CN117815438A - 一种多功能水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多功能水凝胶及其制备方法和应用，该材料包括苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺、负载BNN6的聚多巴胺纳米球、儿茶酚基团功能化的壳聚糖和氧化葡聚糖。通过各成分和用量合理的搭配使该多功能水凝胶具有良好的抗菌性能和抗氧化性能，能够消除细菌感染，清除DPPH、OH自由基和ABTS自由基，同时具有光热效应，还可促进血管生成，具有多个功能，用于制备糖尿病患者伤口愈合敷料，具有良好的应用潜力和前景。

Description

一种多功能水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种多功能水凝胶及其制备方法和应用，特别涉及一种用于制备糖尿病伤口愈合的敷料的水凝胶，属于伤口敷料水凝胶制备领域。
背景技术
慢性糖尿病患者经常出现伤口愈合受损的情况。糖尿病创面延迟愈合的主要原因有以下几个方面：(1)糖尿病创面的高血糖环境容易发生细菌感染和生物膜定位，导致创面出现严重的炎症反应；(2)持续高血糖导致血液中晚期糖基化终产物的产生，导致创面中活性氧(ROS)过多，引发氧化应激，进一步加剧炎症反应；(3)糖尿病引起的血管损伤会干扰营养和氧气的输送，对伤口愈合产生不利影响。因此，在考虑糖尿病患者的伤口愈合时，采用一种具有有效的抗菌特性、缓解氧化应激的能力以及促进血管生成的治疗干预是可取的方法。
水凝胶被广泛认为是促进糖尿病伤口愈合的有利材料，因为它们能够通过整合生物活性分子或材料来减轻上述挑战。阳离子聚合物作为传统抗生素的替代品，已被纳入抗菌水凝胶网络，并显示出其杀菌效果而不产生耐药性。但是阳离子聚合物的选择性有限，且它们在哺乳动物细胞中具有诱导毒性的能力。因此，阳离子聚合物在生物相容性和抗菌性能之间的平衡一直是一个两难的问题。
氧化应激水平的有效管理是促进慢性伤口愈合过程的另一个重要问题。含有儿茶酚基团的水凝胶已被证明具有抗氧化能力，并有望通过减少氧化应激来管理糖尿病伤口。儿茶酚基水凝胶已被用于制备抗氧化水凝胶，并显示出增强的慢性伤口愈合能力。此外，含有儿茶酚基水凝胶通常具有良好的组织粘附性，使水凝胶具有长期有效性。此外，血管生成也有助于伤口愈合。最近，一氧化氮(NO)作为一种活性分子被添加到水凝胶中，显示出通过促进血管生成、刺激肉芽形成和促进胶原沉积来愈合糖尿病伤口的能力。然而，大多数伤口敷料功能单一，并不能满足慢性糖尿病创面微环境复杂的临床治疗要求。
因此，制备一种集抗菌、抗氧化以及促血管生成与一体的多功能水凝胶是用于治疗慢性糖尿病伤口是十分必要的。
发明内容
针对现有技术中水凝胶存在功能单一以及糖尿病创面愈合慢等缺陷，本发明的第一个目的是提供一种多功能水凝胶(CDP-PB)，该水凝胶具有良好的抗菌、抗氧化和促血管生成性能，同时该水凝胶具有较高的生物相容性。
本发明的第二个目的是提供一种多功能水凝胶的制备方法，该制备方法简单，反应条件较为温和，成本低，应用前景大，可进行大规模的制备。
本发明的第三个目的是在于提供一种多功能水凝胶的应用，将其应用于制备糖尿病伤口愈合敷料，该敷料中具有的多功能水凝胶具有良好的体外抗菌和抗氧化性能，能够消除细菌感染，有效清除多种自由基，减轻氧化应激；同时还具有光热效应，可在近红外光控NO的释放，促进血管生成，加速糖尿病创面愈合。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种多功能水凝胶，该水凝胶包括苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺(PEI-PBA)、负载BNN6的聚多巴胺纳米球(PDA@BNN6 NPs)、儿茶酚基团功能化的壳聚糖(Chi-Ca)和氧化葡聚糖(Dex-CHO)；其中，苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺、负载BNN6的聚多巴胺纳米球、儿茶酚基团功能化的壳聚糖和氧化葡聚糖的质量比为(10～100)：(1～10)：(60～600)：(100～1000)。
