CN117844836A - 产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
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- C12Y—ENZYMES
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- C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Abstract
本发明公开了一种构建四氢嘧啶产量提高的基因工程菌的的方法,所述方法增强所述基因工程菌中的ectA、B、C基因;弱化crr、thrA、iclR基因;并增强天冬氨酸脱氢酶AspDH基因、内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*和ppc基因。本发明还公开了利用所述方法获得的四氢嘧啶产量提高的基因工程菌以及利用所述基因工程菌生产四氢嘧啶以及以四氢嘧啶为前体的其它下游产物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术生产领域。具体地说,本发明涉及一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
目前四氢嘧啶的生产方法包括发酵法和酶催化法。其中,嗜盐微生物中具有四氢嘧啶的合成途径,因此广泛应用于四氢嘧啶的发酵法生产中。Sauer T等采用“细菌挤奶法”高密度发酵获得了较高产量的四氢嘧啶,即高渗透压下培养细菌、然后低渗冲击释放溶质、再将菌体重新高渗培养、低渗冲击释放溶质,依次循环多至8-9次,获得产物。朱皖宜(201310416404.4)等公开了一种可用于生产四氢嘧啶的新的盐单胞菌Halomonas sp.HS-2255及其突变株,保藏号为CGMCCNo.6248。该菌株在含有可同化的碳源和氮源且较低的NaCl含量的培养基中具有较高的四氢嘧啶产量,并且副产物羟基四氢嘧啶的含量较低。
酶催化法是通过在大肠杆菌中表达四氢嘧啶合成基因簇ectABC以获得具有相应酶活性的全细胞或粗酶液,以天冬氨酸为前体物催化合成四氢嘧啶的过程。董志扬等(201310518176.1,201310534045.2)利用E.coli BW-pBAD-ectABC,保藏编号为CGMCCNO.8334,将L-天冬氨酸钠经生物转化反应后即得。该菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞外四氢嘧啶87.5g,合成效率达到11.67g/L.d。
以上两种方法中,嗜盐菌发酵生产四氢嘧啶的不足在于培养过程中均需要高NaCl浓度来刺激菌体积累更多的产物,发酵周期较长,而且高浓度的NaCl溶液对发酵设备腐蚀严重,不适合大规模的工业化生产,同时高盐的发酵废液对环境造成了较大压力;酶催化法生产四氢嘧啶的底物为天冬氨酸钠,酶需要诱导表达并提取,因此操作比较复杂,生产成本较高。
因此,本领域需要操作简便,成本低廉,环境友好的四氢嘧啶生产方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种产生四氢嘧啶的基因工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程益生菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供利用上述基因工程益生菌产生四氢嘧啶的方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程益生菌的应用,用于制备四氢嘧啶。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
在第一方面,本发明提供一种构建四氢嘧啶产量提高的基因工程菌的方法,所述方法包括:
1)增强所述基因工程菌中的ectA、B、C基因;
2)弱化所述基因工程菌中的crr、thrA、iclR基因;
3)增强所述基因工程菌中的天冬氨酸脱氢酶AspDH基因、内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*和ppc基因。
在优选的实施方式中,所述“增强”是指提高所述基因工程菌本身存在的内源性基因的表达或活性;或者外源性导入所述基因工程菌中本身不存在的基因,并使得所述外源性导入的基因在所述基因工程菌中表达或起作用。
在优选的实施方式中,所述“弱化”是指降低所述基因工程菌中一个或多个基因的表达或活性。
在优选的实施方式中,所述“弱化”是指经弱化的基因的表达或活性是未弱化的基因的表达或活性的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%;优选使得所述基因完全失活。
在优选的实施方式中,所述“弱化的基因的表达或活性”可以通过,例如在所述基因工程菌的培养基中加入抑制剂或者敲除所述基因工程菌中的基因来实现。
在具体的实施方式中,所述ectA、B、C基因来源于伸长盐单胞菌;所述AspDH基因和突变基因EclysC*来源于铜绿假单胞菌;所述ppc基因来源于大肠杆菌。
在具体的实施方式中,所述基因ectA的序列如SEQ ID NO:1所示;
所述基因ectB的序列如SEQ ID NO:2所示;
所述基因ectC的序列如SEQ ID NO:3所示;
所述基因crr的序列如SEQ ID NO:4所示;
所述基因thrA的序列如SEQ ID NO:5所示;
所述基因iclR的序列如SEQ ID NO:6所示;
所述基因aspDH的序列如SEQ ID NO:7所示;
所述基因PPC的序列如SEQ ID NO:8所示;
所述基因EclysC*的序列如SEQ ID NO:9所示。
在具体的实施方式中,所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株;
优选地,所述菌株为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum);优选大肠杆菌;更优选E.coli nissle 1917。
在优选的实施方式中,所述菌株本身具有产生四氢嘧啶的能力。
在优选的实施方式中,所述天冬氨酸脱氢酶AspDH基因和内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*受J23119启动子控制;所述ppc基因受J23115启动子控制。
在优选的实施方式中,所述J23119启动子的序列如SEQ ID NO:10所示;所述J23115启动子的序列如SEQ ID NO:11所示。
在优选的实施方式中,所述方法构建的基因工程菌产生四氢嘧啶的产量为70g/L或更高以上。
