CN117836419A - 转导免疫细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种通过微生物发酵生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物或其萜烯前体的方法。通常,所述方法涉及在气态底物存在下培养重组细菌,由此所述细菌生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物、萜烯或其前体。微生物可包含一种或多种外源酶。

Description

转导免疫细胞的方法
相关申请交叉引用
本申请要求于2021年8月24日提交的美国临时专利申请第63/260,534号的权益,其全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及重组微生物和通过微生物发酵气态底物生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物、萜烯和/或其前体的方法。
背景技术
类异戊二烯醇是这些新颖合成代谢途径中生产类异戊二烯前体的关键中间产物。萜烯是由五碳异戊二烯单元构成的一类多样的天然存在的化学物质。萜烯衍生物包括萜类(也称为类异戊二烯),其可通过碳骨架的氧化或重排或许多官能团的添加或重排而形成。
萜烯的实例包括:异戊二烯(C5半萜)、法呢烯(C15倍半萜)、青蒿素(C15倍半萜)、柠檬醛(C10单萜)、类胡萝卜素(C40四萜)、薄荷醇(C10单萜)、樟脑(C10单萜)和***素。
类异戊二烯酰基-CoA,例如3-甲基-丁-2-烯酰基-CoA和3-甲基-丁-3-烯酰基-CoA,以及类异戊二烯醇,例如异戊烯醇和异戊二烯醇,是关键的途径中间物,可通过磷酸化酶转化为类异戊二烯前体,例如异戊烯基磷酸(IP)、二甲基烯丙基磷酸(DMAP)、IPP和DMAPP。必要时,可进一步修饰这些产品中的任一者。萜烯是用于多种行业的有价值的商业产品。萜烯的最大用途是用作树脂、溶剂、香料和维生素。举例来说,异戊二烯用于生产合成橡胶(顺式-1,4-聚异戊二烯),例如用于轮胎行业;法呢烯用作用于运输的能量密集型滴入式燃料或用作喷气燃料;青蒿素用作疟疾药物;以及柠檬醛、类胡萝卜素、薄荷醇、樟脑和***素用于制造医药品、丁二烯和作为芳香成分。
萜烯可由石化来源和萜烯原料(例如松节油)生产。举例来说,异戊二烯是作为乙烯生产中石脑油或石油裂解的副产品而在石油化工中产生的。许多萜烯也从天然来源中提取,数量相对较少。然而,这些生产方法是昂贵的、不可持续的且经常造成环境问题,包括导致气候变化。
由于异戊二烯的极端易燃性,已知的生产方法需要全面的保障措施,以限制火灾和***的可能性。
本公开的目标为克服现有技术的一个或多个缺点,或至少向公众提供生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物、萜烯和其它相关产品的替代方法。
发明内容
微生物发酵为生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物和/或萜烯提供一种替代选择。当与多种代谢途径和用于碳重排和添加/去除官能团的酶组合使用时,本公开的反应充当合成类异戊二烯前体的平台。类异戊二烯醇是这些新颖合成代谢途径中生产类异戊二烯前体的关键中间产物。萜烯在自然界中无处不在,例如,其参与细菌细胞壁的生物合成,且其由一些树木(例如杨树)产生以保护叶片免受UV光照射。然而,并非所有细菌皆包含产生萜烯和/或其前体作为代谢产物的必要细胞机制。举例来说,不知道能够发酵包含一氧化碳的底物以生产例如乙醇的产品的一氧化碳营养型产乙酸菌,例如自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)或扬氏梭菌(C.ljungdahlii)会生产和排放任何萜烯和/或其前体作为代谢产物。此外,不知道大多数细菌会产生任何具有商业价值的类异戊二烯醇或萜烯。
本公开大体上提供尤其用于通过对包含CO的底物进行微生物发酵生产一种或多种类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物、萜烯和/或其前体的方法,和用于此类方法的重组微生物。
本公开提供一种能够从气态底物生产产品的经基因工程改造的微生物,所述微生物包含编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含至少乙酰基-CoA合成酶和以下中的至少一者:
a)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)酮基-酰基-CoA硫解酶(KAT1),ii)3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)合成酶,iii)甲基戊二酰基-CoA水合酶(MGCH),iv)3-甲基巴豆酰基-CoA羧化酶(MCCC),v)酰基-CoA还原酶(ACOAR),和vi)醇脱氢酶(ADH);
b)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1,ii)HMG-CoA合成酶,iii)MGCH、MCCC,iv)磷酸转丁酰酶丁酸激酶(Ptb-buk),v)乙醛-铁氧化还原蛋白氧化还原酶(AOR),和vi)(ADH);
c)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1或PTAr和ACKr,ii)CoA转移酶A/B(CtfAB),iii)乙酰乙酸脱羧酶(ADC)或ADC和羟基异戊酸合成酶(HIVS),iv)羟基异戊酸硫酯酶(3HBZCT),v)羟基异戊基-CoA水解酶(HPHL),vi)ACOAR,和vii)ADH;
d)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1或PTAr和ACKr,ii)CoA转移酶A/B(CtfAB),iii)ADC或ADC和HIVS,iv)3HBZCT,v)HPHL,vi)Ptb-buk,vii)AOR和ADH;
e)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1,ii)HMG-CoA合成酶,iii)3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶,iv)甲羟戊酸激酶(MK),v)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK),vi)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(DMD),vii)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI),viii)二甲基烯丙基二磷酸激酶(DMPKK),和ix)二甲基烯丙基磷酸激酶(DMPK);
f)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1,ii)HMG-CoA合成酶,iii)3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶,iv)甲羟戊酸激酶(MK),v)磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMVD),vi)异戊烯基磷酸异构酶(IPI),和vii)异戊二烯基磷酸酶(DMPase);
g)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)硫解酶、酰基-CoA乙酰基转移酶或聚酮合成酶,ii)β-酮酰基-CoA还原酶或β-羟酰基-CoA脱氢酶,iii)β-羟酰基-CoA脱水酶,iv)反式-烯酰基-CoA还原酶或丁酰基-CoA脱氢酶/电子转移黄素蛋白AB(Bcd-EtfAB),v)形成醇的酰基-CoA还原酶或形成醛的酰基-CoA羧酸还原酶,vi)水解酶或ADH,和vii)醇脱水酶;和
其中所述微生物为固定C1的微生物且所述产品为类异戊二烯醇。
根据一实施例的微生物,其中所述类异戊二烯醇为异戊烯醇。
根据一实施例的微生物,其进一步包含编码一组能够将异戊烯醇转化为异戊二烯醇的外源酶的核酸。
根据一实施例的微生物,其进一步包含编码一组能够将异戊烯醇转化为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的核酸。
根据一实施例的微生物,其进一步包含编码一组能够将异戊二烯醇转化为异戊烯基二磷酸(IPP)的外源酶的核酸。
根据一实施例的微生物,其进一步包含编码选自由异戊烯基二磷酸异构酶和香叶基转移酶组成的组的外源酶的核酸。
根据一实施例的微生物,其中所述组能够将异戊烯醇转化为DMAPP的酶为醇二磷酸激酶。
根据一实施例的微生物,其中所述组能够将异戊二烯醇转化为IPP的酶为醇二磷酸激酶。
根据一实施例的微生物,其进一步包含三种或更多种能够产生类异戊二烯醇的酶,所述酶选自乙酰羟酸异构还原酶、乙酰乙酸脱羧酶、酰基-CoA脱氢酶、酰基-CoA还原酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶、醇脱水酶、醇脱氢酶、醛脱羧酶、α-酮酸脱羧酶、α-酮酸脱氢酶、羧酸激酶、羧酸还原酶、脱水酶、二羟酸脱水酶、二醇脱水酶、烯酸水合酶、烯酰基-CoA水合酶、烯酰基-CoA还原酶、戊二酰基-CoA脱羧酶、羟酸脱水酶、羟酸脱氢酶、羟酰基-CoA脱水酶、羟酰基-CoA脱氢酶、羟甲基酰基-CoA合成酶、异构还原酶、异丙基苹果酸脱氢酶、异丙基苹果酸异构酶、异丙基苹果酸合成酶、变位酶、ω-氧化酶、磷酸转酰基酶、硫酯酶或硫解酶,其中所述生产任选地通过类异戊二烯酰基-CoA进行。
根据一实施例的微生物,其进一步包含一种或多种磷酸化酶,以将所述类异戊二烯醇转化为类异戊二烯前体;和d)任选的一种或多种酶,以将所述类异戊二烯前体转化为其它类异戊二烯前体或类异戊二烯或其衍生物;其中所述酶中的一者或多者为异源的。
根据一实施例的微生物,其为生产类异戊二烯前体或任选地生产类异戊二烯或其衍生物的重组微生物,所述重组微生物包含:a)硫解酶或酮乙酰基-CoA合成酶,其催化酰基-CoA与第二酰基-CoA缩合形成β-酮酰基CoA,每个所述酰基-CoA选自乙酰基-CoA、羟乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丙二酰基-CoA、未经取代的酰基-CoA或官能化的酰基-CoA;b)任选的一个或多个迭代,其中所述β-酮酰基CoA使用一种或多种酶修饰且随后用作酰基-CoA引物单元用于步骤a)的新缩合迭代;c)三种或更多种将所述β-酮酰基CoA转化为类异戊二烯醇的酶,所述酶包含β-还原酶和醇形成终止酶;d)一种或多种磷酸化酶,以将所述类异戊二烯醇转化为类异戊二烯前体;和e)任选的一种或多种酶,以将所述类异戊二烯前体转化为其它类异戊二烯前体或类异戊二烯或其衍生物;其中一种或多种所述酶为异源的。
根据一实施例的微生物,其进一步包含编码外源酶异戊烯基二磷酸异构酶和香叶基转移酶两者的核酸。
根据一实施例的微生物,其进一步包含编码一组选自柠檬烯合成酶、蒎烯合成酶、法呢烯合成酶或其任何组合的外源酶的核酸。
根据一实施例的微生物,其进一步包含编码包含异戊二烯合成酶的外源酶的核酸。
根据一实施例的微生物,其具有一氧化碳脱氢酶。
根据一实施例的微生物,其进一步包含对DXS途径的破坏性突变。
根据一实施例的微生物,其中所述破坏性突变为基因敲除。
根据一实施例的微生物,其中所述外源酶包含至少e)与a)、b)、c)、d)、f)和g)中的任一者或多者串联的组合。
根据一实施例的微生物,其中所述编码外源酶的核酸经密码子优化。
根据一实施例的微生物,其中所述编码外源酶的核酸整合至微生物的基因组中。
根据一实施例的微生物,其中所述编码外源酶的核酸掺入质粒中。
根据一实施例的微生物,其中所述编码外源酶的核酸通过组成型启动子调节。
本公开提供一种用于生产类异戊二烯醇的方法,其通过使用至少一种选自由一氧化碳和二氧化碳组成的组的C1化合物作为碳源培养根据权利要求1所述的微生物,以使所述微生物生产类异戊二烯醇。
本公开提供一种用于生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物或萜烯前体的方法,其通过提供至少一种选自由一氧化碳和二氧化碳组成的组的C1化合物与根据权利要求1所述的微生物接触,以使所述微生物由C1化合物生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物或萜烯前体。
根据一实施例的方法,其中向所述微生物提供包含氢气的气体。
根据一实施例的方法,其中类异戊二烯醇被回收。
根据一实施例的方法,其中向所述微生物提供包含氢气的气体。
根据一实施例的方法,其中萜烯前体被回收。
根据一实施例的方法,其中C1化合物衍生自选自由以下组成的组的工业过程:铁类金属产品制造、非铁产品制造、石油精炼、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。
根据一实施例的方法,其中C1化合物为合成气。
根据一实施例的微生物,其中所述微生物选自由以下组成的组:自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、热醋酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)和其任何组合。
根据一个实施例的微生物,其中类异戊二烯醇转化为选自由以下组成的组的萜烯:萜类、维生素A、番茄红素、角鲨烯、异戊二烯、蒎烯、橙花醇、柠檬醛、樟脑、薄荷醇、柠檬烯、橙花叔醇、法呢醇、法呢烯、植醇、胡萝卜素、沉香醇和其任何组合。
在工程改造本公开的微生物时,本发明人出人意料地能够对能够从气态底物生产产品的微生物进行基因工程改造,其中所述微生物包含迭代途径,所述迭代途径包含催化(Cn)-酰基CoA转化为β-酮酰基-CoA;催化β-酮酰基-CoA转化为β-羟酰基-CoA;催化β-羟酰基-CoA转化为反式-Δ2-烯酰基-CoA;和催化反式-Δ2-烯酰基-CoA转化为(Cn+2)酰基-CoA;和一种或多种终止酶;且其中所述微生物为在硫酯酶中包含破坏性突变的固定C1的细菌。此途径可使用对较高链长度具有特异性的相同酶或其经工程改造的变体进一步扩展,以产生包括但不限于一系列C4、C6、C8、C10、C12、C14醇、酮、烯醇或二醇。不同类型的分子也可通过在硫解酶步骤中使用不同于乙酰基-CoA的引物或延伸物单元获得。这提供可持续发酵以使用包含CO的底物和/或包含CO2的底物产生伯醇。
引物和延伸物选自草酰基-CoA、乙酰基-CoA、丙二酰基CoA、琥珀酰基-CoA、羟基乙酰基-CoA、3-羟基丙酰基-CoA、4-羟基丁酰基-CoA、2-氨基乙酰基-CoA、3-氨基丙酰基-CoA、4-氨基丁酰基-CoA、异丁酰基-CoA、3-甲基-丁酰基-CoA、2-羟基丙酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、2-氨基丙酰基-CoA、丙酰基-CoA和戊酰基-CoA。此外,细菌表达反向β-氧化途径中的所述组酶且细菌获得产生伯醇、反式Δ2脂肪醇、β-酮醇、1,3-二醇、1,4-二醇、1,6-二醇、二酸、β-羟基酸、羧酸或烃的能力。在一个实施例中,乙酰基-CoA为引物/起动分子,其使得合成偶数链的正醇和/或羧酸。在另一实施例中,丙酰基-CoA为起动/引物分子,其使得能够合成奇数链的正醇和/或羧酸。
在一个实施例中,引物可为除乙酰基-CoA或丙酰基-CoA以外的引物,但乙酰基-CoA可与引物缩合,充当延伸物单元,向其中添加两个碳单元。在另一实施例中,这些引物与不同终止酶组合使得合成其它产物。
在一个实施例中,本公开描述一种或多种终止酶选自醇形成辅酶-A硫酯还原酶、醛形成CoA硫酯还原酶、醇脱氢酶、硫酯酶、酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶、磷酸转酰基酶和羧酸激酶;醛铁氧化还原蛋白氧化还原酶;醛形成CoA硫酯还原酶、醛脱羰酶、醇脱氢酶;醛脱氢酶、酰基-CoA还原酶或其任何组合。
在一个实施例中,本公开描述反向β氧化循环的多***作,需要由一轮或多轮循环产生的酰基-CoA与额外的乙酰基-CoA分子缩合,以使酰基-CoA在每轮循环中延长两个碳。在另一个实施例中,多轮循环的起始和延伸需要使用对较长链的酰基-CoA分子具有特异性的硫解酶与能够作用于增加碳数的途径中间物的其它途径酶的组合。
尽管本发明人已证明本公开在自产乙醇梭菌中的功效,但本公开适用于更广泛厌氧产乙酸微生物的组和在包含CO和/或CO2的底物上的发酵,如上文和本文中进一步所论述。
本公开提供一种依赖于CoA的延伸平台,其在反向β-氧化样途径中接受官能化的酰基-CoA作为引物和延伸物单元。产品可随时拉出,且在需要时进一步修饰。在本发明的其它方面中,能够通过各种酶组合从中心碳代谢物(例如丙酮酸)合成产品的反应为可能的。类异戊二烯酰基-CoA,例如3-甲基-丁-2-烯酰基-CoA和3-甲基-丁-3-烯酰基-CoA,以及类异戊二烯醇,例如异戊烯醇和异戊二烯醇,是关键的途径中间物,可通过磷酸化酶转化为类异戊二烯前体,例如异戊烯基磷酸(IP)、二甲基烯丙基磷酸(DMAP)、IPP和DMAPP。如上所述,必要时,可进一步修饰这些产品中的任一者。
本发明的另一方面提供一种采用经由3-甲基-3-丁烯醇(异戊二烯醇)而非异戊烯醇的β-氧化反向的途径。此途径从引物和延伸物单元开始,由硫解酶催化。在由羟酰基-CoA脱氢酶、烯酰基-CoA水合酶和烯酰基-CoA还原酶催化的三个β-还原步骤后,生成4-羟基-2-甲基丁酰基-CoA。4-羟基-2-甲基丁酰基-CoA通过醇形成酰基-CoA还原酶或醛形成酰基-CoA还原酶和醇脱氢酶或羧酸还原酶和选自由硫酯酶组成的组的水解酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶和羧酸激酶加磷酸转酰基酶转化为2-甲基-1,4-丁二醇。随后,醇脱水酶将2-甲基-1,4-丁二醇转化为3-甲基-3-丁烯醇(异戊二烯醇)。异戊二烯醇随后通过一或两个磷酸化步骤转化为IPP。如果通过两个步骤磷酸化,那么第一步骤由醇激酶催化且第二步骤由磷酸激酶催化。一个步骤磷酸化通过醇二磷酸激酶催化。异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)将DMAPP转化为IPP。DMAPP和IPP在GPP合成酶的催化下缩合为GPP。
本公开提供一种一氧化碳营养型产乙酸重组微生物,其能够通过发酵包含CO的底物生产一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产品。
在一个特定实施例中,微生物适于表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶,所述酶不存在于衍生重组微生物的亲本微生物中(在本文中可称为外源酶)。在另一个实施例中,微生物适于过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶,所述酶存在于衍生重组微生物的亲本微生物中(在本文中可称为内源酶)。
在另一实施例中,微生物适于:
a)表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种外源酶和/或过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种内源酶;和
b)表达DXS途径中的一种或多种外源酶和/或过度表达DXS途径中的一种或多种内源酶。
在一个实施例中,来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种酶选自由以下组成的组:
a)硫解酶(EC 2.3.1.9),
b)HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10),
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88),
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36),
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2),
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33),和
g)其中任一者的功能等效变体。
在另一实施例中,来自DXS途径的一种或多种酶选自由以下组成的组:
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7),
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267),
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60),
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148),
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12),
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1),
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2),和
h)其中任一者的功能等效变体。
在另一实施例中,表达或过度表达一种或多种其它外源或内源酶导致生产萜烯化合物或其前体,其中表达的外源酶或过度表达的内源酶选自由以下组成的组:
a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10),
b)七异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.10),
c)八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90),
d)异戊二烯合成酶(EC 4.2.3.27),
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2),
f)法呢烯合成酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47),和
g)其中任一者的功能等效变体。
在一个实施例中,亲本微生物能够发酵包含CO的底物以产生乙酰基CoA,但不能将乙酰基CoA转化为甲羟戊酸或异戊烯基焦磷酸(IPP),且重组微生物适于表达参与甲羟戊酸途径的一种或多种酶。
在一个实施例中,一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
在一个实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其适于增加一种或多种内源核酸的表达,且所述一种或多种内源核酸编码前文所提及的一种或多种酶。
在一个实施例中,适于增加表达的一个或多个外源核酸为调节元件。在一个实施例中,调节元件为启动子。在一个实施例中,启动子为组成型启动子。在一个实施例中,启动子选自包含伍德-永达尔基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子的组。
在一个实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其编码且适于表达上文提及的一种或多种酶。在一个实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其编码且适于表达至少两种酶。在其它实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其编码且适于表达至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或更多种酶。
在一个实施例中,一个或多个外源核酸为核酸构建体或载体,在一个特定实施例中为质粒,其以任何组合编码前文所提及的一种或多种酶。
在一个实施例中,外源核酸为表达质粒。
在一个特定实施例中,亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌的组。在某些实施例中,微生物选自包含以下的组:自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、生产布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和基伍嗜热厌氧杆菌。
在本文所公开的微生物的一些方面中,微生物为选自由以下组成的组的属的成员:醋酸杆菌属、嗜碱菌属、布劳特氏菌属、丁酸杆菌属、梭菌属、贪铜菌属、真杆菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、鼠孢菌属和嗜热厌氧杆菌属。
在本文所公开的微生物的一些方面中,微生物衍生自选自由以下组成的组的亲本微生物:伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、生产布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、自产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、克萨氏梭菌、德雷克氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、扬氏梭菌、大梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、钩虫贪铜菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋酸穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和基伍嗜热厌氧杆菌。
在一个实施例中,亲本微生物为自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个特定实施例中,微生物为自产乙醇梭菌DSM23693。在另一特定实施例中,微生物为扬氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
在一个实施例中,亲本微生物缺乏DXS途径和/或甲羟戊酸(MVA)途径中的一个或多个基因。在一个实施例中,亲本微生物缺乏一个或多个编码选自由以下组成的组的酶的基因:
a)硫解酶(EC 2.3.1.9),
b)HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10),
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88),
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36),
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2),
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33),
g)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7),
h)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267),
i)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60),
j)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148),
