CN117821402A - 一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用 - Google Patents

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CN117821402A CN202311684261.5A CN202311684261A CN117821402A CN 117821402 A CN117821402 A CN 117821402A CN 202311684261 A CN202311684261 A CN 202311684261A CN 117821402 A CN117821402 A CN 117821402A
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王少沛
李文华
张孝智
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韩娜
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Abstract

本发明提供一种猪流行性腹泻病毒毒株及其在疫苗制备中的应用，所提供的猪流行性腹泻病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202162。本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒PEDV‑WL20株经鉴定为新型变异毒株。本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒制成的灭活疫苗能显著降低仔猪的腹泻率和死亡率。实验组较市售同类产品在初乳和血清ELISA抗体进行对比，结果表明实验疫苗组在ELISA抗体表现上优于市售竞品组。以上安全与效力实验证明用ST‑WL悬浮细胞培养的猪流行性腹泻病毒新型变异株具有良好的临床防护效果，有很好的免疫原性。

Description

一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒株新型变异毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
背景技术
全悬浮培养工艺是一种不依赖血清和载体的细胞培养工艺，目前主要用VERO和ST细胞进行培养，以VERO细胞居多。ST全悬浮细胞株较VERO全悬浮细胞具有培养效率更高、成本更低、更能适应大体积培养等优势特点。ST细胞为猪睾丸细胞，体外培养呈贴壁生长，可进行连续传代培养。ST细胞培养成为病毒类疫苗的关键技术节点，直接影响到兽用疫苗质量和经济效益。
猪流行性腹泻(Procine Epidemic Diarrhea,PED)首次在英国被报道，后续在美洲和亚洲被报道发现。2010年之前，PED在我国的流行形式主要以散发和地方流行为主，2010年10月新的PED疫情在南方爆发，在全国流行。猪流行性腹泻是目前养猪业危害最严重的疾病之一，以呕吐、腹泻、厌食、脱水为主要发病特征，该病严重危害新生仔猪，死亡率高达100％，对养猪业造成了巨大的经济损失。
猪流行性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪的一种高度接触性肠道传染病，各日龄阶段的猪均易感。猪流行性腹泻病毒是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科、冠状属。PEDV基因组包含7个开放阅读框，分别编码2个多聚蛋白ORF1a和ORF1b；4种结构蛋白包括纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)、核衣壳蛋白(N)。S蛋白是病毒进行靶细胞的关键蛋白，介导受体结合和病毒与细胞膜的融合。此外S蛋白通常用来表明冠状病毒分离株的遗传特征。
研究表明PEDV只有一个血清型，但基于S基因N末端结构域的氨基酸差异，PEDV可以分为基因组1(GIa和GIb)和2(G2a和G2b)型。在2010年之前，欧洲和亚洲流行的大多数PED病毒株属于G1a型毒株，包括经典株和疫苗株，如CV777和DR-13。自2010年以来，我国又多次大规模暴发该病，我国405株PEDV毒株中，84.2％(341/405)为新型PEDV毒株，15.8％(64/405)为传统PEDV或传统PEDV来源的疫苗毒株。目前，经典毒株疫苗(如CV777、DR13等)对PEDV新型变异毒株缺乏有效的交叉中和作用，并不能提供可靠的交叉保护。虽然疫苗在PED的防控中发挥了重要的作用，但越来越多的猪场在使用PEDV疫苗后PED仍然会发生和流行，这说明PEDV在环境压力下一直处于变异的状态，这可能是导致近年PEDV大规模爆发，而不能以疫苗接种等措施控制此病流行的主要原因。