在第二方面,本发明提供一种基因工程菌,所述基因工程菌中ectA、B、C基因得到增强;crr、thrA、iclR基因得到弱化;天冬氨酸脱氢酶AspDH基因、内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*和ppc基因得到增强。
在具体的实施方式中,所述ectA、B、C基因来源于伸长盐单胞菌;所述AspDH基因和突变基因EclysC*来源于铜绿假单胞菌;ppc基因来源于大肠杆菌。
在具体的实施方式中,所述基因ectA的序列如SEQ ID NO:1所示;
所述基因ectB的序列如SEQ ID NO:2所示;
所述基因ectC的序列如SEQ ID NO:3所示;
所述基因crr的序列如SEQ ID NO:4所示;
所述基因thrA的序列如SEQ ID NO:5所示;
所述基因iclR的序列如SEQ ID NO:6所示;
所述基因aspDH的序列如SEQ ID NO:7所示;
所述基因PPC的序列如SEQ ID NO:8所示;
所述基因EclysC*的序列如SEQ ID NO:9所示。
在具体的实施方式中,所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株;
优选地,所述菌株为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum);优选大肠杆菌;更优选E.coli nissle 1917。
在优选的实施方式中,所述菌株本身具有产生四氢嘧啶的能力。
在优选的实施方式中,所述天冬氨酸脱氢酶AspDH基因和内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*受J23119启动子控制;所述ppc基因受J23115启动子控制。
在优选的实施方式中,所述J23119启动子的序列如SEQ ID NO:10所示;所述J23115启动子的序列如SEQ ID NO:11所示。
在优选的实施方式中,所述基因工程菌通过第一方面所述的方法制备得到。
在第三方面,本发明提供第一方面所述的方法制备得到的基因工程菌,或者第二方面所述的基因工程菌在制备四氢嘧啶中的用途。
在第四方面,本发明提供一种四氢嘧啶的制备方法,所述方法包括:
1)培养第一方面所述的方法制备得到的基因工程菌,或者第二方面所述的基因工程菌以产生四氢嘧啶;
2)任选从步骤1)得到的培养体系中分离和纯化产生的四氢嘧啶。
在优选的实施方式中,上述方法制备的四氢嘧啶的产量可达到70g/L以上。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了四氢嘧啶标准品的液相色谱图;
图2显示了四氢嘧啶发酵液的液相色谱图;
图3显示了四氢嘧啶浓度随发酵时间的变化情况。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,出乎意料地发现在适合产生四氢嘧啶的菌株中增强ectA、B、C基因;弱化crr、thrA、iclR基因,增强aspDH基因、ppc基因和EclysC*突变基因得到的基因工程菌能够利用葡萄糖发酵生产四氢嘧啶。本发明不仅克服了化学合成法制备四氢嘧啶存在的反应条件苛刻、能耗大等不足;还克服了发酵或酶催化法制备四氢嘧啶存在的工艺复杂、生产成本高等不足,从而具有较好的工业应用价值。在此基础上完成了本发明。
术语定义
本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如,通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因,则该基因对于该菌株是“外源性”的。相应地,本文所用的术语“内源性”是指某物质是某体系中原本存在的物质。
本文所用的术语“增强”是指增加、提高、增大或升高某种基因或蛋白,例如酶的表达或活性。鉴于本发明的教导和现有技术,本领域技术人员也不难理解本文所用的“增强”还应包括通过表达异源基因而增强该基因的表达或活性。在具体的实施方式中,增强基因的表达或活性可以通过表达内源或异源性的该基因,和/或增加该基因的拷贝数,和/或改造该基因的启动子以增强转录启动速度,和/或修改携带有该基因的信使RNA的翻译调控区或稀有密码子以增强翻译强度,和/或修改该基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现。
本文所用的术语“弱化”或“减弱”是指降低一个或多个基因的表达或活性。在具体的实施方式中,可以利用抑制剂弱化基因的表达或活性。例如,经弱化的基因的表达或活性是未弱化的基因的表达或活性的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%。在优选的实施方式中,可以使得需要弱化的基因完全不表达或完全不具备活性。例如,可以直接敲除该基因。
本发明的基因工程菌构建方法以及构建的菌株
本发明提供了一种构建四氢嘧啶产量提高的基因工程菌的方法,所述方法增强所述基因工程菌中的ectA、B、C基因;弱化所述基因工程菌中的crr、thrA、iclR基因;同时,增强所述基因工程菌中的天冬氨酸脱氢酶AspDH基因、内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*和ppc基因。
基于本发明的教导和本领域的公知常识,本领域技术人员知晓并且可以利用各种来源的基因来构建上述基因工程菌。在具体的实施方式中,所述所述ectA、B、C基因来源于伸长盐单胞菌;所述AspDH基因和突变基因EclysC*来源于铜绿假单胞菌;所述ppc基因来源于大肠杆菌。在优选的实施方式中,所述基因ectA的序列如SEQ ID NO:1所示;所述基因ectB的序列如SEQ ID NO:2所示;所述基因ectC的序列如SEQ ID NO:3所示;所述基因crr的序列如SEQ ID NO:4所示;所述基因thrA的序列如SEQ ID NO:5所示;所述基因iclR的序列如SEQ ID NO:6所示;所述基因aspDH的序列如SEQ ID NO:7所示;所述基因PPC的序列如SEQID NO:8所示;所述基因EclysC*的序列如SEQ ID NO:9所示。
基于本发明的教导和本领域的公知常识,本领域技术人员还可以知晓,可以利用启动子进一步增强有此需要的基因的表达或活性。在具体的实施方式中,利用J23119启动子控制所述天冬氨酸脱氢酶AspDH基因和内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*的表达;利用J23115启动子控制所述ppc基因的表达。在优选的实施方式中,所述J23119启动子的序列如SEQ ID NO:10所示;所述J23115启动子的序列如SEQ ID NO:11所示。