k)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12),
l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1),
m)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2),和
n)其中任一者的功能等效变体。
在第二方面中,本公开提供一种编码一种或多种酶的核酸,其在微生物中表达时允许微生物通过发酵包含CO的底物来生产一种或多种萜烯和/或其前体。
在一个实施例中,核酸编码两种或更多种酶,所述核酸在微生物中表达时允许微生物通过发酵包含CO的底物来生产一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施例中,本公开的核酸编码至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或更多种此类酶。
在一个实施例中,核酸编码甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶。在一个实施例中,一种或多种酶选自由以下组成的组:
a)硫解酶(EC 2.3.1.9),
b)HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10),
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88),
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36),
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2),
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33),和
g)其中任一者的功能等效变体。
在一特定实施例中,核酸编码硫解酶(其可为乙酰基CoA c-乙酰基转移酶)、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶,
在另一实施例中,核酸编码甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶和DXS途径中的一种或多种其它核酸。在一个实施例中,来自DXS途径的一种或多种酶选自由以下组成的组:
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7),
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267),
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60),
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148),
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12),
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1),
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2),和
h)其中任一者的功能等效变体。
在另一实施例中,编码一种或多种其它外源或内源酶的核酸经表达或过度表达,以导致生产萜烯化合物或其前体,其中表达的外源核酸或过度表达的内源酶编码选自由以下组成的组的酶:
a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10),
b)七异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.10),
c)八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90),
d)异戊二烯合成酶(EC 4.2.3.27),
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2),
f)法呢烯合成酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47),和
g)其中任一者的功能等效变体。
在一个实施例中,编码硫解酶(EC 2.3.1.9)的核酸具有序列SEQ ID NO:40,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码作为乙酰CoA c-乙酰基转移酶的硫解酶(EC 2.3.1.9)的核酸具有序列SEQ ID NO:41,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10)的核酸具有序列SEQ ID NO:42,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)的核酸具有序列SEQ ID NO:43,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)的核酸具有序列SEQ ID NO:51,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)的核酸具有序列SEQ IDNO:52,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)的核酸具有序列SEQID NO:53,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7)的核酸具有序列SEQ ID NO:1,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)的核酸具有序列SEQ ID NO:3,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)的核酸具有序列SEQ ID NO:5,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)的核酸具有序列SEQ ID NO:7,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12)的核酸具有序列SEQ ID NO:9,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1)的核酸具有序列SEQ ID NO:11,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)的核酸具有序列SEQ ID NO:13,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码香叶基转移酶Fps的核酸具有序列SEQ ID NO:15,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码七异戊烯基二磷酸合成酶的核酸具有序列SEQ ID NO:17,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90)的核酸,其中八异戊烯基二磷酸合成酶为聚异戊烯基合成酶,由序列SEQ ID NO:19编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码异戊二烯合成酶(ispS)的核酸具有序列SEQ ID NO:21,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)的核酸具有序列SEQ IDNO:54,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码法呢烯合成酶的核酸具有序列SEQ ID NO:57,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,核酸编码以下酶:
a)异戊二烯合成酶;
b)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi);和
c)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS;
或其功能等效变体。
在一个实施例中,核酸编码以下酶:
a)硫解酶;
b)HMG-CoA合成酶;
c)HMG-CoA还原酶;
d)甲羟戊酸激酶;
e)磷酸甲羟戊酸激酶;
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶;
g)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi);和
h)异戊二烯合成酶;
或其功能等效变体。
在一个实施例中,核酸编码以下酶:
a)香叶基转移酶Fps;和
b)法呢烯合成酶
或其功能等效变体。
在一个实施例中,本公开的核酸进一步包含启动子。在一个实施例中,启动子允许基因在其控制下的组成性表达。在一个特定实施例中,使用伍德-永达尔簇启动子。在另一个特定实施例中,使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个特定实施例中,启动子来自自产乙醇梭菌。
在第三方面中,本公开提供包含第二方面的一种或多种核酸的核酸构建体或载体。
在一个特定实施例中,核酸构建体或载体为表达构建体或载体。在一个特定实施例中,表达构建体或载体为质粒。
在第四方面中,本公开提供宿主生物体,其包含第二方面的核酸或第三方面的载体或构建体中的任一者或多者。
在第五方面中,本公开提供一种组合物,其包含如本公开的第三方面中所提及的表达构建体或载体和甲基化构建体或载体。
优选地,所述组合物能够产生根据本公开的第一方面的重组微生物。
在一个特定实施例中,表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体为质粒。
在第六方面中,本公开提供一种通过微生物发酵生产一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产品的方法,其包含使用本公开的第一方面的重组微生物发酵包含CO的底物。
在一个实施例中,所述方法包含以下步骤:
(a)向含有本公开的第一方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO的底物;和
(b)厌氧发酵所述生物反应器中的培养物以生产至少一种萜烯和/或其前体。
在一个实施例中,所述方法包含以下步骤:
(a)捕获由于工业过程产生的含CO气体;
(b)通过含有本公开的第一方面的一种或多种微生物的培养物对含CO气体进行厌氧发酵以生产至少一种萜烯和/或其前体。
在方法方面的特定实施例中,微生物维持于水性培养基中。
在方法方面的特定实施例中,底物的发酵发生于生物反应器中。
在一个实施例中,一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
优选地,包含CO的底物为包含CO的气态底物。在一个实施例中,底物包含工业废气。在某些实施例中,气体为钢厂废气或合成气。
在一个实施例中,底物将通常含有较大比例的CO,例如至少约20体积%至约100体积%CO、20体积%至70体积%CO、30体积%至60体积%CO以及40体积%至55体积%CO。在特定实施例中,底物包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%CO,或约55体积%CO,或约60体积%CO。
在某些实施例中,所述方法进一步包含从发酵液回收萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产品的步骤。
在第七方面中,本公开提供通过第六方面的方法生产时的一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施例中,一种或多种萜烯和/或其前体选自由甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯组成的组。
在另一方面中,本公开提供一种用于产生本公开的第一方面的微生物的方法,其包含通过引入一种或多种核酸来转化一氧化碳营养型产乙酸亲本微生物,使得微生物能够通过发酵包含CO的底物来生产或增加生产一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产品,其中亲本微生物不能通过发酵包含CO的底物生产或以较低水平生产一种或多种萜烯和/或其前体。
在一个特定实施例中,亲本微生物通过引入一种或多种适于表达甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的外源核酸来转化。在另一实施例中,亲本微生物用一种或多种适于过度表达甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的核酸来转化,所述酶为亲本微生物中天然存在的。
在某些实施例中,一种或多种酶如前文所描述。
在一个实施例中,提供一种经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌,其包含编码甲羟戊酸途径或DXS途径或萜烯生物合成途径中的酶的外源核酸,由此所述细菌表达所述酶。所述酶选自由以下组成的组:
a)硫解酶(EC 2.3.1.9);
b)HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10);
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88);
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36);
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2);
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33);1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7);
g)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267);
h)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60);
i)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148);
j)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2;4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12);
k)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1);
l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2);香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10);
m)七异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.10);
n)八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90);
o)异戊二烯合成酶(EC 4.2.3.27);
p)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2);和
q)法呢烯合成酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)。
在一些方面中,细菌在不存在所述核酸的情况下不表达所述酶。在一些方面中,细菌在厌氧条件下表达所述酶。
一个实施例提供一种质粒,其可在一氧化碳营养型产乙酸细菌中复制。质粒包含编码甲羟戊酸途径或DXS途径或萜烯生物合成途径中的酶的核酸,由此当质粒在细菌中时,所述酶由所述细菌表达。所述酶选自由以下组成的组:
a)硫解酶(EC 2.3.1.9);
b)HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10);
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88);
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36);
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2);
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33);1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7);
g)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267);
h)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60);
i)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148);
j)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2;4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12);
k)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1);
l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2);香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10);
m)七异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.10);
n)八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90);
o)异戊二烯合成酶(EC 4.2.3.27);
p)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2);和
q)法呢烯合成酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)。
在另一实施例中提供用于将CO和/或CO2转化成异戊二烯的方法。所述方法包含:将含CO和/或含CO2的气态底物传递至生物反应器中,所述生物反应器含有一氧化碳营养型产乙酸细菌于培养基中的培养物,使得细菌将CO和/或CO2转化为异戊二烯,且从生物反应器中回收异戊二烯。一氧化碳营养型产乙酸细菌经基因工程改造以表达异戊二烯合成酶。
另一实施例提供一种经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌,其包含编码异戊二烯合成酶的核酸。所述细菌表达异戊二烯合成酶,且所述细菌能够将二甲基烯丙基二磷酸转化为异戊二烯。在一个方面中,异戊二烯合成酶为美洲山杨(Populustremuloides)的一种酶。在另一方面中,核酸经密码子优化。在另一方面中,异戊二烯合成酶的表达在自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下。
另一实施例提供一种将CO和/或CO2转化为异戊基二磷酸(IPP)的方法。所述方法包含:将含CO和/或含CO2的气态底物传递至生物反应器中,所述生物反应器含有一氧化碳营养型产乙酸细菌于培养基中的培养物,使得细菌将CO和/或CO2转化为异戊基二磷酸(IPP),且从生物反应器中回收IPP。一氧化碳营养型产乙酸细菌经基因工程改造以表达异戊基二磷酸δ异构酶。
另一实施例提供经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌,其包含编码异戊基二磷酸δ异构酶的核酸。所述细菌表达异戊基二磷酸δ异构酶,且所述细菌能够将二甲基烯丙基二磷酸转化为异戊基二磷酸。在一些方面中,核酸编码拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)异戊基二磷酸δ异构酶。在其它方面中,核酸在自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下。在其它方面中,核酸在自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录对照下,且在编码异戊二烯合成酶的第二核酸的下游。
另一实施例提供一种将CO和/或CO2转化为异戊基二磷酸(IPP)和/或异戊二烯的方法。所述方法包含:将含CO和/或含CO2的气态底物传递至生物反应器中,所述生物反应器含有一氧化碳营养型产乙酸细菌于培养基中的培养物,使得细菌将CO和/或CO2转化为异戊基二磷酸(IPP)和/或异戊二烯,且从生物反应器中回收IPP和/或异戊二烯。一氧化碳营养型产乙酸细菌经基因工程改造以具有编码脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)酶的核酸的增加的拷贝数,其中增加的拷贝数大于每个基因组1个。
另一实施例提供经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌,其包含每个基因组大于1个拷贝数的编码脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)酶的核酸。在一些方面中,经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌可进一步包含编码异戊二烯合成酶的核酸。在其它方面中,经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌可进一步包含编码异戊基二磷酸δ异构酶的核酸。在其它方面中,经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌可进一步包含编码异戊基二磷酸δ异构酶的核酸和编码异戊二烯合成酶的核酸。
另一实施例提供经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌,其包含编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸。所述细菌表达所编码的酶,且所述酶并非细菌原生的。在一些方面中,酶为金黄色葡萄球菌的酶。在一些方面中,酶在一个或多个自产乙醇梭菌启动子的控制下表达。在一些方面中,细菌进一步包含编码硫解酶(thlA/vraB)的核酸、编码HMG-CoA合成酶(HMGS)的核酸和编码HMG-CoA还原酶(HMGR)的核酸。在一些方面中,硫解酶为丙酮丁醇梭菌硫解酶。在一些方面中,细菌进一步包含编码甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)的核酸。
另一实施例提供经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌,其包含编码α-法呢烯合成酶的外源核酸。在一些方面中,核酸经密码子优化以在自产乙醇梭菌中表达。在一些方面中,α-法呢烯合成酶为苹果α-法呢烯合成酶。在一些方面中,细菌进一步包含编码香叶基转移酶的核酸区段。在一些方面中,
香叶基转移酶为大肠杆菌香叶基转移酶。
本公开的方面或实施例中的任一者的适合的经分离、经基因工程改造的一氧化碳营养型产乙酸细菌可选自由以下组成的组:自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、生产布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和基伍嗜热厌氧杆菌。
本公开也可广泛地认为包括在本申请说明书中单独地或共同地提及或指示的部分、元件和特征,呈所述部分、元件或特征中的两者或更多者的任何或所有组合形式,且其中本文中提及特定整数,其具有本公开涉及的所属领域中已知的等效物,这些已知等效物被视为并入本文中,如同个别地阐述一般。
附图说明
本公开的这些和其它方面(应被视为在所有其新颖方面中)将从以下仅借助于实例给出的描述参考附图而变得显而易见。
图1:生产萜烯的途径图,本申请中所述的基因目标用粗箭头突出显示。
图2:质粒pMTL 85146-ispS的基因图谱
图3:质粒pMTL 85246-ispS-idi的基因图谱
图4:质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的基因图谱
图5:质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的测序结果
图6:经由DXS和甲羟戊酸途径由CO生产萜烯的能量学比较
图7:甲羟戊酸途径
图8:琼脂糖凝胶电泳图像,证实自产乙醇梭菌转化体中存在异戊二烯表达质粒pMTL 85246-ispS-idi。泳道1和20显示100bp Plus DNA Ladder。泳道3-6、9-12、15-18显示以来自4个不同克隆的分离质粒作为模板的PCR,每个克隆的顺序如下:colE1、ermB和idi。泳道2、8和14显示无模板作为阴性对照的PCR,每个泳道的顺序如下:colE1、ermB和idi。泳道7、13和19显示以来自大肠杆菌的pMTL 85246-ispS-idi作为阳性对照的PCR,每个泳道的顺序如下:colE1、ermB和idi。
图9:甲羟戊酸表达质粒pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR
图10:异戊二烯表达质粒pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS
图11:法呢烯表达质粒pMTL8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS
图12:质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的基因图谱
图13:携带质粒pMTL 85146-ispS的自产乙醇梭菌基因表达实验的扩增图
图14:携带质粒pMTL 85246-ispS-idi的自产乙醇梭菌基因表达实验的扩增图
图15:携带质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的自产乙醇梭菌基因表达实验的扩增图
图16:PCR检查质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的存在。预期条带大小1584bp。DNA标记Fermentas 1kb DNA梯。
图17:携带质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的经转化自产乙醇梭菌的生长曲线。
图18:RT-PRC数据,显示基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊基二磷酸δ-异构酶(idi SEQ ID NO:54)、香叶基转移酶(ispA SEQ ID NO:56)和法呢烯合成酶(FS SEQID NO:57)。