在本发明的技术方案中的水凝胶中，一方面可以利用Chi-Ca、PEI-PBA、PDA@BNN6NPs这三种物质的氨基基团和Dex-CHO的醛基基团发生席夫碱反应生成席夫碱键；另一方面可以利用PEI-PBA的苯硼酸基团和Chi-Ca的儿茶酚基团形成苯硼酸酯键，而席夫碱键和苯硼酸酯键均为动态共价键，赋予了水凝胶良好的可注射性能、自愈合性能和组织粘附性，可长期应用于不规则伤口部位。此外，Chi-Ca赋予了水凝胶抗氧化性能，使其能够清除多种自由基，减轻氧化应激；PEI-PBA赋予了水凝胶抗菌性能，并且PEI-PBA在近红外光的作用下，由于PDA@BNN6 NPs的存在，水凝胶能发挥出光热作用，并且能够可控释放高浓度的NO，进一步增强水凝胶的抗菌性能；而Dex-CHO可以通过与PEI-PBA发生交联从而减轻PEI-PBA诱导的细胞毒性。因此，通过温和的光热作用有利于新生血管的形成，在进行光热作用后，PDA@BNN6 NPs的BNN6会逐渐脱附，并且缓慢分解生成低浓度的NO，能够进一步促进血管生成。综上，本发明所提供的CDP-PB水凝胶具有多种功能，且通过各种成分的协同作用，应用过程中能够快速的促进血管生成和伤口愈合。
发明人发现，CDP-PB水凝胶中各成分的用量也十分重要。如：Chi-Ca的用量直接决定了水凝胶的抗氧化性能，Chi-Ca的用量越高，水凝胶的抗氧化性能越强，若水凝胶中Chi-Ca含量过低，水凝胶程度过低，不易成胶，且抗氧化能力有限；若水凝胶中Chi-Ca含量过高，由于分子链之间相互作用(包括氢键、π-π堆叠等作用)，Chi-Ca在溶于水的过程中，会通过物理交联的作用自动成胶，这种凝胶机械性能较差，功能单一，不能满足药物的糖尿病伤口治疗需求。而PEI-PBA的用量是决定水凝胶抗菌性能的重要因素之一，PEI-PBA的用量越高，水凝胶的抗菌性能越强，但是PEI-PBA是碱性的，若水凝胶中PEI-PBA含量过高，会导致体系的pH太高，无法顺利成胶，并且会导致严重的细胞毒性问题，若水凝胶中PEI-PBA含量过低，则会影响水凝胶的抗菌能力。而Dex-CHO的用量决定了PEI-PBA的生物相容性和抗菌性能之间的平衡，因此需要选择合适的用量，兼顾水凝胶的生物相容性和抗菌性能。PDA@BNN6 NPs的用量直接决定了水凝胶的光热作用的效果以及NO的释放。因此，只有平衡水凝胶各组分的用量，才能保证水凝胶各种功能的同时具有良好的机械性能。
进一步优选，所述苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺、负载BNN6的聚多巴胺纳米球、儿茶酚基团功能化壳聚糖和氧化葡聚糖的质量比为(10～25)：(1～2)：(60～150)：(100～250)。在进一步优选的范围内，所得到的水凝胶具有较优的综合性能。
作为一种优选的方案，所述PEI-PBA由聚乙烯亚胺(PEI)和4-(溴甲基)苯硼酸(BPBA)通过取代反应得到。
作为一种优选的方案，所述PEI和BPBA的质量比为(3～4)：1。在所选范围内，可以保证BPBA在PEI分子链的接枝率尽可能高，有利于增加凝胶中苯硼酸酯键的含量以提高凝胶的交联程度。
作为一种优选的方案，取代反应的条件为：温度为70～80℃，时间为20～24h。
作为一种优选的方案，所述聚乙烯亚胺的分子量或聚合度为300～3000Da。
作为一种优选的方案，所述取代反应得到的PEI-PBA产物需要经过冰醚沉淀及水除杂处理。
