或来自病毒RNA的RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是甲病毒(alphaviral)基因组RNA或来源于甲病毒基因组RNA。如本领域已知的，甲病毒RNA可以充当mRNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是病毒基因表达载体。在一个实施方案中，病毒是塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)。在一个实施方案中，自我复制的RNA包含一个或更多个转基因，所述转基因中至少一个编码本文中所述的结合剂。在一个实施方案中，如果RNA是病毒RNA或来自病毒RNA，则转基因可部分地或完全地替代病毒序列，例如编码结构蛋白的病毒序列。在一个实施方案中，自我复制的RNA是体外转录的RNA。
为了提高根据本发明使用的RNA的表达和/或稳定性，可将其修饰，优选不改变表达的肽或蛋白质的序列。
在RNA的情况下，根据本发明所使用的术语“修饰”包括不在所述RNA中天然存在的RNA的任何修饰。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。可通过用磷酸酶处理RNA来实现除去这样的未加帽的5’-三磷酸。
根据本发明的RNA可具有经修饰的天然存在的或合成的核糖核苷酸以提高其稳定性和/或降低细胞毒性和/或免疫原性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷被部分地或完全地(优选完全地)替换为胞苷。作为替代或补充，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷被部分地或完全地(优选完全地)替换为尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA。术语“5’-帽”是指在mRNA分子的5’端发现的帽结构且一般由通过不寻常的5’-至5’-三磷酸键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位上被甲基化。术语“常规的5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽，优选是指7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构的5’-帽类似物且被修饰以在与RNA连接时(优选在体内和/或在细胞中)具有稳定所述RNA的能力。
在所述5’-帽或5’-帽类似物存在的情况下，可通过DNA模板的体外转录来实现提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA，其中所述5’-帽共转录地并入到所产生的RNA链中，或者例如可通过体外转录产生RNA且使用加帽酶(例如，痘苗病毒(vaccinia virus)的加帽酶)将5’-帽在转录后连接至RNA。
RNA可包括进一步的修饰。例如，在本发明中使用的RNA的进一步修饰可以是天然存在的poly(A)尾的延长或截短或者5’-或3’-非翻译区(UTR)的改变，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如，***一个或更多个、优选两个拷贝的来自珠蛋白基因(例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β珠蛋白，更优选人β-珠蛋白)的3’-UTR。
因此，为了提高根据本发明所使用的RNA的稳定性和/或表达，可对其进行修饰以与polyA序列结合出现，优选长度为10至500、更优选30至300、甚至更优选65至200、且尤其是100至150个腺苷残基。在一个尤其优选的实施方案中，poly-A序列的长度为约120个腺苷残基。此外，两种或更多种3’-非翻译区(UTR)并入到RNA分子的3’-非翻译区中可导致翻译效率的提高。在一个特别的实施方案中，3’-UTR来自人β-珠蛋白基因。
优选地，如果RNA递送至细胞(即转染到细胞中)，特别是存在于体内的细胞，则RNA表达其编码的蛋白质、肽或抗原。
术语“转染”涉及向细胞中引入核酸(特别是RNA)。出于本发明的目的，术语“转染”还包括向细胞中引入核酸或由这样的细胞摄取核酸，其中所述细胞可存在于对象(例如患者)中。因此，根据本发明，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，所述细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，即使所述转染的遗传材料仅瞬时表达也是足够的。由于在转染过程中引入的核酸通常不整合到核基因组中，因此外来核酸将通过有丝***稀释或被降解。允许核酸附加型扩增(episomal amplification)的细胞大辐降低了稀释的速率。如果希望经转染的核酸实际上保留在细胞及其子代细胞的基因组中，则必须发生稳定转染。RNA可被转染到细胞中以瞬时表达其所编码的蛋白质。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子活性、量或数目之一半而所需的时间周期。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可能影响RNA的“表达持续时间”。可预期具有长半衰期的RNA将长期表达。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码被转录为RNA的过程。随后，RNA可被翻译为蛋白质。根据本发明中，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中RNA(特别是mRNA)是优选使用合适的细胞提取物在无细胞***中体外合成的RNA。优选地，克隆载体应用于生产转录物。这些克隆载体一般被指定为转录载体，并且由根据本发明的术语“载体”所涵盖。
根据本发明的术语“翻译”涉及在细胞的核糖体中的过程，信使RNA的链通过其指导氨基酸序列的组装以形成肽或蛋白质。
根据本发明，术语“表达”以其最通用的含义使用，并且包括例如通过转录和/或翻译生产RNA和/或肽或蛋白质。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别地涉及肽或蛋白质的产生。它还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“反常表达”。
根据本发明，“异常表达”或“反常表达”意指与参照(例如，不具有与某种蛋白质(例如肿瘤抗原)的异常或反常表达相关之疾病的对象中的状态)相比，表达被改变，优选提高。表达的提高是指提高至少10％，特别是至少20％，至少50％或至少100％，或更多。在一个实施方案中，表达仅见于患病组织中，而在健康组织中表达被抑制。
术语“特异性表达”意指蛋白质基本上仅在特定的组织或器官中表达。例如，肿瘤抗原在胃黏膜中特异性表达意指所述蛋白质主要在胃黏膜中表达且在其他组织中不表达或在其他组织或器官类型中的表达没有达到显著程度。因此，即专门在胃黏膜的细胞中表达且在任何其他组织(例如睾丸)中表达显著程度较小的蛋白质在胃黏膜的细胞中特异性地表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原也可在正常条件下在一种以上的组织类型或器官中(例如在2或3种组织类型或器官，但优选是在不超过3种不同的组织或器官类型中)特异性地表达。在这种情况下，则肿瘤抗原在这些器官中特异性地表达。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下表达，优选在肺和胃中以大致相同的程度表达，则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
根据本发明，术语“RNA编码”意指如果存在于合适的环境中(优选在细胞内)，RNA可被表达以产生其所编码的蛋白质或肽。
本发明的一些方面依赖于宿主细胞的过继转移，宿主细胞在体外转染有核酸(例如本文中所述的编码结合剂的RNA)，并被转移至接受者(例如患者)，优选在从低的前体频率向临床相关细胞数目离体扩增后进行。根据本发明，用于治疗的宿主细胞可与待治疗接受者是自体的(autologous)、同种异体的(allogeneic)或同基因的(syngeneic)。
术语“自体的”用于描述来自同一对象的任何事物。例如，“自体移植物”是指来自同一对象的组织或器官的移植物。这样的过程是有利的，原因它们克服了免疫学屏障，否则会导致排斥。
术语“同种异体的”用于描述来自相同物种之不同个体的任何事物。当在一个或更多个基因座上的基因不相同时，将两个或更多个个体称为彼此是同种异体的。
术语“同基因的”用于描述来自具有相同基因型的个体或组织的任何事物，即，同卵双胞胎或同一近交品系的动物，或其组织。
术语“异源的”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例，将一个个体的骨髓转移到不同的个体中构成了异源移植物。异源基因是来自不同于该对象之来源的基因。
根据本发明的术语“肽”包括寡肽和多肽并且指包含两个或更多个(优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选9个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个且至多优选8、10、20、30、40或50个，特别是100个)通过肽键共价连接的氨基酸。术语“蛋白质”是指大的肽，优选是指具有超过100个氨基酸残的肽，但一般而言，术语“肽”和“蛋白质”是同义词并且在本文中可互换使用。
本文中关于特定的氨基酸序列(例如，在序列表中所示的那些)给出的教导将被解释为也涉及产生与所述特定的序列在功能上等同之序列的所述特异性序列的变体，例如与特定氨基酸序列的性质显示出相同或相似性质的氨基酸序列。一个重要的性质是保留与靶标的结合或维持效应物功能。优选地，相对于特定序列为变体的序列，当它替代了抗体中的特定序列时保留了所述抗体与CLDN18.2和/或CD3的结合且优选保留如本文中所述抗体的功能。此外，优选地，相对于特定序列为变体的序列，当它替代了结合剂中的特定序列时保留了所述结合剂与CLDN18.2和/或CD3的结合且优选保留如本文中所述结合剂的功能，例如细胞毒性T细胞介导的裂解。
例如，序列表中示出的序列可被修饰以除去一个或更多个、优选全部的游离半胱氨酸残基，特别是通过除半胱氨酸以外的氨基酸(优选丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)来替代半胱氨酸残基。
本领域技术人员应当理解，特别是可对CDR、高变区和可变区的序列进行修饰而不丧失结合CLDN18.2和/或CD3的能力。例如，CDR区与本文中指定的区域相同或高度同源。对于“高度同源”，可考虑在CDR中进行1至5(优选1至4，例如1至3或1或2)个替换。此外，可对高变区和可变区进行修饰以使得它们显示出与本文中具体公开的区域的显著同源性。在一个实施方案中，可变区序列仅在框架序列中与本文中具体公开的可变区序列不同。
本发明的结合剂可在细胞内产生(例如在胞质溶胶中，在周质中或在内含体中)，并随后从宿主细胞中分离并任选地进一步纯化；或者它们可在胞外产生(例如在培养宿主细胞的培养基中)，并随后从培养基中分离并任选地进一步纯化。用于重组产生多肽的方法和试剂(例如特异性的合适表达载体、转化或转染方法、选择标志物、蛋白质表达的诱导方法、培养条件等)是本领域中已知的。类似地，蛋白质分离和纯化技术是本领域技术人员公知的。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选涉及完整的细胞，即具有完整的膜，尚未释放其正常的细胞内组分(例如酶、细胞器或遗传物质)的细胞。完整的细胞优选活细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地，根据本发明，所述术语涉及可转染有外源核酸的任何细胞。优选地，当细胞转染有外源核酸并转移至接受者时可在接受者中表达所述核酸。术语“细胞”包括细菌细胞；其他可用的细胞是酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括来自革兰氏阴性细菌菌株的细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)，以及***菌株，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和乳球菌属(Lactococcus)的菌株。合适的真菌细胞包括来自木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)和曲霉属(Aspergillus)物种的细胞。合适的酵母细胞包括来自酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))和汉逊酵母属(Hansenula)物种的细胞。合适的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、293 HEK等。然而，也可使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和任何在本领域种用于表达异源蛋白质的其他细胞。特别优选哺乳动物细胞用于过继转移，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类的细胞。细胞可来源于大量的组织类型，且包括原代细胞和细胞系，例如免疫***的细胞，特别是抗原呈递细胞(例如树突细胞和T细胞)、干细胞(例如造血干细胞和间充质干细胞)以及其他的细胞类型。抗原呈递细胞是在其表面上在主要组织相容性复合体的背景中展示抗原的细胞。T细胞可使用其T细胞受体(TCR)识别该复合体。
本文中所用的“降低”、“减小”或“抑制”意指水平(例如，表达水平或细胞增殖水平)的总体降低或导致总体降低的能力，优选5％或更高，10％或更高，20％或更高，更优选50％或更高，最优选75％或更高。
例如“提高”或“增强”的术语优选涉及提高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，最优选至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
ADCC描述了如本文中所述的效应细胞(特别是淋巴细胞)的细胞杀伤能力，其优选需要被抗体标记的靶细胞。
ADCC优选在抗体与肿瘤细胞上的抗原结合以及抗体Fc结构域接合免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcR)时发生。已鉴定出数个Fc受体家族，且特定的细胞群特征性地表达确定的Fc受体。可将ADCC视为直接诱导不同程度的直接肿瘤破坏的机制，所述破坏导致抗原呈递并诱导肿瘤指向性T细胞应答。优选地，ADCC的体内诱导将导致肿瘤指向性T细胞应答和宿主来源的抗体应答。
抗体依赖性细胞介导的吞噬作用
ADCP是许多抗体治疗的一种作用机制。它被定义为这样的高度调节的过程，通过该过程，抗体通过将其Fc结构域与吞噬细胞上的特定受体连接并引发吞噬作用来消除结合的靶标。ADCP可由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞通过FcγRIIa、FcγRI和FcγRIIIa介导，其中巨噬细胞上的FcγRIIa(CD32a)代表主要途径。
当表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别与靶细胞(例如患病细胞，包括肿瘤细胞)结合的抗体，并随后引起靶细胞(例如患病细胞，包括肿瘤细胞)的吞噬作用时，优选发生ADCP。ADCP还通过促进抗原呈递或通过刺激炎性介质的分泌来刺激下游适应性免疫应答。ADCP可通过同时用免疫调节剂治疗而在体内得到改善。ADCP的Fc受体依赖性功能提供了清除病毒和病毒感染细胞的机制，以及通过促进抗原呈递或通过刺激炎性介质的分泌来刺激下游适应性免疫应答的机制。