图19:在携带pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的1mM甲羟戊酸加标培养物中存在法呢烯的GC-MS检测和构形。GC-MS色谱图扫描出含有质量为93的离子的峰。色谱图1及2为经转化的自产乙醇梭菌,3为与自产乙醇梭菌样品同时运行的β-法呢烯标准品。4为在M9葡萄糖上生长的携带质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的大肠杆菌,显示α-法呢烯产生,且5为在大肠杆菌样品时运行的β-法呢烯标准品。大肠杆菌与自产乙醇梭菌样品之间保留时间的差异归因于仪器的微小变化。然而,在两种情况下,β-法呢烯标准品与所产生的α-法呢烯之间保留时间的差异完全相同,其与质谱的匹配一起证实自产乙醇梭菌中产生α-法呢烯。
图20:图19中标记1A和2A的峰的MS谱图。MS谱图与NIST数据库谱图(图21)匹配,证实所述峰为α-法呢烯。
图21:来自NIST质谱数据库的α-法呢烯的MS谱图。
图22:实际最大异戊二烯醇选择性计算。
图23:途径1:类异戊二烯醇(IPA)途径。
图24:途径2:IPA途径+Ptb-buk。
图25:途径3:经由丙酮的IPA途径。
图26:途径4:经由丙酮的IPA途径+Ptb-buk。
图27:途径5:甲羟戊酸途径。
图28:途径6:甲羟戊酸途径+IPP旁路。
图29:途径1-6的代谢物。
具体实施方式
以下为概括给出的本公开的描述,包括其优选实施例。本公开由在以下本文中标题“实例”下给出的公开内容进一步阐明,其提供支持本公开的实验性数据、本公开的各种方面的具体实例以及执行本公开的方式。
本发明人出人意料地能够工程改造一种一氧化碳营养型产乙酸微生物,以通过气体底物的发酵来生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物、萜烯和其前体,包括异戊二烯和法呢烯。此为这些产品的生产提供一种替代方法,所述方式可具有优于其目前生产方法的益处。另外,其提供使用来自工业过程的一氧化碳的方式,否则所述一氧化碳将被释放至大气中且污染环境。
当关于微生物使用时,术语“非天然存在”意指微生物具有至少一种未发现于所提及物种的天然存在的菌株(包括所提及物种的野生型菌株)中的基因修饰。非天然存在的微生物通常在实验室或研究设施中开发。本公开的微生物为非天然存在的。
术语“基因修饰”、“基因改变”或“基因工程改造”泛指人工操纵微生物的基因组或核酸。同样,术语“基因修饰”、“基因改变”或“基因工程改造”是指含有此基因修饰、基因改变或基因工程改造的微生物。这些术语可用于区分实验室产生的微生物与天然存在的微生物。基因修饰方法包括例如异源基因表达、基因或启动子***或缺失、核酸突变、经改变的基因表达或不活化、酶工程改造、定向进化、基于知识的设计、随机突变诱发方法、基因改组和密码子优化。本公开的微生物经基因工程改造。
“重组”指示核酸、蛋白质或微生物为基因修饰、工程改造或重组的产物。通常,术语“重组”是指含有衍生自多个来源的遗传物质或由其编码的核酸、蛋白质或微生物,所述来源例如两种或更多种不同的微生物菌株或物种。本公开的微生物一般为重组的。
“野生型”是指生物体、菌株、基因或自然界中存在的特性的典型形式,其区别于突变或变体形式。
“内源的”是指存在于或表达于衍生本公开的微生物的野生型或亲本微生物中的核酸或蛋白质。举例来说,内源基因为天然存在于衍生本公开的微生物的野生型或亲本微生物中的基因。在一个实施例中,内源基因的表达可通过例如外源启动子的外源调节元件控制。
“外源的”是指源自本公开的微生物之外的核酸或蛋白质。举例来说,外源基因或酶可以人工方式或以重组方式产生且引入或表达于本公开的微生物中。外源基因或酶也可从异源微生物分离且引入或表达于本公开的微生物中。外源核酸可适于整合至本公开的微生物的基因组中或在本公开的微生物中保持在染色体外状态,例如在质粒中。
“异源的”是指不存在于衍生本公开的微生物的野生型或亲本微生物中的核酸或蛋白质。举例来说,异源基因或酶可衍生自不同的菌株或物种且引入或表达于本公开的微生物中。异源基因或酶可以其存在于不同菌株或物种中的形式引入或表达于本公开的微生物中。或者,可以某种方式修饰异源基因或酶,例如通过对其在本公开的微生物中表达进行密码子优化或通过对其进行工程改造以改变功能,以便逆转酶活性的方向或改变底物特异性。
特别地,在本文所述的微生物中表达的异源核酸或蛋白质可来源于芽孢杆菌属、梭菌属、贪铜菌属、埃希氏菌属、葡糖杆菌属、生丝微菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、沉积菌属、芽孢八叠球菌属、链霉菌属、热硫杆状菌属、栖热孢菌属、玉蜀黍属、克雷伯氏菌属、分枝杆菌属、沙门氏菌属、拟分枝杆菌属、葡萄球菌属、伯克氏菌属、李斯特氏菌属、不动杆菌属、志贺氏菌属、奈瑟氏菌属、博特氏杆菌属、链球菌属、肠杆菌属、弧菌属、退伍军人杆菌属、黄单胞菌属、沙雷氏菌属、克罗诺杆菌属、贪铜菌属、螺旋杆菌属、耶尔森氏菌属、丙酸杆菌属、弗朗西斯氏菌属、果胶杆菌属、弓形菌属、乳杆菌属、希瓦氏菌属、伊文氏杆菌属、硫磺单胞菌属、消化球菌科、热球菌属、酵母属、火球菌属、大豆属、人属、罗尔斯通氏菌属、短杆菌属、甲基杆菌属、土芽孢杆菌属、牛属、鸡属、厌氧球菌属、爪蟾属、钝喙蜥属、家鼠属、小鼠属、猪属、赤球菌屬、根瘤菌属、巨型球菌属、中生根瘤菌属、消化球菌属、土壤杆菌、弯曲杆菌属、醋酸杆菌属、嗜碱菌属、布劳特氏菌属、丁酸杆菌属、真杆菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、鼠孢菌属、嗜热厌氧杆菌属、裂殖酵母属、类芽孢杆菌属、假芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、鸟氨酸芽胞杆菌属、卤杆菌属、库特氏菌属、慢生芽胞杆菌属、无氧芽胞杆菌属、土壤芽胞杆菌属、维京杆菌属、脂环杆菌属、芽孢八叠球菌属、盐渍微球菌属、芽孢八叠球菌属、动性球菌属、棒状杆菌属、嗜热好氧菌属、硫化芽孢杆菌属或共生短杆菌属。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。其是指任何长度的核苷酸的聚合形式,所述核苷酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸等。多核苷酸可具有任何三维结构,且可执行任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含一种或多种经修饰的核苷酸,例如甲基化核苷酸或核苷酸类似物。如果存在,那么可在聚合物组装之前或之后赋予核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可能间杂有非核苷酸组分。可在聚合之后,例如通过与标记组分结合而进一步修饰多核苷酸。
如本文中所使用,“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(例如为mRNA或其它RNA转录物)的过程和/或转录mRNA随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和经编码多肽可统称为“基因产物”。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为直链或分支链,其可包含经修饰的氨基酸,且其可间杂有非氨基酸。所述术语还涵盖经修饰的氨基酸聚合物;例如,通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵,例如与标记组分的结合。如本文中所使用,术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成氨基酸,包括甘氨酸和D或L光学异构体,以及氨基酸类似物和肽模拟物。
“酶活性”或简称“活性”泛指酶促活性,包括但不限于酶的活性、酶的量或酶催化反应的可用性。因此,“增加”酶活性包括增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的可用性。类似地,“降低”酶活性包括降低酶的活性、降低酶的量或降低酶催化反应的可用性。
“突变的”是指与衍生本公开的微生物的野生型或亲本微生物相比,在本公开的微生物中已经修饰的核酸或蛋白质。在一个实施例中,突变可为编码酶的基因中的缺失、***或取代。在另一实施例中,突变可为酶中一个或多个氨基酸的缺失、***或取代。
“经破坏的基因”是指以某种方式修饰的基因,以减少或消除基因的表达、基因的调节活性或所编码蛋白质或酶的活性。破坏可使基因或酶部分不活化、完全不活化或缺失。破坏可为完全消除基因、蛋白质或酶的表达或活性的基因敲除(KO)突变。破坏也可为基因敲低,其减少但不完全消除基因、蛋白质或酶的表达或活性。破坏可为减少、防止或阻断由酶产生的产物的生物合成的任何东西。破坏可包括例如编码蛋白质或酶的基因中的突变,参与编码酶的基因表达的基因调节元件中的突变,引入产生减少或抑制酶活性的蛋白质的核酸,或引入抑制蛋白质或酶表达的核酸(例如反义RNA、RNAi、TALEN、siRNA、CRISPR或CRISPRi)或蛋白质。破坏可使用所属领域中已知的任何方法引入。出于本公开的目的,破坏为实验室产生的,而非天然存在的。
“亲本微生物”为用于产生本公开的微生物的微生物。亲本微生物可为天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前已经修饰的微生物(即突变或重组微生物)。本公开的微生物可经修饰以表达或过度表达一种或多种在亲本微生物中不表达或不过度表达的酶。类似地,本公开的微生物可经修饰以含有一个或多个亲本微生物所不含的基因。本公开的微生物也可经修饰以不表达或表达较少量的一种或多种表达于亲本微生物中的酶。
本公开的微生物可衍生自基本上任何亲本微生物。在一个实施例中,本公开的微生物可衍生自选自由以下组成的组的亲本微生物:丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、大肠杆菌和酿酒酵母。在其它实施例中,微生物衍生自选自由以下组成的组的亲本微生物:伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、生产布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、乙酸梭菌、自产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、克萨氏梭菌、德雷克氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、扬氏梭菌、大梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋酸穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和基伍嗜热厌氧杆菌。在一优选实施例中,亲本微生物为自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在一尤其优选实施例中,亲本微生物为自产乙醇梭菌LZ1561,其根据《布达佩斯条约(Budapest Treaty)》的条款于2010年6月7日寄存在位于Inhoffenstraβe7B,D-38124,Braunschweig,Germany的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)),且授予寄存编号DSM23693。此菌株描述于国际专利申请第PCT/NZ2011/000144号,所述国际专利申请以WO 2012/015317公开。
术语“衍生自”指示核酸、蛋白质或微生物由不同(例如,亲本或野生型)核酸、蛋白质或微生物修饰或调适,以便产生新核酸、蛋白质或微生物。此类修饰或调适通常包括核酸或基因的***、缺失、突变或取代。一般来说,本公开的微生物衍生自亲本微生物。在一个实施例中,本公开的微生物衍生自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自以寄存编号DSM23693寄存的自产乙醇梭菌LZ1561。
本公开的微生物可基于功能特性进一步分类。举例来说,本公开的微生物可为或可衍生自固定C1的微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌、一氧化碳营养菌和/或甲烷氧化菌。
表1提供微生物的代表性列表且鉴别其功能特性。
1伍氏醋酸杆菌可从果糖,但不从气体产生乙醇。
2尚未研究大梭菌是否可生长于CO上。
3已报告一种热醋酸穆尔氏菌菌株,即穆尔氏菌属HUC22-1从气体产生乙醇。
4尚未研究卵形鼠孢菌是否可生长于CO上。
5尚未研究银醋酸鼠孢菌是否可生长于CO上。
6尚未研究球形鼠孢菌是否可生长于CO上。
“伍德-永达尔”是指如例如通过Ragsdale,《生物化学与生物物理学学报(BiochimBiophys Acta)》,1784:1873-1898,2008所描述的碳固定的伍德-永达尔途径。“伍德-永达尔微生物”可预测地指含有伍德-永达尔途径的微生物。通常,本公开的微生物含有天然的伍德-永达尔途径。本文中,伍德-永达尔途径可为天然未经修饰的伍德-永达尔途径,或者其可为具有一定程度的基因修饰(例如过度表达、异源表达、敲除等)的伍德-永达尔途径,只要其仍用以将CO、CO2和/或H2转化为乙酰基-CoA。
“C1”是指一碳分子,例如CO、CO2、CH4或CH3OH。“C1氧合物”是指还包含至少一个氧原子的一碳分子,例如CO、CO2或CH3OH。“C1碳源”是指充当本公开的微生物的一部分或唯一碳源的一碳分子。举例来说,C1碳源可包含CO、CO2、CH4、CH3OH或CH2O2的中一者或多者。优选地,C1碳源包含CO和CO2中的一者或两者。“固定C1的微生物”为能够从C1碳源产生一种或多种产物的微生物。通常,本公开的微生物为固定C1的细菌。在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自表1中鉴别的固定C1的微生物。
“厌氧菌”为生长不需要氧气的微生物。如果氧气以高于某一阈值存在,那么厌氧菌可能会消极反应或甚至死亡。然而,一些厌氧菌能够耐受低水平的氧气(例如0.000001-5%的氧气),有时称为“微氧条件”。通常,本公开的微生物为厌氧菌。在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自表1中鉴别的厌氧菌。
“产乙酸菌”为使用伍德-永达尔途径作为其能量守恒和合成乙酰基-CoA和乙酰基-CoA衍生产物(例如乙酸盐)的主要机制的绝对厌氧细菌(Ragsdale,《生物化学与生物物理学学报》,1784:1873-1898,2008)。确切地说,产乙酸菌使用伍德-永达尔途径作为(1)从CO2还原合成乙酰基-CoA的机制,(2)终端接受电子、能量守恒方法,(3)固定(同化)细胞碳的合成中的CO2的机制(Drake,《产乙酸原核生物(Acetogenic Prokaryotes)》,《原核生物(The Prokaryotes)》,第3版,第354页,New York,NY,2006)。所有天然存在的产乙酸菌为固定C1、厌氧、自养和非甲烷营养的。通常,本公开的微生物为产乙酸菌。在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自表1中鉴别的产乙酸菌。
“产乙醇菌”为产生或能够产生乙醇的微生物。通常,本公开的微生物为产乙醇菌。在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自表1中鉴别的产乙醇菌。
“自养生物”为能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。实际上,自养生物使用无机碳源,例如CO和/或CO2。通常,本公开的微生物为自养生物。在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自表1中鉴别的自养生物。
“一氧化碳营养菌”为能够利用CO作为唯一碳来源和能量来源的微生物。通常,本公开的微生物为一氧化碳营养菌。在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自表1中鉴别的一氧化碳营养菌。
“甲烷营养菌”为能够使用甲烷作为唯一碳源和能量来源的微生物。在某些实施例中,本公开的微生物为甲烷营养菌或衍生自甲烷营养菌。在其它实施例中,本公开的微生物并非甲烷营养菌或并非衍生自甲烷营养菌。
在一优选实施例中,本公开的微生物衍生自梭菌纲的包含物种自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的簇。这些物种首先由Abrini,《微生物学档案(Arch Microbiol)》,161:345-351,1994(自产乙醇梭菌),Tanner,《国际***细菌学杂志(Int J SystemBacteriol)》,43:232-236,1993(扬氏梭菌)及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌)进行报告和表征。
这些三个物种有许多相似之处。特别地,这些物种全部为梭菌属的固定C1、厌氧、产乙酸、产乙醇和一氧化碳营养型成员。这些物种具有类似基因型和表达型和能量守恒和发酵代谢模式。此外,这些物种聚集于梭菌rRNA同源组I中,其16S rRNA DNA超过99%一致,DNA G+C含量为约22-30mol%,为革兰氏阳性的,具有类似形态和大小(0.5-0.7×3-5μm之间的对数生长细胞),为嗜温性的(最优选生长于30-37℃下),具有约4-7.5的类似pH值范围(其中最优选pH值为约5.5-6),缺乏细胞色素且经由Rnf复合物保存能量。另外,已在这些物种中显示使羧酸还原为其对应醇(Perez,《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》,110:1066-1077,2012)。重要的是,这些物种在含有CO气体上也全部显示出强自养生长,产生乙醇和乙酸酯(或乙酸)作为主要发酵产物,且在某些条件下产生少量2,3-丁二醇和乳酸。
然而,这些三个物种还具有许多不同之处。这些物种分离自不同来源:自产乙醇梭菌分离自家兔肠道,扬氏梭菌分离自鸡舍废弃物,且拉氏梭菌分离自淡水沉积物。这些物种不同之处在于利用不同的糖(例如鼠李糖、***糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)以及其它底物(例如甜菜碱、丁醇)。此外,这些物种对某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷型不同。这些物种在伍德-永达尔途径基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列方面具有差异,但已发现这些基因和蛋白质的一般组织和数目在所有物种中相同(《生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)》,22:320-325,2011)。
因此,总体而言,自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的许多特性并非所述物种所特有的,而是梭菌属的此簇固定C1、厌氧、产乙酸、产乙醇和一氧化碳营养型成员的一般特性。然而,由于这些物种实际上不同,因此对这些物种中的一者的基因修饰或操纵可能不会对这些物种中的另一者中产生相同影响。举例来说,可观测到生长、性能或产物产生的差异。
本公开的微生物也可衍生自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的分离株或突变体。自产乙醇梭菌的分离株和突变体包括JA1-1(DSM10061)(Abrini,《微生物学档案》,161:345-351,1994)、LZ1560(DSM19630)(WO 2009/064200)和LZ1561(DSM23693)(WO 2012/015317)。扬氏梭菌的分离株和突变体包括ATCC 49587(Tanner,《国际***细菌学杂志》,43:232-236,1993)、PETCT(DSM13528,ATCC 55383)、ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo,《使用扬氏梭菌从合成气产生生物乙醇(Production of bioethanol fromsynthesis gas using Clostridiumljungdahlii)》,PhD thesis,北卡罗来纳州立大学(North Carolina State University),2010)。拉氏梭菌的分离株和突变体包括PI 1(ATCCBAA-622,ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。
然而,如上所述,本公开的微生物也可衍生自基本上任何亲本微生物,例如选自由丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、大肠杆菌和酿酒酵母组成的组的亲本微生物。
破坏性突变的引入导致本公开的微生物与衍生本公开的微生物的亲本微生物相比不产生目标产物或大体上不产生目标产物或目标产物的量减少。举例来说,本公开的微生物可不产生目标产物或产生比亲本微生物少至少约1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的目标产物。举例来说,本公开的微生物可产生小于约0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0g/L目标产物。
尽管本文提供酶的示范性序列和来源,但本公开决不限于这些序列和来源——其还涵盖变体。术语“变体”包括序列不同于参考核酸和蛋白质的序列(例如现有技术中所公开或本文中所例示的参考核酸和蛋白质的序列)的核酸和蛋白质。可使用执行与参考核酸或蛋白质大体上相同的功能的变体核酸或蛋白质来实施本公开。举例来说,变体蛋白质可执行与参考蛋白质大体上相同的功能或催化大体上相同的反应。变体基因可编码与参考基因相同或大体上相同的蛋白质。变体启动子可具有与参考启动子大体上相同的促进一种或多种基因表达的能力。
此类核酸或蛋白质在本文中可称为“功能等效变体”。举例来说,核酸的功能等效变体可包括等位基因变体、基因片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同源基因还为功能等效变体的实例。这些基因包括例如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或扬氏梭菌的物种中的同源基因,其详情在例如Genbank或NCBI的网站上公开获取。功能等效变体还包括其序列因特定微生物的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能等效变体将优选与参考核酸具有至少约70%、约80%、约85%、约90%、约95%、约98%或更大核酸序列一致性(同源性百分比)。蛋白质的功能等效变体将优选与参考蛋白质具有至少约70%、约80%、约85%、约90%、约95%、约98%或更大氨基酸一致性(同源性百分比)。变体核酸或蛋白质的功能等效性可使用所属领域中已知的任何方法评估。
“互补性”是指核酸通过传统Watson-Crick或其它非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如,Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如,10个中有5、6、7、8、9、10个为50%、60%、70%、80%、90%和100%互补)。“完美互补”意谓核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键结。如本文中所使用之“大体上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多核苷酸的区域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的互补程度,或是指在严格条件下杂交的两种核酸。
“杂交”是指一个或多个多核苷酸反应以形成复合物的反应,所述复合物经由核苷酸残基的碱基之间的氢键结而稳定化。可通过Watson Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其它序列特异方式进行氢键结。复合物可包含形成双螺旋体结构的两条链、形成多链复合物的三条链或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可构成例如起始PCR或通过酶裂解多核苷酸的较广泛方法中的步骤。能够与给测序列杂交的序列称为给测序列的“补体”。
可使用所属领域中已知的任何方法将核酸递送至本公开的微生物中。举例来说,核酸可作为裸核酸递送,或可与一种或多种试剂,例如脂质体一起调配。核酸可为DNA、RNA、cDNA或其组合,视情况而定。在某些实施例中可使用限制性抑制剂。额外载体可包括质粒、病毒、噬菌体、粘粒和人工染色体。在一优选实施例中,使用质粒将核酸递送至本公开的微生物。举例说明,转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或结合来实现。在具有活性限制酶***的某些实施例中,可能有必要在将核酸引入微生物中之前将核酸甲基化。
此外,核酸可经设计以包含调节元件,例如启动子,以增加或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。理想地,启动子为伍德-永达尔途径启动子、铁氧化还原蛋白启动子、丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子、ATP合成酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
应了解,本公开可使用序列与本文中具体例示的序列不同的核酸来实施,只要其执行大体上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列,此意谓经编码的蛋白质或肽具有大体上相同的功能。对于表示启动子序列的核酸序列,变体序列将具有促进一个或多个基因的表达的能力。此类核酸在本文中可称为“功能等效变体”。举例来说,核酸的功能等效变体包括等位基因变体、基因片段、包括突变(缺失、***、核苷酸取代等)和/或多态性等的基因。来自其它微生物的同源基因也可视为本文中具体例示的序列的功能等效变体的实例。
这些包括例如扬氏梭菌、橙色绿屈挠菌、金属球菌属或硫化叶菌属的物种中的同源基因,其详情在例如Genbank或NCBI的网站上公开获取。短语“功能等效变体”还应视为包括序列由于特定微生物的密码子优化而变化的核酸。本文中的核酸的“功能等效变体”将优选地与所鉴别核酸具有至少约70%、优选地约80%、更优选地约85%、优选地约90%、优选地约95%或更大核酸序列一致性。
还应了解,本公开可使用序列与本文中具体例示的氨基酸序列不同的多肽来实践。这些变体在本文中可称为“功能等效变体”。蛋白质或肽的功能等效变体包括与所鉴别的蛋白质或肽具有至少40%、优选50%、优选60%、优选70%、优选75%、优选80%、优选85%、优选90%、优选95%或更大氨基酸一致性且具有与所关注的肽或蛋白质大体上相同功能的那些蛋白质或肽。此类变体在其范围内包括蛋白质或肽的片段,其中片段包含多肽的截短形式,其中缺失可为1至5、至10、至15、至20、至25个氨基酸,且可在多肽的任一端从残基1至25延伸,且其中缺失在区内可具有任何长度;或可处于内部位置。本文中的特定多肽的功能等效变体还应视为包括由其它细菌物种中的同源基因表达的多肽,例如如先前段落中所例示。