由于冠状病毒易变异，导致目前已上市应用的猪流行性腹泻类相关疫苗对疫病流行控制效果不理想。现有的PEDV疫苗毒株多数从发病猪场分离毒株的方式获取，由于PEDV为冠状病毒易变异，因此分离获得变异PEDV毒株变得尤为重要，对PEDV变异毒株疫苗的制备和应用具有重要意义。新型变异毒株的出现给猪场的生物安全防控体系带来更大的挑战。因此，PEDV疫苗毒株的更新迫在眉睫，疫苗毒株需要跟随毒株变异的速度，制备变异毒株PEDV疫苗，更好的为畜牧业提供免疫保护。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒毒株及其在疫苗制备中的应用，所提供的猪流行性腹泻病毒株的抗原蛋白基因发生变异，为一新型的变异病毒株，将该病毒株可作为抗原来制备疫苗。另外将制备的疫苗进行猪的安全性与效力检验，对疫苗进行评价。
本发明首先提供一种猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株，该病毒株于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202162。
本发明所提供的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20变异株，其S基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
本发明所提供的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株可用于制备疫苗；
所述的疫苗，作为实施例的一种具体记载，为灭活疫苗；
本发明再一个方面还提供一种灭活疫苗，其中所使用的抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株；
所述的灭活，作为实施例的一种记载，是使用甲醛进行灭活。
本发明的病毒株，其另一个用途是用于制备中和抗体。
本发明还提供一种扩繁所述的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株的方法，是使用猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST-WL来繁殖所述的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株；所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST-WL，已于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021214。
本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株经鉴定为新型变异毒株，通过从潍坊某猪场发病猪群中分离得到，与现在流行毒株基因同源性99％以上。用新型变异毒株制成的灭活疫苗进行超剂量安全性检验，实验组均无异常临床反应。在效力检验方面，本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株制成的灭活疫苗能显著降低仔猪的腹泻率和死亡率。实验组较市售同类产品在初乳和血清ELISA抗体进行对比，结果表明实验疫苗组在ELISA抗体表现上优于市售竞品组。以上安全与效力实验证明用ST-WL悬浮细胞培养的猪流行性腹泻病毒新型变异株具有良好的临床防护效果，有很好的免疫原性。
附图说明
图1腹泻病死仔猪的部分肠道组织及内容物图；
图2PEDV-WL20病毒毒株纯净性检测结果图，其中2-a为支原体检测，2-b为BVDV检测结果图；2-c为圆环病毒外源检测结果图，2-d为伪狂犬外源检测图；
图3贴壁VERO正常细胞图及接毒PEDV后细胞病变图；其中3-a为VERO贴壁细胞正常图，3-b为接PEDV后VERO细胞病变图；
图4RT-PCR检测不同代次的猪流行性腹泻病毒图，其中泳道分别为1：阴性对照；2：阳性对照；3-7：第2、4、6、8、10代细胞培养上清。
图5S基因编码的氨基酸同源性进化树分析图；
图6PEDV S蛋白同源性比对矩阵图；
图7PEDV毒株S蛋白COE区突变位点比较图；
图8接毒前后ST-WL全悬浮细胞图，其中图8-a为接毒前ST-WL细胞图，图8-b为接毒PEDV后ST-WL细胞图；
图9PEDV阴性猪筛选荧光扩增曲线图。
具体实施方式
本发明筛选获得了一株抗原蛋白基因发生了变异的猪流行性腹泻病毒变异毒株PEDV-WL20株，该病毒株于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202162。
