CN117849349A - Rab18蛋白作为靶点在筛选或制备用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明Rab18蛋白作为靶点在筛选或制备用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用，属于生物技术领域。本发明采用qRT‑PCR技术检测了MrTV感染后，罗氏沼虾幼体中Rab18的表达谱，结果显示MrTV感染可显著提高Rab18的表达量，表明Rab18可能参与MrTV的感染过程。进一步采用免疫共沉淀和免疫共聚焦实验证实了罗氏沼虾Rab18是MrTV的结合蛋白。体内中和实验表明预混合MrTV与Rab18蛋白能有效降低MrTV的感染量。上述结果表明罗氏沼虾Rab18是MrTV的结合蛋白，参与了MrTV的感染过程，以Rab18蛋白为靶点，可研发相关生物制剂或建立相关阻断技术，有效防控MrTV的感染。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及Rab18蛋白作为靶点在筛选或制备用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用。
背景技术
罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii(de Man)又名马来西亚大虾，淡水长臂大虾，是世界上最大型的淡水虾之一，具有生长快，食性广，肉质鲜美，营养丰富，经济价值高等优点。目前，罗氏沼虾是世界上养殖量最高的三大虾种之一，中国是世界上罗氏沼虾育苗及养殖产量最高，养殖区域最集中的国家。然而随着集约化水产养殖的发展，养殖密度不断提高，养殖水环境日益恶化，养殖品种种质退化，近年来，我国罗氏沼虾育苗和养殖业均受到了大规模病害的侵袭。其中罗氏沼虾太湖病毒(Macrobrachiumrosenbergii Taihuvirus,MrTV)是罗氏沼虾育苗阶段的主要病原，其感染可引起“罗氏沼虾幼体综合症”的爆发，养殖幼体在短时间内出现大面积死亡，死亡率可达80-90％，严重制约了罗氏沼虾育苗及养殖产业的健康发展。
Rab蛋白是Ras小GTPase超家族中最大的亚家族，广泛存在于所有真核生物中，在进化上较为保守。目前已发现的Rab蛋白有60余种，可定位于特定的细胞内膜，通过与相应效应蛋白的结合，精确调控囊泡的形成、转运、粘附、锚定和融合，是细胞内囊泡运输的分子开关。Rab蛋白是目前已发现的最重要的转运相关蛋白之一，在真核细胞中参与了几乎所有的膜内运输过程，在囊泡运输的特异性和方向性上具有重要的作用，被认为是细胞内膜运输的主要调控因子。
病毒是严格专性细胞内寄生的微生物，实质是核酸与蛋白质的复合体，其感染必须劫持宿主细胞的固有机制完成侵入、胞内运输、基因表达和组装成熟等过程。目前，已有较多的研究证实Rab蛋白参与多种重要致病性病毒的感染过程。病毒在感染过程中，可通过多条途径与多种Rab蛋白互作，劫持其相关转运通路完成自身的增殖与感染，阻断病毒和Rab蛋白及相关效应蛋白的相互作用可有效阻断病毒的感染。因此，Rab蛋白是抗病毒感染的重要靶点。
Rab18是Rab蛋白家族的重要成员，可定位于内质网、高尔基体和脂滴中，主要调控内质网与高尔基体之间的物质转运。病毒感染机制的研究表明，Rab18可被劫持参与多类病毒的增殖过程。在丙肝病毒(HCV)的感染过程中，其核心蛋白被招募到脂滴中进行病毒装配，Rab18被发现在这一过程具有重要的作用，敲降Rab18会抑制核心蛋白招募至脂滴的过程，进而影响病毒的组装，降低HCV的感染。在经典猪瘟病毒(CSFV)的感染过程中，Rab18可被CSFV的NS5A蛋白结合，参与病毒的复制和组装，敲降Rab18蛋白可有效抑制病毒的感染，而过表达Rab18则促进病毒的感染。此外，在人BK多瘤病毒(BKPyV)和登革热病毒(DENV)的研究中也发现，Rab18在BKPyV和DENV的感染过程中是必须的，敲降Rab18可有效抑制病毒的增殖。