补体依赖性细胞毒性
CDC是可通过抗体指引的又一种细胞杀伤方法。IgM是用于补体活化的最有效同种型。IgG1和IgG3在通过经典补体活化途径指引CDC方面也都很有效。优选地，在该级联中，抗原-抗体复合体的形成导致紧邻参与的抗体分子(例如，IgG分子)的CH2结构域的多个C1q结合位点暴露出来(C1q是补体C1的三种亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将先前的低亲和力C1q-IgG相互作用转变为一种高亲合力相互作用，这触发了涉及一系列其他补体蛋白质的级联事件并且导致效应细胞趋化剂/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，该补体级联最终形成膜攻击复合体，其在细胞膜中产生孔，这有利于水和溶质自由地进入和离开细胞。
本文中所述的结合剂和抗体可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体法，例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管原则上优选体细胞杂交方案，但是也可采用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆结合剂(例如单克隆抗体)的杂交瘤的优选动物***为鼠***。在小鼠中产生杂交瘤是已经非常成熟的方案。分离用于融合的经免疫接种脾细胞的免疫接种方案和技术是本领域中已知的。融合伴侣(fusion partner)(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方案也是已知的。用于制备分泌单克隆结合剂(例如单克隆抗体)的杂交瘤的另一些优选动物***为大鼠***和兔***(例如，Spieker-Polet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)中所描述的，还参见Rossi et al.，Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。
在又一个优选实施方案中，可使用携带部分人免疫***而不是小鼠***的转基因或转染色体小鼠产生人结合剂(例如人抗体)。这些转基因和转染色小鼠包括分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。可按照WO2004035607中对CD20的详细描述在这样的转基因小鼠中进行人结合剂(例如人抗体)的产生。
用于产生单克隆结合剂(例如单克隆抗体)的又一策略为直接从产生具有确定特异性之结合剂的淋巴细胞中分离编码抗体的基因，例如，参见Babcock et al.，1996；Anovel strategy for generating monoclonal binding agents such as monoclonalantibodies from single，isolated lymphocytes producing binding agents ofdefined specificities。重组结合剂工程的细节还可参见Welschof和Kraus，Recombinantantibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8和Benny K.C.Lo AntibodyEngineering ISBN 1-58829-092-1。
为了产生抗体，可如所述，利用来自抗原序列(即，抗体待指向的序列)的载体缀合肽、重组表达的抗原或其片段的富集制备物和/或表达抗原的细胞来免疫接种小鼠。或者，可利用编码抗原或其片段的DNA来免疫接种小鼠。如果使用抗原的纯化制备物或富集制备物的免疫接种不产生抗体，还可用表达抗原的细胞(例如，细胞系)免疫接种小鼠来促进免疫应答。可用通过尾静脉或眶后取血获得的血浆和血清样品在免疫接种方案的全程中监测免疫应答。可使用具有足够效价的免疫球蛋白的小鼠来进行融合。可在处死并移出脾之前3天，利用抗原表达细胞腹膜内或经静脉内对小鼠进行加强以提高分泌特异性抗体之杂交瘤的比例。
为了产生生产单克隆抗体的杂交瘤，可从经免疫接种小鼠中分离脾细胞和***细胞，并将其与合适的永生化细胞系(例如，小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后，可针对抗原特异性抗体的产生来筛选获得的杂交瘤。然后可通过ELISA对单个孔筛选分泌抗体的杂交瘤。使用抗原表达细胞通过免疫荧光和FACS分析，可对抗原有特异性的抗体进行鉴定。可将分泌抗体的杂交瘤重新平板接种(replate)，再次筛选，并且如果单克隆抗体仍为阳性的，则可通过有限稀释进行亚克隆。然后，可在组织培养基中体外培养稳定的亚克隆以产生抗体用于表征
还可使用例如本领域公知的重组DNA技术与基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生结合剂(例如抗体)(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，在一个实施方案中，可将目的基因(例如，抗体基因)连接到表达载体(例如，真核表达质粒)中，例如通过使用WO 87/04462、WO89/01036和EP 338841中公开的GS基因表达***或本领域中公知的其他表达***来进行。可将具有所克隆抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞中，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293细胞或者作为替代地其他真核细胞(例如，来自植物的细胞、真菌或酵母细胞)中。用于引入这些基因的方法可以是本领域中所述的方法，例如电穿孔、lipofectine、lipofectamine等。在将这些抗体基因引入宿主细胞后，可对表达抗体的细胞进行鉴定和选择。这些细胞代表此后可扩增其表达水平并扩大规模以生产抗体的转染瘤。可从这些培养上清液和/或细胞中分离并纯化出重组抗体。
或者，克隆的结合剂(例如抗体)基因可在其他表达***中表达，包括原核细胞，例如微生物，例如大肠杆菌(E.coli)。此外，结合剂(例如抗体)可在转基因非人动物中产生，例如在绵羊和兔的乳汁中或在鸡蛋中产生，或者在转基因植物中产生；(参见例如，Verma，R.，et al.(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock，et al.(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157；以及Fischer，R.，et al.(1999)Biol.Chem.380：825-839)。
嵌合
未标记的鼠抗体在人中具有高免疫原性，当重复应用时导致治疗效果降低。通过重链恒定区介导主要的免疫原性。如果对各个结合剂进行嵌合或人源化，则来源于鼠抗体的结合剂在人中的免疫原性可被降低或完全避免。嵌合结合剂是不同部分来自不同动物物种的结合剂，例如具有来源于鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。通过将鼠抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区连接来实现结合剂的嵌合(例如，如Krauset al.，在Methods in Molecular Biology series中，Recombinant antibodies forcancer therapy ISBN-0-89603-918-8所述)。在一个优选实施方案中，通过将人κ-轻链恒定区连接至鼠轻链可变区来产生嵌合结合剂。在另一优选实施方案中，可通过将人λ轻链恒定区连接至鼠轻链可变区来产生嵌合结合剂。用于产生嵌合结合剂的优选重链恒定区为IgG1、IgG3和IgG4。用于产生嵌合结合剂的另一些优选重链恒定区为IgG2、IgA、IgD和IgM。
人源化
结合剂(例如抗体)主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，在各抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体之特性的重组结合剂(例如抗体)，所述表达载体包含来自所述特定天然存在抗体的CDR序列，其移植到来自具有不同特性之不同抗体的框架序列上(参见，例如，Riechmann，L.et al.(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature 321：522-525；和Queen，C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这样的框架序列可获自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库。这些种系系序列将不同于成熟的抗体基因序列，因为它们将不包含完整组装的可变基因，其是在B细胞成熟期间通过V(D)J连接而形成的。种系基因序列还将在均匀穿过可变区的个别处不同于高亲和力第二抗体库(secondary repertoire antibody)的序列。
可使用标准结合测定(例如，ELISA、Western印迹、免疫荧光和流式细胞术分析)来确定抗体和其他结合剂结合抗原的能力。
为了纯化结合剂(例如抗体)，选择的生产细胞系可在2升旋转烧瓶中培养以进行重组抗体纯化。或者，可在基于透析的生物反应器中产生结合剂(例如抗体)。可过滤上清液，并且如果必要的话，在用蛋白L-琼脂糖凝胶(L-sepharose)进行亲和色谱之前浓缩。可通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的结合剂以确保纯度。可将缓冲溶液交换到PBS中，并且可使用相应的消光系数通过OD280确定浓度。可将重组结合剂等分并储存在-65至-85℃下。
为了示出单克隆结合剂(例如单克隆抗体)与表达抗原之活细胞的结合，可使用流式细胞术。可将天然或转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照(在标准培养条件下培养)与杂交瘤上清液中或含有1％FBS的PBS中之不同浓度的单克隆抗体混合，并可于4℃下孵育30分钟。在洗涤之后，荧光标记的检测试剂(例如荧光缀合的抗IgG抗体、抗Fab抗体或蛋白-L)可在与第一结合剂染色相同的条件下与抗原结合的单克隆结合剂结合。通过流式细胞术，用FACS仪器利用光散射和侧向散射特性对单个活细胞设门来分析样品。为了在单次测量中区分抗原特异性单克隆结合剂和非特异性结合物，可采用共转染方法。可如上所述对用编码抗原和荧光标志物的质粒瞬时转染的细胞进行染色。可在与结合剂染色细胞不同的荧光通道中检测到经转染的细胞。由于大多数经转染的细胞同时表达这两种转基因，因此抗原特异性单克隆结合剂优先与表达荧光标志物的细胞结合，而非特异性结合剂以相当的比例与未转染的细胞结合。可利用使用荧光显微术的替代测定来补充或替代流式细胞术测定。可完全如上所述对细胞进行染色并通过荧光显微术进行检查。
为了示出单克隆结合剂(例如单克隆抗体)与表达抗原的活细胞结合，可使用免疫荧光显微术分析。例如，将自发或在转染后表达抗原的细胞系和缺乏抗原表达的阴性对照于标准培养条件下在腔室载玻片(chamber slide)中在补充有10％胎牛血清(fetal calfserum，FCS)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中培养。然后用甲醇或多聚甲醛固定细胞或者不做处理。然后，可将细胞与针对抗原的单克隆结合剂于25℃下反应30分钟。在洗涤之后，使细胞与Alexa555标记的抗小鼠IgG二抗(Molecular Probes)在相同条件下反应。然后，通过荧光显微术检查细胞。
可制备来自表达抗原之细胞的细胞提取物和适当的阴性对照，并进行十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，分开的抗原将被转移至硝酸纤维素膜，封闭，并用待测试的单克隆结合剂进行探测。可使用抗小鼠IgG过氧化物酶检测IgG结合并用ECL底物进行显影。
还可按照技术人员公知的方式，通过免疫组织化学来测试结合剂(例如抗体)与抗原的反应性，例如使用多聚甲醛或丙酮固定的冷冻切片或用多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片，其来自获自常规手术过程期间的患者或获自携带接种有自发表达抗原或在转染后表达抗原之细胞系的异种移植肿瘤的小鼠的非癌组织或癌组织样品。对于免疫染色，可根据供应商的说明孵育与抗原反应的结合剂，然后孵育辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗体(DAKO)。
临床前研究
还可在体内模型(例如，在携带有用表达CLDN18.2之细胞系接种的异种移植肿瘤的免疫缺陷性小鼠中)中对本文中所述的结合物质进行测试以确定它们控制表达CLDN18.2之肿瘤细胞生长的效力。
可在将表达CLDN18.2的肿瘤细胞异种移植到免疫受损的小鼠或其他动物中后，使用本文中所述结合剂进行体内研究。可向无肿瘤小鼠施用结合剂和任选地效应细胞(例如PBMC)，然后注射肿瘤细胞以测量所述结合剂防止肿瘤或肿瘤相关症状形成的效果。可向荷瘤小鼠施用结合剂和任选地效应细胞(例如PBMC)以确定各结合剂降低肿瘤生长、转移或肿瘤相关症状的治疗效果。结合剂和任选地效应细胞的应用可与其他物质(如细胞抑制药物、生长因子抑制剂、细胞周期阻断剂、血管生成抑制剂或抗体)的应用组合以确定提高的协同效力和潜在毒性。为了分析结合剂介导的毒性副作用，可用本文中所述的结合剂或对照试剂接种动物，并针对与CLDN18.2-结合剂治疗可能相关的症状进行彻底研究。
结合剂识别的表位的作图可如Glenn E.Morris ISBN-089603-375-9的“EpitopeMapping Protocols(Methods in Molecular Biology)”和ISBN-089603-375-9的“EpitopeMapping：A Practical Approach”Practical Approach Series，248和OlwynM.R.Westwood，Frank C.Hay的“Epitope Mapping：A Practical Approach”PracticalApproach Series，248中的详细描述进行。
可以以任意合适的药物组合物的形式施用本文中所述的化合物和药剂。
本发明的药物组合物优选是无菌的，并含有有效量的本文中所述结合剂和本文中所讨论的任选的其他药剂以产生期望的反应或期望的效果。
药物组合物通常以均一剂型提供，并且可以以本身已知的方式制备。药物组合物可例如是溶液或混悬液的形式。
药物组合物可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，所有这些均优选为可药用的。术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性成分的作用相互作用之材料的无毒性。
不可药用盐可用于制备可药用盐，并且也包括在本发明中。这类可药用盐以非限制性方式包括由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐还可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
用于药物组合物中的合适缓冲物质包括盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。
用于药物组合物中的合适防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