作为一种优选的方案，所述PDA@BNN6 NPs由聚多巴胺纳米球(PDA NPs)和N,N'-二仲丁基-N,N'-二亚硝基-1,4-苯二胺(BNN6)在避光条件下通过自组装π-π堆叠得到。
作为一种优选的方案，所述聚多巴胺纳米球(PDA NPs)是通过以下方法制备得到：将三嵌段共聚物F127、盐酸多巴胺(DA)和1,3,5-三甲苯混合(TMB)加入氨水进行水浴反应后，超声去除1,3,5-三甲苯模板剂，即得。
作为一种优选的方案，所述水浴反应的条件为：温度为20～25℃，时间为1～2h。
作为一种优选的方案，所述超声去除模板剂1,3,5-三甲苯使用体积比为1：2的丙酮和乙醇的混合物作为溶剂。
作为一种优选的方案，所述BNN6是通过以下方法制备得到：在氮气气氛下，将N,N'-二-仲-丁基-对-苯二胺(BPA)和NaNO2混合，加入盐酸避光反应后，即得。
作为一种优选的方案，所述PDA NPs和BNN6的质量比为1：(1～1.5)。通过控制PDANPs和BNN6的质量比可以使BNN6通过π-π堆叠充分负载在PDA NPs颗粒中。
作为一种优选的方案，所述Chi-Ca由壳聚糖(Chi)和3,4-二羟基苯丙酸(HCA)通过酰胺化反应得到。由于壳聚糖结构单元中存在-NH2基团，极易与酸成盐而溶解，而溶解后的壳聚糖呈凝胶状态，具有较强的吸附能力，从而容易与HCA上的羧基进行酰胺化反应，从而将HCA上的儿茶酚基团化学修饰在壳聚糖表面，得到儿茶酚功能化壳聚糖。
作为一种优选的方案，所述酰胺化反应采用EDC作为羧基活化剂，反应过程中pH为4～6。
作为一种优选的方案，所述Chi和HCA的质量比为1：(1～1.5)。
作为一种优选的方案，所述Dex-CHO是由葡聚糖(Dex)经过高碘酸钠氧化得到。
作为一种优选的方案，所述Dex与高碘酸钠的质量比为1：(1～2)。
作为一种优选的方案，所述氧化的条件为：室温下避光反应10～12h，并利用乙二醇终止反应。
作为一种优选的方案，所述葡聚糖氧化后采用截留分子量为3000～3500Da的纤维素膜透析。
作为一种优选的方案，所述Dex-CHO的氧化程度为50～60％。
本发明还提供了一种多功能水凝胶的制备方法，该方法是将苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺、负载BNN6的聚多巴胺纳米球、儿茶酚基团功能化的壳聚糖和氧化葡聚糖分散在水中混合，即得。
本发明采用乳液诱导界面各向异性组装法制备了PDANPs纳米球，再将BNN6作为NO前药供体，通过π-π堆叠负载到介孔PDA NPs纳米球中。此外，以壳聚糖(Chi)、Dex和PEI为原料，并分别对其进行功能化修饰，最后将修饰后的原料混合，并加入PDA@BNN6 NPs，能够制备具有多功能的水凝胶。本发明的制备方法简单，反应条件较为温和，成本低，应用前景大，可进行大规模的制备。
本发明还提供了一种多功能水凝胶的应用，将其应用于制备糖尿病伤口愈合敷料。该敷料的细胞实验表明，CDP-PB水凝胶具有良好的细胞相容性，并且能够有效清除细胞内产生的多种自由基，缓解氧化损伤。且该敷料在使用时，具有消除伤口感染、减轻炎症、缓解氧化损伤、促进血管生成、刺激肉芽形成和增加胶原沉积的功效，能显著促进糖尿病伤口的愈合。
作为一种优选的方案，所述敷料包括多功能水凝胶及辅料。
本发明多功能水凝胶可通过注射器将CDP-PB涂敷在任意形状的伤口处。
作为一种优选的方案，所述敷料为药学上可接受的注射制剂；进一步优选为药学上可接受的局部注射制剂。
作为一种优选的方案，所述糖尿病伤口愈合敷料具有光热效应，在光热作用下具有抗菌、抗氧化及促血管生成的功能。由于本发明的水凝胶中含有适宜浓度的PDA@BNN6NPs，其赋予了水凝胶良好的光热效应。其具体表现为：一方面，在近红外光的照射下，BNN6受热加速分解生成高浓度的NO，NO协同光热效应能够增强水凝胶中PEI-PBA的抗菌效果；另一方面，在近红外光照射后，部分BNN6会逐渐从PDA NPs上脱附，并且缓慢分解生成低浓度的NO，能够有效促进血管生成。