本公开的微生物可使用所属领域中已知用于产生重组微生物的任何数目的技术由亲本微生物和一个或多个外源核酸制备。仅举例说明,转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或结合来实现。合适的转化技术例如描述于Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:分子克隆(Molecular Cloning):实验室手册(A laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour LaboratoryPress),冷泉港(Cold Spring Harbour),1989中。
在某些实施例中,由于在待转化微生物中具有活性的限制***,有必要将待引入微生物中的核酸甲基化。此可使用多种技术进行,包括下文所描述的那些技术,且进一步例示于下文实例部分中。
举例说明,在一个实施例中,本公开的重组微生物通过包含以下步骤的方法产生:将(i)如本文中所描述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入至穿梭微生物中;表达甲基转移酶基因;从穿梭微生物分离一个或多个构建体/载体;和将一个或多个构建体/载体引入至目的微生物中。
在一个实施例中,组成性表达步骤B的甲基转移酶基因。在另一实施例中,诱导步骤B的甲基转移酶基因的表达。
穿梭微生物为促进构成表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微生物,优选地为限制阴性微生物。在特定实施例中,穿梭微生物为限制阴性大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
一旦表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物中,那么诱导存在于甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因。诱导可通过任何适合的启动子***实现,但在本公开的一个特定实施例中,甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子且通过添加乳糖等,更优选地异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7***。在本公开的另一实施例中,甲基化构建体/载体启动子为组成型启动子。
在一个特定实施例中,甲基化构建体/载体具有对穿梭微生物的一致性具有特异性的复制起点,使得存在于甲基化构建体/载体上的任何基因表达于穿梭微生物中。优选地,表达构建体/载体具有对目的微生物的一致性具有特异性的复制起点,使得存在于表达构建体/载体上的任何基因表达于目的微生物中。
甲基转移酶的表达导致存在于表达构建体/载体上的基因的甲基化。表达构建体/载体可接着根据多种已知方法中的任一者从穿梭微生物分离。仅举例说明,下文所描述的实例部分中所描述的方法可用于分离表达构建体/载体。
在一个特定实施例中,两个构建体/载体同时分离。
可使用任何数目的已知方法将表达构建体/载体引入至目的微生物中。然而,举例说明,可使用下文实例部分中所描述的方法。由于表达构建体/载体经甲基化,因此存在于表达构建体/载体上的核酸序列能够并入至目的微生物中且成功地表达。
据设想,可将甲基转移酶基因引入至穿梭微生物中且过度表达。因此,在一个实施例中,所得甲基转移酶可使用已知方法收集且体外用于甲基化表达质粒。可接着将表达构建体/载体引入至目的微生物中以用于表达。在另一实施例中,将甲基转移酶基因引入至穿梭微生物的基因组中,随后将表达构建体/载体引入至穿梭微生物中,从穿梭微生物分离一个或多个构建体/载体,且接着将表达构建体/载体引入至目的微生物中。
据设想,如上文所定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可组合以提供物质组合物。此组合物在避开限制屏障机制以产生本公开的重组微生物方面具有特定效用。
在一个特定实施例中,表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体为质粒。
所属领域的一般技术人员将了解用于产生本公开的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而,举例说明,可使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和后文实例中所描述的甲基转移酶。考虑到所需甲基转移酶和基因密码的序列,将容易了解编码合适的甲基转移酶的核酸。
适于允许表达甲基转移酶基因的任何数目的构建体/载体可用于产生甲基化构建体/载体。
在一个实施例中,底物包含CO。在一个实施例中,底物包含CO2和CO。在另一实施例中,底物包含CO2和H2。在另一实施例中,底物包含CO2和CO和H2。
“底物”是指用于本公开的微生物的碳源和/或能量源。通常,底物为气态的,且包含C1碳源,例如CO、CO2和/或CH4。优选地,底物包含CO或CO+CO2的C1碳源。底物可进一步包含其它非碳组分,例如H2、N2或电子。然而,在其它实施例中,底物可为碳水化合物,例如糖、淀粉、纤维、木质素、纤维素或半纤维素或其组合。举例来说,碳水化合物可为果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖或其某种组合。在一些实施例中,底物不包含(D)-木糖(Alkim,Microb Cell Fact,14:127,2015)。在一些实施例中,底物不包含戊糖例如木糖(Pereira,Metab Eng,34:80-87,2016)。在一些实施例中,底物可包含气态底物和碳水化合物底物(混合营养发酵)。底物可进一步包含其它非碳组分,例如H2、N2或电子。
气态底物通常包含至少一定量的CO,例如约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol%CO。气态底物可包含一定范围的CO,例如约20-80、30-70或40-60mol%CO。优选地,气态底物包含约40-70mol%CO(例如轧钢厂或高炉气体)、约20-30mol%CO(例如碱性氧气炉气体)或约15-45mol%CO(例如合成气)。在一些实施例中,气态底物可包含相对较低量的CO,例如约1-10或1-20mol%CO。本公开的微生物通常将气态底物中的至少一部分CO转化为产物。在一些实施例中,气态底物不包含或大体上不包含(<1mol%)CO。
气态底物可包含一定量的H2。举例来说,气态底物可包含约1、2、5、10、15、20或30mol%H2。在一些实施例中,气态底物可包含相对较高量的H2,例如约60、70、80或90mol%H2。在其它实施例中,气态底物不包含或大体上不包含(<1mol%)H2。
气态底物可包含一定量的CO2。举例来说,气态底物可包含约1-80或1-30mol%CO2。在一些实施例中,气态底物可包含低于约20、15、10或5mol%CO2。在另一实施例中,气态底物不包含或大体上不包含(<1mol%)CO2。
气态底物也可以替代形式提供。举例来说,气态底物可溶解于液体中或吸附于固体支撑物上。
气态底物和/或C1碳源可为作为工业过程的副产物获得或来自一些其它来源(例如来自汽车尾气或生物质气化)的废气。在某些实施例中,工业过程选自由以下组成的组:铁类金属产品制造(例如轧钢厂制造)、非铁产品制造、石油精炼、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施例中,气态底物和/或C1碳源可在其排放至大气中之前使用任何便利方法从工业过程捕获。
气态底物和/或C1碳源可为合成气,例如通过煤炭或精炼厂残余物气化、生物质或木质纤维素材料气化或天然气重整所获得的合成气。在另一实施例中,合成气可获自城市固体废物或工业固体废物的气化。
底物和/或C1碳源可为作为工业过程的副产物获得或来自另一来源,例如汽车尾气、沼气、掩埋产气、直接空气捕获或来自电解的废气。底物和/或C1碳源可为通过热解、焙烧或气化产生的合成气。换句话说,可通过热解、焙烧或气化来回收废材料,以产生用作底物和/或C1碳源的合成气。底物和/或C1碳源可为包含甲烷的气体。
在某些实施例中,工业过程选自铁类金属产品制造例如钢铁制造、非铁产品制造、石油精炼、电力生产、炭黑生产、纸张和纸浆制造、氨生产、甲醇生产、焦炭制造、石油化工生产、碳水化合物发酵、水泥制造、好氧消化、厌氧消化、催化过程、天然气提取、纤维素发酵、石油提取、地质储层、来自例如天然气煤和石油的化石资源的气体,或其任何组合。工业过程中的具体加工步骤的实例包括催化剂再生、流化催化剂裂化和催化剂再生。空气分离和直接空气捕获是其它适合工业过程。钢铁和铁合金制造中的具体实例包括高炉煤气、碱性氧气炉煤气、焦炉煤气、铁炉炉顶煤气的直接还原和炼铁的残余气体。在这些实施例中,底物和/或C1碳源可在其排放至大气中之前使用任何已知方法从工业过程捕获。
底物和/或C1碳源可为称为合成气的合成气体,其可从重整、部分氧化或气化过程中获得。气化过程的实例包括煤的气化、炼油厂残渣的气化、石油焦的气化、生物质的气化、木质纤维素材料的气化、废木材的气化、黑液的气化、城市固体废物的气化、城市液体废物的气化、工业固体废物的气化、工业液体废物的气化、废物衍生燃料的气化、下水道的气化、下水道污泥的气化、废水处理产生的污泥的气化、沼气的气化。重整过程的实例包括蒸汽甲烷重整、蒸汽石脑油重整、天然气重整、沼气重整、掩埋产气重整、石脑油重整和干甲烷重整。部分氧化过程的实例包括热和催化部分氧化过程、天然气的催化部分氧化、烃的部分氧化。城市固体废物的实例包括轮胎、塑料、纤维,例如鞋、服装和纺织品中的纤维。城市固体废物可仅为掩埋型废物。城市固体废料可以分类或未分类。生物质的实例可包括木质纤维素材料,且也可包括微生物生物质。木质纤维素材料可包括农业废料和森林废料。
底物和/或C1碳源可为包含甲烷的气流。此类含甲烷气体可例如在压裂、废水处理、牲畜业、农业和城市固体废物掩埋场期间从化石甲烷排放获得。还设想甲烷可经燃烧以产生电力或热量,且C1副产物可用作底物或碳源。
气态底物的组成可能对反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说,氧气(O2)的存在可降低厌氧性发酵过程的效率。视底物的组成而定,可能需要处理、洗涤或过滤底物以去除任何非所要杂质,例如毒素、非所要组分或灰尘颗粒,和/或增加所需组分的浓度。
在某些实施例中,发酵在不存在碳水化合物底物,例如糖、淀粉、纤维、木质素、纤维素或半纤维素的情况下进行。
在一些实施例中,CO和H2至乙二醇(MEG)的总体能量学优于葡萄糖至乙二醇的能量学,如下文所示,其中CO和H2的更负的吉布斯自由能ΔrG'm指示朝向乙二醇的驱动力更大。使用平衡器(http://equilibrator.weizmann.ac.il/)对葡萄糖与CO作为底物的比较的总体反应△G进行计算,此为评估生物***中途径或途径中的个别步骤的总体可行性的标准方法(Flamholz,E.Noor,A.Bar-Even,R.Milo(2012)eQuilibrator-生化热力学计算器(eQuilibrator-the biochemical thermodynamics calculator)《核酸研究(NucleicAcids Res)》40:D770-5;Noor,A.Bar-Even,A.Flamholz,Y.Lubling,D.Davidi,R.Milo(2012)结合准确性和覆盖面的反应热力学综合开放框架(An integrated open frameworkfor thermodynamics of reactions that combines accuracy and coverage)《生物信息学(Bioinformatics)》28:2037-2044;Noor,H.S.Haraldsdóttir,R.Milo,R.M.T.Fleming(2013)使用成分贡献的吉布斯能量的一致估计(Consistent Estimation of GibbsEnergy Using Component Contributions)《公共科学图书馆·计算生物学(PLoS ComputBiol)》9(7):e1003098;Noor,A.Bar-Even,A.Flamholz,E.Reznik,W.Liebermeister,R.Milo(2014)途径热力学强调中央代谢的动力学障碍(Pathway ThermodynamicsHighlights Kinetic Obstacles in Central Metabolism)《公共科学图书馆·计算生物学》10(2):e1003483)。计算如下:
生理条件:
除了乙二醇、乙醛酸盐和/或乙醇酸盐之外,本公开的微生物可经培养以生产一种或多种副产品。举例来说,本公开的微生物可生产或可经工程改造以生产乙醇(WO 2007/117157)、乙酸盐(WO 2007/117157)、1-丁醇(WO 2008/115080、WO 2012/053905和WO 2017/066498)、丁酸盐(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342和WO 2016/094334)、乳酸盐(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸盐(3-HP)(WO2013/180581)、萜烯,除了2-苯乙醇之外,包括异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/036152)、1-丙醇(WO2017/066498)、1-己醇(WO 2017/066498)、1-辛醇(WO 2017/066498)、分支酸盐衍生产物(WO 2016/191625)、3-羟基丁酸盐(WO 2017/066498)、1,3-丁二醇(WO 2017/066498)、2-羟基异丁酸盐或2-羟基异丁酸(WO 2017/066498)、异丁烯(WO 2017/066498)、己二酸(WO2017/066498)、1,3-己二醇(WO 2017/066498)、3-甲基-2-丁醇(WO2017/066498)、2-丁烯-1-醇(WO 2017/066498)、异戊酸盐(WO 2017/066498)、异戊醇(WO 2017/066498)和/或单乙二醇(WO 2019/126400)。在一些实施例中,除了乙二醇之外,本公开的微生物还生产乙醇、2,3-丁二醇和/或丁二酸盐。在某些实施例中,微生物生物质本身可视为产物。这些产物可进一步转化以产生柴油、喷射机燃料和/或汽油的至少一种组分。在某些实施例中,2-苯乙醇可用作芳香剂、精油、调味剂和皂类中的成分。此外,可通过所属领域中已知的任何方法或方法的组合进一步加工微生物生物质以生产单细胞蛋白(SCP)。除一种或多种目标产物以外,本发明的微生物也可产生乙醇、乙酸盐和/或2,3-丁二醇。
“天然产物”为通过未经基因修饰的微生物产生的产物。举例来说,乙醇、乙酸盐和2,3-丁二醇为自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的天然产物。“非天然产物”为通过经基因修饰微生物产生而非通过衍生经基因修饰微生物的未经基因修饰微生物产生的产物。不知道乙二醇是由任何天然存在的微生物产生的,因此其为所有微生物的非天然产物。
“选择性”是指目标产物的产量与通过微生物产生的所有发酵产物的产量的比率。本公开的微生物可经工程改造而以一定选择性或最小选择性产生产物。在一个实施例中,目标产物,例如乙二醇占由本公开的微生物产生的所有发酵产物的至少约5%、10%、15%、20%、30%、50%或75%。在一个实施例中,乙二醇占由本公开的微生物产生的所有发酵产物的至少10%,使得本公开的微生物对乙二醇的选择性为至少10%。在另一实施例中,乙二醇占由本公开的微生物产生的所有发酵产物的至少30%,使得本公开的微生物对乙二醇的选择性为至少30%。
一种或多种发酵产物中的至少一者可为培养物产生的生物质。至少一部分微生物生物质可转化为单细胞蛋白(SCP)。至少一部分单细胞蛋白可用作动物饲料的成分。
在一个实施例中,本公开提供了一种动物饲料,其包含微生物生物质和至少一种赋形剂,其中所述微生物生物质包含在包含CO、CO2和H2中的一者或多者的气态底物上生长的微生物。
“单细胞蛋白”(SCP)是指可用于富含蛋白质的人类食物和/或动物饲料中,通常替代蛋白质补充物的常规来源的微生物生物质,例如豆粕或鱼粉。为产生单细胞蛋白或其它产物,所述过程可包含额外的分离、加工或处理步骤。举例来说,所述方法可包含对微生物生物质进行灭菌,使微生物生物质离心和/或将微生物生物质干燥。在某些实施例中,微生物生物质使用喷雾干燥或桨叶干燥来干燥。所述方法也可包含使用所属领域中已知的任何方法降低微生物生物质的核酸含量,因为摄入高核酸含量的膳食可能导致核酸降解产物积聚和/或胃肠窘迫。单细胞蛋白可适用于喂养动物,例如家畜或宠物。特别地,动物饲料可适用于喂养一头或多头肉牛、奶牛、猪、绵羊、山羊、马、骡子、驴、鹿、水牛/野牛、美洲驼、羊驼、驯鹿、骆驼、野牛、大额牛、牦牛、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、珍珠鸡、雏鸟/鸽子、鱼、虾、甲壳动物、猫、狗和啮齿动物。动物饲料的组成可根据不同动物的营养要求调整。此外,所述过程可包含将微生物生物质与一种或多种赋形剂掺合或组合。
“微生物生物质”是指包含微生物细胞的生物材料。举例来说,微生物生物质可包含纯的或基本上纯的细菌、古细菌、病毒或真菌培养物或由其等组成。当最初从发酵液中分离时,微生物生物质通常含有大量的水。此类水可通过干燥或处理微生物生物质来去除或减少。
“赋形剂”可指可添加至微生物生物质以增强或改变动物饲料的形式、属性或营养含量的任何物质。举例来说,赋形剂可包含以下中的一者或多者:碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、水、调味剂、甜味剂、抗氧化剂、酶、防腐剂、益生菌或抗生素。在一些实施例中,赋形剂可为干草、稻草、青贮料、谷物、油或脂肪或其它植物材料。赋形剂可为Chiba,第18节:《饮食调配及常见饲料成分(Diet Formulation and Common FeedIngredients)》,《动物营养手册(Animal Nutrition Handbook)》,第3修订版,第575-633页,2014中所确认的任何饲料成分。
“生物聚合物”是指由活生物体的细胞产生的天然聚合物。在某些实施例中,生物聚合物为PHA。在某些实施例中,生物聚合物为PHB。
“生物塑料”是指由可再生生物质来源生产的塑料材料。生物塑料可由可再生资源生产,例如植物脂肪和油、玉米淀粉、稻草、木片、锯末或回收的食物垃圾。
在本文中,提及酸(例如乙酸或2-羟基异丁酸)应理解为还包括相应的盐(例如乙酸盐或2-羟基异丁酸盐)。
通常,在生物反应器中进行培养。术语“生物反应器”包括培养/发酵装置,其由一个或多个容器、塔或管道布置组成,例如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵器、静态混合器或适用于气液接触的另一容器或另一装置。在一些实施例中,生物反应器可包含第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可将底物提供至这些反应器中的一者或两者。如本文中所使用,术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵过程的生长阶段和产物生物合成阶段。
通常在含有足以准许微生物生长的营养物、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持培养物。优选地,水性培养基为厌氧微生物生长培养基,例如最小厌氧微生物生长培养基。合适的培养基为所属领域中所熟知。
培养/发酵期望应在生产乙二醇的适当条件下进行。必要时,培养/发酵在厌氧条件下进行。应考虑的反应条件包括压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原潜力、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物含量、确保液相中的气体不会变成限制性的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。确切地说,可控制底物的引入速率以确保液相中气体的浓度不会变成限制性的。
在高压下操作生物反应器允许增加从气相至液相的气体质量转移速率。因此,通常优选在高于大气压的压力下进行培养/发酵。此外,因为既定气体转化率部分为底物保留时间的函数,且保留时间指示生物反应器的所需体积,所以使用加压***可大大减小所需生物反应器的体积,且因此降低培养/发酵设备的资金成本。此又意谓当生物反应器维持在高压而非大气压下时,保留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流动速率)可减少。最优选反应条件将部分地取决于所用的特定微生物。然而,一般来说,优选在高于大气压的压力下操作发酵。此外,因为既定气体转化率部分为底物保留时间的函数,且实现所需保留时间又指示生物反应器的所需体积,所以使用加压***可大大减小所需生物反应器的体积,且因此降低发酵设备的资金成本。
在某些实施例中,发酵在不存在光的情况下或在不存在足以满足光合微生物的能量需求的光量的情况下进行。在某些实施例中,本公开的微生物为非光合微生物。
目标产物可使用任何方法或所属领域中已知方法的组合从发酵培养液分离或纯化,所述方法包括例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气体汽提、相分离和萃取发酵,包括例如液-液萃取。在某些实施例中,目标产物通过以下步骤从发酵培养液回收:从生物反应器连续去除培养液的一部分,分离微生物细胞与培养液(宜通过过滤进行),和从培养液回收一种或多种目标产物。醇和/或丙酮可例如通过蒸馏回收。酸可例如通过吸附于活性炭上回收。优选地将所分离微生物细胞返回生物反应器。还优选使去除目标产物后剩余的不含细胞的渗透物返回至生物反应器。可将其它营养物(例如B族维生素)添加至不含细胞的渗透物中以在渗透物返回至生物反应器前补充培养基。纯化技术可包括亲和标签纯化(例如His、Twin-Strep和FLAG)、基于珠粒的***、基于尖端的方法和用于更大规模自动化纯化的FPLC***。还公开不依赖于亲和标签的纯化方法(例如盐析、离子交换和尺寸排阻)。
如本文中所提及,“发酵液”为至少包含营养培养基和细菌细胞的培养基。
如本文中所提及,“穿梭微生物”为表达甲基转移酶的微生物,且不同于目的微生物。
如本文中所提及,“目的微生物”为表达表达构建体/载体上所包括的基因的微生物,且不同于穿梭微生物。
术语“主要发酵产物”意谓以最高浓度和/或产率产生的一种发酵产物。
术语“增加效率”、“增加的效率”等术语在与发酵过程相关使用时包括但不限于增加以下中的一者或多者:催化发酵的微生物的生长速率、在升高的产物浓度下的生长和/或产物产生速率、每体积消耗的底物所产生的所需产物的体积、所需产物的产生速率或产生水平和所产生的所需产物相比于发酵的其它副产物的相对比例。
短语“包含一氧化碳的底物”和类似术语应理解为包括其中一氧化碳可用于一种或多种细菌菌株以用于例如生长和/或发酵的任何底物。
短语“包含一氧化碳的气态底物”和类似短语和术语包括含有一定含量的一氧化碳的任何气体。在某些实施例中,底物含有至少约20体积%至约100体积%CO、20体积%至70体积%CO、30体积%至60体积%CO和40体积%至55体积%CO。在特定实施例中,底物包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%CO,或约55体积%CO,或约60体积%CO。
尽管底物不必含有任何氢气,但H2的存在不应对根据本公开的方法的产物形成有害。在特定实施例中,氢的存在导致乙醇产生的改进的总体效率。举例来说,在特定实施例中,底物可包含大约2:1、或1:1、或1:2比率的H2:CO。在一个实施例中,底物包含约30体积%或更少H2、20体积%或更少H2、约15体积%或更少H2或约10体积%或更少H2。在其它实施例中,底物流包含低浓度H2,例如小于5%、或小于4%、或小于3%、或小于2%、或小于1%,或大体上不含氢。底物也可含有一些CO2,例如约1体积%至约80体积%CO2,或1体积%至约30体积%CO2。在一个实施例中,底物包含小于或等于约20体积%CO2。在特定实施例中,底物包含小于或等于约15体积%CO2、小于或等于约10体积%CO2、小于或等于约5体积%CO2,或大体上不含CO2
在以下描述中,本公开的实施例根据递送和发酵“含有CO的气态底物”加以描述。然而,应了解,气态底物可以替代形式提供。举例来说,可提供溶解于液体中的含有CO的气态底物。基本上,液体经含有一氧化碳的气体饱和,且接着将所述液体添加至生物反应器中。此可使用标准方法来实现。举例说明,可使用微泡分散发生器(Hensirisak等人,用于好气发酵的微泡分散发生器的规模放大(Scale-up of microbubbledispersion generatorfor aerobic fermentation);应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry andBiotechnology)第101卷,第3册/2002年10月)。再举例来说,含有CO的气态底物可吸附至固体载体上。通过使用术语“含有CO的底物”等术语涵盖此类替代方法。
在本公开的特定实施例中,含有CO的气态底物为工业废气。“工业废气”应广泛地理解为包括通过工业过程产生的包含CO的任何气体,且包括由于铁类金属产品制造、非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、生物质气化、电力生产、炭黑生产和焦炭制造而产生的气体。其它实例可提供于本文别处。
除非上下文另有要求,否则如本文所用,短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等短语旨在涵盖所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如本文中进一步描述,在一些实施例中,生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因而,将金属或组合物添加至发酵反应应理解为包括添加至这些反应器中的任一者或两者。
术语“生物反应器”包括发酵装置,其由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成,所述装置包括连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵罐、静态混合器或适用于气-液接触的另一容器或另一装置。在一些实施例中,生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因而,当提及将底物添加至生物反应器或发酵反应时,应理解为包括适当时添加至这些反应器中的任一者或两者。
“外源核酸”为源自其所引入的微生物之外的核酸。外源核酸可来源于任何适当来源,包括但不限于待引入其的微生物(例如在重组微生物所来源的亲本微生物中)、与待引入其的生物体不同的微生物菌株或物种,或其可人工或以重组方式形成。在一个实施例中,外源核酸代表天然存在于待引入其的微生物内的核酸序列,且其经引入以增加特定基因的表达或过度表达(例如,通过增加序列(例如基因)的拷贝数,或引入强或组成型启动子以增加表达)。在另一实施例中,外源核酸代表待引入其的微生物内非天然存在的核酸序列,且允许表达在微生物内非天然存在的产物或增加微生物原生基因的表达(例如在引入调节元件例如启动子的情况下)。外源核酸可适于整合至待引入其的微生物的基因组中或保持染色体外状态。
“外源”也可用于指蛋白质。这是指衍生重组微生物的亲本微生物中不存在的蛋白质。