MrTV是一类无囊膜，直径约为25-30nm的单股正链RNA病毒，隶属于双顺反子病毒。目前对于该病毒的感染尚无有效的治疗和防控方法，对于该病原的感染机制及其与宿主相互关系的研究也相对较少。在病毒感染阻断的研究中发现，以病毒的宿主结合蛋白为靶点，抑制宿主结合蛋白的表达或阻断病毒与宿主结合蛋白的结合能有效抑制病毒的增殖与感染。我们的工作表明罗氏沼虾Rab18蛋白在MrTV感染后表达量迅速上升，表明Rab18是MrTV应答基因，可能参与MrTV的感染过程。进一步研究表明，罗氏沼虾Rab18可与MrTV及其结构蛋白VP3互作，是MrTV的结合蛋白。预混合MrTV与Rab18蛋白后感染罗氏沼虾幼体，能有效降低MrTV的感染量，表明罗氏沼虾Rab18可作为靶点，阻断MrTV感染。经对现有技术的文献检索发现，目前尚无以Rab18为靶点，防控MrTV的专利公布。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种Rab18蛋白作为靶点在筛选或制备用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用的技术方案，并为建立相关阻断技术提供技术支撑。
具体通过以下技术方案加以实现：
本发明第一方面提供了Rab18蛋白作为靶点在筛选用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用。
本发明第二方面提供了Rab18蛋白作为靶点在制备用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用。
本发明第三方面提供了Rab18蛋白或rMrRab18融合蛋白在制备抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用。
进一步，所述Rab18蛋白或rMrRab18融合蛋白与罗氏沼虾太湖病毒混合后有效降低病毒感染量。
本发明的有益效果在于：
1)本发明构建了罗氏沼虾Rab18的pET28a原核表达载体rMrRab18，表达并纯化了rMrRab18融合蛋白，免疫新西兰大白兔制备了Rab18多克隆抗血清，Western blot显示制备的抗血清能特异性识别Rab18；
2)qRT-PCR检测结果表明，MrTV感染后4-48h，罗氏沼虾幼体中Rab18 mRNA表达量显著上调，预示Rab18是MrTV的应答基因，可能参与MrTV的感染过程；
3)Co-IP实验结果显示MrTV既可以与内源性的罗氏沼虾Rab18蛋白，也可以和原核表达的rMrRab18融合蛋白相互作用，表明Rab18是MrTV的结合蛋白。此外，MrTV结构蛋白VP3能与原核表达的rMrRab18融合蛋白相互作用，表明Rab18是MrTV-VP3的结合蛋白；
4)免疫共聚焦实验结果显示，MrTV和Rab18在罗氏沼虾血淋巴细胞中存在强烈的共定位信号，进一步表明Rab18蛋白是MrTV的结合蛋白，参与MrTV的感染过程；
5)体内中和实验显示，预混合MrTV和rMrRab18蛋白可显著降低MrTV的感染量，表明以Rab18为靶点，开发生物制剂或建立阻断技术可有效降低MrTV的感染。
附图说明
图1Rab18的原核表达和抗体制备。M，蛋白marker；1，未诱导；2，0.5mmol IPTG诱导；3，His纯化；4，WB验证制备的Rab18抗体的特异性。箭头显示Rab18表达条带；
图2qRT-PCR检测MrTV感染后，罗氏沼虾幼体中Rab18表达变化。*表示差异显著；
图3Co-IP验证Rab18和MrTV及其结构蛋白VP3的相互作用。Anti-VP3表明Vp3抗体固定化树脂，Rab18抗体用于WB验证互作；Anti-Rab18表明Rab18抗体固定化树脂，VP3抗体用于WB验证互作；
图4Rab18和MrTV在罗氏沼虾血淋巴细胞中的共定位。A：DAPI染色；B：Rab18兔抗和Dylight 488抗体标记Rab18蛋白；C：VP3鼠抗和Dylight549抗体标记MrTV；D:明场；E：合并所有信号。箭头表示共定位的MrRab18和MrTV；
图5体内中和实验，预混合不同剂量的纯化的rMrRab18蛋白和MrTV后感染罗氏沼虾幼体，qRT-PCR检测MrTV感染量变化。*表示与MrTV感染组相比差异显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理与特征进行描述，所举实施案例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明中涉及的罗氏沼虾Rab18基因序列已在NCBI公布，Genbank号：KP216763。
