CN117805375A

CN117805375A - 一种分析nk细胞分化分期及nk细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用

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Publication number: CN117805375A
Application number: CN202410217205.9A
Authority: CN
Inventors: 刘艳荣; 王亚哲
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2024-02-28
Filing date: 2024-02-28
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2044-02-28
Also published as: CN117805375B

Abstract

本发明涉及抗体医药技术领域，特别是涉及一种分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用。利用本发明提供的抗体组合物结合流式细胞术可以对临床患者的骨髓液、胸腹水、外周血或***等标本进行免疫表型分析，对临床怀疑NK细胞肿瘤直接利用本发明的抗体组合物进行一步检测，对临床诊断不明的患者需经初筛管检测后怀疑为NK细胞肿瘤时，利用本发明的抗体组合物进行第二步检测，对NK细胞进行全面免疫分型、克隆性鉴定、分化途径识别、肿瘤细胞的分期判断、筛查MRD标志及治疗靶点。

Description

一种分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用

技术领域

本发明涉及抗体医药技术领域，特别是涉及一种分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用。

背景技术

NK（natural killer）细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和***。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。

对NK的识别主要依据其表达的膜表面或胞内的分子，如表达CD56，CD16，CD57，同时表达CD7，CD2，CD161，CD94，颗粒酶A/B和穿孔素，不表达T系特异性标志CD3及T系相关性标志CD4，CD5，TCRαβ，或TCRγδ，但低水平表达CD8，cCD3，CD159a，CD159c及CD158系列(KIRs)。一般利用CD3^-CD56⁺和/或CD16⁺对NK细胞进行设门。并将NK细胞分为CD56^st+CD16^-和CD56^dim+CD16⁺ 2类，前者是早期NK细胞，主要具有细胞因子分泌功能；后者是晚期NK细胞。主要行使细胞杀伤功能。

NK的肿瘤包括前体NK细胞肿瘤和成熟NK细胞起源的NK细胞淋巴瘤。前者由于NK细胞的分化路径与髓系前体细胞及T系来源细胞有很大的重叠性，至今很难定义，文献报道也有很大的不确定性。部分诊断为髓性/NK急性白血病的实体，被认为是前体NK细胞起源，但与具有原始的免疫表型特征-微分化型急性髓性白血病（AML-M0）难以区分开来。母细胞样浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）因为表达CD56曾经被归为NK白血病。在发育早期，NK祖细胞表达标志与T-ALL重叠，包括CD7、CD2，甚至CD5和cCD3（e链）；因此，很难区分T-ALL和前体NK细胞肿瘤，而哪些是NK细胞特异性标志，并不清楚。2008版WHO分类***中将NK-淋巴母细胞白血病/淋巴瘤归入系列分类不明白血病目录下，2016年归入淋巴母细胞白血病/淋巴瘤目录下，作为临时分类。也说明此类肿瘤诊断的难度。

对成熟NK细胞淋巴瘤（NHL-NK）根据2022年WHO分类，将其分为侵袭性NK细胞白血病（ANKL）、NK大颗粒淋巴细胞白血病（NK-LGLL）、结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）。

NK细胞肿瘤的总体发病率很低，对其缺乏***性认识。因其缺乏独特的组织病理学模式，重叠的细胞形态特征，免疫表型复杂性、缺乏特定的遗传异常和多样性临床表现均使诊断NK肿瘤具有较大的难度。

NK细胞淋巴瘤诊断的难点是确定其克隆性。而克隆性的确定是诊断肿瘤的先决条件。T细胞的克隆性可以通过检测TCRvβ受体库或TRBC1确定。但NK细胞不具有此类受体，因此克隆性较难确定。文献报道利用KIR（CD158）系列受体来帮助确定NK细胞的克隆性。CD158系列在正常人有一定的表达频率，在NK细胞肿瘤中可以异常高表达或不表达。但因NK细胞肿瘤发病率较低，研究报道较少，且阳性率不高，其在NK细胞淋巴瘤中的表达需要进一步研究。