作为一种优选的方案，所述光热作用的条件为：照射功率密度为：0.1～10W/cm2，光照时间为5～20min的近红外激光。在所选范围内，光热协同作用的效果最好，且能显著提高敷料中水凝胶的抗菌性能。
与现有技术相比，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
1)本发明制备的CDP-PB多功能水凝胶具有良好抗菌性能，能够消除细菌感染；具有良好抗氧化性能，其能够清除多种自由基，尤其是DPPH、OH和ABTS自由基；以及具有促血管生成性能，同时该水凝胶具有较高的生物相容性。
2)本发明通过PEI-PBA、PDA@BNN6 NPs、Chi-Ca和Dex-CHO合理的配方比例，制备出具有优异抗菌性能的CDP-PB水凝胶，其中PDA@BNN6 NPs具有光热效应(PTT)，含有儿茶酚的水凝胶具有清除DPPH、OH和ABTS自由基的作用，可以减轻氧化应激。此外，在几种物质的协同作用下，使得在氧化应激条件下，CDP-PB水凝胶处理可增加细胞的迁移和增殖。CDP-PB水凝胶还具有具有消除伤口感染、促进血管生成、刺激肉芽形成和增加胶原沉积的功效。这些特点表明了CDP-PB水凝胶在临床应用中的潜力。
3)本发明提供的多功能CDP-PB水凝胶的制备方法简单，反应条件较为温和，成本低，应用前景大，可进行大规模的制备。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的PDA NPs及PDA@BNN6 NPs的TEM图，其中图1(a)和图1(b)为不同放大倍数下的PDA NPs的TEM图，图1(c)和图1(d)为不同放大倍数下的PDA@BNN6NPs的TEM图。
图2为本发明实施例1和对比例1～5制得的水凝胶的实物图和SEM图，其中图2(a)为实施例1和对比例1～5制得的水凝胶实物图；图2(b)为实施例1和对比例1～5制得的水凝胶的SEM图。
图3为本发明实施例1制得的CDP-PB水凝胶光热性能检测结果图。
图4为本发明不同组的水凝胶抗菌检测结果图；其中(1)为对照组(PBS组)，(2)为CD组，(3)为CDP组，(4)为CDP-P组，(5)为CDP-P+N组，(6)为CDP-PB+N组。
图5为本发明实施例1和对比例1～5制得的不同种类和不同浓度的水凝胶去除DPPH的检测结果图。
图6为本发明实施例1和对比例1～5制得的不同种类和不同浓度的水凝胶去除ABTS的检测结果图。
图7为本发明实施例1和对比例1～5制得的不同种类和不同浓度的水凝胶去除·OH自由基的检测结果图。
图8为本发明不同组的小鼠伤口愈合作用实拍对比图；其中(1)为PBS、(2)为CD、(3)为CDP、(4)为CDP-P、(5)为CDP-P+N、(6)为CDP-PB+N。
图9为本发明不同组小鼠伤口愈合作用的创面愈合率统计图；其中(1)为PBS、(2)为CD、(3)为CDP、(4)为CDP-P、(5)为CDP-P+N、(6)为CDP-PB+N。
具体实施方式
以下实施例仅就本发明的优选实施方案进行具体描述，并非对本发明的实施范围进行限定，对于技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，所作出的改进应当视为本发明的保护范围内。
实施例1
1)PDA@BNN6 NPs纳米球的制备：
采用乳液诱导界面各向异性组装法制备了PDA NPs纳米粒子。将0.6g F127、0.9g DA、0.96mL TMB分别加入30mL水和30mL乙醇中，超声分散至完全溶解，然后在搅拌中滴加2.25mL氨水，25℃水浴反应2h，11000r/min离心15min后丢弃上清，收集固体。用乙醇和去离子水分别洗涤3次。用30ml丙酮/乙醇混合物(1/2，v/v)超声30min去除模板剂，离心，重复操作3次。最后，在60℃下真空干燥得到PDA NPs纳米球。