而且，使用目前市售的ST贴壁细胞(编号为CVCC NO.CL27中国兽医药品监察所)对PEDV-WL20株的培养效果不理想，毒价较低达不到制备疫苗的浓度。因此，通过细胞驯化筛选，获得高效培养PEDV-WL20株的ST-WL全悬浮细胞系，已于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021214。
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：猪流行性腹泻病毒的分离
1.1样品信息
2020年山东潍坊某规模化猪场在使用猪流行性腹泻病毒商品化疫苗后仍发生猪流行性腹泻疫情。无菌解剖获取腹泻病死仔猪的部分肠道组织及内容物中筛选获得，(图1)病死仔猪肠道壁较薄为典型腹泻症状。
1.2病毒的分离
选取腹泻症状典型的病死仔猪小肠组织20g，使用液氮进行处理后，加入灭菌的PBS缓冲液用研钵研磨组织，制成20％(按1:5的重量体积比)组织悬液，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22um滤器过滤除菌。将过滤除菌后组织液进行分装，无菌检验合格后保存备用。
将Vero细胞复苏后在培养瓶中使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，取长满单层的Vero细胞，弃去生长液，反复使用PBS清洗3遍，待用。
使用无菌的DMEM将组织过滤液按照10％的体积比进行稀释，稀释好的组织过滤液需要按照0微克/ml、10微克/ml、100微克/ml三个梯度添加猪胰蛋白酶，37℃二氧化碳培养箱孵育2个小时，然后将抚育好的组织过滤液悬液加入到致密单层的Vero细胞当中。分离组一共包括无胰酶组、10微克/ml组、100微克/ml组。以上组织液液接入细胞中继续作用2h后弃掉组织液，换为2％胎牛血清DMEM。
阴性对照组使用无菌的DMEM加入0微克/ml、10微克/ml、100微克/ml后分别加入到致密单层的ST细胞当中，接入ST细胞中作用2h后弃掉组织液，换为2％胎牛血清DMEM；阳性对照组使用无菌的DMEM加入0微克/ml、10微克
/ml、100微克/ml后分别按照10％体积比例接入本实验室所保存的猪流行性腹泻病毒液(107TCID50/ml)到致密单层的ST细胞当中，接入ST细胞中作用2h后弃掉组织液，换为2％胎牛血清DMEM。
继续培养72小时，间隔24小时观察细胞状态，并且将板子-80℃保存。将第一代毒冻融4次后按照10％的比例，分别加入含0微克/ml、10微克/ml、100微克/ml三个梯度添加猪胰蛋白酶的DMEM中，同时设定阴性对照组和阳性对照组。
37℃温箱培养2h后，三组全部弃液，换液为2％DMEM。
间隔24小时观察细胞状态，继续培养72小时，并且将板子-80℃保存。如此操作盲传至第10代，观察是否产生CPE。同时设置空白细胞作为对照。按照以上方法进行连续传代培养，直至出现明显且稳定的细胞病变，而阴性对照组未出现明显的细胞病变。盲传之后挑取出现明显病变的病毒液进行分装，并且冻存于-80℃冰箱。
实施例2：PEDV-WL20病毒毒株的鉴定
2.1毒株纯净性检测
将获取的PEDV-WL20分离毒株进行外源病原检测。将分离毒株在VERO细胞上盲传至100代，通过PCR方法检测分离毒株中是否纯净，主要进行支原体、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒等外源病原检测。
结果如图2所示，本发明所述分离毒株的第2代、50代、第100代次细胞均未检测到支原体、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和牛病毒性腹泻病毒等外源病原。
2.2病毒含量检测(TCID50法)
使用VERO细胞进行猪流行性腹泻病毒滴度的测定。VERO细胞长满单层消化后铺96孔细胞培养板，当96孔细胞板长满后将腹泻分离毒株用不加血清的DMEM进行10倍系列稀释，从10-1稀释至10-10，每个稀释度接种8孔，同时设置阴性和阳性细胞对照孔。置37℃，5％CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变情况(图3)。连续培养3～5天观察细胞感染病毒情况，计算病毒滴度。统计出现CPE孔数，按照Reed-Muench法计算细胞毒的TCID50效价。
2.3PCR扩增与鉴定
将分离毒株在ST细胞上继续进行10代传代，并在此过程中挑选第2、4、6、8、10代次细胞培养物分别各取250μL，使用Total RNA Kit II试剂盒(OMEGA)提取RNA。将提取后的RNA进行反转录，反应体系如下：6μL的RNA与1μLOligo(dT)混合均匀，70℃10min，降温2min。向该混合液中加入2μL 5×Buffer，0.5μL 10mM的dNTP mix，0.25μL MLV反转录酶及0.25μLRNase Inhibitor。混匀后按如下条件反应：42℃，60min；70℃，15min。反转录后的cDNA用以下引物进行PCR扩增。
鉴定引物如下：