流式细胞术（FCM）在白血病及淋巴瘤的诊断中发挥着重要的作用，FCM的优势是快递、高通量、敏感。每秒检测上万个细胞，同时检测多种细胞标志，包括膜表面及胞内蛋白分子。利用一些系列特异性标志，可以在复杂的血细胞或骨髓（BM）或组织标本中将淋巴细胞，粒细胞、单核细胞及其他细胞区分开，然后对不同的细胞进行精细的分析。

由于肿瘤性NK细胞经常发生抗原表达异常性改变，如不表达或低表达CD56、CD16、CD57、CD7等，在此情况下利用这些可抗原对NK细胞进行设门就很困难。其余的NK细胞相关标志如CD161、CD94、颗粒酶和穿孔素，不仅表达在NK细胞，还在部分T细胞中表达，因此特异性不强，这些抗体是否可以帮助对NK细胞进行设门及确定NK细胞来源仍不确定。另外由于NK细胞肿瘤发病率很低，在一般的免疫分型抗体组合中NK相关抗体的使用频率较低，因此对一些抗体的正常表达谱均不太清楚，这些标志在鉴别肿瘤性或克隆性NK细胞的作用也不清楚。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用。本发明提供的抗体组合物可以对NK肿瘤细胞进行全面免疫分型、克隆性鉴定、分化途径识别、肿瘤细胞的分期判断、筛查MRD标志及治疗靶点。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物，包括膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物；

所述膜标记抗体组合物包括：抗CD3抗体、抗CD2抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD56抗体、抗CD57抗体、抗CD16抗体、抗CD161抗体、抗CD94抗体、抗CD159a抗体、抗CD159c抗体、抗CD158a抗体、抗CD158b抗体、抗CD158e抗体、抗NKp30抗体、抗NKp46抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体；

所述胞内标记抗体组合物包括：抗颗粒酶B抗体和抗穿孔素抗体。

优选的，所述抗体组合物中的抗体为荧光素标记的抗体；

所述膜标记抗体组合物中，抗CD3抗体、抗CD2抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD56抗体、抗CD57抗体、抗CD16抗体、抗CD161抗体、抗CD94抗体、抗CD159a抗体、抗CD159c抗体、抗CD158a抗体、抗CD158b抗体、抗CD158e抗体、抗NKp30抗体、抗NKp46抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体的荧光素标记按顺序分别为：cFluorR668、BV510、BV650、BV480、cFluorB548、PE-Fire700、BV711、cFluorV450、PE-Cy7、PE-Dazz1e594、PE-Cy5、PE、APC-Fire750、FITC、APC、BV785、BV605、APC-Fire810和cFluorV547；

所述胞内标记抗体组合物中，抗颗粒酶B抗体的荧光素标记为BV421，抗穿孔素抗体的荧光素标记为cFluorR720。

优选的，所述膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物在检测时分别用于1个流式管中。

本发明提供了上述技术方案所述抗体组合物在制备NK细胞检测相关产品中的应用，所述NK细胞检测包括（1）~（6）中的一种或多种：

（1）对NK细胞进行肿瘤免疫分型；

（2）对NK细胞进行克隆性鉴定；

（3）对NK细胞的分化途径进行识别；

（4）对NK细胞进行分化分期；

（5）筛查MRD标志物；

（6）筛查NK肿瘤治疗靶点。

本发明提供了一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的试剂盒，包括上述技术方案所述抗体组合物；所述抗体组合物中的膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物独立包装。