对于本发明方法中需要增强的基因,本领域技术人员知晓这些基因可以是外源性引入的,即从无到有的增强;也可以是菌株原本存在的,即从低到高的增强。
对于本发明方法中需要弱化的基因,本领域技术人员知晓这些基因可以是菌株中原本存在的,从而可以利用抑制剂或完全敲除来降低这些基因的表达或活性。在特定的情况下,这些需要弱化的基因也可以是菌株中本身就不存在的。
对于四氢嘧啶产量的提高,既可以指原菌株不产生四氢嘧啶,在经本发明的方法构建后具备产生四氢嘧啶的能力;也指原菌株能够产生四氢嘧啶,但经本发明的方法构建后四氢嘧啶产量得到提高。
因此,本发明的构建方法既可以从头构建四氢嘧啶生产菌株,也可以改造已有的四氢嘧啶生产菌株。而经本发明的方法改造或构建的基因工程菌产生四氢嘧啶的产量可以达到70g/L或更高。
本发明的有益效果主要体现在:
1.本发明的方法构建的基因工程菌能够以葡萄糖为底物直接发酵生产四氢嘧啶;
2.本发明的方法构建的基因工程菌能够在不需要高盐浓度的常规发酵条件下大量积累四氢嘧啶;
3.本发明的方法构建的基因工程菌产生的四氢嘧啶的产率高;
3.与现有的发酵法和酶催化法生产四氢嘧啶盐工艺相比,本发明的方法构建的基因工程菌产生四氢嘧啶的整个发酵过程控制原料成本较低,培养条件简单,设备损耗小,发酵周期短,操作简便,无需收集菌体提取酶液;和
4.利用本发明的方法构建的基因工程菌产生四氢嘧啶的方法对环境友好。
以下结合具体实施例,进一步描述本发明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明,实施例中所用的技术手段为本领域常规操作,或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1.产生四氢嘧啶的基因工程菌E.coli nissle 1917的构建
(1)L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径的构建。
①通过金斯瑞公司合成密码子优化后的ectABC基因,根据序列设计一对引物S1-F/R,扩增获取ectABC片段。
②设计引物Mut1-F/R克隆获得pmut1载体质粒,获得带有相同粘性末端的ectABC和pmut1线性片段。
③使用翌圣无缝连接酶连接步骤②中获得的两个目的片段,得到目的载体pmut1-ectABC。
④将步骤③中获得的载体转化入E.coli nissle 1917中,获得E.coliECN01
(2)crr基因的敲除
①用CRISPR-Cas9***删除大肠杆菌基因组中的基因,采用PCR技术以E.colinissle 1917基因组为模板,根据crr基因序列,在基因两端设计同源臂引物,扩增获取crr基因的上下游同源臂,构建到pTargetF载体上。
②将上述基因敲除片段导入含有pCas质粒的E.coli ECN01中获得阳性转化子,消除阳性转化子中的壮观霉素和卡那霉素抗性基因后获得crr基因敲除菌E.coli ECN02。
(3)iclR基因的敲除
以步骤(2)中的方法敲除iclR基因,获得阳性转化子并消除氯霉素抗性基因后获得crr和iclR基因敲除菌E.coli ECN03
(4)thrA基因的敲除
以步骤(2)中的方法敲除thrA基因,获得阳性转化子并消除氯霉素抗性基因后获得crr、iclR、thrA基因敲除菌E.coli ECN04。
(5)内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*过表达
①采用PCR技术以E.coli nissle 1917基因组为模板,根据EclysC*基因序列设计两对引物扩增EclysC*基因片段;
②将上述片段整合到pmut1质粒e位点;
③将上述②基因片段导入E.coli ECN04中,获得阳性转化子即E.coli ECN05。
(6)ppc基因过表达;
①采用PCR技术以E.coli nissle 1917基因组为模板,根据ppc基因序列设计一对引物扩增ppc基因片段;
②将上述片段整合到pmut1质粒e位点;
③将上述②基因片段导入E.coli ECN05中,获得阳性转化子即E.coli ECN06。
(7)aspDH基因过表达
①通过通过金斯瑞公司合成密码子优化后的aspDH基因,根据序列设计一对引物,扩增aspDH基因片段;
②将上述片段整合到pmut1质粒e位点;
③将上述②基因片段导入E.coli ECN06中,获得阳性转化子即E.coli ECN07。
可见,本发明所述产生四氢嘧啶的基因工程菌:
1)删除大肠杆菌中编码磷酸转移酶***葡萄糖特异性酶Ⅱ结构域A的基因crr和编码乙醛酸循环转录阻遏子的基因iclR,以减少磷酸烯醇式丙酮酸的消耗,并且加强乙醛酸循环,使碳流更多地用于草酰乙酸的合成。
2)敲除大肠杆菌基因组中编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的基因thrA削弱苏氨酸途径;同时,为了补充天冬氨酸激酶活性的不足,过表达大肠杆菌内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*。
3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因的ppc启动子替换为J23115启动子过表达;在pmut1载体整合由J23119启动子控制的铜绿假单胞菌天冬氨酸脱氢酶AspDH基因,加强草酰乙酸转化为天冬氨酸的反应。
通过上述一系列的改造增强了葡萄糖到L-天冬氨酸-β-半醛的代谢通量,减弱了L-天冬氨酸-β-半醛的支路代谢,使得工程菌可以直接利用葡萄糖发酵生产四氢嘧啶,发酵72h后四氢嘧啶的产量达到了70.77g/L,具体生产四氢嘧啶的方法见实施例2。
实施例2.产生四氢嘧啶的基因工程菌E.coli ECN07的发酵培养及检测
在本实施例中,对产生四氢嘧啶的基因工程菌E.coli ECN07进行发酵培养及检测,具体步骤如下:
(1)使用细菌完全培养基活化产生四氢嘧啶的基因工程菌(E.coli ECT06工程菌),37℃恒温培养12h;
(2)将上述活化斜面转接二代活化斜面,37℃恒温培养10h;
(3)种子培养,使用接种环刮取一环菌种至装有50mL种子培养基的250mL圆底三角瓶中,于37℃、220rpm摇床培养6-8h,此为一级种子液;将一级种子液以0.1-10%的接种量接种于种子培养基中(如摇瓶装液量200ml),37℃、220rpm摇床培养6-8h培养得到二级种子液。