上游引物NF：5′-CGGTTCTCACAGATAGTGAG-3′；
下游引物NR：5′-CGCTAGAAAAACACTCAGTAAT-3′。
反应体系为：cDNA 1μL，2×Taq Mix 12.5μL，10μM/mL的上下游引物各0.5μL，补加去离子水至25μL，混合均匀。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，反应30个循环；72℃延伸10min。PCR结束后，将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图4所示，本发明所述分离毒株从第2代开始一直到第10代，不同代次细胞培养物样品均检测到特异性的阳性条带。从而说明，该分离毒株为猪流行性腹泻病毒。
2.4S蛋白鉴定
提取分离毒株的基因组RNA；并进行反转录及PCR扩增(RNA提取和反转录体系及反应条件同上述步骤2)。反转录后的cDNA用下述引物进行PCR：扩增S基因。
测序结果显示，该分离毒株的S基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，具体序列如下：
mksltyfwlf lpvlstlslp qdvtrcsant nfrrffskfn vqapavvvlg gylpigenqgvnstwycagq
hptasgvhgi flshirgghg feigisqepf dpsgyqlylh katngntnat arlricqfpsiktlgptadn dvttgrnclf
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gedgisyqlc tancigyaan vfatepnghi pegfsfnnwf llsndstlvh gkvvsnqpllvncllampki yglgqffsfn
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ilycddpvsq lkcsqvafdl ddgfypissr nllsheqpis fvtlpsfndh sfvnitvsasfgghsganli asdttingls
sfcvdtrqft islfynvtns ygyvsksqds ncpftlqsvn dylsfskfcv stsllasactidlfgypefg sgvkftslyf
qftkgelitg tpkplrgvid vsfmtldvct kytiygfkge giitltnssi lagvyytsdsgqllafknvt sgavysvtpc
sfseqaayvd ddivgvissl ssstfnstre lpgffyhsnd gsnctepvlv ysnigvcksgsigyvpsqsg qvkiaptvtg
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latissfngd gynftnvlgv svydpasgrv vqkrsfiedl lfnkvvtngl gtvdedykrcsngrsvadlv
caqyysgvmv lpgvvdaekl hmysasligg lvlggftsaa alpfsyavqa rlnylalqtdvlqrnqqlla esfnsaigni
tsafesvkea isqtskglnt vahaltkvqe vvnsqgaalt qltvqlqhnf qaisssiddiysrldilsad vqvdrlitgr
lsalnafvaq tltkytevqa srklaqqkvn ecvksqsqry gfcggdgehi fslvqaapqgllflhtvlvp gdfvdviaia
glc vndeial tlrepglvlf thelqnhtat eyfvssrrmf eprkptvsdf vqiescvvtyvnltrdqlpd vipdyidvnk
tldeilaslp nrtgpsfpld vfnatylnlt geiadleqrs eslrntteel qsliyninntlvdlewlnrv etyikwpwwv
wliifivlif vvsllvfcci stgccgccgc ccacfsgccr gprlqpyevf ekvhvq。
进一步将SEQ ID NO:1与其他猪流行性腹泻病毒株的S蛋白序列在MegAlign中进行同源性比较，其同源性比对结果见图5。
在市售的商品化PEDV疫苗毒株在中国应用较早的是G1群毒株疫苗，在临床上获得了比较好的效果，2010年后G2群毒株在中国开始流行，G2群毒株疫苗逐步上市，也有较好的免疫效果。最新的流行病学调查研究结果表明中国境内流行的毒株以变异毒株G2亚群为主。