优选的，所述试剂盒还包括：红细胞溶解液、破膜剂和缓冲液PBS。

本发明提供了一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的***，包括检测模块和分析模块；

所述检测模块用于通过流式细胞术检测待测样本的抗原表达水平，包括上述技术方案所述抗体组合物或上述技术方案所述的试剂盒；

所述分析模块用于分析检测模块的检测结果。

本发明提供了上述技术方案所述的试剂盒或上述技术方案所述的***在制备NK肿瘤细胞检测相关产品中的应用，所述NK细胞检测包括（1）~（6）中的一种或多种：

（1）对NK细胞进行肿瘤免疫分型；

（2）对NK细胞进行克隆性鉴定；

（3）对NK细胞的分化途径进行识别；

（4）对NK细胞进行分化分期；

（5）筛查MRD标志物；

（6）筛查NK肿瘤治疗靶点。

有益效果：

利用本发明提供的抗体组合物结合流式细胞术可以对临床患者的骨髓液、胸腹水、外周血或***等标本进行免疫表型分析，对临床怀疑NK细胞肿瘤直接利用本发明进行一步检测，对临床诊断不明的患者需经初筛管（参见中国专利CN202310744220.4）进行第一步筛查检测后怀疑为NK细胞肿瘤时，利用本发明进行第二步检测，对NK细胞进行全面免疫分型、克隆性鉴定、分化途径识别、肿瘤细胞的分期判断、筛查MRD标志及治疗靶点。

进一步的，本发明提供的抗体组合物可以配合初筛管的使用，全面分析NK细胞的表型，具体作用包括：

1、了解NK细胞的分化规律，初筛管中利用CD3、CD56、CD7、CD5对CD3^-CD56⁺CD7⁺CD5^-NK细胞进行设门，分析NK细胞的比例（正常<40%）。当NK细胞比例增加及出现CD56和CD7弱表达（dim）或不表达的异常表型时，需利用本发明提供的抗体组合物进行第二步NK细胞的进一步检测。

2、在利用初筛管对正常NK细胞分析时，本发明发现存在少数早期NK细胞，表型为CD117⁺CD45^dim+CD56强表达（st）。而初筛管中包含胞核（n）TdT、CD34、CD38、CD33、MPO、cCD3抗体，因此本发明可以同时观察早期NK细胞这些抗原的表达，本发明发现这些早期的NK细胞为nTDT^-CD34^-CD38^-CD33^-MPO^-，cCD3可以出现少数阳性。当早期NK细胞比例增加及抗原出现表达异常时，如阴性变阳性或阳性变阴性，提示表型异常，需利用本发明提供的抗体组合物进行第二步NK细胞的进一步检测。

3、对临床就诊时已怀疑NK细胞肿瘤的标本，可以直接采用本发明提供的抗体组合物进行NK细胞的检测。

4、上述1~3种情况发生时，则利用本发明的21个抗体组合对NK细胞进行进一步全面的检测，以确定是否为NK细胞，表型是否异常，是否为克隆性及确定肿瘤性NK细胞的比例及异常性，并可以判断NK肿瘤细胞的分化阶段。用于确定NK细胞肿瘤、免疫分型、肿瘤分期鉴定及确定治疗后微量残留病（MRD）监测的标志：白血病相关的免疫表型（LAIP）及筛查治疗靶点及治疗后进行MRD检测。

更重要的是，利用本发明提供的抗体组合物，可以方便的利用多种标志对NK细胞进行灵活的设门，全面分析NK细胞不同分化期抗原表达的规律，帮助确定哪些标志为NK细胞特异性标志，尤其是早期NK分化的标志，对确定是否为NK细胞系列来源的肿瘤细胞有重要作用。而目前主要将NK细胞分为CD56^st+CD16^-/dim+和CD56⁺CD16⁺两个阶段，通过本发明提供的抗体组合物，可以同时根据CD159和CD158系列及NKp46、穿孔素和颗粒酶的表达将NK细胞进行更精细的分期，并对不同期及不同亚群的NK细胞进行精细分析，以明确不同期NK细胞上本组合中的21个抗体的表达特点，对分析NK细胞的分化途径，特别是鉴别前体NK细胞肿瘤提供了依据，解决了临床上此类肿瘤诊断的一大难点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为一例正常骨髓标本正常NK细胞检测结果；

图2为一例第1期NK肿瘤细胞的检测结果；

图3为一例CD5⁺NK肿瘤细胞检测结果；

图4和图5为一例CD7^-NK肿瘤细胞检测结果；

图6为一例CD56^-NK肿瘤细胞检测结果；

图7为一例骨髓标本存在前体NK肿瘤细胞检测结果。

具体实施方式

在本发明中，所述抗体组合物中的抗体优选为荧光素标记的抗体；

所述膜标记抗体组合物中，抗CD3抗体、抗CD2抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD56抗体、抗CD57抗体、抗CD16抗体、抗CD161抗体、抗CD94抗体、抗CD159a抗体、抗CD159c抗体、抗CD158a抗体、抗CD158b抗体、抗CD158e抗体、抗NKp30抗体、抗NKp46抗体、抗HLA-DR抗体和抗CD45抗体的荧光素标记按顺序分别优选为：cFluorR668、BV510、BV650、BV480、cFluorB548、PE-Fire700、BV711、cFluorV450、PE-Cy7、PE-Dazz1e594、PE-Cy5、PE、APC-Fire750、FITC、APC、BV785、BV605、APC-Fire810和cFluorV547；