可注射制剂可包含可药用赋形剂，例如乳酸林格液(Ringer Lactate)。
术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其中将活性组分组合以有助于、增强或实现应用。根据本发明，术语“载体”还包括适于向患者施用的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。
可能的用于肠胃外施用的载体物质是例如，无菌水、林格液、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物(polyoxyethylene/polyoxy-propylene copolymer)。
术语“赋形剂”在本文中使用时旨在表示可存在于药物组合物中但不是活性成分的所有物质，例如，载体、黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
本文中所述的药剂和组合物可通过任意常规途径施用，例如，通过肠胃外施用，包括通过注射或输注。施用优选肠胃外施用，例如，静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用或肌内施用。
适于肠胃外施用的组合物一般包括活性化合物的无菌水性或非水性制备物，其优选与接受者的血液等张。相容性载体和溶剂的一些实例为林格液和等张氯化钠溶液。此外，通常使用无菌固定油类作为溶液或混悬液介质。
本文中所述的药剂和组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与其他剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病的进程。这包括减缓疾病的进展并且特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病或病症中的期望反应还可以是延迟或预防所述疾病或所述病症的发作。
本文中所述药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、身材大小和体重)、治疗的持续时间、伴随治疗的类型(如果存在的话)、具体施用途径以及类似因素。因此，本文中所述药剂的施用剂量可取决于多个这样的参数。在患者对初始剂量反应不够的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的更局部化的施用途径实现的有效的更高剂量)。
本文中所述的药剂和组合物可例如在体内向患者施用以治疗或预防多种病症，例如本文中所述的那些。优选的患者包括人患者，其具有可通过施用本文中所述药剂和组合物来矫正或改善的病症。这包括涉及以CLDN18.2的表达模式改变为特征的细胞的病症。
例如，在一个实施方案中，本文中所述的药剂可用于治疗患有癌症疾病的患者，所述癌症疾病例如本文中所述的癌症疾病，其特征在于存在表达CLDN18.2的癌细胞。
根据本发明描述的药物组合物和治疗方法也可用于免疫接种或疫苗接种以预防本文中所述的疾病。
本发明的药物组合物可与补充免疫增强物质(例如一种或更多种佐剂)一起施用，并且可包含一种或更多种免疫增强物质以进一步提高其有效性，优选地实现免疫刺激的累加作用。术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。在这方面，多种机制是可能的，这取决于多种佐剂类型。例如，允许DC成熟的化合物，例如，脂多糖或CD40配体，形成第一类合适的佐剂。通常来说，影响免疫***的“危险信号”(LPS、GP96、dsRNA等)类型的任何药剂或者细胞因子(例如GM-CSF)均可用作佐剂，其使免疫应答能够以受控方式加强和/或受到影响。在本上下文中也可任选地使用CpG寡脱氧核苷酸，尽管考虑了如上所述的在某些情况下会发生的其副作用。特别优选的佐剂是细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFα、INF-γ、GM-CSF、LT-α或生长因子，例如hGH。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)或油类，例如最优选的是/>ISA51。脂肽，例如Pam3Cys，也适合用作本发明药物组合物中的佐剂。
本文中所提供的药剂和组合物可单独使用或与常规的治疗方案组合使用，所述常规的治疗方案例如手术、辐照、化学治疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或不相关的)。
癌症的治疗代表其中组合策略是尤其理想的领域，原因是两种、三种、四种或甚至更多种癌症药物/治疗的组合作用经常产生比单治疗方法的影响明显更强的协同效应。因此，在本发明的另一个实施方案中，利用基于免疫或疫苗接种的机制(例如本发明的方法和药物组合物)的癌症治疗可与靶向类似或其他特定机制的多种其他药物和/或方法有效组合。其中有例如与常规肿瘤治疗、多表位策略、另外的免疫治疗和靶向血管生成或凋亡之治疗方法的组合(综述参见例如Andersen et al.2008：Cancer treatment：the combinationof vaccination with other therapies.Cancer Immunology Immunotherapy，57(11)：1735-1743.)。不同药剂的依次施用可在不同的检查点(check point)抑制癌细胞生长，而另一些药剂可例如抑制新血管生成、恶性细胞的存活或转移，其有可能将癌症转化为慢性疾病。以下列表提供了可与本发明组合使用的抗癌药物和治疗的一些非限制性实例：
1.化学治疗
化学治疗是用于多种类型癌症之护理的标准。最常见的化学治疗剂通过杀伤迅速***的细胞(癌症细胞的主要特性之一)而发挥作用。因此，与常规化学治疗药物(例如烷基化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和影响细胞***或DNA合成的其他抗肿瘤剂)的组合通过清除抑制细胞、重新启动免疫***，通过使肿瘤细胞更易受到免疫介导的杀伤，或通过另外活化免疫***的细胞可显著改善本发明的治疗效果。在多个研究中已示出化学治疗和以接种疫苗为基础的免疫治疗药物的累加抗癌作用(参见例如Quoix etal.2011：Therapeutic vaccination with TG4010and first-line chemotherapy inadvanced non-small-cell lung cancer：a controlled phase 2B trial.LancetOncol.12(12)：1125-33.；还可参见Liseth et al.2010：Combination of intensivechemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies：the hematological experience.J Biomed Biotechnol.2010：6920979；还可参见Hirookaet al 2009：A combination therapy of gemcitabine with immunotherapy forpatients with inoperable locally advanced pancreatic cancer.Pancreas 38(3)：e69-74)。有数以百计可获得的化学治疗药物，其基本上都适合用于组合治疗。可与本发明相组合的化学治疗药物的一些(非限制性)实施例是：卡铂(Paraplatin)、顺铂(Platinol、Platinol-AQ)、环磷酰胺(Cytoxan、Neosar)、多西他赛(Taxotere)、多柔比星(Adriamycin)、埃罗替尼(Tarceva)、依托泊苷(VePesid)、吉西他滨(Gemzar)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec)、伊立替康(Camptosar)、甲氨蝶呤(Folex、Mexate、Amethopterin)、紫杉醇(Taxol、Abraxane)、索拉非尼(Nexavar)、舒尼替尼(Sutent)、拓扑替康(Hycamtin)、长春新碱(Oncovin、Vincasar PFS)和长春碱(Velban)。
2.手术
癌症手术(移出肿瘤的操作)仍然是癌症治疗的基础。可将手术与其他癌症治疗相组合以去除任何剩余的肿瘤细胞。已无数次证明将手术方法与后续的免疫治疗性治疗组合是有前景的方法。
3.辐射
放射治疗仍然是癌症治疗的重要组成部分，所有癌症患者中约50％在他们疾病的进程中接受放射治疗。放射治疗的主要目的是使癌症细胞丧失其增殖(细胞***)潜力。用于治疗癌症的辐射类型是光子辐射(x射线和γ射线)和粒子辐射(电子、质子和中子束)。有两种方式将辐射递送至癌症的部位。外束辐射是通过对准高能射线(光子、质子或粒子辐射)从体外递送至肿瘤部位。内部辐射或近距离治疗(brachytherapy)是通过密封在导管或籽(seed)中的放射源从机体内部直接递送至肿瘤部位中。适用于与本发明组合的放射治疗技术是例如分级法(fractionation)(以分级的方案递送的放射治疗，例如，在数周内每日给予1.5至3Gy的级分)、3D适形放射治疗(3DCRT；递送辐射至总肿瘤体积)、强度调制放射治疗(IMRT；电脑控制的多个辐射束的强度调制)、图像引导放射治疗(IGRT；包括允许校正的放疗前成像的技术)和立体定向体部放射治疗(SRBT，在很少的治疗部分中递送极高的个体剂量的辐射)。关于放射治疗综述，参见Baskar et al.2012：Cancer and radiationtherapy：current advances and future directions.Int.J Med Sci.9(3)：193-199。
4.抗体
抗体(优选单克隆抗体)通过多种机制实现其对癌细胞的治疗效果。它们可在产生凋亡或程序性细胞死亡中具有直接的作用。它们可阻断信号转导途径的组分(例如，生长因子受体)，有效地阻止肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，它们可引起抗独特型抗体(anti-idiotype antibody)形成。间接作用包括募集具有细胞毒性的细胞，例如单核细胞和巨噬细胞。将这种类型的抗体介导的细胞杀伤称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。抗体还结合补体，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。此外，靶细胞结合的抗体可被非特异性吞噬细胞识别，引起靶细胞的吞噬作用，这称为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。如例如在Gadri et al.2009：Synergistic effect ofdendritic cell vaccination and anti-CD20antibody treatment in the therapy ofmurine lymphoma.J Immunother.32(4)：333-40中所示出的，将手术方法与免疫治疗药物或方法组合是一种成功的途径。以下的列表提供了可与本发明组合的抗癌抗体和潜在的抗体靶标(在括号内)的一些非限制性实例：阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿达木单抗(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿泊珠单抗(HLA-DR)、阿昔莫单抗(CEA)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利木单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、莫比伐单抗(Bivatuzumabmertansine)(CD44v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD19)、布妥昔单抗(CD30TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(黏蛋白CanAg)、雷坎妥珠单抗(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(***癌细胞)、卡鲁单抗(Carlumab)(CNTO888)、卡妥索单抗(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)、替坦司可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、西他土珠单抗(TRAIL-R2)、达西珠单抗(CD40)、达罗土珠单抗(Dalotuzumab)(***I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B-淋巴瘤细胞)、多兹图单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥珠单抗(PDL192)、恩司昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥索单抗(HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(整合素αvβ3)、法勒珠单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、弗拉伏妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、弗拉伏妥单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、盖尼塔单抗(IGF-I)、吉妥单抗奥唑米星(CD33)、吉伏珠单抗(Gevokizumab)(IL-1β)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、格莱木单抗-维多汀(Glembatumumab vedotin)(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、依库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(CA-125)、依坦希单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(CD22)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、洛妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、鲁卡木单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马帕木单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL-5)、米拉珠单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、莫妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)(CD22)、他那可单抗(C242抗原)、他那莫单抗(5T4)、纳那妥单抗(Namatumab)(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-Rα)、奥纳珠单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(Oportuzumabmonatox)(EpCAM)、奥戈伏单抗(CA-125)、欧西鲁单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(Patritumab)(HER3)、培妥莫单抗(Pemtumomab)(MUC1)、帕妥珠单抗(HER2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙玛立珠单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL-6)、他贝鲁单抗(Tabalumab)(BAFF)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(CD19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(生腱蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、替加珠单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL-13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、西莫白介素图考珠单抗(tucotuzumab celmoleukin)(EpCAM)、优利妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)(4-1BB)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA16.88)、扎妥木单抗(EGFR)、扎木单抗(CD4)。