(4)使用移液管将二级种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐进行发酵培养;发酵条件为:发酵罐装液量30-70%。将种子液按0.1-10%的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中,起始发酵条件为30-37℃,0.1-1vvm,发酵过程中维持溶氧15-70%,发酵过程中通过流加葡萄糖溶液控制发酵液残糖在0.5-5g/L,用氨水控制pH6.8-7.4,发酵48-72h。
(5)收集发酵液,13000rpm离心,收集上清液相检测四氢嘧啶含量;
(6)使用去离子水将上清稀释200倍,经0.22μm微孔过滤膜过滤后待测;
(7)使用1260Infinity II液相色谱***(安捷伦)测定样品中的四氢嘧啶含量。上述制备样品使用微量进样针,进样量20μl,色谱柱为HILIC Amide色谱柱,柱温30℃,流动相为1%乙腈,流速1mL/min,紫外检测波长210nm,出峰时间约4.0min。经液相色谱检测,如图1和图2所示,发酵48h后,发酵液中的四氢嘧啶含量为70.77g/L(图3)。
种子培养基成分为:葡萄糖2.5%,酵母粉1%,蛋白胨0.6%,KH2PO4 1.2%,MgSO4·7H2O 0.5%,FeSO4·7H2O 10mg/l,MnSO4·H2O 10mg/l,维生素B11.3mg/l,维生素H0.3mg/l,用去离子水定容。
发酵培养基成分为:葡萄糖2.0%,酵母粉0.2%,蛋白胨0.4%,柠檬酸钠0.01%,KH2PO4 0.2%,MgSO4·7H2O 0.07%,FeSO4·7H2O 80mg/l,MnSO4·H2O80mg/l,维生素B10.8mg/l,维生素H 0.2mg/l,用去离子水定容。
可见,针对背景技术中所述问题,本发明提了供一株能够生产四氢嘧啶的工程菌,所述工程菌具有特定基因型的大肠杆菌,包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因;crr、thrA、iclR三个基因缺陷型;具有J23119启动子控制的铜绿假单胞菌aspDH基因;J23115启动子控制的ppc基因;tacJ23119启动子控制EclysC*突变基因。在上述基因型的共同作用下该四氢嘧啶工程菌可以以葡萄糖为底物发酵生产四氢嘧啶,能够克服化学合成法反应条件苛刻、能耗大等不足;能够克服伸长盐单胞菌发酵或酶催化法存在的工艺复杂、生产成本高等不足。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的序列
基因ectA(SEQ ID NO:1)
ATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTACACCCTCCGCCGACCTGGCCAAGCCCAGCGTGGCCGATGCCGTGGTCGGCCATGAGGCCTCACCGCTCTTCATCCGCAAGCCAAGCCCCGATGACGGCTGGGGCATCTACgAGCTGGTCAAGTCCTGTCCGCCTCTCGACGTCAATTCCGCCTACGCCTATCTGTTGCTGGCCACCCAGTTCCGCGATAGCTGCGCCGTGGCGACCAACGAAGAGGGCGAGATCGTCGGCTTCGTTTCCGGCTACGTGAAGAGCAACGCCCCCGATACCTATTTCCTCTGGCAGGTTGCCGTGGGCGAGAAGGCACGTGGCACCGGCCTGGCCCGTCGTCTGGTGGAAGCCGTGATGACACGCCCGGAAATGGCCGAGGTCCACCATCTCGAGACCACTATCACGCCCGACAACCAGGCGTCCTGGGGCTTGTTCCGCCGTCTCGCCGATCGCTGGCAGGCGCCGTTGAACAGCCGCGAATACTTCTCCACCGATCAACTCGGCGGTGAGCATGACCCGGAAAACCTCGTTCGCATCGGCCCGTTCCAGACCGACCAGATCTGA
基因ectB(SEQ ID NO:2)
ATGCAGACCCAGATTCTCGAACGCATGGAGTCCGACGTTCGGACCTACTCCCGCTCCTTCCCGGTCGTCTTCACCAAGGCGCGCAATGCCCGCCTGACCGACGAGGAAGGGCGCGAGTACATCGACTTCCTGGCCGGTGCCGGCACCCTGAACTACGGCCACAACAACCCGCACCTCAAGCAGGCGCTGCTCGACTATATCGACAGCGACGGCATCGTCCACGGCCTGGACTTCTGGACTGCGGCCAAGCGCGACTATCTGGAAACCCTGGAAGAGGTGATCCTCAAGCCGCGCGGTCTCGACTACAAGGTGCATCTGCCCGGACCGACTGGCACCAACGCCGTCGAGGCGGCCATTCGCCTGGCCCGGGTCGCCAAGGGGCGCCACAATATCGTCTCCTTCACCAACGGCTTTCATGGCGTCACCATGGGCGCGCTGGCGACCACCGGTAACCGCAAGTTCCGCGAGGCCACCGGTGGCGTGCCGACCCAGGCTGCTTCCTTCATGCCGTTCGATGGCTACCTCGGCAGCAGCACCGACACCCTCGACTACTTCGAGAAGCTGCTCGGCGACAAGTCCGGCGGCCTGGACGTGCCCGCGGCGGTGATCGTCGAGACAGTGCAGGGCGAGGGCGGTATCAATGTCGCCGGCCTGGAGTGGCTCAAGCGCCTCGAGAGCATCTGCCGCGCCAATGACATCCTGCTGATCATCGACGACATCCAGGCGGGCTGCGGCCGGACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCGAGCATGCCGGCATCACGCCGGATATCGTGACCAACTCCAAGTCGCTGTCCGGTTACGGCCTGCCGTTCGCTCACGTCCTGATGCGCCCCGAGCTCGACAAGTGGAAGCCCGGTCAGTACAACGGCACCTTCCGCGGCTTCAACCTGGCTTTCGCCACTGCTGCTGCCGCCATGCGCAAGTACTGGAGCGACGACACCTTCGAGCGTGACGTGCAGCGCAAGGCTCGCATCGTCGAGGAACGCTTCGGCAAGATCGCCGCCTGGCTGAGCGAGAACGGCATCGAGGCCTCCGAGCGCGGCCGCGGGCTGATGCGGGGCATCGACGTGGGTTCCGGCGATATCGCCGACAAGATCACCCACCAAGCCTTCGAGAACGGGTTGATCATCGAAACCAGCGGTCAGGACGGCGAAGTGGTCAAGTGCCTGTGCCCGCTGACCATTCCCGACGAAGACCTGGTCGAGGGACTCGACATCCTCGAGACCAGCACCAAGCAGGCCTTTAGCTGA