所述胞内标记抗体组合物中，抗颗粒酶B抗体的荧光素标记优选为BV421，抗穿孔素抗体的荧光素标记优选为cFluorR720；所述膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物在检测时优选分别用于1个流式管中。

本发明还提供了上述技术方案所述抗体组合物在制备NK细胞检测相关产品中的应用，所述NK细胞检测包括（1）~（6）中的一种或多种：

（1）对NK细胞进行肿瘤免疫分型；

（2）对NK细胞进行克隆性鉴定；

（3）对NK细胞的分化途径进行识别；

（4）对NK细胞进行分化分期；

（5）筛查MRD标志物；

（6）筛查NK肿瘤治疗靶点。

本发明还提供了一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的试剂盒，包括上述技术方案所述抗体组合物；所述抗体组合物中的膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物独立包装。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括：红细胞溶解液、破膜剂和缓冲液PBS。

本发明还提供了一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的***，包括检测模块和分析模块；

所述分析模块用于分析检测模块的检测结果。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒或上述技术方案所述的***在制备NK肿瘤细胞检测相关产品中的应用，所述NK细胞检测包括（1）~（6）中的一种或多种：

（1）对NK细胞进行肿瘤免疫分型；

（2）对NK细胞进行克隆性鉴定；

（3）对NK细胞的分化途径进行识别；

（4）对NK细胞进行分化分期；

（5）筛查MRD标志物；

（6）筛查NK肿瘤治疗靶点

利用本发明提供的抗体组合物结合流式细胞术可以对临床患者的骨髓液、胸腹水、外周血或***等标本进行免疫表型分析，对临床怀疑NK细胞肿瘤直接利用本发明进行一步检测，对临床诊断不明的患者需经初筛管（参见中国专利CN202310744220.4）检测后怀疑为NK细胞肿瘤时，利用本发明进行第二步检测，对NK细胞进行全面免疫分型、克隆性鉴定、分化途径识别、肿瘤细胞的分期判断、筛查MRD标志及治疗靶点。

本发明实施例的抗体优选购自BD公司，Biolegend、cytek公司、贝克曼公司；本发明实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；本发明实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 试剂的配制

本实施例使用的最终抗体组合及配伍的荧光素见表1，膜标记抗体共19种，包括：抗CD16-eFluorV450、抗CD7-BV480、抗CD2-BV510、抗CD45-cFluorV547、抗NKp46-BV605、抗CD5-BV650、抗CD57-BV711、抗NKp30-BV785、抗CD158b-FITC、抗CD8-cFluorB548、抗CD159c-PE、抗CD94-PE-Dazzle594、抗CD159a-PE-Cy5、抗CD56-PE-Fire700、抗CD161-PE-Cy7、抗159e-APC、抗CD3-cFluorR668、抗158a-APC-Fire750、抗HLA-DR-APC-Fire810。胞内标记抗体2种，包括：抗颗粒酶B-BV421和穿孔素-cFluorR720。

表1 抗体组合与荧光素配伍

配置抗体组合：取上述两组抗体（膜标记抗体和胞内标记抗体），按照预实验确定的每次用量，混合置于2个容器内，得到用于膜标记的抗体预混液和用于胞内标记的抗体预混液。上述抗体购自BD公司，Biolegend、cytek公司和贝克曼公司。

将上述抗体组合在一起制备用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的检测试剂盒。所述试剂盒还包括红细胞溶解液、破膜剂和缓冲液PBS，所述红细胞溶解液可自行配置也可以商业购买。