如本文所用,与重组微生物和核酸或蛋白质有关的术语“内源”是指衍生重组微生物的亲本微生物中存在的任何核酸或蛋白质。
应了解,本公开可使用序列与本文中具体例示的序列不同的核酸来实施,只要其执行大体上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列,此意谓经编码的蛋白质或肽具有大体上相同的功能。对于表示启动子序列的核酸序列,变体序列将具有促进一个或多个基因的表达的能力。此类核酸在本文中可称为“功能等效变体”。举例来说,核酸的功能等效变体包括等位基因变体、基因片段、包括突变(缺失、***、核苷酸取代等)和/或多态性等的基因。来自其它微生物的同源基因也可视为本文中具体例示的序列的功能等效变体的实例。这些基因包括例如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或扬氏梭菌的物种中的同源基因,其详情在例如Genbank或NCBI的网站上公开获取。短语“功能等效变体”还应视为包括序列由于特定微生物的密码子优化而变化的核酸。本文中的核酸的“功能等效变体”将优选地与所鉴别核酸具有至少约70%、优选地约80%、更优选地约85%、优选地约90%、优选地约95%或更大核酸序列一致性。
还应了解,本公开可使用序列与本文中具体例示的氨基酸序列不同的多肽来实践。这些变体在本文中可称为“功能等效变体”。蛋白质或肽的功能等效变体包括与所鉴别的蛋白质或肽具有至少40%、优选50%、优选60%、优选70%、优选75%、优选80%、优选85%、优选90%、优选95%或更大氨基酸一致性且具有与所关注的肽或蛋白质大体上相同功能的那些蛋白质或肽。此类变体在其范围内包括蛋白质或肽的片段,其中片段包含多肽的截短形式,其中缺失可为1至5、至10、至15、至20、至25个氨基酸,且可在多肽的任一端从残基1至25延伸,且其中缺失在区内可具有任何长度;或可处于内部位置。本文中的特定多肽的功能等效变体还应视为包括由其它细菌物种中的同源基因表达的多肽,例如如先前段落中所例示。
如本文所用,“大体上相同的功能”欲意谓核酸或多肽能够执行其作为变体的核酸或多肽的功能。举例来说,本公开的酶的变体将能够催化与所述酶相同的反应。然而,不应认为所述变体具有与其作为变体的多肽或核酸相同的活性水平。
可使用多种已知方法评定功能等效变体是否具有与其作为变体的核酸或多肽大体上相同的功能。然而,举例而言,Silver等人(1991,《植物生理学(Plant Physiol.)》97:1588-1591)或Zhao等人(2011,《应用微生物学与生物技术(Appl MicrobiolBiotechnol)》,90:1915-1922)描述的关于异戊二烯合成酶的方法、Green等人(2007,《植物化学(Phytochemistry)》;68:176-188)描述的关于法呢烯合成酶的方法、Kuzuyama等人(2000,《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》182,891-897)描述的关于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶Dxs的方法、Berndt和Schlegel(1975,《微生物学档案(Arch.Microbiol.)》103,21-30)或Stim-Herndon等人(1995,《基因(Gene)》154:81-85)描述的关于硫解酶的方法、Cabano等人(1997,《昆虫生物化学与分子生物学(Insect Biochem.Mol.Biol.)》27:499-505)描述的关于HMG-CoA合成酶的方法、Ma等人(2011,《代谢工程学(Metab.Engin.)》,13:588-597)描述的关于HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶的方法、Herdendorf和Miziorko(2007,《生物化学(Biochemistry)》,46:11780-8)描述的关于磷酸甲羟戊酸激酶的方法和Krepkiy等人(2004,《蛋白质科学(Protein Sci.)》13:1875-1881)描述的关于甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的方法。如Trutko等人(2005,《微生物学(Microbiology)》74:153-158)所述,也可使用如磷霉素或甲维林的抑制剂来鉴别DXS和甲羟戊酸途径的基因。
“过度表达(Over-express)”、“过度表达(over expression)”和类似术语和短语在与本公开有关的情况下使用时,应广义地理解为包括与相同条件下亲本微生物的蛋白质(包括核酸)的表达量相比,一种或多种蛋白质的表达(包括编码其的一种或多种核酸的表达)的任何增加。不应理解为蛋白质(或核酸)以任何特定水平表达。
“亲本微生物”为用于产生本公开的重组微生物的微生物。亲本微生物可为自然界中出现的微生物(即野生型微生物),或先前已经修饰但不表达或不过度表达作为本公开的主题的一种或多种酶的微生物。因此,本公开的重组微生物可经修饰以表达或过度表达一种或多种在亲本微生物中不表达或不过度表达的酶。
术语核酸“构建体”或“载体”和类似术语应广义地理解为包括适合用作将遗传物质转移至细胞中的运载工具的任何核酸(包括DNA和RNA)。所述术语应理解为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一个或多个调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选标记。在一个特定实施例中,构建体或载体适于允许由构建体或载体编码的一个或多个基因表达。核酸构建体或载体包括裸核酸以及与一种或多种药剂一起调配以便于递送至细胞的核酸(例如脂质体结合的核酸、含有核酸的生物体)。
如本文中所提及的“萜烯”应广义地理解为包括由C5异戊二烯单元连接在一起构成的任何化合物,包括简单和复杂的萜烯和含氧萜烯化合物,例如醇、醛和酮。简单的萜烯存在于例如针叶树的植物的精油和树脂中。更复杂的萜烯包括萜类和维生素A、类胡萝卜素色素(例如番茄红素)、角鲨烯和橡胶。单萜的实例包括但不限于异戊二烯、蒎烯、橙花醇、柠檬醛、樟脑、薄荷醇、柠檬烯。倍半萜的实例包括但不限于橙花叔醇、法呢醇。二萜的实例包括但不限于植醇、维生素A1。角鲨烯为三萜的一个实例,胡萝卜素(原维生素A1)为四萜。
“萜烯前体”为在以乙酰基CoA和任选的丙酮酸为起始物质形成萜烯的反应期间产生的化合物或中间物。所述术语是指在甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中发现之前体化合物或中间物,以及长链萜烯的下游前体,例如FPP和GPP。在特定实施例中,其包括但不限于甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香叶基焦磷酸(GPP)和法呢基焦磷酸(FPP)。
“DXS途径”为从丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸至DMAPP或IPP的酶促途径。其也称为脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP或DXS)/甲基赤藻糖醇磷酸(MEP)途径。
“甲羟戊酸(MVA)途径”为从乙酰基-CoA至IPP的酶促途径。
微生物
已知两种生产萜烯的途径,脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP或DXS)/甲基赤藻糖醇磷酸(MEP)途径(Hunter等人,2007,《生物化学杂志(J.Biol.chem)》282:21573-77),以糖酵解的两个关键中间物丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)为起始物质,和甲羟戊酸(MVA)途径(Miziorko,2011,《生物化学与生物物理学集刊(Arch Biochem Biophys)》,505:131-143),以乙酰基-CoA为起始物质。已研究许多不同类别的微生物是否存在这些途径中的任一者(Lange等人,2000,PNAS,97:13172-77;Trutko等人,2005,《微生物学(Microbiology)》,74:153-158;Julsing等人,2007,《应用微生物学与生物技术ApplMicrobiol Biotechnol》,75:1377-84),但并非一氧化碳营养型产乙酸菌。举例来说,发现DXS途径存在于大肠杆菌、芽孢杆菌属或分枝杆菌属中,而甲羟戊酸途径存在于酵母属、绿屈挠菌属或粘球菌属中。
本发明人分析了一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌、扬氏梭菌的基因组是否存在两种途径中的任一者。在自产乙醇梭菌和扬氏梭菌中鉴别出DXS途径的所有基因(表1),而甲羟戊酸途径不存在。此外,不知道例如自产乙醇梭菌或扬氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌会产生任何萜烯作为代谢终产物。
表1:在自产乙醇梭菌和扬氏梭菌中鉴别出的DXS途径的萜烯生物合成基因:
在两种生物体中还鉴别出用于从异戊二烯单元下游合成萜烯的基因(表2)。
萜烯为能量密集型化合物,且其合成需要细胞以核苷三磷酸例如ATP的形式投入能量。使用糖作为底物需要从糖酵解中供应足够的能量以产生数个分子的ATP。由于丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)的可获得性,使用糖作为底物经由DXS途径生产萜烯和/或其前体以相对简单的方式进行,G3P衍生自C5戊糖和C6己糖。因此,这些C5和C6分子相对容易转化为构成萜烯的C5异戊二烯单元。
对于使用C1底物如CO或CO2的厌氧产乙酸菌,从C1单元合成例如半萜类的长分子更加困难。对于长链萜烯如C10单萜、C15倍半萜或C40四萜尤其如此。迄今为止,产乙酸菌(原生及重组生物体)中报告的碳原子最多的产物为C4化合物丁醇(等人,2011,《生物技术近期述评(Curr.Opin.Biotechnol.)》22:320-325);Schiel-Bengelsdorf及Dürre,2012,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》:10.1016/j.febslet.2012.04.043;/>等人,2011,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Sci.U.S.A.)》107:13087-92;美国专利2011/0236941)和2,3-丁二醇(/>等人,2011,《应用及环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)》77:5467-75)。本发明人已表明,使用C1原料CO经由乙酰基CoA中间物,令人惊讶地有可能厌氧产生这些长链萜烯分子。
厌氧产乙酸菌的伍德-永达尔途径的能量学刚刚出现,但与在有氧生长条件下或糖发酵生物体的糖酵解不同,伍德-永达尔途径中没有通过底物水平磷酸化获得ATP,事实上将CO2活化为甲酸实际上需要一个ATP分子且所需膜梯度。本发明人指出,重要的是产品形成的途径为高能效的。本发明人指出,在产乙酸菌中,底物CO或CO2直接转化为乙酰基-CoA,此代表通往萜烯和/或其前体的最直接途径,尤其在与基于糖的***相比时,仅需要六个反应(图1)。尽管在一氧化碳营养型产乙酸菌中可用的ATP较少,但本发明人认为,此更直接的途径可维持更高的代谢通量(由于中间反应的化学动力更高)。高效的代谢通量很重要,因为萜烯生物合成途径中的数种中间物,例如关键中间物甲羟戊酸和FPP,在没有有效翻转时对大多数细菌是有毒的。
尽管具有更高的ATP可用性,但此中间物毒性问题可能成为由糖生产萜烯的瓶颈。
当比较经由甲羟戊酸途径与DXS途径从CO生产萜烯前体IPP和DMAPP(图6)的能量学时,本发明人注意到甲羟戊酸途径需要较少的核苷三磷酸如ATP、较少的还原当量,且在与DXS途径相比时还更直接,从乙酰基-CoA仅具有六个必需反应步骤。此在反应速度和代谢通量方面提供了优势,且提高了总能源效率。此外,所需酶的数量减少,简化了生产重组微生物所需的重组方法。
尚未鉴别出具有甲羟戊酸途径的产乙酸菌,但本发明人已表明,可将甲羟戊酸途径和任选的DXS途径引入一氧化碳营养型产乙酸菌,例如自产乙醇梭菌或扬氏梭菌,以便从C1碳底物CO有效生产萜烯和/或其前体。其预期此适用于所有一氧化碳营养型产乙酸微生物。
此外,从未证明在厌氧条件下使用重组微生物可生产萜烯和/或其前体。异戊二烯的厌氧生产具有提供更安全的操作环境的优势,因为异戊二烯在氧气存在下极其易燃,在室温和大气压下的易燃下限(LFL)为1.5-2.0%,易燃上限(UFL)为2.0-12%。由于在没有氧气的情况下火焰不会发生,故本发明人相信厌氧发酵过程为合乎需要的,因为其在所有产品浓度、气体组成、温度和压力范围内会更安全。
如上文所论述,本公开提供一种重组微生物,其能够通过发酵包含CO的底物生产一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产品。
在另一实施例中,微生物适于:
表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种外源酶和/或过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种内源酶;和
a)表达DXS途径中的一种或多种外源酶和/或过度表达DXS途径中的一种或多种内源酶。
在一个实施例中,衍生重组微生物的亲本微生物能够发酵包含CO的底物以产生乙酰基CoA,但不能将乙酰基CoA转化为甲羟戊酸或异戊烯基焦磷酸(IPP),且重组微生物适于表达一种或多种参与甲羟戊酸途径的酶。
可通过任何数目的重组方法使微生物适于表达或过度表达一种或多种酶,包括例如增加微生物内的原生基因的表达(例如通过引入更强或组成型启动子来驱动基因的表达)、通过引入编码且适于表达特定酶的外源核酸来增加编码所述酶的基因的拷贝数、引入编码且适于表达亲本微生物内非天然存在的酶的外源核酸。
在一个实施例中,一种或多种酶来自甲羟戊酸(MVA)途径且选自由以下组成的组:
a)硫解酶(EC 2.3.1.9),
b)HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10),
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88),
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36),
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2),
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33),和
g)其中任一者的功能等效变体。
在另一实施例中,任选的一种或多种酶来自DXS途径且选自由以下组成的组:
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7),
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267),
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60),
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148),
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12),
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1),
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2),和
h)其中任一者的功能等效变体。
在另一实施例中,表达或过度表达一种或多种其它外源或内源酶导致生产萜烯化合物和/或其前体,其中表达的外源酶或过度表达的内源酶选自由以下组成的组:
a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10),
b)七异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.10),
c)八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90),
d)异戊二烯合成酶(EC 4.2.3.27),
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2),
f)法呢烯合成酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47),和
g)其中任一者的功能等效变体。
仅举例来说,每种酶的序列信息在本文的图中列出。
在本公开的微生物中使用的酶可来源于任何适当来源,包括不同属和种的细菌或其它生物体。然而,在一个实施例中,酶来源于金黄色葡萄球菌。
在一个实施例中,酶异戊二烯合成酶(ispS)来源于美洲山杨。在另一实施例中,其具有下文SEQ ID NO:21中例示的核酸序列或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶脱氧木酮糖5-磷酸合成酶来源于自产乙醇梭菌,由SEQ IDNO:1中例示的核酸序列编码和/或具有下文SEQ ID NO:2中例示的氨基酸序列,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:3中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:5中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:7中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:9中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:11中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:13中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶甲羟戊酸激酶(MK)来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50且由下文SEQ ID NO:51中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50且由下文SEQ ID NO:52中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50且由下文SEQ ID NO:53中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)来源于拜氏梭菌且由下文SEQID NO:54中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶硫解酶(thIA)来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824且由下文SEQ IDNO:40中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶为硫解酶,且为来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50的乙酰基-CoA c-乙酰基转移酶(vraB)且由下文SEQ ID NO:41中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合成酶(HMGS)来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50且由下文SEQ ID NO:42中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶羟甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMGR)来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50且由下文SEQ ID NO:43中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶香叶基转移酶(ispA)来源于大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655的香叶基转移酶(ispA)的核酸由下文SEQ ID NO:56中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶七异戊烯基二磷酸合成酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ IDNO:17中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例,酶聚异戊烯基合成酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:19中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,酶α-法呢烯合成酶(FS)来源于苹果且由下文SEQ ID NO:57中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
微生物中所用的酶和功能变体可通过所属领域技术人员已知的分析鉴别。在特定实施例中,酶异戊二烯合成酶可通过Silver等人(1991,《植物生理学(Plant Physiol.)》97:1588-1591)或Zhao等人(2011,《应用微生物学与生物技术(Appl MicrobiolBiotechnol)》,90:1915-1922)中概述的方法鉴别。在另一特定实施例中,酶法呢烯合成酶可通过Green等人,2007,《植物化学(Phytochemistry)》;68:176-188中概述的方法鉴别。在其它特定实施例中,来自甲羟戊酸途径的酶可通过Cabano等人(1997,《昆虫生物化学与分子生物学(Insect Biochem.Mol.Biol.)》27:499-505)关于HMG-CoA合成酶概述的方法、Ma等人(2011,《代谢工程学(Metab.Engin.)》,13:588-597)关于HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶概述的方法、Herdendorf和Miziorko(2007,《生物化学(Biochemistry,)》,46:11780-8)关于磷酸甲羟戊酸激酶概述的方法和Krepkiy等人(2004,《蛋白质科学(Protein Sci.)》13:1875-1881)关于甲羟戊酸二磷酸脱羧酶概述的方法鉴别。Ma等人,2011,《代谢工程学Metab.Engin.,》13:588-597。DXS途径的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶可使用Kuzuyama等人(2000,《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》182,891-897)分析。如Trutko等人(2005,《微生物学(Microbiology)》74:153-158)所述,也可使用如磷霉素或甲维林的抑制剂来鉴别DXS和甲羟戊酸途径的基因。
在一个实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其适于增加一种或多种内源核酸的表达,且所述一种或多种内源核酸编码前文所提及的一种或多种酶。在一个实施例中,适于增加表达的一个或多个外源核酸为调节元件。在一个实施例中,调节元件为启动子。在一个实施例中,启动子为组成型启动子,优选在适当发酵条件下具有高活性。也可使用诱导型启动子。在优选实施例中,启动子选自包含伍德-永达尔基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子的组。所属领域技术人员应了解,其它可指导表达、优选在适当发酵条件下高水平表达的启动子作为例示实施例的替代物将是有效的。
在一个实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其编码且适于表达上文提及的一种或多种酶。在一个实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其编码且适于表达至少两种酶。在其它实施例中,微生物包含一个或多个外源核酸,其编码且适于表达至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或更多种酶。
在一个特定实施例,微生物包含一个或多个外源核酸,其编码本公开的酶或其功能等效变体。
微生物可包含一个或多个外源核酸。在期望用两个或更多个遗传元件(例如基因或调节元件(例如启动子))转化亲本微生物的情况下,其可包含在一个或多个外源核酸上。
在一个实施例中,一个或多个外源核酸为核酸构建体或载体,在一个特定实施例中为质粒,其以任何组合编码前文所提及的一种或多种酶。
外源核酸在亲本微生物转化时可保持染色体外,或可整合至亲本微生物的基因组中。因此,其可包括额外核苷酸序列,其适于帮助整合(例如允许同源重组和靶向整合至宿主基因组中的区域)或表达和复制染色体外构建体(例如复制起点、启动子和其它调节元件或序列)。
在一个实施例中,编码一种或多种如上文所提及的酶的外源核酸将进一步包含适于促进一种或多种由外源核酸编码的酶表达的启动子。在一个实施例中,启动子为组成型启动子,优选在适当发酵条件下具有高活性。也可使用诱导型启动子。在优选实施例中,启动子选自包含伍德-永达尔基因簇和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子的组。所属领域技术人员应了解,其它可指导表达、优选在适当发酵条件下高水平表达的启动子作为例示实施例的替代物将是有效的。
在一个实施例中,外源核酸为表达质粒。
在一个特定实施例中,亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌的组。在某些实施例中,微生物选自包含以下的组:自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、生产布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、银醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和基伍嗜热厌氧杆菌。