将1.17mlBPA加入9ml无水乙醇中，并向溶液中注入足够的氮气以去除溶液中的空气。在氮气气氛下，一边搅拌一边向上述溶液中注入NaNO2(6M)水溶液10ml。搅拌30分钟后，用注射器缓慢加入HCl水溶液10ml(6M)。反应溶液的颜色由橙色变为红色，并出现米色沉淀物。再搅拌4h后，离心收集固体产物，分别用去离子水和50％(v/v)乙醇洗涤三次。最后将产物BNN6在避光的条件下进行真空冷冻干燥过夜，在避光保护下4℃保存。
将10mg PDA NPs纳米球分散于10ml去离子水中，同时将10mg BNN6溶解于5ml乙醇中。将BNN6溶液缓慢滴入PDA NPs纳米球分散液中，在黑暗条件下搅拌12h，然后静置2h，使其充分自组装。11000r/min离心15min后，丢弃上清液，用去离子水洗涤3次，得PDA@BNN6NPs纳米球。最后加入15ml去离子水重新分散，避光低温保存。
2)Chi-Ca的制备：
将3g壳聚糖加入300ml去离子水中，再加入1M盐酸使壳聚糖完全溶解，得到淡黄色透明液体。用NaOH(1M)调节液的pH至5.4，加入3.6g HCA，得到咖啡色的透明液。7.5g EDC溶解于300ml 50％(v/v)乙醇水溶液中，然后逐渐加入到上述壳聚糖混合液中，使其逐渐混浊。用HCl(1M)调节pH至4.6，剧烈搅拌2h，用纤维素膜(MWCO＝6000～8000Da)先在100mM的NaCl溶液(pH＝3～3.5)中透析48h，每12h换一次透析液，然后在去离子水(pH＝5)中透析12h，最后进行冷冻真空干燥得到Chi-Ca。
3)Dex-CHO的制备：
将5g葡聚糖(Dex)溶解于50ml去离子水中，5g NaIO4溶解于30ml去离子水中。然后将NaIO4溶液缓慢加入葡聚糖溶液中，在室温下避光搅拌12h。反应结束时，用10ml乙二醇终止反应。将产物用纤维素膜(MWCO＝3500Da)进行广泛的水透析3d，去除多余的反应物。最后，通过冷冻干燥得到纯化的Dex-CHO，并在4℃下保存。用盐酸羟胺滴定法测定Dex-CHO的氧化程度为55.6％。
4)PEI-PBA的制备：
将3.6g PEI和1.08g BPBA溶于30ml甲醇中，70℃油浴回流搅拌24h，冷却至室温后，冰醚中沉淀3次，60℃真空干燥，得到粗产品。将粗产物加入去水中过滤，去除不溶性杂质。最后经冻干得到PEI-PBA，4℃保存。
5)多功能水凝胶(CDP-PB)的制备：
将Chi-Ca溶于去离子水中得到Chi-Ca溶液，然后将PDA@BNN6 NPs加入Chi-Ca溶液中搅拌得到Chi-Ca/PDA@BNN6 NPs溶液，将Dex-CHO和PEI-PBA分别溶于去离子水中，得到Dex-CHO溶液和PEI-PBA溶液。将Chi-Ca/PDA@BNN6 NPs溶液、Dex-CHO溶液和PEI-PBA溶液等体积比混合，剧烈搅拌得到水凝胶CDP-PB，最后得到的水凝胶中Chi-Ca浓度为15mg/ml、PDA@BNN6 NPs的浓度为0.2mg/ml、Dex-CHO的浓度为25mg/ml、PEI-PBA的浓度为2.5mg/ml。
由图1(a)和图1(b)可知，本实施例制备的PDANPs具有介孔球状结构；由图1(c)和图1(d)可知，PDA@BNN6 NPs为均一的纳米球结构。
实施例2
该实施例与实施例1的区别仅在于将水凝胶中PEI-PBA的浓度更改为5mg/ml，其余条件和步骤和条件均一致。所制备的水凝胶的微观形貌和实物图均和实施例1一致。
实施例3
该实施例与实施例1的区别仅在于将水凝胶中PDA@BNN6 NPs的浓度更改为0.1mg/ml，其余条件和步骤和条件均一致。所制备的水凝胶的微观形貌和实物图均和实施例1一致，但由于PDA@BNN6 NPs的浓度减小导致所制备水凝胶的光热作用下的抗菌效果低于实施例1。