下列实施案例中提到的MrTV自然感染罗氏沼虾幼体采自浙江省某发病，保存于实验室-80℃冰箱。
下列实施案例中提到的VP3-pET32a融合表达载体和VP3多克隆鼠抗为本实验室制备，冻存于本实验室中。
下述实施案例中所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下列实施案例中提到的MrTV qRT-PCR检测方法为本实验室已建立的以MrTV-VP3为靶基因的定量检测方法。
下述实施案例中所使用的其他实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明的实现步骤包括：
1、根据NCBI公布的罗氏沼虾Rab18 ORF序列，设计含酶切位点引物，构建Rab18-pET28a原核表达载体rMrRab18，IPTG诱导表达，His纯化Rab18蛋白，免疫新西兰大白兔，制备Rab18多克隆兔抗。
2、使用蔗糖密度梯度离心法从自然感染的罗氏沼虾幼体中纯化MrTV，浸泡感染7日龄罗氏沼虾幼体，分别于感染后0、4、8、12、24和48h提取感染幼体总RNA，使用qRT-PCR法检测MrTV感染后，罗氏沼虾幼体中Rab18表达量变化。
3、Co-IP验证MrTV和内源性的罗氏沼虾Rab18蛋白及原核表达的rMrRab18的相互作用；Co-IP验证rMrRab18蛋白与原核表达的VP3-pET32a融合蛋白之间的相互作用。
4、体外培养罗氏沼虾单层血淋巴细胞，添加纯化的MrTV病毒，感染16h后多聚甲醛固定，以实验室保存的MrTV结构蛋白VP3多克隆鼠抗标记MrTV，以步骤1中制备的Rab18多克隆兔抗标记Rab18蛋白，DAPI染核，共聚焦显微镜观察MrTV与Rab18的共定位。
5、预混合纯化的rMrRab18蛋白和MrTV 1h后浸泡感染罗氏沼虾7日龄幼体，24h后，提取感染幼体的总RNA，qRT-PCR检测MrTV感染量变化。
具体的操作步骤如下：
一、罗氏沼虾Rab18的原核表达和抗体制备
1、取50-100mg健康罗氏沼虾幼体,使用天根RNAsimple总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用Takara PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA，严格按照说明书进行操作。
2、根据NCBI公布的罗氏沼虾Rab18序列(Genbank号：KP216763)，设计含酶切位点的引物，上游引物为5’-TTGGATCCATGTCTGATTCGGACATTC-3’，含酶切位点BamHI，下游引物为5’-CTCTCGAGCTACAGTACTGCACAGTAA-3’，含酶切位点XhoI(下横线为相应的酶切位点)。
3、以步骤1反转录的cDNA为模板，使用步骤2设计合成的引物，PCR扩增长度为621bp的罗氏沼虾Rab18 ORF框，胶回收目的条带，连接pMD19T(Takara)后转化DH5α感受态，测序鉴定阳性克隆。
4、融合表达载体构建：提取步骤3中测序鉴定正确的阳性克隆质粒和pET28a表达载体(Novagen)，用限制性内切酶BamHI和XhoI(Takara)双酶切3h后，胶回收目的片段，T4DNA连接酶(Takara)连接过夜，转化感受态BL21(DE3)(Takara)。测序鉴定后获得正确编码的重组表达载体rMrRab18。
5、重组蛋白诱导表达与纯化：将步骤4中含正确编码rMrRab18的阳性克隆37℃扩培过夜，1：100接种于新的LB液体培养基(含卡那)中，37℃振荡培养，当OD600达0.4-0.6时,加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃诱导过夜。离心收集菌体，超声破碎后，使用His-bind纯化试剂盒(Merck)对融合蛋白进行分离纯化，12％ SDS-PAGE电泳检测结果表明IPTG成功诱导rMrRab18融合表达(图1，lane 1-2)，分子量大小符合预期，His纯化获得了单一蛋白条带(图1，lane 3)。
6、多克隆兔抗制备与纯化：