5.细胞因子、趋化因子、共刺激分子、融合蛋白
本发明的另一个实施方案是组合使用本发明的药物组合物与细胞因子、趋化因子、共刺激分子和/或其融合蛋白以引起有益的免疫调节或肿瘤抑制效果。为了提高免疫细胞向肿瘤中的浸润并有助于抗原递呈细胞向肿瘤引流***的运动，可使用具有C、CC、CXC和CX3C结构的多种趋化因子。一些最有前景的趋化因子是例如CCR7及其配体CCL19和CCL21，此外，CCL2、CCL3、CCL5和CCL16。另一些实例为CXCR4、CXCR7和CXCL12。此外，共刺激或调节分子，例如B7配体(B7.1和B7.2)是可用的。其他细胞因子也是可用的，例如白细胞介素由其是(例如，IL-1至IL17)、干扰素(例如IFNα1至IFNα8、IFNα10、IFNα13、IFNα14、IFNα16、IFNα17、IFNα21、IFNβ1、IFNW、IFNE1和IFNK)、造血因子、TGF(例如，TGF-α、TGF-β和TGF家族的其他成员)，最后，受体的肿瘤坏死因子家族的成员及其配体以及其他刺激分子，包括但不限于：4-1BB、4-1BB-L、CD137、CD137L、CTLA-4GITR、GITRL、Fas、Fas-L、TNFR1、TRAIL-R1、TRAIL-R2、p75NGF-R、DR6、LT.β.R、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn114、Troy/Trade、TAJ、TNFRII、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、GITRL、TACI、BAFF-R、BCMA、RELT和CD95(Fas/APO-1)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白、TNF受体相关的凋亡介导蛋白(TRAMP)和死亡受体6(DR6)。尤其是CD40/CD40L和OX40/OX40L是用于联合免疫治疗重要的靶标，因为它们直接作用于T细胞存活和增殖。综述参见Lechner et al.2011：Chemokines，costimulatorymolecules and fusion proteins for the immunotherapy of solidtumors.Immunotherapy 3(11)，1317-1340。
6.细菌处理
研究人员一直使用厌氧细菌(例如诺维氏梭状芽孢杆菌(Clostridium novyi))来消耗贫氧(oxygen-poor)肿瘤的内部。当厌氧细菌与肿瘤的氧化侧接触时，它们就死亡，这意味着它们对机体其余部分是无害的。另一个策略是利用已转化有可将无毒前药转换为有毒药物之酶的厌氧细菌。随着细菌在肿瘤的坏死区和低氧区的增殖，所述酶仅在肿瘤中表达。因此，全身性应用的前药仅在肿瘤中代谢为有毒药物。已用非致病性厌氧菌生孢梭菌(Clostridium sporogenes)表明这是有效的。
7.激酶抑制剂
用于补充性癌症治疗的另一大组潜在靶标包括激酶抑制剂，原因是癌细胞的生长和存活与激酶活性的失调密切相关。为了恢复正常的激酶活性，并因此降低肿瘤生长，正在使用广泛的抑制剂。靶向的激酶的组包括受体酪氨酸激酶，例如BCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2/ErbB2、IGF-IR、PDGFR-α、PDGFR-β、c-Kit、Flt-4、Flt3-野生型、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK；细胞质酪氨酸激酶，例如c-SRC、c-YES、Ab1、JAK-2；丝氨酸/苏氨酸激酶，例如ATM、AuroraA&B、CDK、mTOR、PKCi、PLK、b-Raf、S6K、STK11/LKB1和脂质激酶，例如PI3K、SK1。小分子激酶抑制剂，例如PHA-739358、尼罗替尼、达沙替尼和PD166326、NSC 743411、拉帕替尼(GW-572016)、卡奈替尼(CI-1033)、司马沙尼(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、Sutent(SU11248)、索拉非尼(BAY 43-9006)和来氟米特(SU101)。更多的信息参见例如Zhang et al.2009：Targeting cancer with smallmolecule kinase inhibitors.Nature Reviews Cancer 9，28-39。
8.Toll样受体
Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)家族的成员是固有免疫和适应性免疫的重要纽带，且许多佐剂的作用依赖TLR的活化。大量针对癌症已建立的疫苗并入TLR的配体以加强疫苗应答。除TLR2之外，已经检验了TLR3、TLR4、尤其是TLR7和TLR8在被动免疫治疗方法中用于癌症治疗。密切相关的TLR7和TLR8通过影响免疫细胞、肿瘤细胞和肿瘤微环境而有助于抗肿瘤应答，并且可被核苷类似物结构活化。全部TLR都已用作独立的免疫治疗或癌症疫苗佐剂，并且可与本发明的制剂和方法组合。更多的信息参见van Duin etal.2005：Triggering TLR signaling in vaccination.Trends in Immunology，27(1)：49-55。
9.血管生成抑制剂
除了靶向受肿瘤介导的逃逸机制(escape mechanism)和免疫抑制影响之免疫调节受体的治疗，还有靶向肿瘤环境的治疗。血管生成抑制剂阻止了肿瘤生存所需要之血管的广泛生长(血管生成)。例如，可通过靶向不同的分子来阻断为满足肿瘤细胞提高的养分和氧需求而被促进的血管生成。可与本发明组合的血管生成介导分子或血管生成抑制剂的非限制性实例是可溶性VEGF(VEGF同种型VEGF121和VEGF165、受体VEGFR1、VEGFR2和受体神经毡蛋白(Neuropilin)-2(NRP-2)、血管生成素2、TSP-1和TSP-2、血管抑素(angiostatin)和相关分子、内皮细胞抑制素(endostatin)、血管形成抑制素(vasostatin)、钙网蛋白、血小板因子4、TIMP和CDAI、Meth-1和Meth-2、IFN-α、IFN-β和IFN-γ、CXCL10、IL-4、IL-12和IL-18、凝血酶原(三环结构域-2)、抗凝血酶III片段、催乳素、VEGI、SPARC、骨桥蛋白、乳腺丝抑蛋白(maspin)、血管能抑素(canstatin)、增殖蛋白相关蛋白、休眠蛋白(restin)和药物例如贝伐珠单抗、伊曲康唑、羧胺***、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、血小板应答蛋白、VEGFR拮抗剂、血管生成抑制性类固醇+肝素、软骨来源的血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、2-甲氧基***、替可加兰(tecogalan)、四硫钼酸盐、沙利度胺、血小板应答蛋白、催乳素Vβ3抑制剂、利诺胺(linomide)、他喹莫德(tasquinimod)，综述参见例如Schoenfeld和Dranoff 2011：Anti-angiogenesisimmunotherapy.Hum Vaccin.(9)：976-81。
10.小分子靶向治疗药物
小分子靶向治疗药物通常是癌细胞内在突变的、过表达的或其他关键蛋白质上酶促结构域的抑制剂。突出的和非限制性的实例是酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Gleevec/Glivec)和吉非替尼(Iressa)。在先前的专利申请US2009004213中也描述了使用靶向一些激酶的小分子(例如苹果酸舒尼替尼和/或甲苯磺酸索拉非尼)与疫苗组合用于癌症治疗。
11.基于病毒的疫苗
有许多可用的或正在开发的基于病毒的癌症疫苗可与本发明的制剂一起用于组合的治疗方法。使用此类病毒载体的一个优点在于其引发免疫应答的固有能力，作为产生免疫活化所必需的危险信号之病毒感染的结果出现炎性反应。理想的病毒载体应该是安全的，并且不应该引入抗载体免疫应答以使得加强抗肿瘤特异性应答。重组的病毒例如痘苗病毒(vaccinia virus)、单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和禽痘病毒已用于动物肿瘤模型中且基于其令人鼓舞的结果，已经开始了人临床试验。尤其重要的基于病毒的疫苗是病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，其是包含来自病毒外层外壳之某些蛋白质的小颗粒。病毒样颗粒不含有来自病毒的任何遗传物质并且不会引起感染，但是它们可被构建以呈递在其外壳上的肿瘤抗原。VLP可来源于多种病毒，例如乙肝病毒或其他病毒科，包括细小病毒科(Parvoviridae)(例如腺相关病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，HIV)和黄病毒科(Flaviviridae)(例如，丙型肝炎病毒)。一般性综述参见Sorensen和Thompsen 2007：Virus-based immunotherapy of cancer：what do we know and whereare we going？APMIS115(11)：1177-93；针对癌症的病毒样颗粒在Buonaguro et al.2011：Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseasesand cancer.Expert Rev Vaccines 10(11)：1569-83；以及Guillén et al.2010：Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants：application to chronicdisease，cancer immunotherapy and infectious disease preventivestrategies.Procedia in Vaccinology 2(2)，128-133中进行了综述。
12.多表位策略
多表位的使用显示了用于接种疫苗的有前景成果。与智能算法***组合的快速测序技术使得能够利用肿瘤突变组(mutanome)，并且可为可与本发明组合的个性化疫苗提供多表位。更多的信息参见2007：Vaccination of metastatic colorectal cancerpatients with matured dendritic cells loaded with multiple majorhistocompatibility complex class I peptides.J Immunother 30：762-772；此外，Castle et al.2012：Exploiting the mutanome for tumor vaccination.Cancer Res 72(5)：1081-91。
13.过继T细胞转移
例如，在Rapoport等2011：Combination immunotherapy using adoptive T-celltransfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivinafter ASCT for myeloma.Blood 117(3)：788-97中描述了肿瘤抗原疫苗接种与T细胞转移的组合。
14.基于肽的靶向治疗
肽可与细胞表面受体或在肿瘤周围受影响的胞外基质结合。如果核素在细胞附近衰变，则与这些肽(例如，RGD)连接的放射性核素最终杀伤癌细胞。这些结合基序的寡聚体或多聚体尤其受到极大的关注，原因是其可导致增强的肿瘤特异性和亲合力。对于非限制性实例，参见Yamada 2011：Peptide-based cancer vaccine therapy for prostatecancer，bladder cancer，and malignant glioma.Nihon Rinsho 69(9)：1657-61。
15.其他治疗
还有许多其他的癌症治疗可与本发明的制剂和方法组合以产生协同效应。非限制性的实例是靶向凋亡的治疗、热疗(hyperthermia)、激素治疗、端粒酶治疗、胰岛素增强治疗、基因治疗和光动力学治疗。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，所述实施例不被解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：包含对CLDN18.2和CD3具有特异性的结合结构域的结合剂的产生
本发明人研究了以下可能性：使用包含对CLDN18.2和CD3具有特异性的结合结构域的结合剂(抗CLDN18.2×抗CD3双特异性抗体，bsAb)来重定向CD3+效应T细胞以破坏表达CLDN18.2的细胞系。使用来自鼠抗CLDN18.2抗体的抗原结合结构域(ABD)(SEQ ID NO：38和41)来产生数个抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb(参见WO 2007/059997)。另外，使用了对CD3具有不同亲和力的数种抗CD3scFv序列。下表2给出了携带鼠CLDN18.2 ABD和CD3ABD的bsAb的概述。
表2：携带鼠CLDN18.2 ABD和CD3ABD的bsAb的概述
*与CLDN18.2二价结合的bsAb包含与第三链相同的第四链
实施例1A：抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb的产生
图1描绘了抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb的示意图。
通过基因合成产生编码VH(CLDN18.2)和VL(CLDN18.2)的DNA，并将其亚克隆到含有合适融合配偶体(例如恒定区或抗CD3scFv-Fc)的pTT5表达载体中。通过基因合成产生编码抗CD3scFv-Fc重链的DNA。将DNA转染到HEK293E细胞中用于表达。还产生了抗RSV×抗CD3双特异性抗体(SEQ ID NO：93，94，95)作为对照。
实施例1B：通过抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb对NUGC-4和KP-4细胞系的结合和重定向的T细胞细胞毒性