对比例1～5
对比例1～5分别为CD、CDP、CD-P、CDP-P和CD-PB水凝胶的制备，与实施例1的步骤基本相同，不同之处仅在于原料用量不同，各种水凝胶的组份详细信息见表1。
表1水凝胶中各组分的浓度(mg/ml)
将实施例1和对比例1～5得到的水凝胶进行扫描电镜形貌观察检测，结果见图2，其中图2(a)为水凝胶实物图；图2(b)为水凝胶的SEM图。由图2(b)中所示，CDP、CDP-P和CDP-PB的粒径明显小于CD、CDP和CD-PB三种水凝胶材料，这是因为CD、CDP和CD-PB三种水凝胶材料均未掺杂PEI-PBA，而CDP、CDP-P和CDP-PB由于掺入了PEI-PBA，增加了水凝胶的交联密度。
同时由图2(b)可知，本实施例所制备的CDP-PB水凝胶具有均一的网格结构；该结构使得水凝胶具有良好的吸附能力、保湿性能的同时，还具有自适应形状的特性，这一特性使得水凝胶在许多应用中能够更好地适应和满足实际需求。
将实施例1制备的CDP-PB水凝胶进行光热性能的测试：
将500μl的水凝胶放入2ml的玻璃瓶中，在808nm激光的照射下，用红外热像仪(FLIR C2，美国)每隔30s记录水凝胶的温度。研究了激光功率密度与材料光热性能的关系，并测量了CDP-PB水凝胶在不同功率密度(0.3、0.6、0.9、1.5、2.1W/cm2)808nm近红外激光照射条件下10min内的温升。
由图3可知CDP-PB水凝胶光热效果跟光功率密度有关，随着光功率密度增加光热效果增强。其中，在功率密度为0.6～2.1W/cm2的温升效果较好。
将实施例1和对比例1～5得到的水凝胶进行抗菌性能的测试：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在TSB培养基中培养，37℃孵育12h。细菌细胞生长到对数相后，将菌悬液离心(5000rpm，5min)，无菌生理盐水洗涤3次，再用无菌生理盐水重悬。然后将菌悬液稀释至108CFU/ml，即利用酶标仪测定其在600nm处的光密度(OD)为0.1。
采用斑点平板法检测水凝胶的抑菌活性。将50μl的108CFU/ml菌悬液加入到400μl的48孔板水凝胶表面，用808nm近红外激光(0.6W/cm2)照射或不处理水凝胶5min。对照组为未经照射处理的菌液，试验组分为CD、CDP、CDP-P、CDP-P+N、CDP-PB+N，其中CD、CDP和CDP-P组仅为菌液和水凝胶37℃共孵育了4h，而CDP-P+N和CDP-PB+N组是菌液和水凝胶37℃共孵育4h前，进行了近红外光的照射处理。孵育完成后，在水凝胶表面加入适量无菌生理盐水稀释细菌10倍。将稀释后的菌悬液转移到96孔板上，用无菌生理盐水逐级稀释。将稀释后的菌悬液转移到覆盖TSA的平板上，置于37℃恒温培养箱中，培养12h。抑菌量以菌落数计算，公式如下:
菌落(CFU/ml)＝C/V×M(1)
式中，C表示给定稀释度下在平板上生长的平均菌落数，V表示覆盖平板的稀释剂体积(mL)，M表示稀释次数。
由图4可知，CDP-PB+N处理组杀菌效果最好，杀菌率达99.9％，说明水凝胶由于含有PDA@BNN6 NPs，进行了近红外光的照射后有利于NO的热解释放，从而进一步提高了CDP-PB水凝胶的抗菌性能。
将实施例1和对比例1～5得到的水凝胶进行抗氧化性能的测试：
分别将400mg实施例1和对比例1～5得到的水凝胶加入4ml PBS(0.01M，pH＝7.2～7.4)中，使用组织研磨机将其分散到匀浆中，形成6组水凝胶分散液。然后用PBS(0.01M，pH＝7.2～7.4)将6组水凝胶分散液分别稀释至10mg/ml、5mg/ml和2.5mg/ml。