实施例2 抗体组合流式细胞分析NK细胞肿瘤的免疫表型

一、实验主要材料及仪器

1. 材料：10×PBS缓冲液、流式细胞仪专用溶血素（BD公司）；

2. 仪器： NL-3000型号全光谱流式细胞仪（Cytek公司），配备405nm，488nm、635nm三根激光，38个荧光检测器。台式低速离心机、漩涡混匀器。

二、方法

1. 样本采集：

将取材到的人骨髓液或外周血1~3mL立即置于肝素抗凝管并迅速颠倒数次以防止标本凝固。胸腹水、***、灌洗液等各种细胞，采集后应尽快送往实验室，标本放置于4℃冷藏保存。必须在48小时内完成流式细胞术（FCM）检测，按说明书操作。

2. 样本制备过程：

（1）细胞计数：取骨髓10μl加入150μ PBS，混匀，利用迈瑞FCM（型号mindray）计数每微升细胞数，根据检测结果，将细胞浓度调整为5~10×10⁶/100µl，取50~100µl细胞加入试管中。***标本用组织研磨器制备成单个细胞，再细胞计数。

（2）抗原染色：

a）每管分别加入实施例1中用于膜标记的抗体预混液和细胞充分混匀，室温避光孵育15 min；

b）透膜：加入透膜剂A液100μl，室温作用5min。

c）溶血：加入1×FACS溶血素2ml，低速涡流混匀，室温避光静置8~10min。300g离心洗涤5min，弃去上清。

d）洗涤：加入1ml PBS洗液，300g离心洗涤5min，弃去上清。

e）固定：加入透膜剂B液100μl，固定细胞膜并使其通透，同时加入实施例1中用于胞内标记的抗体预混液，混匀后室温避光孵育15min。

f）洗涤：加入1ml含有0.1% NaN₃和1%~2% BSA的PBS洗液，300g离心洗涤5min，弃去上清。加入PBS 200μl悬浮细胞，待上机检测。

（3）上机检测：

a）确定最适电压和补偿：按照光谱流式细胞仪的常规操作方法设定电压，参照实施例1所述试剂盒的荧光配色制备单染样本，用于仪器设定。

b）仪器设置、校正和质控：Cytek NL-3000开机预热机器20min以上并上去离子水冲洗，检测内质控品，保证各检测值在控制范围内。调取AL-PANAL上样，采集数据。

c）上机检测：按照设定好的仪器条件，每管获取5~10万细胞。如不能及时上机检测，则加入0.5ml 1%多聚甲醛，混匀后置于4℃冰箱内保存，24小时内完成检测。

三、结果分析：使用Kaluza软件分析数据：

（一）病例分析

（1）使用FSC-A/FSC-H设置去双连体细胞门A，SSC-A/SSC-B继续设置门B去黏连，FSC-A/SSC-A图去除碎片及死细胞，将活的单个细胞设门R1。

（2）显示R1门细胞，建立CD45/SSC图，根据细胞的分布不同，对淋巴细胞（淋）、单核细胞（单）、粒细胞（粒）、有核红细胞（红）、幼稚细胞（幼）进行设门并设定不同颜色。观察各群细胞比例是否正常。幼稚细胞比例是否增加等。正常骨髓中，各群细胞具有正常比例范围：淋系细胞20~40%，单核细胞2~8%，粒细胞40~60%，有核红细胞2~15%，幼稚细胞低于5%。

（3）显示淋巴细胞门细胞，建立CD3/CD56图，对CD3⁺CD56-T细胞、CD3⁺CD56⁺NKT细胞、CD3^-CD56^+/-NK细胞进行设门（NK1门），并观察各群细胞比例。