基因ectC(SEQ ID NO:3)
ATGATCGTTCGCAATCTCGAAGAAGCGCGCCAGACCGACCGTCTGGTCACCGCCGAAAACGGCAACTGGGACAGCACCCGCCTGTCGCTGGCCGAAGATGGTGGCAACTGCTCCTTCCACATCACCCGCATCTTCGAGGGTACCGAGACCCACATCCACTATAAGCATCACTTCGAGGCTGTTTATTGCATCGAAGGCGAGGGCGAAGTGGAAACCCTGGCCGATGGCAAGATCTGGCCCATCAAGCCGGGTGACATCTACATCCTCGACCAGCACGACGAGCACCTGCTGCGCGCCAGCAAGACCATGCACCTGGCCTGCGTGTTCACGCCGGGCCTGACCGGCAACGAAGTGCACCGCGAAGACGGTTCCTACGCACCTGCCGACGAAGCCGACGACCAGAAGCCGCTGTAA
基因crr(SEQ ID NO:4)
ATGGGTTTGTTCGATAAACTGAAATCTCTGGTTTCCGACGACAAGAAGGATACCGGAACTATTGAGATCATTGCTCCGCTCTCTGGCGAGATCGTCAATATCGAAGACGTGCCGGATGTCGTTTTTGCGGAAAAAATCGTTGGTGATGGCATTGCTATCAAACCAACGGGTAACAAAATGGTCGCGCCTGTAGACGGCACCATTGGTAAAATCTTTGAAACCAACCACGCGTTCTCTATCGAATCTGATAGCGGCGTTGAGCTGTTCGTCCACTTCGGTATCGACACCGTTGAACTGAAAGGCGAAGGCTTCAAGCGTATTGCTGAAGAAGGTCAGCGCGTGAAAGTTGGTGATACTGTCATTGAATTTGATCTGCCGCTGCTGGAAGAGAAAGCCAAGTCAACCCTGACTCCGGTTGTTATCTCCAACATGGACGAAATCAAAGAACTGATCAAACTGTCCGGTAGCGTAACCGTGGGTGAAACCCCGGTTATCCGCATCAAGAAGTAA
基因thrA(SEQ ID NO:5)
ATGCGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTACATCAGTGGCAAATGCAGAACGTTTTCTGCGGGTTGCCGATATTCTGGAAAGCAATGCCAGGCAGGGGCAGGTGGCCACCGTCCTCTCTGCCCCCGCCAAAATCACCAACCATCTGGTAGCGATGATTGAAAAAACCATTAGCGGCCAGGATGCTTTACCCAATATCAGCGATGCCGAACGTATTTTTGCCGAACTTCTGACGGGACTCGCCGCCGCCCAGCCGGGATTTCCGCTGGCACAATTGAAAACTTTCGTCGACCAGGAATTTGCCCAAATAAAACATGTCCTGCATGGCATCAGTTTGTTGGGGCAGTGCCCGGATAGCATCAACGCTGCGCTGATTTGCCGTGGCGAGAAAATGTCGATCGCCATTATGGCCGGCGTGTTAGAAGCGCGTGGTCACAACGTTACCGTTATCGATCCGGTCGAAAAACTGCTGGCAGTGGGTCATTACCTCGAATCTACCGTTGATATTGCTGAATCCACCCGCCGTATTGCGGCAAGCCGCATTCCGGCTGACCACATGGTGCTGATGGCTGGTTTCACTGCCGGTAATGAAAAAGGCGAGCTGGTGGTTCTGGGACGCAACGGTTCCGACTACTCCGCTGCGGTGCTGGCGGCCTGTTTACGCGCCGATTGTTGCGAGATCTGGACGGATGTTGACGGTGTTTATACCTGCGATCCGCGTCAGGTGCCCGATGCGAGGTTGTTGAAGTCGATGTCCTATCAGGAAGCGATGGAGCTTTCTTACTTCGGCGCTAAAGTTCTTCACCCCCGCACCATCACCCCCATCGCCCAGTTTCAGATCCCTTGCCTGATTAAAAATACCGGAAATCCTCAAGCACCAGGTACGCTCATTGGTGCCAGCCGTGATGAAGACGAATTACCGGTCAAGGGCATTTCCAATCTGAATAACATGGCAATGTTCAGCGTTTCCGGCCCGGGGATGAAAGGGATGGTTGGCATGGCGGCGCGCGTCTTTGCAGCGATGTCACGCGCCCGTATTTCCGTGGTGCTGATTACGCAATCATCTTCCGAATACAGTATCAGTTTCTGCGTTCCGCAAAGCGACTGTGTGCGAGCTGAACGGGCAATGCAGGAAGAGTTCTACCTGGAACTGAAAGAAGGTTTACTGGAGCCGTTGGCGGTGACGGAACGGCTGGCCATTATCTCGGTGGTAGGTGATGGTATGCGCACCTTACGTGGGATCTCGGCGAAATTCTTTGCCGCGCTGGCCCGCGCCAATATCAACATTGTCGCCATTGCTCAGGGATCTTCTGAACGCTCAATCTCTGTCGTGGTCAATAACGATGATGCGACCACTGGCGTGCGCGTTACTCATCAGATGCTGTTCAATACCGATCAGGTTATCGAAGTGTTTGTGATTGGCGTCGGTGGCGTTGGCGGTGCGCTGCTGGAGCAACTGAAGCGTCAGCAAAGCTGGTTGAAGAATAAACATATCGACTTACGTGTCTGCGGTGTTGCTAACTCGAAGGCACTCCTCACCAATGTACATGGCCTTAATCTGGAAAACTGGCAGGAAGAACTGGCGCAAGCCAAAGAGCCGTTTAATCTCGGGCGCTTAATTCGCCTCGTGAAAGAATATCATCTGCTGAACCCGGTCATTGTTGACTGTACTTCCAGCCAGGCAGTGGCGGATCAATATGCCGACTTCCTGCGCGAAGGTTTCCACGTTGTTACGCCGAACAAAAAGGCCAACACCTCGTCGATGGATTACTACCATCAGTTGCGTTATGCGGCGGAAAAATCGCGGCGTAAATTCCTCTATGACACCAACGTTGGGGCTGGATTACCGGTTATCGAGAACCTGCAAAATCTGCTCAATGCTGGTGATGAATTGATGAAGTTCTCCGGCATTCTTTCAGGTTCGCTTTCTTATATCTTCGGCAAGTTAGACGAAGGCATGAGTTTCTCCGAGGCGACCACACTGGCGCGGGAAATGGGTTATACCGAACCGGACCCGCGAGATGATCTTTCTGGTATGGATGTGGCGCGTAAGCTATTGATTCTCGCTCGTGAAACGGGACGTGAACTGGAGCTGGCGGATATTGAAATTGAACCTGTGCTGCCCGCAGAGTTTAACGCCGAGGGTGATGTCGCCGCTTTTATGGCGAATCTGTCACAGCTCGACAATCTCTTTGCCGCGCGTGTGGCGAAGGCCCGTGATGAAGGAAAAGTTTTGCGCTATGTTGGCAATATTGATGAAGATGGCGTCTGCCGCGTGAAGATTGCCGAAGTGGATAGTAATGATCCGCTGTTCAAAGTGAAAAATGGCGAAAACGCCCTGGCCTTCTATAGCCACTATTATCAGCCGCTGCCGTTGGTACTGCGCGGATATGGTGCGGGCAATGACGTTACAGCTGCCGGTGTCTTTGCTGATCTGCTACGTACCCTCTCATGGAAGTTAGGAGTCTGA
基因iclR(SEQ ID NO:6)
TCAGCGTATTCCACCGTACGCCAGCGTCACTTCCTTCGCCGCTTTAATCACCATCGCGCCAAACTCGGTCACGCGGTCATCGGTAATACGTGAAATCGGTCCGGAAATTGAAATTGCGGCAAACGGTTCGCGGTGCTCATCGAAAATACACGCTGCAAGGCAACGCAGCCCCAGCGCATGTTCCTCATCGTCAAATGAATAACCCCGTTTGCGCGTTTGGGCGAGATCTTCTTTTAAATGCACAGGAGACACCAGCGTCGCGTGGGTATAGGCATGTAACCCTTTGCGGTGCAGCAGCTTCGTCACCTGTTCTTCGCTCAGTTGGGCCAGAAAGGCTTTACCCGCACCGGAAGCGTGCATCGGCAATTTACCGCCGATAGGCGCGGACATACGCATCAGGTGAGTACACTGTACCTGGTCGATAATAATCGCTTCGTGATTGCTTTGATCAAGCACCGCCATATTGACCGTTTCGCCAGACTCTTCCATTAGATTGCGCAGGATAGGGTGAACAATCGCTAACAAATTACGGCTCTGGAGAAAGCTGCTACCGACCATAAAGGCGTGTGCGCCGATTGCCCAGTGACCCAGTTCGCCGACCTGACGGACAAAGCCCTGTTGCTGCATCGTGGTTAGCAGGCGGTGGGTCGTGGAATTGGGTAACCCGGCTTGCTGTGCCAGTTCCGTGAGTGCCACACTGCCATTGGATTCGGCAATCCACTCCAGTAATTTCAGGCCACGCGTTAAAGACTGAACCTGTCCAGTCGCTGGTGCGGTGGCAACGGCGGGTTTTCTGCCGCGTTTTGCGGGAATGGGTGCGACCAT
基因aspDH(SEQ ID NO:7)
ATGGCCCTGAATATTGTGATGATTGGTTGTGGTGCCATTGGCGCCGGTGTGCTGGAATTATTAGAAAATGATCCGCAGCTGCGTGTGGATGCCGTGATTGTGCCACGTGATAGCGAAACCCAGGTGCGTCATCGTCTGGCCAGTTTACGTCGTCCGCCACGTGTTCTGAGTGCCTTACCGGCAGGTGAACGTCCAGATCTTCTGGTGGAATGTGCCGGTCATCGTGCCATTGAACAGCATGTGCTGCCGGCCTTAGCCCAGGGTATTCCGTGTTTAGTGGTGAGCGTGGGTGCCCTTAGCGAACCAGGTTTAGTGGAACGTCTGGAAGCCGCCGCACAAGCCGGTGGTAGTCGTATTGAACTTCTGCCGGGTGCCATTGGTGCCATTGATGCCTTAAGCGCCGCACGTGTTGGTGGTTTAGAAAGCGTGCGTTATACCGGTCGTAAACCGGCCAGCGCCTGGTTAGGTACACCAGGTGAAACAGTTTGTGATCTGCAGCGTCTGGAAAAAGCCCGTGTGATTTTTGATGGTAGCGCCCGTGAAGCCGCCCGTTTATATCCGAAAAATGCCAATGTGGCCGCCACCCTGAGCCTGGCAGGTCTTGGTTTAGATCGTACACAAGTTCGTCTGATTGCCGATCCGGAAAGCTGTGAAAATGTGCATCAGGTGGAAGCCAGCGGTGCCTTTGGTGGTTTTGAACTGACCCTGCGTGGTAAACCGCTGGCCGCCAATCCAAAAACCAGCGCCTTAACCGTTTATAGCGTGGTGCGTGCACTGGGTAATCATGCCCATGCCATTAGCATTTAA
基因PPC(SEQ ID NO:8)
ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCAAAGTGCTGGGAGAAACCATCAAGGATGCGTTGGGAGAACACATTCTTGAACGCGTAGAAACTATCCGTAAGTTGTCCAAATCTTCACGCGCTGGCAATGATGCTAACCGCCAGGAGTTGCTCACCACCTTACAAAATTTGTCGAACGACGAGCTGCTGCCCGTTGCGCGTGCGTTTAGTCAGTTCCTGAACCTGGCCAACACCGCTGAGCAATACCACAGCATTTCGCCGAAAGGCGAAGCTGCCAGCAACCCGGAAGTGATCGCCCGCACCCTGCGTAAACTGAAAAACCAGCCGGAACTGAGCGAAGACACCATCAAAAAAGCAGTGGAATCGCTGTCGCTGGAACTGGTCCTCACGGCTCACCCAACCGAAATTACCCGTCGTACACTGATCCACAAAATGGTGGAAGTGAACGCCTGTTTAAAACAGCTCGATAACAAAGATATCGCCGACTACGAACACAACCAGCTGATGCGCCGCCTGCGCCAGTTGATCGCCCAGTCATGGCATACCGATGAAATCCGTAAACTGCGCCCAAGCCCGGTAGATGAAGCCAAATGGGGCTTTGCCGTAGTAGAAAACAGCCTGTGGCAAGGCGTACCGAATTACCTGCGCGAACTGAACGAACAACTGGAAGAGAACCTCGGCTACAAACTGCCCGTCGAATTTGTTCCGGTCCGTTTTACCTCGTGGATGGGCGGTGACCGCGACGGCAACCCGAACGTCACTGCCGATATCACCCGCCACGTCCTGCTACTCAGCCGCTGGAAAGCCACCGATTTGTTCCTGAAAGATATTCAGGTTCTGGTTTCTGAACTGTCGATGGTTGAAGCCACCCCTGAACTGCTGGCGCTGGTTGGCGAAGAGGGTGCCGCAGAACCGTATCGCTATCTGATGAAAAACCTGCGTTCTCGCCTGATGGCGACACAGGCATGGCTGGAAGCGCGCCTGAAAGGCGAAGAATTGCCAAAACCAGAAGGTCTGCTGACACAAAACGAAGAACTGTGGGAACCGCTCTACGCTTGCTACCAGTCACTTCAGGCGTGTGGCATGGGTATTATCGCCAATGGCGATCTGCTCGACACCCTGCGCCGCGTGAAATGTTTCGGCGTACCGCTGGTGCGTATTGATATCCGTCAGGAGAGCACGCGTCATACCGAAGCATTAGGCGAACTGACCCGCTACCTCGGTATCGGCGATTATGAAAGCTGGTCAGAAGCCGACAAACAGGCGTTCCTGATCCGCGAACTGAACTCCAAACGTCCGCTTCTACCACGCAACTGGCAACCAAGCGCCGAAACGCGCGAAGTGCTCGATACCTGCCAGGTGATTGCCGAAGCGCCGCAAGGCTCCATTGCCGCCTACGTGATCTCGATGGCGAAAACGCCGTCCGACGTGCTGGCTGTCCACCTGCTGCTGAAAGAAGCGGGTATCGGGTTTGCGATGCCGGTTGCTCCGCTGTTTGAAACCCTCGATGACCTGAACAACGCCAACGATGTCATGACCCAGCTGCTGAATATCGACTGGTATCGCGGCCTGATTCAGGGCAAACAGATGGTGATGATTGGCTATTCCGACTCAGCAAAAGATGCGGGCGTGATGGCAGCTTCCTGGGCGCAATATCAGGCACAGGATGCATTAATCAAAACCTGCGAAAAAGCGGGTATTGAGCTGACGTTGTTCCACGGTCGCGGCGGTTCCATTGGTCGCGGCGGCGCACCTGCCCATGCGGCGCTGCTGTCACAACCGCCAGGAAGCCTGAAAGGTGGCCTGCGCGTGACCGAACAGGGCGAGATGATCCGCTTTAAATATGGTCTGCCAGAAATCACCGTCAGCAGCCTGTCGCTGTACACCGGGGCGATTCTGGAAGCCAACCTGCTGCCACCGCCTGAGCCGAAAGAGAGCTGGCGTCGCATTATGGATGAACTGTCAGTCATCTCCTGCGATCTCTACCGTGGCTACGTACGTGAAAACAAAGATTTTGTGCCTTACTTCCGCTCCGCTACGCCGGAACAAGAATTGGGTAAACTGCCGTTGGGTTCACGTCCGGCGAAACGTCGCCCAACCGGCGGCGTCGAGTCACTGCGCGCTATTCCGTGGATTTTCGCCTGGACGCAAAACCGCCTGATGCTCCCCGCCTGGCTGGGTGCAGGTACGGCGCTGCAAAAAGTGGTCGAAGATGGCAAACAGAGCGAGCTGGAAGCCATGTGCCGCGATTGGCCATTCTTCTCGACGCGTCTCGGCATGCTGGAGATGGTCTTCGCCAAAGCAGACCTGTGGCTGGCGGAATACTATGACCAACGCCTGGTAGACAAAGCACTGTGGCCGTTAGGTAAAGAGTTACGCAATCTGCAAGAAGAAGACATCAAAGTGGTGCTGGCGATTGCCAACGATTCTCACCTGATGGCCGATCTGCCGTGGATTGCAGAGTCTATTCAGCTACGGAATATTTACACCGACCCGCTGAACGTATTGCAGGCCGAGTTGCTGCACCGCTCCCGCCAGGCAGAAAAAGAAGGCCAGGAACCGGATCCTCGCGTCGAGCAGGCGTTAATGGTCACTATTGCCGGGATTGCGGCAGGTATGCGTAATACCGGCTAA
基因EclysC*(SEQ ID NO:9)
ATGTCTGAAATTGTTGTCTCCAAATTTGGCGGTACCAGCGTAGCTGATTTTGACGCCATGAACCGCAGCGCTGATATTGTGCTTTCTGATGCCAACGTGCGTTTAGTTGTCCTCTCGGCTTCTGCTGGTATCACTAATCTGCTGGTCGCTTTAGCTGAAGGACTGGAACCTGGCGAGCGATTCGAAAAACTCGACGCTATTCGCAACATCCAGTTTGCCATTCTGGAACGTCTGCGTTACCCGAACGTTATCCGTGAAGAGATTGAACGTCTGCTGGAGAACATTACTGTTCTGGCAGAAGCGGCGGCGCTGGCAACGTCTCCGGCGCTGACAGATGAACTGGTCAGCCACGGCGAGCTGATGTCGACCCTGCTGTTTGTCGAGATCCTGCGCGAACGCGATGTTCAGGCACAGTGGTTTGATGTACGTAAAGTGATGCGTACCAACGATCGATTTGGTCGTGCAGAGCCAGATGTAGCCGCGCTGGCGGAACTGGCCGCGCTGCAGCTGCTCCCACGCCTCAATGAAGGCTTAGTGATCACCCAGGGATTTATCGGCAGCGAAAATAAAGGTCGTACAACGACGCTTGGCCGTGGAGGCAGCGATTATACGGCAGCCTTGCTGGCGGAGGCTTTACACGCATCTCGTGTTGATATCTGGACCGACGTCCCGGGCATCTACACCACCGATCCGCGCGTGGTTTCCGCAGCAAAACGCATTGATGAAATCGCGTTTGCCGAAGCGGCAGAGATGGCAACTTTTGGTGCAAAAGTACTGCATCCGGCAACGTTGCTACCCGCAGTACGCAGCGATATCCCAGTCTTTGTCGGCTCCAGCAAAGACCCACGCGCAGGTGGTACGCTGGTGTGCAATAAAACTGAAAATCCGCCGCTGTTCCGCGCGCTGGCGCTTCGTCGCAATCAGACTCTGCTCACTTTGCACAGCCTGAATATGCTGCATTCTCGCGGTTTCCTCGCGGAAGTTTTCGGCATCCTCGCGCGGCATAATATTTCGGTAGACTTAATCACCACGTCAGAAGTGAGTGTGGCATTAATCCTTGATACCACCGGTTCAACCTCCACTGGCGATACGTTGCTGACGCAATCCCTGCTGATGGAGCTTTCCGCACTGTGCCGGGTGGAAGTGGAAGAGGGTCTGGCGCTGGTCGCGTTGATTGGCAATGACCTGTCAAAAGCCTGCGGCGTTGGCAAAGAGGTATTCGGCGTACTGGAACCGTTCAACATTCGCATGATTTGTTACGGCGCATCCAGCCATAACCTGTGCTTCCTGGTGCCCGGCGAAGATGCCGAGCAGGTAGTGCAGAAGCTGCATTTTAATTTATTTGAGTAA
J23115启动子(SEQ ID NO:10)
tttatagctagctcagcccttggtacaatgctagc
J23119启动子(SEQ ID NO:11)
ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc。
Claims (10)
1.一种构建四氢嘧啶产量提高的基因工程菌的方法,所述方法包括:
1)增强所述基因工程菌中的ectA、B、C基因;
2)弱化所述基因工程菌中的crr、thrA、iclR基因;
3)增强所述基因工程菌中的天冬氨酸脱氢酶AspDH基因、内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*和ppc基因。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述ectA、B、C基因来源于伸长盐单胞菌;所述AspDH基因和突变基因EclysC*来源于铜绿假单胞菌;所述ppc基因来源于大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述基因ectA的序列如SEQ ID NO:1所示;
所述基因ectB的序列如SEQ ID NO:2所示;
所述基因ectC的序列如SEQ ID NO:3所示;
所述基因crr的序列如SEQ ID NO:4所示;
所述基因thrA的序列如SEQ ID NO:5所示;
所述基因iclR的序列如SEQ ID NO:6所示;
所述基因aspDH的序列如SEQ ID NO:7所示;
所述基因PPC的序列如SEQ ID NO:8所示;
所述基因EclysC*的序列如SEQ ID NO:9所示。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株;
优选地,所述菌株为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum);优选大肠杆菌;更优选E.coli nissle 1917。
5.一种基因工程菌,所述基因工程菌中ectA、B、C基因得到增强;crr、thrA、iclR基因得到弱化;天冬氨酸脱氢酶AspDH基因、内源抗反馈抑制的突变基因EclysC*和ppc基因得到增强。
6.如权利要求5所述的基因工程菌,其特征在于,所述ectA、B、C基因来源于伸长盐单胞菌;所述AspDH基因和突变基因EclysC*来源于铜绿假单胞菌;ppc基因来源于大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的基因工程菌,其特征在于,所述基因ectA的序列如SEQ ID NO:1所示;
所述基因ectB的序列如SEQ ID NO:2所示;
所述基因ectC的序列如SEQ ID NO:3所示;
所述基因crr的序列如SEQ ID NO:4所示;
所述基因thrA的序列如SEQ ID NO:5所示;
所述基因iclR的序列如SEQ ID NO:6所示;
所述基因aspDH的序列如SEQ ID NO:7所示;
所述基因PPC的序列如SEQ ID NO:8所示;
所述基因EclysC*的序列如SEQ ID NO:9所示。
8.如权利要求7所述的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌是适合产生四氢嘧啶的菌株;
优选地,所述菌株为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum);优选大肠杆菌;更优选E.coli nissle 1917。
9.权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到的基因工程菌,或者权利要求5-8中任一项所述的基因工程菌在制备四氢嘧啶中的用途。
10.一种四氢嘧啶的制备方法,所述方法包括:
1)培养权利要求1-4中任一项所述的方法制备得到的基因工程菌,或者权利要求5-8中任一项所述的基因工程菌以产生四氢嘧啶;
2)任选从步骤1)得到的培养体系中分离和纯化产生的四氢嘧啶。
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-
2023
- 2023-09-06 CN CN202311145351.7A patent/CN117844836A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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HAO ZHANG ET AL.: "Metabolic Engineering of Escherichia coli for Ectoine Production With a Fermentation Strategy of Supplementing the Amino Donor", FRONTIERS IN BIOENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, vol. 10, 25 January 2022 (2022-01-25), pages 1 - 11 * |
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