首先，对不同种类和不同浓度的水凝胶去除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的效果进行了评价。将500μl不同种类和不同浓度的水凝胶分散液与500μl的200μMDPPH混合，最终测试溶液体系中水凝胶分散液的浓度分别为5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml。37℃孵育10min后，离心收集上清，用酶标仪测定517nm处吸光度。结果见图5。
然后，评价不同种类和不同浓度的水凝胶对2,2′-氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的清除作用。等量的7.4mM的ABTS和过硫酸钾(K2S2O8，2.6mM)混合。在室温黑暗环境中搅拌12h后，用PBS(0.01M，pH＝7.2～7.4)稀释上述混合溶液。将不同种类和不同浓度的水凝胶分散液500μl与稀释后的ABTS 500μl混合，最终测试溶液体系中水凝胶分散液的浓度分别为5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml。室温孵育10min，离心收集上清，用酶标仪测定405nm处吸光度。结果见图6。
最后，评价了不同种类和不同浓度的水凝胶对羟基自由基(·OH)的清除作用。500μl的过氧化氢(100μM)和50μl的辣根过氧化物酶(合1mg/ml)进行反应生成了羟基自由基(·OH)，当与不同种类和不同浓度的500μl混合水凝胶分散液在室温下孵化10分钟。加入100μl(3,3',5,5'-四甲基联苯胺(2.5mg/ml)溶解在二甲亚砜(DMSO)进行颜色反应，离心收集上清液，用酶标仪测量650nm处的吸光度。
在上述实验中，以PBS(0.01M，pH＝7.2～7.4)代替水凝胶分散液作为对照试验。自由基清除率按下式计算:
清除率(％)＝((Ab-Ah))/Ab×100％
式中Ab为对照组吸光度，Ah为水凝胶组吸光度。
不同种类和不同浓度的水凝胶对羟基自由基(·OH)的清除作用结果见图7。
由图5～7可知，水凝胶对DPPH、·OH和ABTS的清除率是浓度依赖性的。当水凝胶匀浆浓度高达5mg/ml时，所有水凝胶都显示出较高水平的抗氧化活性，能有效清除DPPH、·OH和ABTS自由基。对比发现，当水凝胶匀浆浓度低于5mg/ml时，掺入PDANPs或PDA@BNN6 NPs的水凝胶的清除效果优于未掺入的水凝胶。这主要是因为水凝胶中自由基清除作用归因于游离儿茶酚基团和儿茶酚-硼酸复合物。此外，PDA NPs或PDA@BNN6 NPs增加了水凝胶体系中游离儿茶酚基团和儿茶酚-硼酸盐络合物的含量，从而增强了纳米颗粒掺杂水凝胶对自由基的清除能力。
将实施例1和对比例1～5得到的水凝胶进行伤口愈合性能的测试：
所有动物实验均在中南大学湘雅医学院实验动物中心(中国长沙)按照实验方案和伦理规则完成。雄性BALB/c小鼠(6周龄)在给药前驯化2周。为了建立链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠，连续5天注射STZ。具体为：小鼠禁食12小时，然后腹腔注射新鲜制备的STZ(50mg/kg)，禁食2小时。给药完成后，每隔5天从尾静脉采血，并用血糖仪测量血糖水平。3周后，当小鼠空腹葡萄糖浓度高于300mg/l时，认为小鼠患有糖尿病。
所有手术均在无菌条件下进行。糖尿病小鼠被固定住，用电动剃须刀刮掉小鼠背部的毛，刮掉的地方用脱毛膏进行进一步的脱毛。手术区域用75％酒精消毒。腹腔注射戊巴比妥钠溶液(6mg/ml)麻醉小鼠，并在小鼠背部制造直径为8mm的圆形全皮肤创面。然后在每个创面中加入50μl MRAS菌悬液(108CFU/ml)，静置48h。将糖尿病小鼠随机分为对照组(PBS)、CD组、CDP组、CDP-P组、CDP-P+N组和CDP-PB+N组。近红外组在感染创面加入水凝胶敷料后，用808nm近红外激光(0.6W/cm2)照射创面5min，同时用热像仪记录创面热像。每2天更换一次水凝胶，共4次处理。分别于第0、4、6、8、10、14天拍摄伤口。采用Image J软件对创面面积进行测量和分析。