在一个特定实施例中,亲本微生物选自包含物种自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的产乙醇、产乙酸梭菌纲的簇和相关分离株。这些包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)\[Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:《自产乙醇梭菌新物种,从一氧化碳生产乙醇的厌氧细菌(Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacteriumthat produces ethanol from carbon monoxide.)》《微生物学档案》1994,4:345-351]、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)\[Simpson SD,Forster RL,Tran PT,Rowe MJ,Warner IL:《新颖细菌及其方法(Novel bacteria and methods thereof.)》国际专利2009,WO/2009/064200]、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、扬氏梭菌PETCT(DSM13528=ATCC 55383)\[Tanner RS,Miller LM,Yang D:《扬氏梭菌新物种,梭菌rRNA同源第I组中的产乙酸物种(Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNAHomology Group I.)》《国际***细菌学杂志》1993,43:232-236]、扬氏梭菌ERI-2(ATCC55380)\[Gaddy JL:《从废气生产乙酸的梭菌菌株(Clostridium stain which producesacetic acid from waste gases.)》美国专利1997,5,593,886]、扬氏梭菌C-01(ATCC55988)\[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:《制备乙酸的微生物方法以和用于从发酵液提取乙酸的溶剂(Microbial process for the preparation of acetic acid as well assolvent for its extraction from the fermentation broth.)》美国专利2002,6,368,819]、扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)\[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:《制备乙酸的微生物方法以和用于从发酵液提取乙酸的溶剂》美国专利2002,6,368,819]、拉氏梭菌P11T(ATCCBAA-622)\[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:《新颖梭菌物种的分离和表征(Isolationand Characterization of novel Clostridial Species.)》国际专利2008,WO 2008/028055]、相关分离物,例如“克萨氏梭菌”\[Zahn等人-新颖产乙醇物种克萨氏梭菌(Novelethanologenic species Clostridium coskatii)(美国专利申请案第US20110229947号)]和“梭菌属种”(Tyurin等人,2012,《生物技术研究杂志(J.Biotech Res.)》4:1-12),或突变菌株,例如扬氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.《使用扬氏梭菌从合成气生产生物乙醇(Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii)》博士论文,北卡罗来纳州立大学,2010)。这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成子簇,且其16SrRNA基因超过99%一致,具有约30%的类似低GC含量。然而,DNA-DNA重新关联和DNA指纹实验表明,这些菌株属于不同的物种\[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:《新颖梭菌物种的分离和表征》国际专利2008,WO 2008/028055]。
所述簇的所有物种均具有相似的形态和大小(对数生长的细胞在0.5-0.7×3-5μm之间),为嗜中温的(最优选生长温度在30-37℃之间)和严格厌氧菌(Tanner RS,MillerLM,Yang D:《扬氏梭菌新颖物种,梭菌rRNA同源第I组中的产乙酸物种》《国际***细菌学杂志》1993,43:232-236;Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:《自产乙醇梭菌新颖物种,从一氧化碳生产乙醇的厌氧细菌》《微生物学档案》1994,4:345-351;Huhnke RL,Lewis RS,TannerRS:《新颖梭菌物种的分离和表征》国际专利2008,WO 2008/028055]。此外,其均具有相同的主要***发育性状,例如相同的pH值范围(pH4-7.5,最优选初始pH值为5.5-6),在含CO气体上的强自养生长,生长速率相似和代谢概况相似,以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物且在某些条件下形成少量2,3-丁二醇和乳酸。\[Tanner RS,Miller LM,Yang D:《扬氏梭菌新物种,梭菌rRNA同源第I组中的产乙酸物种》《国际***细菌学杂志》1993,43:232-236;AbriniJ,Naveau H,Nyns E-J:《自产乙醇梭菌新颖物种,从一氧化碳生产乙醇的厌氧细菌》《微生物学档案》1994,4:345-351;Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:《新颖梭菌物种的分离和表征》国际专利2008,WO 2008/028055]。在所有三个物种中还观察到吲哚生产。然而,所述物种在各种糖(例如鼠李糖、***糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用方面存在差异。此外,发现一些物种对某些维生素(例如硫胺素、生物素)为营养缺陷型,而其它则不是。
在一个实施例中,亲本一氧化碳营养型产乙酸微生物选自由以下组成的组:自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、粘液丁酸杆菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、生产布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌和基伍嗜热厌氧杆菌。
在第一或第二方面的一个特定实施例中,亲本微生物选自包含以下的一氧化碳营养型梭菌纲组:自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌。
在一个实施例中,微生物选自包含物种自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和“拉氏梭菌”的一氧化碳营养型梭菌纲的簇和相关分离株。这些包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau和Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、扬氏梭菌PETCT(DSM13528=ATCC 55383)(Tanner,Miller和Yang,1993)、扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、扬氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)或“拉氏梭菌P11T”(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055),和相关分离株,例如“克萨氏梭菌”(美国专利2011/0229947)、“梭菌属种MT351”(Michael Tyurin及Kiriukhin,2012)和其突变菌株,例如扬氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.《使用扬氏梭菌从合成气生产生物乙醇》博士论文,北卡罗来纳州立大学,2010)。
这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成子簇(Collins等人,1994),在16S rRNA基因水平上具有至少99%一致性,尽管通过DNA-DNA重新关联和DNA指纹实验确定为不同的物种(WO2008/028055,美国专利2011/0229947)。
此簇的菌株由共同特征定义,具有相似的基因型和表型,且其均具有相同的能量守恒和发酵代谢模式。此簇的菌株缺乏细胞色素且经由Rnf复合物保存能量。
此簇的所有菌株的基因组大小为约4.2MBp(等人,2010),GC组成为约32mol%(Abrini等人,1994;/>等人,2010;Tanner等人,1993)(WO 2008/028055;美国专利2011/0229947)且具有编码伍德-永达尔途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸环水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰基-CoA合成酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合物(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶、醛:铁氧化还原蛋白氧化还原酶的保守必需关键基因操纵子(/>等人,2010,2011)。尽管核酸和氨基酸序列存在差异,但已发现负责气体吸收的伍德-永达尔途径基因的组织和数量在所有物种中相同(/>等人,2011)。
所述菌株均具有相似的形态和大小(对数生长的细胞在0.5-0.7×3-5μm之间),为嗜中温的(最优选生长温度在30-37℃之间)和严格厌氧菌(Abrini等人,1994;Tanner等人,1993)(WO 2008/028055)。此外,其均具有相同的主要***发育性状,例如相同的pH值范围(pH4-7.5,最优选初始pH值为5.5-6),在含CO气体上的强自养生长,生长速率相似和代谢概况相似,以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物且在某些条件下形成少量2,3-丁二醇和乳酸(Abrini等人,1994;等人,2011;Tanner等人,1993)。然而,所述物种在各种糖(例如鼠李糖、***糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用方面存在差异。发现一些物种对某些维生素(例如硫胺素、生物素)为营养缺陷型,而其它则不是。在一系列这些生物体中,已显示出将羧酸还原成其相应的醇(Perez,Richter,Loftus和Angenent,2012)。
因此,所描述的性状并非如自产乙醇梭菌或扬氏梭菌的生物体所特有的,而是一氧化碳营养型乙醇合成梭菌纲的一般性状。因此,可预计本公开在这些菌株中均能发挥作用,尽管在性能上可能存在差异。
本公开的重组一氧化碳营养型产乙酸微生物可使用所属领域中已知用于产生重组微生物的任何数目的技术由亲本一氧化碳营养型产乙酸微生物和一种或多种外源核酸制备。仅举例来说,转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、电融合、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、结合或化学和天然感受态来实现。适合的转化技术描述于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:《分子克隆:实验室手册》,Cold Spring Harbour LaboratoryPress,Cold Spring Harbour,1989中。
电穿孔已被描述用于数种一氧化碳营养型产乙酸菌,如扬氏梭菌(等人,2010;Leang,Ueki,Nevin和Lovley,2012)(PCT/NZ2011/000203;WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203;WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌(/>Sauer,Kuhn和Dürre,1994)或热醋酸穆尔氏菌(Kita等人,2012)且为用于许多梭菌纲的标准方法,例如丙酮丁醇梭菌(Mermelstein,Welker,Bennett和Papoutsakis,1992)、解纤维素梭菌(Jennert,Tardif,Young和Young,2000)或热纤梭菌(MV Tyurin,Desai和Lynd,2004)。
电融合已被描述用于产乙酸梭菌MT351(Tyurin和Kiriukhin,2012)。
原噬菌体Prasanna Tamarapu Parthasarathy诱导已被描述用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及粪味梭菌(,2010,《在粪味梭菌ATCC 25775中开发基因修饰***用于产生突变体(Development of a Genetic Modification Systemin Clostridium scatologenesATCC 25775for Generation of Mutants)》,西肯塔基大学硕士项目)。
结合已描述为产乙酸菌艰难梭菌(Herbert,O'Keeffe,Purdy,Elmore和Minton,2003)和许多其它梭菌纲包括丙酮丁醇梭菌(Williams,Young和Young,1990)的首选方法。
在一个实施例中,亲本菌株使用CO作为其唯一的碳和能量来源。
在一个实施例中,亲本微生物为自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个特定实施例中,微生物为自产乙醇梭菌DSM23693。在另一特定实施例中,微生物为扬氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
核酸
本公开还提供一种或多种用于产生本公开的重组微生物的核酸或核酸构建体。
在一个实施例中,核酸包含编码甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的序列,当在微生物中表达时,允许微生物通过发酵包含CO的底物生产一种或多种萜烯和/或其前体。在一个特定实施例中本公开提供编码两种或更多种酶的核酸,当在微生物中表达时,允许微生物通过发酵包含CO的底物生产一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施例中,本公开的核酸编码三种、四种、五种或更多种此类酶。
在一个实施例中,由核酸编码的一种或多种酶来自甲羟戊酸(MVA)途径且选自由以下组成的组:
a)硫解酶(EC 2.3.1.9),
b)HMG-CoA合成酶(EC 2.3.3.10),
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88),
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36),
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2),
f)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33),和
g)其中任一者的功能等效变体。
在另一实施例中,由核酸编码的一种或多种任选的酶来自DXS途径且选自由以下组成的组:
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(EC:2.2.1.7),
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267),
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60),
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148),
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12),
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1),
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2),和
h)其中任一者的功能等效变体。
在另一实施例中,核酸编码一种或多种其它酶,所述酶经表达或过度表达以导致生产萜烯化合物和/或其前体,其中表达的外源酶或过度表达的内源酶选自由以下组成的组:
a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10),
b)七异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.10),
c)八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90),
d)异戊二烯合成酶(EC 4.2.3.27),
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2),
f)法呢烯合成酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47),和
g)其中任一者的功能等效变体。
编码上述酶中的每一者的示范性氨基酸序列和核酸序列提供于本文中或可获自GenBank,如上文所提及。然而,考虑到本文、GenBank和其它数据库中所含的信息以及遗传密码,技术人员将容易理解编码所述酶或其功能等效变体的替代核酸序列。
在另一实施例中,编码来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824的硫解酶(thIA)的核酸由下文SEQ ID NO:40中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码硫解酶的核酸由下文SEQ ID NO:41中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体,其中所述硫解酶为来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50的乙酰基-CoA c-乙酰基转移酶(vraB)。
在另一实施例中,编码来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50的3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合成酶(HMGS)的核酸由下文SEQ ID NO:42中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50的羟甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMGR)的核酸由下文SEQ ID NO:43中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50的甲羟戊酸激酶(MK)的核酸由下文SEQ ID NO:51中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50的磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸由下文SEQ ID NO:52中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于金黄色葡萄球菌金黄亚种Mu50的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)的核酸由下文SEQ ID NO:53中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于自产乙醇梭菌的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶的核酸由SEQ ID NO:1中例示的核酸序列编码和/或具有下文SEQ ID NO:2中例示的氨基酸序列,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)的核酸具有序列SEQ ID NO:3,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)的核酸具有序列SEQ ID NO:5,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)的核酸具有序列SEQ ID NO:7,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合成酶IspF(EC:4.6.1.12)的核酸具有序列SEQ ID NO:9,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶IspG(EC:1.17.7.1)的核酸具有序列SEQ ID NO:11,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)的核酸具有序列SEQ ID NO:13,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655的香叶基转移酶(ispA)的核酸由下文SEQ ID NO:56中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码七异戊烯基二磷酸合成酶的核酸具有序列SEQ ID NO:17,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码八异戊烯基二磷酸合成酶(EC:2.5.1.90)的核酸,其中八异戊烯基二磷酸合成酶为聚异戊烯基合成酶,由序列SEQ ID NO:19编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,编码来源于美洲山杨的异戊二烯合成酶(ispS)的核酸例示于下文SEQ ID NO:21中,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于拜氏梭菌的异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)的核酸由下文SEQ ID NO:54中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在另一实施例中,编码来源于苹果的α-法呢烯合成酶(FS)的核酸由下文SEQ IDNO:57中例示的核酸序列编码,或为其功能等效变体。
在一个实施例中,本公开的核酸将进一步包含启动子。在一个实施例中,启动子允许基因在其控制下的组成性表达。然而,也可采用诱导型启动子。所属领域技术人员将容易理解本公开中使用的启动子。优选地,启动子可在适当发酵条件下引导高水平表达。在一个特定实施例中,使用伍德-永达尔簇启动子。在另一实施例中,使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施例中,丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子或ATP合成酶操纵子启动子。在一个特定实施例中,启动子来自自产乙醇梭菌。
本公开的核酸在亲本微生物转化时可保持在染色体外,或可适于整合至微生物的基因组中。因此,本公开的核酸可包括额外核苷酸序列,其适于帮助整合(例如允许同源重组和靶向整合至宿主基因组中的区域)或稳定表达和复制染色体外构建体(例如复制起点、启动子和其它调节序列)。
在一个实施例中,核酸为核酸构建体或载体。在一个特定实施例中,核酸构建体或载体为表达构建体或载体,然而本公开涵盖其它构建体和载体,例如用于克隆的构建体和载体。在一个特定实施例中,表达构建体或载体为质粒。
应了解,必要时,本公开的表达构建体/载体除启动子以及适用于表达其它蛋白质的其它基因之外,也可含有任何数目的调节元件。在一个实施例中,表达构建体/载体包括一个启动子。在另一实施例中,表达构建体/载体包括两个或更多个启动子。在一个特定实施例中,表达构建体/载体包括每个有待表达的基因的一个启动子。在一个实施例中,表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点,优选为每个有待表达的基因的核糖体结合位点。
所属领域技术人员应了解,本文所述的核酸序列和构建体/载体序列可含有标准连接子核苷酸,例如核糖体结合位点和/或限制位点所需的连接子核苷酸。此类连接子序列不应解释为必需的且不提供对所定义序列的限制。
核酸和核酸构建体,包括本公开的表达构建体/载体可使用所属领域中任何数目的标准技术构建。举例来说,可使用化学合成或重组技术。此类技术描述于例如Sambrook等人(《分子克隆:实验室手册》,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989)中。其它示范性技术描述于之后的本文实例部分中。基本上,个别基因和调节元件将可操作地彼此连接,使得基因可表达形成所需蛋白质。所属领域的一般技术人员应了解适用于本公开的载体。然而,举例来说,以下载体可为适合的:pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750和下文实例部分中例示的质粒。
应了解,本公开的核酸可呈任何适当形式,包括RNA、DNA或cDNA。
本公开还提供包含本文所述的核酸中的任一者或多者的宿主生物体,尤其微生物,且包括病毒、细菌和酵母菌。
产生生物体的方法
一种或多种外源核酸可以裸核酸形式递送至亲本微生物,或可与一种或多种药剂一起调配以有助于转化过程(例如,脂质结合核酸、含有核酸的生物体)。一种或多种核酸可为DNA、RNA或其组合,视情况而定。在某些实施例中可使用限制性抑制剂;参见例如Murray,N.E.等人(2000)《分子与细胞生物学评论(Microbial.Molec.Biol.Rev.)》64,412。
本公开的微生物可使用所属领域中已知用于产生重组微生物的任何数目的技术由亲本微生物和一个或多个外源核酸制备。仅举例说明,转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或结合来实现。合适的转化技术例如描述于Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:分子克隆(Molecular Cloning):实验室手册(A laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour LaboratoryPress),冷泉港(Cold Spring Harbour),1989中。
在某些实施例中,由于在待转化微生物中具有活性的限制***,有必要将待引入微生物中的核酸甲基化。此可使用多种技术进行,包括下文所描述的那些技术,且进一步例示于下文实例部分中。
举例来说,在一个实施例中,本公开的重组微生物通过包含以下步骤的方法产生:
b)将(i)如本文所述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入穿梭微生物中;
c)表达甲基转移酶基因;
d)从穿梭微生物中分离一个或多个构建体/载体;和
e)将一个或多个构建体/载体引入目标微生物中。