NUGC-4是表达高水平CLDN18.2的胃癌细胞系，并且KP-4是表达非常低水平CLDN18.2的胰腺癌细胞系(与CLDN18.2阴性对照细胞系相当)。因此，本发明人研究了抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb和抗RSV×抗CD3bsAb对照介导的NUGC-4和KP-4细胞系上的结合和重定向T细胞细胞毒性(RTCC)。
将200,000个细胞(NUGC-4或KP-4)用指定浓度的抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb在冰上孵育1小时。然后将样品洗涤并用Alexa647AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Penn)在冰上染色一个小时。将样品再次洗涤，并通过流式细胞术进行分析。显示与KP-4和NUGC-4细胞结合的数据在图2中示出。/>
为了研究由抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb介导的RTCC，将NUGC-4或KP-4用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为10∶1)和指定浓度的抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb在37℃下孵育24小时。根据制造商的说明，使用CytoTox-ONETM均质膜完整性测定(Homogeneous MembraneIntegrity Assay)(Promega，Madison，Wis.)测量乳酸脱氢酶水平来确定RTCC，并在WallacVictor2微板读取仪(PerkinElmer，Waltham，Mass.)上获取数据，参见图3。
总的来说，数据显示在所有测试的浓度下，抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb剂量依赖性地与NUGC-4细胞结合，而几乎没有检测到与KP-4细胞的结合。值得注意的是，“Fab2-scFv”形式的bsAb(即XENP24647、XENP24648和XENP24649)与NUGC-4细胞的结合比“Fab-scFv”形式的bsAb(即XENP24645和XENP24646)更有效得多。这可能是由于“Fab2-scFv”形式所传递的额外的亲合力。与细胞结合一致，数据显示抗CLDN18.2×抗CD3bsAb剂量依赖性地诱导NUGC-4上的RTCC，而在KP-4细胞上未诱导RTCC。
实施例1C：使用NUGC-4和SNU-601细胞进一步表征抗CLDN18.2×抗CDA3 bsAb
(a)将SNU-601鉴定为表达CLDN18.2的细胞系
为了更好地表征本发明的抗CLDN18.2×抗CD3抗体，本发明人试图鉴定相比于NUGC-4的表达而具有更高CLDN18.2表达水平的细胞系。本发明人使用流式细胞术如下研究了XENP24647与多种细胞系的结合。将来自多种细胞系的200,000个细胞(和作为阴性对照的Ramos细胞)用XENP24647在冰上孵育1小时，随后用PE AffiniPure F(ab′)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Penn)在冰上染色1小时，并通过流式细胞术进行分析。图4示出了XENP24647与NUGC-4和SNU-601的结合。数据表明SNU-601相比于NUGC-4而表达更高水平的CLDN18.2。因此，本发明人使用NUGC-4和SNU-601细胞来进一步表征抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb。
(b)Nugc-4和SNU-601细胞上的抗CLDN18.2×和抗CD3 bsAb的结合
本发明人研究了NUGC-4和SNU-601细胞上的抗CLDN18.2×和抗CD3抗体结合。将实验如上所述进行。具体地，将来自不同细胞系的200,000个细胞(和作为阴性对照的Ramos细胞)用指定浓度的指定bsAb在冰上孵育1小时，随后用PE AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Penn.)在冰上染色1小时，并通过流式细胞术进行分析。图5示出了指示bsAb与NUGC-4和SNU-601结合的PE MFI。各bsAb剂量依赖性地与NUGC-4和SNU-601结合，其中与SNU-601细胞的最大结合比与NUGC-4的结合高，这与相应的CLDN18.2在各细胞系上的表达水平一致。与以上实施例1B中的发现一致，数据显示“Fab2-scFv”形式的bsAb结合细胞比“Fab-scFv”形式的bsAb更有效得多。
(c)通过抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb在NUGC-4和SNU-601细胞上对重定向的T细胞细 胞毒性的诱导
接下来，本发明人研究了NUGC-4和SNU-601上的抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb介导的RTCC。将实验如上所述进行。具体地，将NUGC-4或SNU-601细胞用人PBMC(效应细胞与靶细胞的比率为20∶1)和指定浓度的指定bsAb和抗CD107a-BV421在37℃下孵育24小时或48小时。作为对照，使用仅靶细胞或使用靶细胞和效应细胞(不具有bsAb)。在孵育之后，将样品在冰上用以下抗体染色1小时：抗CD69-PE、抗CD25-APC、抗CD4-APC-Fire750和抗CD8-BV605。然后用BUV395膜联蛋白-V(BD Bioscience，San Jose，Calif.)和7-AAD活力染色溶液(BioLegend，San Diego，Calif.)对细胞进行染色。最后，将细胞通过流式细胞术进行分析。
AnnexinV与7AAD结合是凋亡诱导的指标。因此，活细胞是AnnexinV-7AAD-，而死细胞是AnnexinV+、7AAD+和AnnexinV+7AAD+细胞的总和。描述用效应细胞和指定bsAb孵育之后死亡/垂死靶细胞和活靶细胞数目的数据在图6至9中示出。数据示出了bsAb增强了对靶细胞(即NUGC-4和SNU-601细胞)的杀伤，如死亡/垂死细胞的增加以及活细胞的减少所示。值得注意的是，数据显示对CD3具有较高亲和力的结合结构域增强了RTCC(例如在比较XENP24645和XENP24646时；以及在比较XENP24647和XENP24649时)。此外，在对CD3具有特异性的相同结合结构域的bsAb的情况下，“Fab2-scFv”形式的bsAb比“Fab-scFv”形式的bsAb更强效地增强RTCC(例如在比较XENP24647和XENP24645时)。另外，“Fab2-scFv”bsAb相对于“Fab-scFv”bsAb(例如，对CD3具有相同亲和力的XENP24645(Fab-scFv形式)和XENP24647(Fab2-scFv形式))的增强的RTCC在表达较高水平CLDN18.2的SNU-601中更明显，这表明“Fab2-scFv”形式为表达较高水平CLDN18.2的细胞系提供了选择性。
本发明人还研究了本发明的bsAb对T细胞的活化。CD69是早期活化标志物，并且CD25是晚期活化标志物，两者均在T细胞活化后通过TCR信号传导上调。CD107a是T细胞脱颗粒和细胞毒性活性的功能标志物。对效应细胞进行设门以鉴定CD4+T细胞和CD8+T细胞。然后对T细胞针对CD69、CD25和CD107a表达进行设门。图10至13中描述了描绘CD4+和CD8+T细胞上标志物上调的数据。数据显示与RTCC结果一致的趋势。例如，更高亲和力的CD3结合和/或二价CLDN18.2结合增强了T细胞活化和脱颗粒。
实施例2：具有人源化CLDN18.2抗原结合结构域的抗CLDN18.2×抗CD3bsAb的产生
产生了携带对CLDN18.2具有特异性的人源化ABD的bsAb。下表3给出了产生的人源化bsAb的概述。
表3：携带对CLDN18.2具有特异性的人源化ABD的bsAb的概述
*与CLDN18.2二价结合的bsAb包含与第三链相同的第四链
实施例2A：CLDN18.2抗原结合结构域的人源化
本发明人使用字符串内容优化设计了具有人源化可变区的抗CLDN18.2mAb(参见，例如，WO 2005/056759和美国专利No.7,657,380)(VH：SEQ ID NO：39，40；VL：SEQ ID NO：42)。人种系同一性从针对鼠ABD(SEQ ID NO：38，41；“H0L0”)的73.2％分别提高至针对两种变体的86.6％(SEQ ID NO：40，42；“H2L1”)和88.3％(SEQ ID NO：39，42；“H1L1”)。将来自人源化mAb的可变区用于产生“Fab-scFv”和“Fab2-scFv”形式二者的另外的抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb，如实施例1A中所述。
实施例2B：CLDN18.2 ABD的人源化保留了结合、RTCC和T细胞活化
接下来，本发明人比较了具有鼠CLDN18.2 ABD的抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb与具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb的细胞结合、RTCC的诱导和T细胞活化的诱导。
如图4中所观察到的，尽管SNU-601细胞系的特征在于CLDN18.2的表达水平比NUGC-4细胞系高，但SNU-601细胞群的CLDN18.2表达非常不均一。因此，使用流式细胞术，本发明人基于CLDN18.2表达分选SNU-601细胞，并将CLDN18.2+群体扩增4天。如实施例1C中所述，重新评估扩增的CLDN18.2+群体(此后称为富集的SNU-601或SNU-601(2E4))的CLDN18.2表达，并将其与非富集的SNU-601细胞进行比较，参见图14。数据显示SNU-601(2E4)包含显著更高的CLDN18.2+细胞群。本节中的实验使用SNU-601(2E4)细胞进行。
如实施例1B中所述，评估具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb与SNU-601(2E4)细胞的结合。具体地，将200,000个SNU-601(2E4)细胞与指定浓度的指定bsAb在冰上孵育一小时。然后将样品用Alexa647 AffiniPure F(ab′)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Penn.)染色，并用流式细胞术分析。对照样品包括具有鼠CLDN18.2 ABD的bsAb、二价抗CLDN18.2mAb、仅细胞和仅二抗。指示bsAb结合的AlexaF657 MFI在图15中示出。数据显示具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb与具有鼠CLDN18.2 ABD的bsAb具有相似的对SNU-601(2E4)细胞的结合，这表明人源化保留了bsAb的结合效力。值得注意的是，与二价抗CLDN18.2mAb相比，“Fab2-scFv”形式的bsAb显示出相似的结合。另外，数据显示包含根据SEQ ID NO：39和42的人源化VH和VL(H1L1)的bsAb(例如XENP29472、XENP29474、XENP29476和XENP29478)比包含根据SEQ ID NO：40和42的人源化VH和VL(H2L1)的bsAb(例如XENP29473、XENP29475、XENP29477和XENP29479)更好地保留了结合。
接下来，本发明人研究了具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb对T细胞的活化和对SNU-601(2E4)细胞上RTCC的诱导。将SNU-601(2E4)细胞用CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，Mass.)标记。将经CFSE标记的SNU-601(2E4)细胞用人PBMC(效应物与靶物的比率为10∶1)和抗CD107a-BV421在37℃下孵育24小时。在孵育之后，收集上清液，通过V-PLEX促炎组1人试剂盒(根据制造商方案；Meso Scale Discovery，Rockville，Md.)进行细胞因子分析，并且将细胞用Aqua Zombie在室温下染色15分钟。然后将细胞洗涤并用抗CD4-APC-Cy7、抗CD8-perCP-Cy5.5和抗CD69-APC染色抗体染色，并通过流式细胞术分析。本发明人使用两种不同的方法用于研究RTCC的诱导：a)CSFE+靶细胞数目的降低(参见图15A)，和b)CSFE+靶细胞上的ZombieAqua染色(参见图15B，C)。本发明人还研究了基于CD69和CD107a表达的CD4+和CD8+T细胞的活化和脱颗粒(参见图16至20)。最后，本发明人研究了T细胞对IFNγ和TNFα的分泌，参见图21。与结合数据一致，人源化保留了具有人源化CLDN18.2 ABD的bsAb对RTCC和T细胞活化以及细胞因子分泌的诱导。值得注意的是，与实施例1C一致，更高亲和力的CD3结合和/或二价CLDN18.2结合增强了RTCC的效力以及T细胞活化、脱颗粒和细胞因子分泌。
实施例3：抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb的进一步表征
下表4给出了生成和测试的另外的bsAb的概述。
表4：另外的bsAb的概述
*与CLDN18.2二价结合的bsAb包含与第三链相同的第四链
实施例3A：抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb对食蟹猴和小鼠CLDN18.2具有交叉反应性
为了便于临床开发(例如，通过研究模型动物中的治疗剂)，bsAb与小鼠和/或食蟹猴CLDN18.2具有交叉反应性是有用的。因此，研究了抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb与人CLDN18.2、食蟹猴CLDN18.2和鼠CLDN18.2的结合。将HEK293细胞瞬时转染以表达人、食蟹猴或小鼠CLDN18.2。在转染之后48小时，将细胞与指定浓度的bsAb混合，并在4℃下孵育1小时。将细胞洗涤，并然后用第二Ab在4℃下染色1小时。在再洗涤两次之后，将细胞在Attune流式细胞仪上分析。如图22和23中所示出的数据显示，抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb剂量依赖性地结合用人、食蟹猴和小鼠CLDN18.2各自转染的细胞。值得注意的是，与“Fab-scFv”形式的bsAb(即XENP24645和XENP29472)相比，“Fab2-scFv”形式的bsAb(即XENP24647和XENP29476)与CLDN18.2转染的细胞的结合强效得多，并且与二价mAb形式(即XENP24644)具有相似的效力。
实施例3B：抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb不显示脱靶反应性
为了确定缺乏脱靶反应性，除了用瞬时转染以表达人、食蟹猴或小鼠CLDN18.1或人CLDN9的HEK293之外，通常如上所述研究了本发明的bsAb与人、食蟹猴和小鼠CLDN18.1和人CLDN9的结合。如图24所示的数据显示，抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb未表现出任何脱靶反应性。
实施例3C：抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb显示了一系列RTCC效力