由图8和图9可知，(1)PBS、(2)CD、(3)CDP、(4)CDP-P治疗组第4天创面部位明显出现化脓，表明存在严重的细菌感染。其中PBS组创面愈合最慢，第14天愈合率仅为63.4±5.6％。治疗14d后，CD组、CDP组、CDP-P组、CDP-P+N组、CDP-PB+N组创面愈合率分别为71.8±8.6％、77.1±5.7％、85.5±4.2％、89.0±3.3％、96.7±2.3％。结果表明CDP-PB+N治疗组在伤口愈合方面显示出优异的效果。
此外，在第14天，通过涂片法检测创面组织中是否有残留细菌来评估各组水凝胶的体内抗菌效果。CDP-PB+N治疗组表现出较强的抗菌效果，抗菌率为97.3％，明显高于其他组。表明具有CDP-PB水凝胶良好的抗菌活性是PEI-PBA阳离子聚合物表现的正电荷、PDA@BNN6 NPs纳米球释放大量NO气体和PTT效应共同作用的结果。

Claims (9)

1.一种多功能水凝胶，其特征在于：包括苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺、负载BNN6的聚多巴胺纳米球、儿茶酚基团功能化的壳聚糖和氧化葡聚糖；其中，苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺、负载BNN6的聚多巴胺纳米球、儿茶酚基团功能化壳聚糖和氧化葡聚糖的质量比为(10～100)：(1～10)：(60～600)：(100～1000)。
2.根据权利要求1所述的一种多功能水凝胶，其特征在于：
所述苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺由聚乙烯亚胺和4-(溴甲基)苯硼酸通过取代反应得到；
所述聚乙烯亚胺和4-(溴甲基)苯硼酸的质量比为(3～4)：1。
3.根据权利要求1所述的一种多功能水凝胶，其特征在于：
所述负载BNN6的聚多巴胺纳米球由聚多巴胺纳米球和BNN6在避光条件下通过自组装π-π堆叠得到；
所述聚多巴胺纳米球是通过以下方法制备得到：将三嵌段共聚物F127、盐酸多巴胺和1,3,5-三甲苯混合加入氨水进行水浴反应后，超声去除1,3,5-三甲苯模板剂，即得。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种多功能水凝胶，其特征在于：所述儿茶酚基团功能化的壳聚糖由壳聚糖和3,4-二羟基苯丙酸通过酰胺化反应得到；
所述酰胺化反应采用EDC作为羧基活化剂，反应过程中pH为4～6；
所述壳聚糖和3,4-二羟基苯丙酸的质量比为1：(1～1.5)。
5.根据权利要求4所述的一种多功能水凝胶，其特征在于：
所述氧化葡聚糖由葡聚糖经过高碘酸钠氧化得到；
所述葡聚糖与高碘酸钠的质量比为1：(1～2)；
所述氧化的条件为：室温下避光反应10～12h。
6.权利要求1～5任一项所述的一种多功能水凝胶的制备方法，其特征在于：将苯硼酸基团接枝修饰的聚乙烯亚胺、负载BNN6的聚多巴胺纳米球、儿茶酚基团功能化的壳聚糖和氧化葡聚糖分散在水中混合，即得。
7.权利要求1～5任一项所述的一种多功能水凝胶的应用，其特征在于：应用于制备糖尿病伤口愈合敷料。
8.根据权利要求7所述的一种多功能水凝胶的应用，其特征在于：所述糖尿病伤口愈合敷料具有光热效应，在光热作用下具有抗菌、抗氧化及促血管生成的功能。
9.根据权利要求8所述的一种多功能水凝胶的应用，其特征在于：所述光热作用的条件为：照射功率密度为0.1～10W/cm2，光照时间为5～20min的近红外激光。
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