（4）确定NK细胞在淋巴细胞中或有核细胞中的比例：显示NK1门细胞，建立一系列2个抗体的二维点图，对NK细胞进行进一步设门，以去除非NK细胞的干扰。对正常NK细胞，利用CD2/CD7，CD5/CD161对CD3^-NK1门内CD2⁺CD7⁺CD5^-/dimNK细胞进行设门（NK），以除去CD2^-CD7^-B细胞及CD5^st+残留T细胞。精确的设门是准确的分析NK细胞表型的前提。但肿瘤性NK可以出现CD7^-、CD56^-、CD16^-、CD161^-等异常表型，需要根据具体标本中肿瘤性NK细胞的表达特定，例如多数NK细胞表达颗粒酶B、CD94、NKp46，不表达CD5，则在CD3^-NK1门内利用颗粒酶B阳性、CD94阳性、NKp46阳性及CD5阴性，对CD7^-CD56^-CD16^-的NK细胞进行灵活的设门，最终确定NK细胞在淋巴细胞中或有核细胞中的比例，及分析肿瘤性NK细胞本组合中其他抗原的表达情况，判定其异常性。

（5）分析NK细胞的分化规律及判断是否出现表型异常：建立一系列2个抗体的二维点图，显示NK门细胞，观察组合内其余标志的全部表达情况。主要包括CD56/CD16、CD56/CD94、CD56/NKp46、CD94/C159a、CD94/C159c、CD56/穿孔素、CD56/颗粒酶B、CD158e/CD158a、CD158b/CD158a、CD159c/CD159a、NKp30/NKp46、CD5/CD7、CD16/CD57、CD16/CD161、CD8/HLA-DR、CD94/CD161等。

（6）分析不同抗原在NK细胞群中的阳性比例，本发明中，首先检测正常标本，确立正常参考值（表2~3），并以均数±3×SD作为判断异常的标准。分析肿瘤标本时，确定NK细胞的克隆性（表4）。

（二）判定LAIP标志，对于NK肿瘤的LAIP主要包括：

1、交叉系列抗原表达或跨系抗原表达，注意是否表达髓系及T系相关抗原：CD33、CD5等。

2、以正常NK细胞抗原表达强度作为标准判断标本中NK细胞抗原表达强度有无异常，如CD56，CD16，CD161，CD94，CD7等。

3、克隆性异常，CD158a/b/e和CD159a/c的异常高表达（限制性或克隆性），标准见表5中阈值。

（三）提供筛查治疗靶点相关的标志的依据：针对NK肿瘤的靶向药物目前很少，通过本发明的检测，可以筛选在NK肿瘤表达率较高且对NK细胞较特异的标志，例如本发明筛选得到CD159a阳性的NK肿瘤发生率较高，且90%以上的肿瘤细胞表达此抗原，而NKp46只在NK细胞表达，不表达在T细胞，是非常特异性的NK细胞标志，可用于治疗靶点的开发。

（四）MRD检测：利用本组合在治疗后用于MRD检测，依据患者的LAIP，对异常NK细胞进行检测，同时可分析异常NK细胞的克隆性，以发现肿瘤性NK细胞。

四、结果：

共检查20例正常人外周血（PB），其中男11例，女9例，中位年龄42岁（22~65）岁。建立正常人淋巴细胞、CD3^-CD56⁺NK细胞、CD3⁺CD56^-T细胞及CD3⁺CD56⁺NKT细胞及本组合中主要抗体的参考范围，见表2和表3。从表3可以看出，经常用于NK细胞分析的抗原除在NK细胞上表达，多数还表达于NKT或T细胞，如CD94、CD161、CD159a、颗粒酶B、穿孔素；CD159c主要表达在NK和NKT中；CD158系列抗体主要表达于NK细胞，在NKT中少量表达；而CD16、NKp30及NKp46只表达在NK细胞中，对鉴别NK细胞的特异性较强。

表2 正常人PB淋巴细胞亚群结果

表3 正常人PB NK、NKT及T细胞检测抗原的参数值（%）

自2021年8月至2023年10月共检测标本48例，男27例，女21例，中位年龄58岁（6~84）。其中包括31例NK肿瘤，4例意义未明克隆性NK（NK-Cus）和11例正常或1例反应性NK细胞增多标本。11例正常NK标本包括：4例骨髓增生性肿瘤，2例T细胞增殖性肿瘤，1例浆细胞白血病，1例血小板减低及1例粒细胞缺如标本（基本信息见表4）。1例反应性NK细胞增多病例为病毒感染者，男，68岁，WBC 36.07×10⁹/L，HB 138×10⁹g/L，PLT 202×10⁹/L，淋巴细胞占80.84%，其中Nk细胞占91.47%。1例三系减低患者出现异常前体NK细胞，男，65岁，WBC 2×10⁹/L，HB 46×10⁹g/L，PLT 16×10⁹/L，淋巴细胞占25.31%，其中Nk细胞占5.31%。从表4可以看出NK肿瘤标本，其淋巴细胞%及NK%均明显增高。