使用Bradford法对步骤5中纯化所得的rMrRab18蛋白进行浓度测定后，免疫新西兰大白兔制备Rab18多克隆抗血清。使用rMrRab18蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，亲和纯化Rab18多克隆抗血清。Western blot(WB)检测结果表明制备的多克隆兔抗能特异性识别Rab18蛋白(图1，lane 4)。
His蛋白纯化试剂盒纯化的空pET32a载体获得Trx/His/S标签蛋白，作为阴性对照用于下游实验。
二、qRT-PCR检测MrTV感染后，罗氏沼虾幼体中Rab18表达量变化
1、采用蔗糖密度梯度离心法从自然感染罗氏沼虾幼体中分离纯化MrTV病毒，使用建立的以MrTV-VP3为靶基因的qRT-PCR法对病毒拷贝数进行定量。
2、MrTV(106copies)浸泡感染7日龄罗氏沼虾幼体，分别于感染后0，4，8，12，24和48h提取感染幼体总RNA，反转录cDNA，对照组采用TN缓冲液进行浸泡感染。
3、使用qRT-PCR法检测MrTV感染后不同时间，罗氏沼虾幼体中Rab18表达谱。引物序列为qRab18-F：5’-ACAAAATTGACAAGGAGAAAAGAGA-3’；qRab18-R：5’-AAAGTCCTGGAGTTTGAATGATC-3’。
qPCR使用Takara TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂盒，反应体系为：2×TB Green Premix Ex Taq II 12.5μl,上下游引物浓度各0.2μmol,2μl cDNA模板，ddH2O补充至终体积为25μl。反应程序为95℃3min；40个循环，95℃10s，60℃45s，72℃20s。
本实验重复3次，选择罗氏沼虾18s rDNA基因为看家基因(引物序列为q18s-F：5’-GTCTGTGATGCCCTTAGATGTCC-3’；q18s-R：5’-GCAAGCCCCAATCCCTATC-3’)，采用Livak 2-ΔΔCT法对Rab18表达量进行相对定量分析。实验数据表示为平均值±标准误(mean±SE)，统计分析使用IBM SPSS25软件包，采用student t test，P<0.05为差异显著。
研究结果表明，和未感染组(0h)相比，MrTV感染后Rab18表达量呈上调趋势，统计分析结果表明感染后4-48h，Rab18表达量显著上调，感染后48h，表达量最高，为对照组的8.67倍(图2)。
三、Co-IP验证Rab18与MrTV及其结构蛋白VP3的相互作用
Co-IP使用Pierce Co-Immunoprecipitation Kit(Thermo Scientific)，严格按说明书进行操作。简要如下：
首先使用MrTV结构蛋白VP3多克隆鼠抗固定化树脂，以纯化的MrTV病毒为bait蛋白，分为2个实验组，第1组以纯化的rMrRab18融合蛋白为Prey蛋白；第2组以差速离心法提取的罗氏沼虾幼体总膜蛋白为Prey蛋白。Bait和Prey蛋白充分混合，经试剂盒Control树脂预处理后添加到VP3抗体固定化的树脂中，4℃摇床孵育过夜。柱子使用裂解/洗涤缓冲液充分洗涤后，使用洗脱缓冲液洗脱免疫共沉淀复合物。洗脱的复合物使用制备的Rab18抗体为一抗进行WB验证。
其次，使用制备的Rab18抗体固定化树脂，以纯化的rMrRab18蛋白为Bait蛋白，以纯化的MrTV为Prey蛋白。Bait和Prey蛋白充分混合，经预处理、孵育、洗涤和洗脱后获得免疫共沉淀复合物，进一步使用VP3抗体为一抗进行WB验证。
第三，His纯化VP3-pET32a融合蛋白，分别使用VP3抗体和Rab18抗体固定化树脂，混合纯化的VP3-pET32a融合蛋白与纯化的rMrRab18蛋白为Bait和Prey蛋白混合物。免疫共沉淀复合物分别使用Rab18抗体和VP3抗体进行WB检测。
阴性对照组使用Trx/His/S标签蛋白为Prey蛋白，其余同实验组。
结果显示阴性对照组均无明显条带，实验组均有特异性条带(图3)，表明纯化的MrTV与原核表达的rMrRab18蛋白及提取的内源性罗氏沼虾Rab18蛋白之间均有相互作用，且体外原核表达的MrTV-VP3与rMrRab18之间也存在相互作用，表明Rab18是MrTV及其结构蛋白VP3的结合蛋白。
四、免疫共聚焦验证Rab18与MrTV的共定位