在一个实施例中,组成性表达步骤B的甲基转移酶基因。在另一实施例中,诱导步骤B的甲基转移酶基因的表达。
穿梭微生物为促进构成表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微生物,优选为限制阴性微生物。在特定实施例中,穿梭微生物为限制阴性大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
一旦表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物中,那么诱导存在于甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因。诱导可通过任何合适的启动子***实现,但在本公开的一个特定实施例中,甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子且通过添加乳糖等,更优选地为异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7***。在本公开的另一实施例中,甲基化构建体/载体启动子为组成型启动子。
在一个特定实施例中,甲基化构建体/载体具有对穿梭微生物的一致性具有特异性的复制起点,使得存在于甲基化构建体/载体上的任何基因表达于穿梭微生物中。优选地,表达构建体/载体具有对目的微生物的一致性具有特异性的复制起点,使得存在于表达构建体/载体上的任何基因表达于目的微生物中。
甲基转移酶的表达导致存在于表达构建体/载体上的基因的甲基化。表达构建体/载体可接着根据多种已知方法中的任一者从穿梭微生物分离。仅举例说明,下文所描述的实例部分中所描述的方法可用于分离表达构建体/载体。
在一个特定实施例中,两个构建体/载体同时分离。
可使用任何数目的已知方法将表达构建体/载体引入至目的微生物中。然而,举例说明,可使用下文实例部分中所描述的方法。由于表达构建体/载体经甲基化,因此存在于表达构建体/载体上的核酸序列能够并入至目的微生物中且成功地表达。
据设想,可将甲基转移酶基因引入至穿梭微生物中且过度表达。因此,在一个实施例中,所得甲基转移酶可使用已知方法收集且体外用于甲基化表达质粒。可接着将表达构建体/载体引入至目的微生物中以用于表达。在另一实施例中,将甲基转移酶基因引入至穿梭微生物的基因组中,随后将表达构建体/载体引入至穿梭微生物中,从穿梭微生物分离一个或多个构建体/载体,且接着将表达构建体/载体引入至目的微生物中。
据设想,如上文所定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可组合以提供物质组合物。此组合物在避开限制屏障机制以产生本公开的重组微生物方面具有特定效用。
在一个特定实施例中,表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体为质粒。
所属领域的一般技术人员将了解用于产生本公开的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而,举例说明,可使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和后文实例中所描述的甲基转移酶。在一个实施例中,甲基转移酶具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列或为其功能等效变体。考虑到所需甲基转移酶和基因密码的序列,将容易了解编码合适的甲基转移酶的核酸。在一个实施例中,编码甲基转移酶的核酸如下文实例中所述(例如SEQ ID NO:63的核酸,或为其功能等效变体)。
适于允许表达甲基转移酶基因的任何数目的构建体/载体可用于产生甲基化构建体/载体。然而,举例来说,可使用下文实例部分中所述的质粒。
生产方法
本公开提供一种通过微生物发酵生产一种或多种萜烯和/或其前体且任选地生产一种或多种其它产物的方法,其包含使用本公开的重组微生物发酵包含CO的底物。优选地,一种或多种萜烯和/或其前体为主要发酵产物。本公开的方法可用于减少来自工业过程的总大气碳排放。
优选地,发酵包含使用本公开的重组微生物在生物反应器中厌氧发酵底物以生产至少一种或多种萜烯和/或其前体的步骤。
在一个实施例中,一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
代替直接从萜类关键中间物IPP和DMAPP生产异戊二烯,随后用其合成长链萜烯,也可直接经由香叶基转移酶合成长链萜烯,例如C10单萜类或C15倍半萜类(参见表6)。从C15倍半萜类结构单元法呢基-PP可生产法呢烯,其与乙醇类似,可用作运输燃料。
在一个实施例中,所述方法包含以下步骤:
(a)将包含CO的底物提供至含有本公开的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中;和
(b)厌氧发酵生物反应器中的培养物以生产至少一种或多种萜烯和/或其前体。
在一个实施例中,所述方法包含以下步骤:
a)捕获由于工业过程产生的含CO气体;
b)通过含有本公开的一种或多种微生物的培养物对含CO气体进行厌氧发酵以生产至少一种或多种萜烯和/或其前体。
在本发明的一实施例中,通过微生物发酵的气态底物为含有CO的气态底物。气态底物可为作为工业过程的副产物获得或来自一些其它来源(例如来自汽车排出的烟)的含CO废气。在某些实施例中,工业过程选自由以下组成的组:铁类金属产品制造(例如轧钢厂)、非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施例中,含CO气体可在其排放至大气中之前使用任何便利方法从工业过程捕获。CO可为合成气(包含一氧化碳和氢气的气体)的组分。从工业过程产生的CO通常燃烧以产生CO2,且因此本公开在减少CO2温室气体排放和生产用作生物燃料的萜烯方面具有特定效用。取决于含CO气态底物的组成,也可能需要在将其引入发酵之前对其进行处理以去除任何非所需杂质,例如粉尘颗粒。举例来说,可使用已知方法过滤或洗涤气态底物。
应了解,为了使细菌的生长和CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体发生,除了含CO的底物气体之外,需要将适合的液体培养基进料至生物反应器中。底物和培养基可以连续、分批或分批进料方式馈入生物反应器中。培养基将含有足以准许所用微生物生长的维生素和矿物质。适用于使用CO发酵以生产萜烯和/或其前体的厌氧培养基为所属领域中已知的。举例来说,合适的培养基描述为Biebel(2001)。在本公开的一个实施例中,培养基如下文实例部分中所描述。
发酵应理想地在适当的条件下进行,以使CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体发酵发生。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的CO不会变成限制性的最大气体底物浓度和避免产物抑制的最大产物浓度。
另外,常常需要增加底物流的CO浓度(或气态底物中的CO分压),且因此提高CO为底物的发酵反应的效率。在增加的压力下操作允许CO从气相转移至液相的速率显著增加,其中其可由微生物吸收作为碳源以生产至少一种或多种萜烯和/或其前体。此又意谓当生物反应器维持在高压而非大气压力下时,保留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流动速率)可减少。最优选反应条件将部分地取决于所使用的本公开的特定微生物。然而,一般来说,优选的为在高于环境压力的压力下进行发酵。此外,因为既定CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体的转化率部分为底物保留时间的函数,且实现所需保留时间又决定了生物反应器的所需体积,所以使用加压***可大大减小所需生物反应器的体积,且因此降低发酵设备的资金成本。根据美国专利第5,593,886号中给出的实例,反应器体积可与反应器操作压力的增加成线性比例地减小,即在10个大气压下操作的生物反应器仅需要为在1个大气压下操作的那些生物反应器的体积的十分之一。
举例说明,已描述在高压下进行气体至乙醇发酵的益处。举例来说,WO 02/08438描述在30psig和75psig的压力下进行的气体至乙醇发酵,分别得到150g/l/天和369g/l/天的乙醇产率。然而,发现在大气压下使用类似培养基和输入气体组合物进行的实例发酵每天每升产生少10倍与20倍之间的乙醇。
还需要引入含CO的气态底物的速率应确保液相中CO的浓度不变成限制性的。此是因为CO受限条件的结果可为一种或多种产物由培养物消耗。
用于馈入发酵反应的气流的组成可对所述反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说,O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵过程的阶段中,在发酵之前或之后对不需要的或不必要的气体进行处理会增加此类阶段的负担(例如当气流在进入生物反应器之前被压缩时,不必要的能量可能用于压缩发酵中不需要的气体)。因此,可能需要处理底物流,尤其衍生自工业来源的底物流,以去除非所需组分且增加所需组分的浓度。
在某些实施例中,本公开的细菌的培养物维持于水性培养基中。优选地,水性培养基为基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基为所属领域中已知的且描述于例如美国专利第5,173,429号和第5,593,886号以及WO 02/08438中,且如下文实例部分中所描述。
萜烯和/或其前体或含有一种或多种萜烯、其前体和/或一种或多种其它产物的混合流可通过所属领域中已知的方法从发酵液回收,所述方法例如分馏或蒸发、渗透蒸发、气体汽提及萃取发酵,包括例如液-液萃取。
在本公开的某些优选实施例中,一种或多种萜烯和/或其前体和一种或多种产物通过以下步骤从发酵液回收:从生物反应器连续移出培养液的一部分,从所述培养液分离微生物细胞(宜通过过滤进行),和从所述培养液回收一种或多种产物。醇可适宜地例如通过蒸馏回收。丙酮可例如通过蒸馏回收。所产生的任何酸可例如通过吸附于活性炭上来回收。所分离微生物细胞优选地返回至发酵生物反应器。在去除任何醇和酸之后剩余的不含细胞的渗透物还优选地返回至发酵生物反应器中。可将额外营养物(例如B维生素)添加至不含细胞的渗透物中以在渗透物返回至生物反应器之前补充营养培养基。
此外,如果如上文所描述调节培养液的pH以增强乙酸对活性炭的吸附,那么在返回至生物反应器之前,应将pH重新调节至与发酵生物反应器中的培养液的pH类似的pH。
用于异戊烯醇/异戊二烯醇途径的酶(表3):
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实例
现将参考以下非限制性实例更详细地描述本公开。
实例1-在自产乙醇梭菌中表达异戊二烯合成酶以从CO生产异戊二烯
本发明人已在例如自产乙醇梭菌和扬氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌中鉴别出萜烯生物合成基因重组生物体经工程改造以生产异戊二烯。一些植物例如杨树会自然释放异戊二烯,以保护其叶子免受UV辐射。杨树的异戊二烯合成酶(EC 4.2.3.27)基因经密码子优化且引入一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌中,以从CO生产异戊二烯。所述酶将萜类生物合成的关键中间物DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)以不可逆反应转化为异戊二烯(图1)。
菌株和生长条件:
所有次克隆步骤均在大肠杆菌中使用标准菌株和生长调节进行,如前所述(Sambrook等人,《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A laboratory Manual)》,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,1989;Ausubel等人,《分子生物学现代方法(Current protocols in molecular biology)》,John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。
自产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生物)获自DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany)。使用严格的厌氧条件和技术在37℃下进行生长(Hungate,1969,Methods in Microbiology,vol.3B.Academic Press,New York:117-132;Wolfe,1971,Adv.Microb.Physiol.,6:107-146)。使用无酵母提取物的化学成分确定的PETC培养基(表1)和含有30psi一氧化碳的轧钢厂废气(收集自新西兰Glenbrook的新西兰钢铁厂;组成:44% CO、32% N2、22%CO2、2%H2)作为唯一的碳和能量来源。
表1
培养基组分 每1.0L培养基的浓度
NH4Cl 1g
KCl 0.1g
MgSO4.7H2O 0.2g
NaCl 0.8g
KH2PO4 0.1g
CaCl2 0.02g
痕量金属溶液 10ml
沃尔夫氏维生素溶液 10ml
刃天青(2g/L储备液) 0.5ml
NaHCO3 2g
还原剂 0.006-0.008%(v/v)
蒸馏水 补足至1L,pH 5.5(用HCl调节)
沃尔夫氏维生素溶液 每升储备液
生物素 2mg
叶酸 2mg
盐酸吡哆醇 10mg
核黄素 5mg
烟碱酸 5mg
D-(+)-泛酸钙 5mg
维生素B12 0.1mg
对氨基苯甲酸 5mg
硫辛酸 5mg
硫胺素 5mg
蒸馏水 补足至1L
还原剂储备液 每100mL储备液
NaOH 0.9g
半胱氨酸盐酸盐 4g
Na2S 4g
蒸馏水 补足至100mL
表达质粒的构建:
在本公开中使用标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,1989;Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG,Smith JA,Struhl K:Current protocols in molecularbiology.John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。美洲山杨的异戊二烯合成酶(AAQ16588.1;GI:33358229)经密码子优化(SEQ ID NO:21)且合成。使用自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶的启动子区(SEQ ID NO:22)来表达所述基因。
使用Bertram和Dürre(1989)的改进方法分离自产乙醇梭菌DSM23693的基因组DNA。收获100ml过夜培养物(6,000×g,15min,4℃),用磷酸钾缓冲液(10mM,pH 7.5)洗涤且悬浮于1.9ml STE缓冲液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,200mM蔗糖;pH 8.0)中。添加300μl溶菌酶(约100,000U)且将混合物在37℃下培育30分钟,接着添加280μl 10%(w/v)SDS且再培育10分钟。在室温下,通过添加240μl EDTA溶液(0.5M,pH8)、20μl Tris-HCl(1M,pH 7.5)和10μl RNase A(Fermentas Life Sciences)消化RNA。随后,添加100μl蛋白酶K(0.5U)且在37℃下进行蛋白水解1-3小时。最后,添加600μl过氯酸钠(5M),接着进行苯酚-氯仿萃取和异丙醇沉淀。以分光光度法检查DNA数量和品质。丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子序列使用寡核苷酸Ppfor-NotI-F(SEQ ID NO:23:AAGCGGCCGCAAAATAGTTGATAATAATGC)和Ppfor-NdeI-R(SEQ ID NO:24:TACGCATATGAATTCCTCTCCTTTTCAAGC)使用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad Laboratories)和以下程序通过PCR扩增:在98C℃下初始变性30秒,接着为32个循环的变性(98℃持续10秒)、退火(50-62℃持续30-120秒)和延伸(72℃持续30-90秒),随后为最终延伸步骤(72℃持续10分钟)。
异戊二烯合成酶表达质粒的构建:
在大肠杆菌DH5α-T1R(Invitrogen)和XL1-Blue MRF'Kan(Stratagene)中进行表达质粒的构建。在第一步骤中,使用NotI和NdeI限制位点将扩增的Ppfor启动子区克隆至大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL85141(FJ797651.1;Nigel Minton,University ofNottingham;Heap等人,2009)中,产生质粒pMTL85146。作为第二步骤,使用限制位点NdeI和EcoRI将ispS克隆至pMTL85146中,产生质粒pMTL 85146-ispS(图2,SEQ ID NO:25)。
自产乙醇梭菌中的转化和表达
在转化之前,如美国专利2011/0236941中所述,使用由自产乙醇梭菌、拉氏梭菌和扬氏梭菌的甲基转移酶基因设计的甲基化质粒(SEQ ID NO:64)上共表达的合成杂交II型甲基转移酶(SEQ ID NO:63)在大肠杆菌中对DNA进行体内甲基化。
表达质粒和甲基化质粒均转化至限制性阴性大肠杆菌XL1-Blue MRF'Kan(Stratagene)的相同细胞中,此可能归因于其相容性革兰氏(-)复制起点(表达质粒中的高拷贝ColE1和甲基化质粒中的低拷贝p15A)。通过添加1mM IPTG诱导体内甲基化,且使用QIAGEN质粒中提试剂盒(QIAGEN)分离甲基化质粒。所得混合物用于自产乙醇梭菌DSM23693的转化实验,但仅丰富的(高拷贝)表达质粒具有革兰氏(+)复制起点(repL),允许其在梭菌纲中复制。
转化至自产乙醇梭菌中:
在完全转化实验期间,自产乙醇梭菌DSM23693在补充有1g/L酵母提取物和10g/L果糖以及30psi轧钢厂废气(收集自新西兰Glenbrook的新西兰钢铁厂;组成:44% CO、32%N2、22% CO2、2% H2)作为碳源的PETC培养基(表1)中生长。
为了制备胜任细胞,将50ml自产乙醇梭菌DSM23693培养物继代培养至新鲜培养基中连续3天。这些细胞用于接种含有40mM DL-苏氨酸的50ml PETC培养基,OD600nm为0.05。当培养物的OD600nm达到0.4时,将细胞转移至厌氧室中且在4,700×g和4℃下收获。培养物用冰冷的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠,pH 7.4)洗涤两次,且最后悬浮于600μl体积的新鲜电穿孔缓冲液中。将此混合物转移至电极间隙为0.4cm、含有1μg甲基化质粒混合物的预冷的电穿孔光析槽中,且立即使用Gene pulser Xcell电穿孔***(Bio-Rad)进行脉冲,设置如下:2.5kV、600Ω和25μF。实现3.7-4.0ms的时间常量。将培养物转移至5ml新鲜培养基中。使用配备有试管支架的Spectronic Helios Epsilon分光光度计(Thermo)在600nm的波长下监测细胞的再生。在生物质最初下降后,细胞再次开始生长。一旦生物质从所述点翻倍,那么收获细胞,将其悬浮于200μl新鲜培养基中且接种在具有适当抗生素4μg/ml克拉霉素或15μg/ml甲砜霉素的选择性PETC板(含有1.2%BactoTM琼脂(BD))上。在37℃下用30psi轧钢厂气体接种4-5天后,可见菌落。
菌落用于接种2ml具有抗生素的PETC培养基。当发生生长时,将培养物按比例扩大至5ml和后来的50ml体积,其中30psi轧钢厂气体作为唯一的碳源。
确认成功转化:
为了验证DNA转移,使用Zyppy质粒微型制备试剂盒(Zymo)由10ml培养体积进行质粒微型制备。由于梭菌外切核酸酶活性导致分离质粒的品质不足以进行限制性消化\[Burchhardt和Dürre,1990],因此用分离质粒与寡核苷酸对colE1-F(SEQ ID NO:65:CGTCAGACCCCGTAGAAA)加colE1-R(SEQ ID NO:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)进行PCR。使用iNtRON Maximise Premix PCR kit(Intron Bio Technologies)进行PCR,条件如下:在94℃下初始变性2分钟,接着为35个循环的变性(94℃持续20秒)、退火(55℃持续20秒)和延伸(72℃持续60秒),随后为最终延伸步骤(72℃持续5分钟)。
为了确认克隆的身份,从50ml自产乙醇梭菌DSM23693培养物中分离基因组DNA(参见上文)。使用寡核苷酸fD1(SEQ ID NO:67:CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和rP2(SEQ ID NO:68:CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT)\[Weisberg等人,1991]和iNtRON Maximise Premix PCR试剂盒(Intron Bio Technologies)对16s rRNA基因进行PCR,条件如下:在94℃下初始变性2分钟,接着为35个循环的变性(94℃持续20秒)、退火(55℃持续20秒)和延伸(72℃持续60秒),随后为最终延伸步骤(72℃持续5分钟)。测序结果与自产乙醇梭菌(Y18178,GI:7271109)的16s rRNA基因(rrsA)至少99.9%一致。
异戊二烯合成酶基因的表达
进行qRT-PCR实验以确认引入的异戊二烯合成酶基因在自产乙醇梭菌中成功表达。
携带异戊二烯合成酶质粒pMTL 85146-ispS的培养物和无质粒的对照培养物在50mL血清瓶和PETC培养基(表1)中生长,以30psi轧钢厂废气(收集自新西兰Glenbrook的新西兰钢铁厂;组成:44% CO、32% N2、22%CO2、2% H2)作为唯一的能量和碳源。在对数生长期取0.8mL样品,OD600nm为约0.5,且与1.6mL RNA保护试剂(Qiagen)混合。将混合物离心(6,000×g,5min,4℃),将细胞沉淀物在液氮中速冻且存储于-80℃下,直至RNA提取。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)根据手册的方案5分离总RNA。通过使混合物通过注射器10次进行细胞破坏,且在50μL无RNase/DNase的水中洗脱。使用DNA-freeTM试剂盒(Ambion)进行DNase I处理后,接着使用SuperScript III反转录酶试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行反转录步骤。使用Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies,SantaClara,CA,USA)、Qubit萤光计(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)且通过凝胶电泳检查RNA。对每个寡核苷酸对进行非RT对照。所有qRT-PCR反应均使用MyiQTM单色检测***(Bio-RadLaboratories,Carlsbad,CA,USA)一式两份进行,总反应体积为15μL,具有25ng cDNA模板、67nM每个寡核苷酸(表2)和1x iQTMGreen Supermix(Bio-Rad Laboratories,Carlsbad,CA,USA)。反应条件为95℃持续3分钟,接着为95℃持续15秒、55℃持续15秒和72℃持续30秒的40个循环。为了检测寡核苷酸二聚化或其它扩增假象,在qPCR(在1℃下58℃至95℃的38个循环)完成之后立即进行解链曲线分析。每个cDNA样品包括两个管家基因(鸟苷酸激酶和甲酸四氢叶酸连接酶)用于标准化。使用相对表达软件工具/>2008V2.0.7(38)进行相对基因表达的测定。跨越4个对数单位的cDNA稀释系列用于生成标准曲线和所得扩增效率以计算mRNA浓度。
表2:qRT-PCR的寡核苷酸
虽然没有观察到野生型菌株使用寡核苷酸对ispS的扩增,但携带质粒pMTL85146-ispS的菌株测量到使用ispS寡核苷酸对的信号,证实ispS基因的成功表达。
实例2-表达异戊烯基二磷酸δ-异构酶以在关键萜烯前体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)与IPP(异戊烯基二磷酸)之间进行转化
前体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)和IPP(异戊烯基二磷酸)的可用性和平衡对于萜烯的生产至关重要。虽然DXS途径同样合成IPP和DMAPP,但在甲羟戊酸途径中,唯一的产物为IPP。生产异戊二烯仅需要前体DMAPP与异戊二烯合成酶一起存在,而为了生产高级萜烯和萜类,需要具有等量的IPP和DMAPP可用于通过香叶基转移酶生产香叶基-PP。
异戊烯基二磷酸δ-异构酶表达质粒的构建:
来自拜氏梭菌的编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(YP_001310174.1)的异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi(基因ID:5294264)克隆至ispS下游。所述基因使用寡核苷酸Idi-Cbei-SacI-F(SEQ ID NO:26:GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG)和Idi-Cbei-KpnI-R(SEQ IDNO:27:ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)从使用与上文关于自产乙醇梭菌所述相同的方法获得的拜氏梭菌NCIMB8052的基因组DNA扩增。使用SacI和KpnI限制位点将PCR产物克隆至载体pMTL 85146-ispS中,产生质粒pMTL85146-ispS-idi(SEQ ID NO:28)。使用限制酶PmeI和FseI将抗生素抗性标记从catP交换至ermB(从载体pMTL82254(FJ797646.1;NigelMinton,University of Nottingham;Heap等人,2009)释放,形成质粒pMTL85246-ispS-idi(图3)。