为了排序CLDN18.2×抗CD3 bsAb的效力，研究了由bsAb和比较例bsAb(AMG 910；SEQ ID NO：132，来自WO 2020/025792)的NUGC4靶细胞杀伤。将NUGC4靶细胞用CSFE标记，并在37℃下过夜回收。然后将NUGC4细胞与效应细胞(用于每个实验的不同供体)在效应细胞：靶细胞之比为10∶1和指定的抗体浓度下孵育48小时。将细胞进行染色以区分活/死细胞，用抗CD4-APC-Fire750、抗CD8-PerCP-Cy5.5、抗CD107a-BV421和抗CD69-BV785染色以区分不同T细胞群体上的T细胞活化，并在Symphony流式细胞仪上进行分析。如图25所示的数据显示bsAb有效地诱导了RTCC。可将bsAb根据它们的RTCC效力按以下排序：XENP31726(最强效)＞XENP32461＞XENP29478＞XENP29472(最低效)。值得注意的是，XENP32461诱导的RTCC与比较例双特异性抗体相比具有相似的效力，而XENP31726诱导的RTCC与比较例双特异性抗体相比具有增强的效力。
实施例3D：在表达不同CLDN18.2抗原密度的细胞系上RTCC诱导的体外表征
研究了抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb对具有不同CLDN18.2密度的细胞的细胞杀伤活性。在第一组实验中，将BxPc3(600k CLDN18.2结合位点)、GSU(70k CLDN18.2结合位点)、NUGC4(50k CLDN18.2结合位点)和KatoIII(30k CLDN18.2结合位点)靶细胞用CSFE标记，并将其以约10K细胞/孔接种于96孔平底培养板中的100μl测定培养基(RPMI1640/10％FBS)中，以在37℃下过夜回收。将效应细胞从人PBMC中分离，并以10∶1的效应：靶比率和指定浓度的bsAb与靶细胞孵育。在孵育48小时之后，将细胞用PBS中的Live/DeadTM可固定蓝死细胞染色试剂盒(1∶1000)在室温下染色30分钟。然后将样品用1×FACS缓冲液洗涤。将细胞用抗CD4-APC-Fire750、抗CD8-PerCP-Cy5.5、抗CD 107a-BV421和抗CD69-BV785染色，再次用冰冷的PBS洗涤，并重悬于90μl FACS缓冲液中。将数据通过FACS Fortessa以固定体积(60μl)采集。描述RTCC的诱导、T细胞活化和细胞因子分泌的数据在图26至33中示出。与实施例3C中的数据一致，数据显示，与XENP29478和XENP29472(以及另外的bsAb XENP29474)相比，XENP31726和XENP32461(以及另外的bsAb XENP31724和XENP29476)更强效地诱导了RTCC。
在另一组实验中，研究了在3∶1的较低效应物：靶比率下的活性。将KatoIII(30kCLDN18.2结合位点)和HGC27-4H2(20k CLDN18.2结合位点)靶细胞用CSFE标记，并将其接种在96孔平底培养板中的100μl测定培养基(RPMIl640/10％FBS)中，以在37℃下过夜回收。将效应细胞从人PBMC中分离，并将其以3∶1的效应：靶比率和指定浓度的bsAb与靶细胞孵育。在孵育24小时之后，将细胞用PBS中的Live/DeadTM可固定蓝死细胞染色试剂盒(1∶1000)在室温下染色30分钟。然后将样品用1×FACS缓冲液洗涤。将细胞用抗CD4-APC-Fire750、抗CD8-PerCP-Cy5.5、抗CDl07a-BV421和抗CD69-BV785染色，用冰冷的PBS再次洗涤，并重悬于90μl FACS缓冲液中。将数据通过FACS Fortessa以固定体积(60μl)采集。描述了RTCC的诱导、T细胞活化和细胞因子分泌的数据在图34至36中示出。
在最后的实验中，通常如上所述，使用KatoIII靶细胞研究了甚至更低的效应物：靶比率为1∶1时的活性。数据在图37中示出。数据示出了测试的bsAb有效地诱导表达CLDNl8.2的癌细胞上的靶细胞杀伤和RTCC。
实施例4：ASP2138(XENP31726)在NUGC-4 10cF7_5_3E10荷瘤人PBMC移植NOG小鼠 模型中的抗肿瘤作用
检测了抗CLDN18.2×抗CD3 bsAb ASP2138(XENP31726)对NUGC-4 10cF7_5_3E10荷瘤人外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclear cell，PBMC)移植的NOG小鼠模型中肿瘤生长的作用。每周一次腹腔内施用ASP 2138，持续14天，在1、3和10mg/kg剂量下，分别诱导NUGC-4 10cF7_5_3E10肿瘤的60％、91％和99％的显著生长抑制，而体重没有减轻。另外，在3mg/kg组中，10只小鼠中有1只实现了完全的肿瘤消退。
该研究表明ASP2138在人PBMC移植NOG小鼠模型中对表达人密蛋白18.2的胃癌表现出抗肿瘤作用。
实施例4A：材料和方法
(a)抗体
将ASP2138(Lot No.DSP20804；Astellas Pharma Inc.，Tokyo，Japan)在施用之前溶解于磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)中。
(b)细胞系
NUGC-4 10cF7_5_3E10(内源性表达人密蛋白18.2的胃癌细胞系NUGC-4的亚克隆)获自Ganymed Pharmaceuticals AG(Mainz，Germany)，并在补充有10％热灭活胎牛血清和1％glutamax的RPMI 1640培养基中在5％CO2中在37℃下培养。
(c)动物
六周龄的雌性NOG小鼠购自In-Vivo Science Inc.(Tokyo，Japan)。这项研究由Astellas Pharma Inc.，Tsukuba研究中心的机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准，该中心被AAALAC国际认可。
(d)人PBMC注射和肿瘤接种
将人PBMC(Precision for Medicine，93000-10M)以2.5×107个细胞/mL混悬于PBS中，并以5×106个细胞/200μL/小鼠静脉注射于7周龄小鼠。在人PBMC注射之后一周，将NUGC-4 10cF7_5_3E10细胞以1×107个细胞/mL混悬于PBS中，并以1×106个细胞/100μL/小鼠皮下接种于8周龄小鼠的胁腹，并使其生长。
(e)施用和测量
在接种NUGC-4 10cF7_5_3E10细胞之后8天，将具有相似平均肿瘤体积的小鼠在组间分配(n＝10)。然后，开始施用ASP2138。将施用的第一天限定为第0天。使小鼠在第0天和第7天接受PBS或ASP2138(0.1、1、3和10mg/kg)的腹膜内施用。在第0、3、7、10和14天分别使用卡尺和天平测量肿瘤直径和体重。将肿瘤体积[mm3]用以下公式确定：
(肿瘤长轴的长度[mm])×(肿瘤短轴的长度[mm])2×0.5。
将肿瘤生长的抑制百分比(％Inh)使用以下公式计算：
％Inh＝100×(1-每组的[第14天的平均肿瘤体积-第0天的平均肿瘤体积]÷PBS组的[第14天的平均肿瘤体积-第0天的平均肿瘤体积])。
(f)统计学分析
将值表示为肿瘤体积和体重的的平均值±平均值的标准误差(SEM)。在第14天，使用Dunnett多重比较检验将ASP2138处理组的平均肿瘤体积和体重与PBS组的进行比较。P＜0.05被认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism(8.0.2版，GraphPad Software，SanDiego，CA，USA)和Microsoft Excel(2002版，Microsoft Corporation，Redmond，WA，USA)进行数据处理。
实施例4B：结果和结论
在人PBMC移植的NOG小鼠模型中，每周一次腹膜内施用1、3和10mg/kg下的ASP2138持续14天，分别诱导了NUGC-4 10cF7_5_3E10肿瘤的60％、91％和99％的显著生长抑制(图38)。另外，在3mg/kg组中，10只小鼠中有1只实现了完全的肿瘤消退。在任何测试剂量下，用ASP2138处理的小鼠的体重均未受影响(图38)。
该研究表明ASP2138在人PBMC移植的NOG小鼠模型中表现出对人胃癌的抗肿瘤作用。所有测试的bsAb浓度均显示出优异的体内抗肿瘤作用。

Claims (130)

1.结合剂，其包含对CLDN18.2具有特异性的结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域，
其中所述结合剂包含至少三条多肽链，其中
(i)第一多肽链包含来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区(VH)(VH(CLDN18.2))，
(ii)第二多肽链包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的VH(VH(CD3))和来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区(VL)(VL(CD3))，以及
(iii)第三多肽链包含来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的VL(VL(CLDN18.2))。
2.权利要求1所述的结合剂，其中所述第一多肽链包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的重链的恒定区1(CH1)。
3.权利要求1或2所述的结合剂，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的重链的恒定区2(CH2)和来源于免疫球蛋白或其功能性变体的重链的恒定区3(CH3)。
4.权利要求1至3中任一项所述的结合剂，其中所述第三多肽链包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的轻链的恒定区(CL)。
5.权利要求1至4中任一项所述的结合剂，其中所述免疫球蛋白是IgG1。
6.权利要求5所述的结合剂，其中所述IgG1是人IgG1。
7.权利要求3至6中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链上的VH以及CH1、CH2和CH3从N端至C端按以下顺序排列：
VH(CLDN18.2)-CH1-CH2-CH3。
8.权利要求3至7中任一项所述的结合剂，其中所述第二多肽链上的VH、VL以及CH2和CH3从N端至C端按以下顺序排列：
VH(CD3)-VL(CD3)-CH2-CH3，或
VL(CD3)-VH(CD3)-CH2-CH3。
9.权利要求1至8中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链与所述第二多肽链相互作用并且与所述第三多肽链相互作用。
10.权利要求1至9中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CLDN18.2)与所述VL(CLDN18.2)相互作用以形成对CLDN18.2具有特异性的结合结构域，并且所述VH(CD3)与所述VL(CD3)相互作用以形成对CD3具有特异性的结合结构域。
11.权利要求3至10中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链上的CH2与所述第二多肽链上的CH2相互作用，和/或所述第一多肽链上的CH3与所述第二多肽链上的CH3相互作用。
12.权利要求4至11中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链上的CH1与所述第三多肽链上的CL相互作用。
13.权利要求1至12中任一项所述的结合剂，其包含对CLDN18.2具有特异性的另外的结合结构域，其中所述第二多肽链还包含VH(CLDN18.2)，并且其中所述结合剂包含与所述第三多肽链相同的第四多肽链。
14.权利要求13所述的结合剂，其中所述第二多肽链还包含来源于免疫球蛋白或其功能性变体的CH1。
15.权利要求14所述的结合剂，其中所述免疫球蛋白是IgG1。
16.权利要求15所述的结合剂，其中所述IgG1是人IgG1。
17.权利要求14至16中任一项所述的结合剂，其中所述第二多肽链上的VH、VL以及CH1、CH2和CH3从N端至C端按以下顺序排列：
VH(CLDN18.2)-CH1-VH(CD3)-VL(CD3)-CH2-CH3，或
VH(CLDN18.2)-CH1-VL(CD3)-VH(CD3)-CH2-CH3。
18.权利要求13至17中任一项所述的结合剂，其中所述第二多肽链与所述第四多肽链相互作用。
19.权利要求13至18中任一项所述的结合剂，其中所述第二多肽链上的VH(CLDN18.2)与所述第四多肽链上的VL(CLDN18.2)相互作用以形成所述对CLDN18.2具有特异性的另外的结合结构域。
20.权利要求14至19中任一项所述的结合剂，其中所述第二多肽链上的CH1与所述第四多肽链上的CL相互作用。
21.权利要求1至20中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CD3)包含选自SEQ ID NO：54、58和61的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
22.权利要求1至21中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CD3)包含：
(i)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1，含有氨基酸序列RIRSKANNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：50)或其功能性变体的CDR2，和含有氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO：45)或其功能性变体的CDR3，
(ii)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1，含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：44)或其功能性变体的CDR2，和含有氨基酸序列HGNFGDEYVSWFAY(SEQ ID NO：51)或其功能性变体的CDR3，或者
(iii)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1，含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：44)或其功能性变体的CDR2，和含有氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO：45)或其功能性变体的CDR3。
23.权利要求1至22中任一项所述的结合剂，其中所述VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3。
24.权利要求1至23中任一项所述的结合剂，其中所述VL(CD3)包含：含有氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：46)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ IDNO：47)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：48)或其功能性变体的CDR3。
25.权利要求1至24中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3。