从图6可以看出，该分离株PEDV-WL20属于G2亚群。从而说明，本发明所述分离毒株是一个猪流行性腹泻病毒G2C亚型流行毒株。从序列比对的结果可知，该分离株与商品化疫苗使用的经典毒株(G1群，CV777毒株)S蛋白序列同源性进仅93％，遗传距离较远；该分离株与NCBI中发布的GZSB2020株S蛋白序列同源性为99％；该分离株与之前申报的PEDV-AQ株S蛋白序列同源性进仅92.5％，遗传距离较远。
将分离PEDV-WL20株与之前申报AQ株及市场主流PEDV毒株进行S基因编码的氨基酸同源性进化树分析，明确分离毒株基因型，确认为市场流行PEDV毒株。从图5来看，分离PEDV-WL20株与PEDV-AQ株遗传距离较远，属于不同基因型；PEDV-WL20株与PEDV-GZSB2020株遗传距离较近，同属于PEDV新型变异株G2C毒株，与市场流行PEDV一致。
COE蛋白序列(499～638aa)比对结果显示：PEDV-WL20株与CV777经典株相比，PEDV分离毒株S蛋白COE中和表位发生如下突变：在523A→S、527L→H、533V→I、539I→G、542F→L、555T→S、533V→I、575C→D、599G→S、610A→E、617L→F、638E→R，共计12处有突变(图7)；PEDV-WL20株与PEDV-AQ株相比，PEDV分离毒株S蛋白COE中和表位发生如下突变：在539I→G、542F→L、555T→S、574C→D、599G→S、638Q→R共计6处有突变,说明WL20株较AQ株发生明显突变；PEDV-WL20株与新型变异株PEDV-GZSB2020株相比，PEDV分离毒株S蛋白COE中和表位发生如下突变：在539I→G、575C→D仅2处有突变,说明WL20株与GZSB2020株接近，都为新型变异毒株，与近几年市场流行新型变异毒株S蛋白序列接近，说明分离PEDV毒株为变异毒株。
2.5动物回归实验
取猪流行性腹泻病毒中和抗体均小于1：8的母猪所产的3日龄仔猪5头，每头口服本发明所述分离毒株第5代103个TCID50，观察7日，统计接种猪的发病情况，并对试验猪进行剖检，观察病理变化。取发病猪肠粘膜和内容物，提取RNA，按实施例2.3所述方法进行PCR检测，并将PCR产物进行序列测定。
结果显示，5头仔猪全部发病，发病率为100％，5头仔猪死亡，死亡率100％，发病猪表现为腹泻，脱水，个别猪出现呕吐，剖检观察发现胃和小肠出现典型的病理变化。从发病猪的肠粘膜及内容物中可扩增出1326bp片段，序列分析结果表明为本发明所述分离PEDV毒株的特异性基因。
实施例3：PEDV细胞悬浮培养方法
包括如下步骤：
3.1细胞的复苏与摇瓶扩增
将冻存的ST细胞(猪睾丸细胞)复苏到125ml细胞摇瓶中，放入37℃、5.0％CO2、120rpm的培养摇床中培养3天；计算接种所需细胞和培养基的体积，将细胞密度调整至1.0x106 cells/mL；每3天重复一次，直至培养体积可放大上14L生物反应器。
3.2悬浮培养罐准备及灭菌
将准备好的罐体，从进料口打入PBS(4L)，在高压灭菌器中达到121℃后进行50分钟以上的高压灭菌，在温度下降到90℃以下才能释放高压灭菌锅的压力，采用缓慢排气的方式(30分钟)。
3.3细胞上罐
从排料口打出PBS(4L)，计算接种所需细胞和培养基的体积，将细胞密度调整至3.0x106 cells/mL，将培养所获的ST细胞从进料口导入14L反应器中。
3.4细胞悬浮培养与细胞检测
按照以下条件(表1)进行培养。
表1：悬浮罐培养参数表
溶氧 PH 温度 转速(转/分钟)
40 7.2 35℃ 80
3.5接毒
当悬浮细胞密度达到6～8x106 cells/mL时，按下表进行接毒，并按照以下条件(表2)进行接毒后培养(图8)。
表2：悬浮罐接毒参数表
种毒 接种体积比 MOI
A罐 108.5TCID50/ml 1％ 1
B罐 108.5TCID50/ml 0.2％ 0.2
3.6收毒与TCID50检测
取样A组按照接毒后24小时、30小时、36小时时间点取样；B组按照接毒后36小时、42小时、48小时、54小时时间点取样，分别进行病毒含量检测。
实施例4：病毒液中抗原含量检测
本实施例用以说明采用实施例2方法所得的病毒液中抗原含量检测结果。
采用实施例2方法进行连续3个批次(批号分别为210403、210405、210506)的病毒培养，各批次抗原病毒含量如表3所示。
表3：不同时间点病毒含量检测表
由:3可知，采用本发明方法所得的抗原病毒含量高，是传统转瓶生产工艺的10～30倍，是VERO全悬浮细胞培养工艺的2～3倍，且各批次所得的病毒含量稳定。
本次试验目的在于探索不同接毒比例条件下放大腹泻病毒生产工艺的产毒曲线，试验结果显示培养温度为35℃，接毒MOI为0.2时，48小时可以达到产毒高峰，效价为109.0TCID50/ml。
实施例5：猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株灭活疫苗制备
猪流行性腹泻灭活疫苗在疫苗制备过程中所采用的试剂：
1.ST-WL细胞：全悬浮ST-WL细胞，