参考Du等(2012)建立的方法，抽取健康罗氏沼虾血淋巴细胞置于Nest玻底皿中，加入含有双抗(100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素)的L-15培养基(pH 7.2-7.4)，28℃体外培养6h后更换新的培养基(含105copies纯化的MrTV病毒)。感染后16h，小心去除培养基，PBS(pH 7.4)清洗去除未吸附的MrTV病毒。
免疫共聚焦实验主要参考Ning等(2019)建立的方法，简要如下：使用预冷的4％多聚甲醛固定血淋巴细胞30min，PBS清洗3次后，0.5％ Triton X-100透膜10min，5％ BSA 4℃封闭过夜。使用VP3多克隆鼠抗和Rab18兔抗(1：500稀释于含1％ BSA的PBS)为一抗孵育1h，PBS洗涤三次后，使用Abbkine Dylight 549山羊抗鼠IgG(H+L)和Abbkine Dylight 488山羊抗兔IgG(H+L)(1:500稀释于含1％ BSA的PBS)为二抗暗处孵育1h，DAPI染核5min。PBS清洗后Zeiss LSM780共聚焦显微镜观察。
如图4所示，DAPI染色标记细胞核，呈蓝色(图4A)，Rab18多克隆兔抗和AbbkineDylight 488山羊抗兔IgG标记罗氏沼虾Rab18蛋白，呈绿色(图4B)，VP3多克隆鼠抗和Abbkine Dylight 549山羊抗鼠IgG标记侵染血细胞的MrTV，呈红色(图4C)，通过颜色叠加(黄色)判断共定位。结果表明感染后16h，MrTV侵染血淋巴细胞，且Rab18与MrTV呈现出强共定位现象(图4E)，进一步证明Rab18可能作为MrTV的结合蛋白参与MrTV的感染过程。
五、体内中和实验
健康罗氏沼虾7日龄幼体被分为5组，每组含有约100个幼体。1-3组为实验组，分别将10、20、30ug纯化的rMrRab18蛋白和106copies纯化的MrTV病毒预混合1h后浸泡感染幼体；第4组为对照组1，使用106copies纯化的MrTV病毒浸泡感染幼体；第5组为对照组2，使用20ug纯化的Trx/his/S标签蛋白代替rMrRab18蛋白和病毒预混合1h后浸泡感染幼体。感染24h后，提取5组幼体的总RNA，反转录cDNA，使用建立的MrTV qRT-PCR检测方法检测感染幼体中的MrTV含量，使用罗氏沼虾18s rDNA为看家基因。实验重复3次，数据表述为平均值±标准误(mean±SE)，分析方法为Livak2-ΔΔCt法，显著性分析使用one-way ANOVA分析，多重比较采用Duncan法，p<0.05为差异显著。。
结果表明和2组对照组相比，不同剂量的rMrRab18和MrTV预混合后感染罗氏沼虾幼体，MrTV感染量均显著下降，表明添加纯化的rMrRab18蛋白可显著降低MrTV在罗氏沼虾幼体中的感染量，表明Rab18能部分阻断MrTV的感染，但实验组之间差异不显著，表明不存在剂量-依赖关系(图5)。
综上，本发明构建了罗氏沼虾Rab18蛋白原核表达载体rMrRab18，完成了rMrRab18的表达与纯化，制备了Rab18的多克隆兔抗。qRT-PCR检测结果表明MrTV感染后4-48h罗氏沼虾幼体中Rab18表达量显著上升，表明Rab18是MrTV的应答基因，可能参与MrTV的感染过程。Co-IP和免疫共沉淀实验结果表明Rab18是MrTV的结合蛋白及其结构蛋白VP3的结合蛋白。体内中和实验将不同剂量纯化的rMrRab18蛋白和MrTV病毒预混合1h后感染罗氏沼虾7日龄幼体，结果显示实验组MrTV感染量均显著下降，表明以Rab18为靶点，进行抗MrTV感染相关生物制剂的研发或阻断技术的研究具有较高的可行性。
Claims (4)
1.Rab18蛋白作为靶点在筛选用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用。
2.Rab18蛋白作为靶点在制备用于抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用。
3.Rab18蛋白或rMrRab18融合蛋白在制备抗罗氏沼虾太湖病毒感染的生物制剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于Rab18蛋白或rMrRab18融合蛋白与罗氏沼虾太湖病毒混合后有效降低病毒感染量。
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