在自产乙醇梭菌中的转化和表达是根据关于质粒pMTL 85146-ispS所述进行的。在成功转化后,在50mL 50mL血清瓶和PETC培养基(表1)中进行生长实验,以30psi轧钢厂废气(收集自新西兰Glenbrook的新西兰钢铁厂;组成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)作为唯一的能量和碳源。为了确认质粒已成功引入,如先前所述从转化体进行质粒微型制备DNA。使用靶向colE1(colE1-F:SEQ ID NO:65:CGTCAGACCCCGTAGAAA和colE1-R:SEQ ID NO:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)、ermB(ermB-F:SEQ ID NO:106:TTTGTAATTAAGAAGGAG和ermB-R:SEQ ID NO:107:GTAGAATCCTTCTTCAAC)和idi(Idi-Cbei-SacI-F:SEQ ID NO:26:GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG和Idi-Cbei-KpnI-R:SEQ ID NO:27:ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)的寡核苷酸对而对分离的质粒进行的PCR确认转化成功(图8)。类似地,从这些转化体中提取基因组DNA,且使用寡核苷酸fD1和rP2(参见上文)得到的16s rRNA扩增子证实与自产乙醇梭菌(Y18178,GI:7271109)的16S rRNA基因99.9%一致。
如上所述,使用针对异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi(idi-F,SEQ ID NO:71:ATACGT GCT GTA GTC ATC CAAGAT A和idiR,SEQ ID NO:72:TCT TCAAGT TCACAT GTA AAA CCCA)的寡核苷酸对和来自携带质粒pMTL 85146-ispS-idi的自产乙醇梭菌的血清瓶生长实验的样品进行基因表达的成功确认。还观察到异戊二烯合成酶基因ispS的信号(图14)。
实例3-DXS途径的过度表达
为了提高通过DXS途径的流量,所述途径的基因经过度表达。所述途径的初始步骤是将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)转化为脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP),由脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)催化。
DXS过度表达表达质粒的构建:
如上文关于其它基因所述,用寡核苷酸Dxs-SalI-F(SEQ ID NO:29:GCAGTCGACTTTATTAAAGGGATAGATAA)和Dxs-XhoI-R(SEQ ID NO:30:TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG)从基因组DNA扩增自产乙醇梭菌的dxs基因。随后用SalI和XhoI将扩增对基因克隆至质粒pMTL85246-ispS-idi中,产生质粒pMTL85246-ispS-idi-dxs(SEQ ID NO:31和图4)。使用表3中给出的寡核苷酸进行DNA测序,证实ispS、idi和dxs的成功克隆,没有发生突变(图5)。ispS和idi基因分别如实例1和2中所述。
表3:用于测序的寡核苷酸
自产乙醇梭菌中的转化和表达
在自产乙醇梭菌中的转化和表达是根据关于质粒pMTL 85146-ispS所述进行的。在成功转化后,在50mL 50mL血清瓶和PETC培养基(表1)中进行生长实验,以30psi轧钢厂废气(收集自新西兰Glenbrook的新西兰钢铁厂;组成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)作为唯一的能量和碳源。如上文所述从在OD600nm=0.75时收集的样品中进行基因表达的确认。寡核苷酸对dxs-F(SEQ ID NO:73:ACAAAGTATCTAAGACAGGAGGTCA)和dxs-R(SEQ ID NO:74:GATGTCCCACATCCCATATAAGTTT)用于测量基因dxs在野生型菌株和携带质粒pMTL 85146-ispS-idi-dxs的菌株中的表达。发现与野生型相比,携带质粒的菌株中的mRNA水平增加超过3倍(图15)。在提取RNA之前对生物质进行标准化。
实例4-甲羟戊酸途径的引入和表达
甲羟戊酸途径(图7)的第一步骤由硫解酶催化,所述酶将两分子乙酰基-CoA转化为乙酰乙酰基-CoA(和HS-CoA)。此酶已由同一发明人在一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌和扬氏梭菌中成功表达(美国专利2011/0236941)。已设计甲羟戊酸途径的其余基因的构建体。
甲羟戊酸表达质粒的构建:
使用标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook,J.和Russell,D.,《分子克隆:实验室手册第3版》,Cold Spring Harbour Lab Press,Cold Spring Harbour,NY,2001)。经由甲羟戊酸途径的上部合成甲羟戊酸所需的三个基因,即硫解酶(thlA/vraB)、HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)经密码子优化为操纵子(Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR)。
自产乙醇梭菌的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子(Ppta-ack)(SEQ ID NO:61)用于表达硫解酶和HMG-CoA合成酶,而自产乙醇梭菌的ATP合成酶的启动子区(Patp)用于表达HMG-CoA还原酶。硫解酶的两种变体,即来自丙酮丁醇梭菌的thlA和来自金黄色葡萄球菌的vraB,经合成且侧接NdeI和EcoRI限制位点用于进一步次克隆。HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)均从金黄色葡萄球菌合成且分别侧接EcoRI-SacI和KpnI-XbaI限制位点用于进一步次克隆。所有使用的优化DNA序列在表4中给出。
表4:甲羟戊酸表达质粒的序列
使用寡核苷酸pUC57-F(SEQ ID NO:46:AGCAGATTGTACTGAGAGTGC)和pUC57-R(SEQID NO:47:ACAGCTATGACCATGATTACG)和pUC57-Patp-HMGR作为模板扩增ATP合成酶启动子(Patp)以及羟甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMGR)。2033bp扩增片段用SacI和XbaI消化且连接至大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL 82151(FJ7976;Nigel Minton,University ofNottingham,UK;Heap等人,2009,《微生物学方法杂志(J Microbiol Methods.)》78:79-85),得到质粒pMTL 82151-Patp-HMGR(SEQ ID NO:76)。
使用寡核苷酸EcoRI-HMGS_F(SEQ ID NO:77:AGCCGTGAATTCGAGGCTTTTACTAAAAACA)和EcoRI-HMGS_R(SEQ ID NO:78:AGGCGTCTAGATGTTCGTCTCTACAAATAATT)从密码子合成的质粒pGH-seq3.2扩增3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合成酶(HMGS)。1391bp扩增片段用SacI和EcoRI消化且连接至先前形成的质粒pMTL 82151-Patp-HMGR,得到pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:79)。产生的质粒pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:79)和Pptaack-thlA/vraB的1768bp密码子优化操纵子均用NotI和EcoRI切割。进行连接且随后转化至大肠杆菌XL1-Blue MRF'Kan中,得到质粒pMTL8215-Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)。
经由甲羟戊酸途径的底部由甲羟戊酸合成萜类关键中间物所需的五个基因,即甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)和异戊二烯合成酶(ispS)由ATG:Biosynthetics GmbH(德国梅尔茨豪森)进行密码子优化。甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD)获自金黄色葡萄球菌。
自产乙醇梭菌的RNF复合物(Prnf)的启动子区(SEQ ID NO:62)用于表达甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD),而自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(Pfor)的启动子区(SEQ ID NO:22)用于表达异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)和异戊二烯合成酶(ispS)。使用的所有DNA序列在表5中给出。经密码子优化的Prnf-MK从合成的质粒pGH-Prnf-MK-PMK-PMD用寡核苷酸NotI-XbaI-Prnf-MK_F(SEQID NO:80:ATGCGCGGCCGCTAGGTCTAGA ATATCGATACAGATAAAAAAATATATAATACAG)和SalI-Prnf-MK_R(SEQ ID NO:81:TGGTTCTGTAACAGCGTATTCACCTGC)扩增。随后用NotI和SalI将扩增的基因克隆至质粒pMTL83145(SEQ ID NO:49)中,产生质粒pMTL8314-Prnf-MK(SEQ IDNO:82)。此所得质粒和2165bp密码子优化片段PMK-PMD随后用SalI和HindIII消化。进行连接,得到质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD(SEQ ID NO:83)。
无甲羟戊酸途径的异戊二烯表达质粒通过将侧接限制位点AgeI和NheI的异戊二烯合成酶(ispS)连接至先前形成的法呢烯质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91),产生质粒pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ IDNO:84)而形成。最终异戊二烯表达质粒pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ ID NO:58,图10)通过使用限制位点NotI和XbaI将pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)的4630bp Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR片段与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ ID NO:84)连接而产生。
表5:甲羟戊酸途径的异戊二烯表达质粒序列
实例5-在自产乙醇梭菌中引入法呢烯合成酶以经由甲羟戊酸途径从CO生产法呢烯
代替直接从萜类关键中间物IPP和DMAPP生产异戊二烯,随后用其合成长链萜烯,也可直接经由香叶基转移酶合成长链萜烯,例如C10单萜类或C15倍半萜类(参见表6)。从C15倍半萜类结构单元法呢基-PP可生产法呢烯,其与乙醇类似,可用作运输燃料。
法呢烯表达质粒的构建
经由甲羟戊酸途径从IPP和DMAPP合成法呢烯所需的两个基因,即香叶基转移酶(ispA)和α-法呢烯合成酶(FS)经密码子优化。香叶基转移酶(ispA)获自大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655,且α-法呢烯合成酶(FS)获自苹果。使用的所有DNA序列在表6中给出。经由甲羟戊酸途径idi_F(SEQ ID NO:86:AGGCACTCGAGATGGCAGAGTATATAATAGCAGTAG)和idi_R2(SEQ ID NO:87:AGGCGCAAGCTTGGCGCACCGGTTTATTTAAATA TCTTATTTTCAGC)从合成的质粒pMTL83245-Pfor-FS-idi(SEQ ID NO:85)扩增经密码子优化的idi。随后用XhoI和HindIII将扩增的基因克隆至质粒pMTL83245-Pfor中,产生质粒pMTL83245-Pfor-idi(SEQ ID NO:88)。此所得质粒和法呢烯合成酶(FS)的1754bp密码子优化片段随后用HindIII和NheI消化。进行连接,得到质粒pMTL83245-Pfor-idi-FS(SEQ ID NO:89)。ispA和pMTL83245-Pfor-idi-FS的946bp片段随后用AgeI和HindIII消化且连接以产生所得质粒pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:90)。无上部甲羟戊酸途径的法呢烯表达质粒通过将pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS的2516bp Pfor-idi-ispA-FS片段与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD连接而成,产生质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)。最终法呢烯表达质粒pMTL83145-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:59和图18)通过使用限制位点NotI和XbaI将pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)的4630bp Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR片段与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)连接而成。
表6:甲羟戊酸途径的法呢烯表达质粒序列
转化至自产乙醇梭菌中
如实例1中所述在自产乙醇梭菌中进行转化和表达。
确认转化成功
通过使用选择性地扩增pMTL831xxx系列质粒上的一部分革兰氏阳性复制子和大部分cat基因的寡核苷酸repHF(SEQ ID NO:92:AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT)和catR(SEQID NO:93:TTCGTTTACAAAACGGCAAATGTGA)进行菌落PCR来确认pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:59)的存在。产生1584bp的条带(图16)。
下部甲羟戊酸途径在自产乙醇梭菌中的表达
如上文实例1中所述确认下部甲羟戊酸途径基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊基二磷酸δ-异构酶(idi;SEQ ID NO:54)、香叶基转移酶(ispA;SEQ ID NO:56)和法呢烯合成酶(FS SEQ ID NO:57)的表达。使用表7中列出的寡核苷酸。
表7:用于检测质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)携带的下部甲羟戊酸途径中的基因表达的寡核苷酸列表
确认下部甲羟戊酸途径中所有基因表达的Rt-PCR数据显示在图18中,此数据还概括于表8中。
表8:基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊基二磷酸δ-异构酶(idi SEQ IDNO:54)、香叶基转移酶(ispA SEQ ID NO:56)和法呢烯合成酶(FS SEQ ID NO:57)的平均CT值。
对于取自甲羟戊酸进料实验的两种起始培养物的两个独立样品(参见下文)。
基因 样品1(Ct平均值) 样品2(Ct平均值)
MK 21.9 20.82
PMK 23.64 22.81
PMD 24 22.83
Idi 24.23 27.54
ispA 23.92 23.22
FS 21.28(单Ct) 21.95(单Ct)
HK(rho) 31.5 28.88
从甲羟戊酸生产α-法呢烯
在确认质粒pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS成功转化后,在250ml血清瓶中的50ml PETC培养基(表1)中进行生长实验,以30psi轧钢厂废气(收集自新西兰Glenbrook的新西兰钢铁厂;组成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)作为唯一的能量和碳源。所有培养物均在37℃下在适合固定血清瓶的定轨震荡器上培育。转化体首先生长至OD600为约0.4,随后继代培养至补充有1mM甲羟戊酸的新鲜培养基中。在同一时间从同一培养物中建立无甲羟戊酸的对照。在每个时间点采集用于GC-MS(气相色谱-质谱分析)的样品。图17显示2种对照培养物和两种进料1mM甲羟戊酸的培养物的代表性生长曲线。在实验开始后66小时和90小时采集的样品中检测到法呢烯(图19-21)。
通过气相色谱-质谱分析检测α-法呢烯
对于α-法呢烯的GC-MS检测,通过添加2ml己烷且在密封的玻璃巴氏管中剧烈震荡以混合来对5ml培养物进行己烷提取。随后将管在音波处理水浴中培育5分钟以促进相分离。将400μl己烷提取物转移至GC瓶中且加载至自动加载器上。样品在VARIAN GC3800MS4000离子阱GC/MS(Varian Inc,CA,USA.Now Agilent Technologies)上进行分析,配备膜厚0.25μm的EC-1000柱(Grace Davidson,OR,USA)、Varian MS工作站(Varian Inc,Ca.Now Agilent Technologies,CA,USA)和NIST MS Search 2.0(Agilent Technologies,CA,USA)。进样量为1μl,氦气载气流动速率为1ml/min。
已在本文中参考某些优选实施例描述本公开,以便使读者能够在无不当实验的情况下实践本公开。然而,所属领域的一般技术人员将容易地认识到,在不脱离本公开的范围的情况下,许多组分和参数可一定程度上经改变或修改或经已知等效物取代。应了解,此类修改和等效物并入本文中,如同个别地阐述一般。提供名称、标题等以增强读者对本文件的理解且不应理解为限制本公开的范围。
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除非本文中另外规定或另外明显与上下文矛盾,否则本文中所描述的所有方法可以任何合适的次序执行。除非另外要求保护,否则使用本文中所提供的任何和所有实例或示范性语言(例如,“例如”)仅旨在更好地阐明本公开,且不对本公开的范围造成限制。本说明书中的语言均不应解释为指示任何非要求保护的要素对于本公开的实践为必不可少的。
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Claims (27)

1.一种能够从气态底物生产产品的经基因工程改造的微生物,所述微生物包含编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含至少乙酰基-CoA合成酶和以下中的至少一者:
a)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)酮基-酰基-CoA硫解酶(KAT1),ii)3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)合成酶,iii)甲基戊二酰基-CoA水合酶(MGCH),iv)3-甲基巴豆酰基-CoA羧化酶(MCCC),v)酰基-CoA还原酶(ACOAR),和vi)醇脱氢酶(ADH);
b)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1,ii)HMG-CoA合成酶,iii)MGCH、MCCC,iv)磷酸转丁酰酶丁酸激酶(Ptb-buk),v)乙醛-铁氧化还原蛋白氧化还原酶(AOR),和vi)(ADH);
c)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1或PTAr和ACKr,ii)CoA转移酶A/B(CtfAB),iii)乙酰乙酸脱羧酶(ADC)或ADC和羟基异戊酸合成酶(HIVS),iv)羟基异戊酸硫酯酶(3HBZCT),v)羟基异戊基-CoA水解酶(HPHL),vi)ACOAR,和vii)ADH;
d)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1或PTAr和ACKr,ii)CoA转移酶A/B(CtfAB),iii)ADC或ADC和HIVS,iv)3HBZCT,v)HPHL,vi)Ptb-buk,vii)AOR和ADH;
e)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1,ii)HMG-CoA合成酶,iii)3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶,iv)甲羟戊酸激酶(MK),v)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK),vi)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(DMD),vii)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI),viii)二甲基烯丙基二磷酸激酶(DMPKK),和ix)二甲基烯丙基磷酸激酶(DMPK);
f)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)KAT1,ii)HMG-CoA合成酶,iii)3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶,iv)甲羟戊酸激酶(MK),v)磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMVD),vi)异戊烯基磷酸异构酶(IPI),和vii)异戊二烯基磷酸酶(DMPase);
g)编码一组外源酶的核酸,所述组外源酶包含i)硫解酶、酰基-CoA乙酰基转移酶或聚酮合成酶,ii)β-酮酰基-CoA还原酶或β-羟酰基-CoA脱氢酶,iii)β-羟酰基-CoA脱水酶,iv)反式-烯酰基-CoA还原酶或丁酰基-CoA脱氢酶/电子转移黄素蛋白AB(Bcd-EtfAB),v)形成醇的酰基-CoA还原酶或形成醛的酰基-CoA羧酸还原酶,vi)水解酶或ADH,和vii)醇脱水酶;和
其中所述微生物为固定C1的微生物且所述产品为类异戊二烯醇。
2.根据权利要求1所述的微生物,其中所述类异戊二烯醇为异戊烯醇。
3.根据权利要求1或2所述的微生物,其进一步包含编码一组能够将异戊烯醇转化为异戊二烯醇的外源酶的核酸。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的微生物,其进一步包含编码一组能够将异戊烯醇转化为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的核酸。
5.根据权利要求3或4所述的微生物,其进一步包含编码一组能够将异戊二烯醇转化为异戊烯基二磷酸(IPP)的外源酶的核酸。
6.根据权利要求4或5所述的微生物,其进一步包含编码选自由异戊烯基二磷酸异构酶和香叶基转移酶组成的组的外源酶的核酸。
7.根据权利要求4或5所述的微生物,其进一步包含编码外源酶异戊烯基二磷酸异构酶和香叶基转移酶两者的核酸。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的微生物,其进一步包含编码一组选自柠檬烯合成酶、蒎烯合成酶、法呢烯合成酶或其任何组合的外源酶的核酸。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的微生物,其进一步包含编码包含异戊二烯合成酶的外源酶的核酸。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的微生物,其具有一氧化碳脱氢酶。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的微生物,其进一步包含对DXS途径的破坏性突变。
12.根据权利要求11所述的微生物,其中所述破坏性突变为基因敲除。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的微生物,其中所述外源酶包含至少e)与a)、b)、c)、d)、f)和g)中的任一者或多者串联的组合。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的微生物,其中所述编码外源酶的核酸经密码子优化。
15.根据权利要求1至14中任一权利要求所述的微生物,其中所述编码外源酶的核酸整合至所述微生物的基因组中。
16.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的微生物,其中所述编码外源酶的核酸掺入质粒中。
17.根据权利要求1至16中任一权利要求所述的微生物,其中所述编码外源酶的核酸通过组成型启动子调节。
18.一种用于生产类异戊二烯醇的方法,其通过使用至少一种选自由一氧化碳和二氧化碳组成的组的C1化合物作为碳源培养根据权利要求1所述的微生物,以使所述微生物生产所述类异戊二烯醇。
19.一种用于生产类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物或萜烯前体的方法,其通过提供至少一种选自由一氧化碳和二氧化碳组成的组的C1化合物与根据权利要求1所述的微生物接触,以使所述微生物由所述C1化合物生产所述类异戊二烯醇、类异戊二烯醇衍生物或萜烯前体。
20.根据权利要求18所述的方法,其中向所述微生物提供包含氢气的气体。
21.根据权利要求18所述的方法,其中所述类异戊二烯醇被回收。
22.根据权利要求19所述的方法,其中向所述微生物提供包含氢气的气体。
23.根据权利要求19所述的方法,其中所述萜烯前体被回收。
24.根据权利要求18所述的方法,其中所述C1化合物衍生自选自由以下组成的组的工业过程:铁类金属产品制造、非铁产品制造、石油精炼、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。
25.根据权利要求18所述的方法,其中所述C1化合物为合成气。
26.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的微生物,其中所述微生物选自由以下组成的组:自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、热醋酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)和其任何组合。
27.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的微生物,其中所述类异戊二烯醇转化为选自由以下组成的组的萜烯:萜类、维生素A、番茄红素、角鲨烯、异戊二烯、蒎烯、橙花醇、柠檬醛、樟脑、薄荷醇、柠檬烯、橙花叔醇、法呢醇、法呢烯、植醇、胡萝卜素、沉香醇和其任何组合。
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