2.病毒：猪流行性腹泻病毒(PEDV-WL20株，保藏编号：CCTCC NO：
V202162)。
3.培养基：CD ST-258无血清商品化悬浮培养基(兰州建顺生物)和DMEM
培养基(Gibco)。
4.水佐剂为Gel 02购自法国赛比克有限公司。
步骤1猪流行性腹泻抗原的制备
将驯化得到的ST-WL全悬浮细胞置于CD ST-258无血清商品化悬浮培养基中，放入37℃，5.0％CO2，120rpm的培养摇床中培养3天。细胞活率>95％，细胞生长稳定且活细胞密度至3.0x106 cells/mL时，更换1/3体积的培养液并以病毒接种量为0.2剂量接入PEDV-WL20种毒液，吸附1小时后，补加CD ST-258无血清悬浮培养液作为维持液；发酵罐参数设置为：溶氧40％、PH 7.2、温度37℃、转速80r/min在培养后42h收获抗原并取样进行TCID50检测。经检测抗原液的TCID50效价为109.0/ml，符合配苗要求。
步骤2猪流行性腹泻灭活疫苗的制备
将抗原液中加入最终含量为0.2％的甲醛溶液，充分振荡，置37℃灭活24小时。再加1％含量为5％的灭菌亚硫酸钠终止灭活。按照现行《中国兽药典》附录进行检验，确定无菌。
将灭活的病毒液用维持液10倍稀释后接种于Vero细胞中，每瓶1ml。37℃吸附2小时，弃掉接种液，加入细胞维持液，同时设不接毒的Vero细胞对照。置于37℃培养5天，无细胞病变。按照以上方式盲传3代，均无细胞病变。经灭活检验抗原合格。
将灭活的猪流行性腹泻与水佐剂以9:1的比例混合，按疫苗总量的0.005％加入硫柳汞，充分搅拌混合。制备一批实验室试制疫苗，疫苗批号为WL-P01。
实施例6：猪流行性腹泻灭活疫苗的安全性试验
参照现行《中国兽药》对实施例5制备的PEDV-WL20株灭活疫苗进行无菌检验、稳定性、性状等实验室检验，检验均合格。
6.1仔猪的安全性实验
筛选PEDV抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪7头，用于安全性检验。对仔猪进行颈部肌肉免疫，间隔14日二免。首次免疫和二免接种双倍剂量4ml/头，第二次免疫后连续观察14天，观察仔猪的接种部位及临床症状。同时设立对照组2头，不做任何处理。试验结果见表4。
表4：PEDV-WL20株灭活疫苗超剂量安全试验表(仔猪)
免疫组5头仔猪接种本发明制备的PEDV-WL20株灭活疫苗后，连续观察14天，精神、饮食正常，体温未见升高，未见腹泻相关临床症状。说明该疫苗对仔猪安全。
6.2母猪的安全性试验
筛选PEDV抗原和抗体阴性的怀孕母猪7头，用于母猪安全性实验。颈部肌肉接种怀孕母猪5头，产前6周进行第一次免疫，产前3周进行第二次免疫，首次免疫和二免接种双倍剂量4ml/头。观察接种部位情况，统计母猪产仔数量及质量。同时设立对照组2头不做任何处理。试验结果见表5。
表5：PEDV-WL20株灭活疫苗灭活疫苗超剂量安全试验表(母猪)
5头怀孕母猪接种本发明制备的PEDV-WL20株灭活疫苗后未见明显临床症状，接种部位无异常情况。观察至母猪分娩，免疫组和对照组仔猪均无弱仔、流产和死胎情况。免疫组和对照组平均产仔数没有明显差异，说明该疫苗对母猪安全。
实施例7:猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株灭活疫苗的效力试验
1、PEDV-WL20株灭活疫苗的仔猪免疫效力检验
选择7头PEDV抗原和抗体阴性的8-10日龄仔猪用于本试验。将仔猪分为2组，第一组为PEDV-WL20株灭活疫苗免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为空白对照组，2头，不做任何处理。首免后14日进行二免，免疫后观察接种部位炎症情况及仔猪的临床症状，二免2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表6。
表6：PEDV-WL20株灭活疫苗免疫仔猪后中和抗体结果表
免疫组仔猪接种部位均未见红肿、硬块、结痂等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，PEDV-WL20株灭活疫苗免疫组在免后第2周，5头仔猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，免后第五周之后逐渐下降。该试验结果表明，对于8-10日龄仔猪，PEDV-WL20株灭活疫苗免疫效力良好，免疫力持续时间长。
2、PEDV-WL20株灭活疫苗的母猪免疫效力检验
选择7头PEDV抗原和抗体阴性的后备母猪用于本试验。将后备母猪随机分为3组，第一组为疫苗1免疫组，5头，颈部肌肉接种，2ml/头；第二组为空白对照组，2头，不做任何处理。产前7周首免，产前4周二免，免疫后观察接种部位炎症情况及母猪的临床症状，二免后2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表7。