表4 48例标本的基本信息

注：NK%为NK在淋巴细胞中的百分比。

根据不用抗原表达的参考值，主要以均数±3×SD为标准确定抗原是否表达异常，个别标志根据正常骨髓标本结果进行了微调。主要参考14个标志： CD56^hi>26%、CD5>19%、CD7<60%、CD16<47%、CD56<80%、CD161<47.39%、NKp30>91%、CD94<10%、CD158a>50%、CD158b>88%、CD158e>44%、CD159a>89%、CD159c>50%、颗粒酶B<16.83%、穿孔素<60%。每个参数异常计为1分，对三组标本进行了积分分析（表5）。从表5可以看出，出现异常表达频率最高的标志为CD159a、CD159c的克隆性（高表达或称限制性表达）及CD161的低表达，而CD158系列标志克隆性表达率较低。

表5 各组中抗原表达异常的病例数及所占百分比

通过积分分析，可以将NK肿瘤与正常NK或反应NK细胞鉴别。31例NK肿瘤标本全部积分³2，11正常NK细胞及1例病毒感染的反应性标本积分全部<2分，其中3例1分，其余0分。4例NK-Cus标本，分别为滤泡淋巴瘤、血小板增多、贫血及血小板减低的患者，标本中出现NK细胞积分³2，达到NK肿瘤患者积分标准，但NK%均不高，意义未明，将其单独分类。

根据NK细胞的分化规律及NK肿瘤细胞抗原的表达特点，本发明依据CD159a、CD159c、CD158a/b/e、CD57共6个抗原将NK细胞肿瘤分为1~4共4期，第1期：只出现CD159a克隆性；第2期：出现159a和CD159c的克隆性；第3期：CD158a/b/e 3个抗体中任何一个出现克隆性，可同时出现CD159c克隆性，或CD158和CD159a均阴性；第4期：在III期表型的基础上出现CD57高表达（>70%）。

31例NK肿瘤，1~4期分别为13例、6例、7例及5例（表5）。分析不同抗原在1~2期及3~4期中出现异常表达的例数及百分比，可以看出CD56强表达、CD16、穿孔素、CD161及CD7的低表达均全部发生在1~2期NK肿瘤中。其中CD56强表达，CD16、穿孔素的低表达符合早期NK细胞的分化规律，但CD161及CD7低表达与分化阶段不符，属于肿瘤性异常。正常NK细胞中CD158系列表达于CD56^dimCD16⁺晚期，CD57也表达于最晚期。说明1~4期代表了NK肿瘤细胞分化由低到高的变化过程。本发明发现3例CD5的表达异常只见于第4期NK肿瘤，说明CD5的表达见于晚期的NK细胞分化阶段。本发明按照CD159a、CD159c、CD158a/b/e、CD57 6个参数对NK肿瘤进行分期，可以反映NK细胞的分化阶段。虽然正常早期NK细胞强表达CD56、CD94和NKp46，不表达CD16，但因肿瘤NK不依据正常分化规律发展，所以无法完全依据这些标志对NK肿瘤进行分期，而本发明的结果说明依据CD159a和CD159c能够对早期NK进行鉴别。也说明CD159a表达早于CD159c，而较多的1-2期NK肿瘤，说明CD159a和CD159c在NK细胞克隆性鉴别中的作用比CD158系列强。只依据CD158系列抗原的克隆性判断NK肿瘤，将漏诊大部分NK肿瘤。