26.权利要求1至25中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列SYWIN(SEQ ID NO：32)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列NIYPSDSYTNYNQKFQG(SEQ ID NO：33)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列SWRGNSFDY(SEQ ID NO：34)或其功能性变体的CDR3。
27.权利要求1至26中任一项所述的结合剂，其中所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3。
28.权利要求1至27中任一项所述的结合剂，其中所述VL(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：35)或其功能性变体的CDR1，含有氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：36)或其功能性变体的CDR2，和含有氨基酸序列QNDYSYPFT(SEQ ID NO：37)或其功能性变体的CDR3。
29.权利要求1至28中任一项所述的结合剂，其中
(i)所述VH(CD3)包含SEQ ID NO：58的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3，以及所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3，
(ii)所述VH(CD3)包含SEQ ID NO：61的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL(CD3)包含SEQ IDNO：55的CDR1、CDR2和CDR3，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3，以及所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3，或
(iii)所述VH(CD3)包含SEQ ID NO：54的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL(CD3)包含SEQ IDNO：55的CDR1、CDR2和CDR3，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：39的CDR1、CDR2和CDR3，以及所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：42的CDR1、CDR2和CDR3。
30.权利要求1至29中任一项所述的结合剂，其中
所述VH(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列或其功能性变体，
所述VL(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列或其功能性变体，
所述VH(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，和/或者
所述VL(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
31.权利要求1至29中任一项所述的结合剂，其中
所述VH(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列或其功能性变体，
所述VL(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列或其功能性变体，
所述VH(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，和/或者
所述VL(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
32.权利要求1至29中任一项所述的结合剂，其中
所述VH(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：54表示的氨基酸序列或其功能性变体，
所述VL(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列或其功能性变体，
所述VH(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，和/或者
所述VL(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
33.权利要求3至32中任一项所述的结合剂，其中在所述第一多肽链上，所述CH1通过肽接头与所述CH2连接。
34.权利要求33所述的结合剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQID NO：27)或其功能性变体。
35.权利要求3至34中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CD3)或VL(CD3)通过肽接头与所述CH2连接。
36.权利要求14至35中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CD3)或VL(CD3)通过肽接头与所述CH1连接。
37.权利要求35或36所述的结合剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6。
38.权利要求37所述的结合剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)2(SEQ ID NO：26)或其功能性变体。
39.权利要求35至38中任一项所述的结合剂，其中所述连接所述VH(CD3)或VL(CD3)与所述CH2的肽接头包含氨基酸序列KTHTCPPCP(SEQ ID NO：21)或其功能性变体。
40.权利要求39所述的结合剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列(G4S)2KTHTCPPCP(SEQID NO：23)或其功能性变体。
41.权利要求39所述的结合剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列EPKSSDKTHTCPPCP(SEQID NO：22)或其功能性变体。
42.权利要求1至41中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CD3)与所述VL(CD3)通过肽接头相互连接。
43.权利要求42所述的结合剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列(GKPGS)x或其功能性变体，其中x是2、3、4、5或6。
44.权利要求43所述的结合剂，其中所述肽接头包含氨基酸序列(GKPGS)4(SEQ ID NO：11)或其功能性变体。
45.权利要求2至44中任一项所述的结合剂，其中所述CH1包含含有根据EU编号的第208位处的天冬氨酸残基的氨基酸序列。
46.权利要求14至45中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链上的CH1包含含有根据EU编号的第208位处的天冬氨酸残基的氨基酸序列，并且所述第二多肽链上的CH1包含含有根据EU编号的第208位处的天冬酰胺残基的氨基酸序列。
47.权利要求1至46中任一项所述的结合剂，其基本上不与人FcγRI、IIa、IIb和/或IIIa结合。
48.权利要求3至47中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链和/或所述第二多肽链上的CH2包含含有以下中的一个或更多个的氨基酸序列：根据EU编号的第233位处的脯氨酸残基、第234位处的缬氨酸残基、第235位处的丙氨酸残基、第236位处的缺失、第267位处的赖氨酸残基和第295位处的谷氨酸残基。
49.权利要求48所述的结合剂，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链上的CH2包含含有以下的氨基酸序列：根据EU编号的第233位处的脯氨酸残基、第234位处的缬氨酸残基、第235位处的丙氨酸残基、第236位处的缺失和第267位处的赖氨酸残基，并且其中所述第一多肽链上的CH2还包含根据EU编号的第295位处的谷氨酸残基，并且所述第二多肽链上的CH2还包含根据EU编号的第295位处的谷氨酰胺残基。
50.权利要求3至49中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链和/或所述第二多肽链上的CH3包含含有以下中的一个或更多个的氨基酸序列：根据EU编号的第357位处的谷氨酰胺残基、第364位处的赖氨酸残基、第368位处的天冬氨酸残基、第370位处的丝氨酸残基、第384位处的天冬氨酸残基、第418位处的谷氨酸残基和第421位处的天冬氨酸残基。
51.权利要求50所述的结合剂，其中所述第一多肽链上的CH3包含含有以下的氨基酸序列：根据EU编号的第357位处的谷氨酸残基、第364位处的丝氨酸残基、第368位处的天冬氨酸残基、第370位处的丝氨酸残基、第384位处的天冬氨酸残基、第418位处的谷氨酸残基和第421位处的天冬氨酸残基，并且所述第二多肽链上的CH3包含含有以下的氨基酸序列：根据EU编号的第357位处的谷氨酰胺残基、第364位处的赖氨酸残基、第368位处的亮氨酸残基、第370位处的赖氨酸残基、第384位处的天冬酰胺残基、第418位处的谷氨酰胺残基和第421位处的天冬酰胺残基。
52.权利要求1至51中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链包含由SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列或其功能性变体。
53.权利要求1至52中任一项所述的结合剂，其中所述第二多肽链包含由SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列或其功能性变体。
54.权利要求1至53中任一项所述的结合剂，其中所述第三多肽链包含由SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列或其功能性变体。
55.权利要求1至54中任一项所述的结合剂，其中所述第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体。
56.权利要求1至55中任一项所述的结合剂，其中所述第二多肽链包含以下或由以下组成：选自SEQ ID NO：74、75、76和77的氨基酸序列或其功能性变体。
57.权利要求1至56中任一项所述的结合剂，其中所述第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
58.权利要求1至12、21至29、32至35、39、41至45和47至57中任一项所述的结合剂，其中
(i)所述第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)所述第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)所述第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
59.权利要求1至30、33至40和42至57中任一项所述的结合剂，其中
(i)所述第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)所述第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：74表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)所述第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
60.权利要求1至30、33至40和42至57中任一项所述的结合剂，其中
(i)所述第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)所述第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：76表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)所述第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
61.权利要求1至29、31、33至39和41至57中任一项所述的结合剂，其中
(i)所述第一多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或其功能性变体，
(ii)所述第二多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列或其功能性变体，以及
(iii)所述第三多肽链包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或其功能性变体。
62.权利要求1至61中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CLDN18.2)、VL(CLDN18.2)、VH(CD3)和/或VL(CD3)是人源化的。
63.权利要求1至62中任一项所述的结合剂，其中CD3在T细胞表面上表达。
64.权利要求63所述的结合剂，其中所述结合剂与T细胞上的CD3的结合导致所述T细胞的增殖和/或活化。
65.权利要求1至64中任一项所述的结合剂，其中CLDN18.2在癌细胞中表达。
66.权利要求65所述的结合剂，其中CLDN18.2在所述癌细胞的表面上表达。
67.权利要求65或66所述的结合剂，其中所述结合剂与CLDN18.2的胞外部分结合。
68.权利要求1至67中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂诱导针对表达CLDN18.2的癌细胞的T细胞介导的细胞毒性。
69.权利要求65至68中任一项所述的结合剂，其中所述癌细胞来自选自以下的癌症：胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
70.核酸，其编码权利要求1至69中任一项所述的结合剂的多肽链。
71.核酸，其编码权利要求1至69中任一项所述的结合剂。
72.核酸组，其共同编码权利要求1至69中任一项所述的结合剂。
73.载体，其包含权利要求70所述的核酸。
74.载体，其包含权利要求71所述的核酸或权利要求72所述的核酸组。
75.载体组，其包含权利要求72所述的核酸组。
76.权利要求74所述的载体或权利要求75所述的载体组，其能够表达所述结合剂。
77.宿主细胞，其包含权利要求71所述的核酸、权利要求72所述的核酸组、权利要求74或76所述的载体或者权利要求75或76所述的载体组。
78.药物组合物，其包含权利要求1至69中任一项所述的结合剂、权利要求71所述的核酸、权利要求72所述的核酸组、权利要求74或76所述的载体、权利要求75或76所述的载体组或者权利要求77所述的宿主细胞。
79.权利要求1至69中任一项所述的结合剂、权利要求71所述的核酸、权利要求72所述的核酸组、权利要求74或76所述的载体、权利要求75或76所述的载体组、权利要求77所述的宿主细胞或者权利要求78所述的药物组合物，其用于治疗。