表7：PEDV-WL20株灭活疫苗免疫后备母猪后中和抗体结果表
免疫组母猪猪接种部位均未见红肿、硬块等炎症反应，未见明显异常临床症状。血清中PEDV中和抗体结果显示，PEDV-WL20株灭活疫苗组在免后第2周，所有母猪的中和抗体均大于1:32，在免后第4周达到最高峰，免后第五周之后逐渐下降。该试验结果表明，本发明提供的PEDV-WL20株灭活疫苗接种母猪后，能产生较高的中和抗体，且能维持在相对较高的水平，具有良好的免疫效力。
3.PEDV-WL20株灭活疫苗与竟品对比实验
选用经检验猪流行性腹泻抗体阴性母猪(如表8，图7)产3日龄哺乳仔猪10头，后海穴注射。其中接种倍量免疫剂量(2ml)2头，接种免疫剂量(1ml)8头，观察14天，均应无异常临床反应。本实验数据由杭州贝尔塔完成检测并提供。
表8猪流行性腹泻阴性猪筛选表
疫苗免疫前与注射后21～35d分别前腔静脉采血，用PEDV-IgA抗体检测试剂盒(ab112746，杭州贝尔塔生物技术有限公司)检测猪血液中PEDV特异性抗体。
读取各反应孔的OD650数值，并根据以下公式判定结果：已知阴性样品的OD值≤0.3且已知阳性样品的OD值的比值S/P值≥0.8；在上述条件成立的情况下，如果待检血清样品与已知阳性样品OD值的比值S/P值≥0.25则判为阳性，否则判为阴性。
表9免后21d猪流行性腹泻ELISA抗体检测表
从表9中可以看出，通过用ST-WL细胞悬浮培养生产的变异株猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株制备的疫苗免疫妊娠母猪，免疫后21d ELISA抗体效价和对照组相比有显著提高。实验组较市售同类产品在初乳和血清ELISA抗体进行对比，结果表明实验疫苗组在ELISA抗体表现上优于市售竞品组。PEDV-WL20变异株具有很好的免疫原性。本实验数据由杭州贝尔塔完成检测并提供。
实施例8猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株灭活疫苗的临床试验
在样品分离地区存在猪流行性腹泻病毒感染的规模化猪场进行实验，每个猪场分为挑选同胎次产期相同的健康妊娠母猪40头，随机分组为1、2、3、4共4组，分别按照表10所述方法进行免疫，免疫后统计各猪场母猪生产的仔猪的平均腹泻率和平均死亡率，比较不同猪流行性腹泻病毒疫苗对于仔猪的保护情况，具体结果见表11。
表10妊娠母猪免疫方案表
表11：免疫后的妊娠母猪生产的仔猪腹泻率和死亡率统计表
从表10、表11的统计结果可知，注射本发明的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株灭活疫苗进行两次免疫的1组妊娠母猪生产的仔猪平均腹泻率仅为10％，平均死亡率仅为8％，远低于注射市售疫苗免疫的2、3、4组妊娠母猪生产的仔猪。从而说明本发明分离得到的猪流行性腹泻病毒PEDV-WL20株制成的灭活疫苗能显著降低仔猪的腹泻率和死亡率，对仔猪的保护效果显著优于市售疫苗。
以上所述内容仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种猪流行性腹泻病毒，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒的保藏编号为CCTCCNO:V202162。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒的S基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
3.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒在制备疫苗中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。
5.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗中所使用的抗原为灭活的权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒。
6.如权利要求5所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活是使用甲醛进行灭活。
7.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒在制备中和抗体中的应用。
8.一种扩繁权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，所述的方法是使用保藏编号为CCTCC NO：C2021214的猪睾丸传代细胞系来悬浮繁殖。
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