80.权利要求1至69中任一项所述的结合剂、权利要求71所述的核酸、权利要求72所述的核酸组、权利要求74或76所述的载体、权利要求75或76所述的载体组、权利要求77所述的宿主细胞或者权利要求78所述的药物组合物，其用于治疗或预防涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症。
81.权利要求80所述应用的结合剂、核酸、核酸组、载体、载体组、宿主细胞或药物组合物，其中所述癌症选自胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
82.权利要求1至69中任一项所述的结合剂、权利要求71所述的核酸、权利要求72所述的核酸组、权利要求74或76所述的载体、权利要求75或76所述的载体组、权利要求77所述的宿主细胞或者权利要求78所述的药物组合物用于制备用于治疗或预防涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症的药物的用途。
83.权利要求82所述的用途，其中所述癌症选自胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
84.治疗或预防涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症的方法，其中所述方法包括向患有癌症的对象施用权利要求1至69中任一项所述的结合剂、权利要求71所述的核酸、权利要求72所述的核酸组、权利要求74或76所述的载体、权利要求75或76所述的载体组、权利要求77所述的宿主细胞或者权利要求78所述的药物组合物。
85.权利要求84所述的方法，其中所述癌症选自胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
86.包含对CLDN18.2具有特异性的结合结构域的结合剂，所述结合结构域包含来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区(VH)(VH(CLDN18.2))和来源于对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区(VL)(VL(CLDN18.2))，其中
所述VH(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列SYWIN(SEQ ID NO：32)的CDR1、含有氨基酸序列NIYPSDSYTNYNQKFQG(SEQ ID NO：33)的CDR2和含有氨基酸序列SWRGNSFDY(SEQ ID NO：34)的CDR3，以及
所述VL(CLDN18.2)包含：含有氨基酸序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：35)的CDR1、含有氨基酸序列WASTRES(SEQ ID NO：36)的CDR2和含有氨基酸序列QNDYSYPFT(SEQ ID NO：37)的CDR3。
87.权利要求86所述的结合剂，其还包含对CD3具有特异性的结合结构域。
88.权利要求87所述的结合剂，其中所述对CD3具有特异性的结合结构域包含来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的VH(VH(CD3))和来源于对CD3具有特异性的免疫球蛋白的VL(VL(CD3))，其中
所述VH(CD3)包含选自SEQ ID NO：54、58和61的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，以及
所述VL(CD3)包含SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3。
89.权利要求88所述的结合剂，其中
所述VH(CD3)包含：
(i)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列RIRSKANNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：50)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO：45)或其功能性变体的CDR3，
(ii)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：44)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列HGNFGDEYVSWFAY(SEQ ID NO：51)或其功能性变体的CDR3，或者
(iii)含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO：43)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：44)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO：4S)或其功能性变体的CDR3，以及
所述VL(CD3)包含：含有氨基酸序列GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：46)或其功能性变体的CDR1、含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO：47)或其功能性变体的CDR2和含有氨基酸序列ALWYSNHWV(SEQ ID NO：48)或其功能性变体的CDR3。
90.权利要求86至89中任一项所述的结合剂，其中
所述VH(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：39表示的氨基酸序列或其功能性变体，和/或者
所述VL(CLDN18.2)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：42表示的氨基酸序列或其功能性变体。
91.权利要求88至90中任一项所述的结合剂，其中
所述VH(CD3)包含以下或由以下组成：选自SEQ ID NO：54、58或61的氨基酸序列或者其功能性变体，并且
所述VL(CD3)包含以下或由以下组成：由SEQ ID NO：55表示的氨基酸序列或其功能性变体。
92.权利要求86至91中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂是全长抗体或抗体片段的形式。
93.权利要求86至92中任一项所述的结合剂，其中所述对CLDN18.2具有特异性的结合结构域是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段的形式。
94.权利要求87至93中任一项所述的结合剂，其中所述对CD3具有特异性的结合结构域是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或scFv片段的形式。
95.权利要求87至94中任一项所述的结合剂，其中所述对CLDN18.2具有特异性的结合结构域是Fab片段的形式，并且所述对CD3具有特异性的结合结构域是scFv片段的形式。
96.权利要求86至95中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂是双特异性分子。
97.权利要求96所述的结合剂，其中所述双特异性分子是双特异性抗体。
98.权利要求86至97中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂能够一价或二价地与CLDN18.2结合。
99.权利要求86至98中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CLDN18.2)、VL(CLDN18.2)、VH(CD3)和/或VL(CD3)是人源化的。
100.权利要求86至99中任一项所述的结合剂，其中所述VH(CLDN18.2)通过肽接头与所述VL(CLDN18.2)连接，和/或所述VH(CD3)通过肽接头与所述VL(CD3)连接。
101.权利要求100所述的结合剂，其中所述肽接头包含选自SEQ ID NO：2至20的氨基酸序列。
102.包含对CLDN18.2具有特异性的两个结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂，
其中所述结合剂包含四条多肽链，其中
(i)所述第一多肽链包含由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或由其组成，
(ii)所述第二多肽链包含由SEQ ID NO：74表示的氨基酸序列或由其组成，
(iii)所述第三多肽链包含由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或由其组成，以及
(iv)所述第四多肽链与所述第三多肽链相同，
其中所述第一多肽链与所述第二多肽链相互作用并且与所述第三多肽链相互作用，并且所述第二多肽链与所述第四多肽链相互作用。
103.包含对CLDN18.2具有特异性的结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂，
其中所述结合剂包含三条多肽链，其中
(i)所述第一多肽链包含由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或由其组成，
(ii)所述第二多肽链包含由SEQ ID NO：75表示的氨基酸序列或由其组成，以及
(iii)所述第三多肽链包含由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或由其组成，
其中所述第一多肽链与所述第二多肽链相互作用并且与所述第三多肽链相互作用。
104.包含对CLDN18.2具有特异性的两个结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂，
其中所述结合剂包含四条多肽链，其中
(i)所述第一多肽链包含由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或由其组成，
(ii)所述第二多肽链包含由SEQ ID NO：76表示的氨基酸序列或由其组成，
(iii)所述第三多肽链包含由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或由其组成，以及
(iv)所述第四多肽链与所述第三多肽链相同，
其中所述第一多肽链与所述第二多肽链相互作用并且与所述第三多肽链相互作用，以及所述第二多肽链与所述第四多肽链相互作用。
105.包含对CLDN18.2具有特异性的两个结合结构域和对CD3具有特异性的结合结构域的结合剂，
其中所述结合剂包含四条多肽链，其中
(i)所述第一多肽链包含由SEQ ID NO：73表示的氨基酸序列或由其组成，
(ii)所述第二多肽链包含由SEQ ID NO：77表示的氨基酸序列或由其组成，
(iii)所述第三多肽链包含由SEQ ID NO：78表示的氨基酸序列或由其组成，以及
(iv)所述第四多肽链与所述第三多肽链相同，
其中所述第一多肽链与所述第二多肽链相互作用并且与所述第三多肽链相互作用，以及所述第二多肽链与所述第四多肽链相互作用。
106.权利要求87至105中任一项所述的结合剂，其中CD3在T细胞的表面上表达。
107.权利要求106所述的结合剂，其中所述结合剂与T细胞上的CD3的结合导致所述T细胞的增殖和/或活化。
108.权利要求86至107中任一项所述的结合剂，其中CLDN18.2在癌细胞中表达。
109.权利要求108所述的结合剂，其中CLDN18.2在所述癌细胞的表面上表达。
110.权利要求108或109所述的结合剂，其中所述结合剂与CLDN18.2的胞外部分结合。
111.权利要求86至110中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂诱导针对表达CLDN18.2的癌细胞的T细胞介导的细胞毒性。
112.权利要求108至111中任一项所述的结合剂，其中所述癌细胞来自选自以下的癌症：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
113.核酸，其编码权利要求102至112中任一项所述的结合剂的多肽链。
114.核酸，其编码权利要求86至112中任一项所述的结合剂。
115.核酸组，其共同编码权利要求86至112中任一项所述的结合剂。
116.载体，其包含权利要求113所述的核酸。
117.载体，其包含权利要求114所述的核酸或权利要求115所述的核酸组。
118.载体组，其包含权利要求115所述的核酸组。
119.权利要求117所述的载体或权利要求118所述的载体组，其能够表达所述结合剂。
120.宿主细胞，其包含权利要求114所述的核酸、权利要求115所述的核酸组、权利要求117或119所述的载体或者权利要求118或119所述的载体组。
121.药物组合物，其包含权利要求86至112中任一项所述的结合剂、权利要求114所述的核酸、权利要求115所述的核酸组、权利要求117或119所述的载体、权利要求118或119所述的载体组或者权利要求120所述的宿主细胞。
122.权利要求86至112中任一项所述的结合剂、权利要求114所述的核酸、权利要求115所述的核酸组、权利要求117或119所述的载体、权利要求118或119所述的载体组、权利要求120所述的宿主细胞或者权利要求121所述的药物组合物，其用于治疗。
123.权利要求86至112中任一项所述的结合剂、权利要求114所述的核酸、权利要求115所述的核酸组、权利要求117或119所述的载体、权利要求118或119所述的载体组、权利要求120所述的宿主细胞或者权利要求121所述的药物组合物，其用于治疗或预防涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症。
124.权利要求123所述应用的结合剂、核酸、核酸组、载体、载体组、宿主细胞或药物组合物，其中所述癌症选自胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
125.权利要求86至112中任一项所述的结合剂、权利要求114所述的核酸、权利要求115所述的核酸组、权利要求117或119所述的载体、权利要求118或119所述的载体组、权利要求120所述的宿主细胞或者权利要求121所述的药物组合物用于制备用于治疗或预防涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症的药物的用途。
126.权利要求125所述的用途，其中所述癌症选自胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
127.治疗或预防涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症的方法，其中所述方法包括向患有癌症的对象施用权利要求86至112中任一项所述的结合剂、权利要求114所述的核酸、权利要求115所述的核酸组、权利要求117或119所述的载体、权利要求118或119所述的载体组、权利要求120所述的宿主细胞或者权利要求121所述的药物组合物。
128.权利要求127所述的方法，其中所述癌症选自胃癌、食管癌、胃食管连接部(GEJ)的癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移、克鲁肯伯格瘤、腹膜转移和/或***转移。
129.用于产生权利要求1至69和86至112中任一项所述的结合剂的方法。
130.权利要求129所述的方法，其包括用权利要求71或114所述的核酸、权利要求72或115所述的核酸组、权利要求74、76、117或119中任一项所述的载体或者权利要求75、76、118或119中任一项所述的载体组转染宿主细胞。
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