前体NK细胞肿瘤：本发明发现一例三系减低的患者，其骨髓中淋巴细胞比例正常，但经筛查管检测发现存在少量CD5^-CD7⁺CD56⁺CD117^p+cCD3^-CD33^p+CD34^-异常幼稚细胞，此群细胞CD45^dim+，是否为前体NK细胞不能确定。用本发明组合进一步检测，发现CD3^-CD7⁺细胞中存在三个亚群，分别为1、CD7⁺CD94^-CD56^-/dim+；2、CD7^st+CD94⁺CD56^st+；3、CD7^d+CD94⁺CD56^dim+CD16⁺。第1群细胞不表达CD94及其他NK相关标志，强表达CD117，不表达CD34和CD38，CD56从阴到弱阳，少数细胞表达CD33和MPO，似为NK祖细胞。第2群细胞，表达早期NK细胞相关标志：CD159a，NKp46，少数细胞弱表达CD16，符合早期NK细胞表型。第3群细胞同时表达颗粒酶B，符合晚期NK细胞。CD117⁺NK细胞在正常骨髓中比例很少，只出现于部分CD56^hiCD16^-早期NK细胞中。在31例NK肿瘤中未见CD117表达。此例患者CD117⁺在NK中达到63%，比例明显增高，而且还出现17%更早期的NK祖细胞，本发明认为属于为前体NK细胞。虽然在有核细胞中的比例为1.0%，但提示有出现急性NK细胞白血病的可能。而急性NK细胞白血病太少见，如何诊断一致是个悬而未定的问题。此例患者说明NKp46、CD159a和CD94在鉴别前体NK中起到重要作用，为诊断前体NK肿瘤提供重要依据。因为此类肿瘤发病率太低，2年内只见到1例，还需要进一步累计病例加以验证，但本发明为此类肿瘤的诊断提供了重要依据。

病例检测结果：

图1为一例正常骨髓标本正常NK细胞检测结果。在CD45/SSC图中对淋巴细胞（淋），单核细胞（单），粒细胞（粒）及有核红细胞（红）进行设门并显示比例。利用CD56/CD3，对CD56⁺CD3^-NK细胞（NK1）CD56⁺CD3⁺（NKT）细胞、CD56^-CD3⁺（T）细胞设门。建立CD2/CD7和CD5/CD161图显示NK1门内细胞，选择CD2⁺CD7⁺，和CD5^-CD161⁺细胞对NK细胞进行进一步设门（NK）。建立CD56/CD16图显示NK门内细胞，对CD56^hiCD16^-早期（56^hi）NK和CD56^dim+CD16⁺晚期（56^d）NK细胞设门。建立一系列2维点图，均显示NK门内细胞，分析不同抗原在早期和晚期NK细胞中的表达特点。图中显示早期NK细胞表型为CD94^st+NKp46⁺CD159⁺CD161⁺CD7^st+，而其余的标志均不表达；晚期NK细胞出现表达的抗原为颗粒酶、穿孔素、CD159c、CD158系列、CD57。不表达HLA-DR。

图2为一例第1期NK肿瘤标本的细胞检测结果。在CD45/SSC图中对淋巴细胞（淋），单核细胞（单），粒细胞（粒）及有核红细胞（红）进行设门并显示比例。建议CD56/CD3图，对CD56⁺CD3⁺ （NKT）细胞、CD56^-CD3⁺（T）细胞设门。因NK肿瘤可以出现CD56-，故选择CD56^+/-CD3^-（NK1）对NK细胞进行初步设门。建立CD2/CD7和颗粒酶/CD94图显示NK1门内细胞，选择CD2⁺CD7⁺和颗粒酶⁺细胞对NK细胞进行进一步设门（NK）。建立CD56/CD16图显示NK门内细胞，对CD56^hiCD16^-/dim+早期NK（56^hi）和CD56^dim+CD16^dim+晚期NK（56^d）设门。建立一系列2维点图，均显示NK门细胞，分析不同抗原在早期和晚期NK细胞中的表达特点。从CD94/CD56图中显示少数细胞CD56^-CD94⁺及CD56⁺CD94^-NK细胞，从其他图中可见CD56⁺CD94^-NK细胞同时表达颗粒酶B、穿孔素、CD159c、CD158、CD57、CD161、CD16及CD5，多克隆性表达CD158系列，但不表达CD159a，说明为正常晚期NK细胞。CD94⁺CD56^+/-细胞全部表达CD159a、CD94st和NKp46，低表达颗粒酶B、穿孔素、CD16、HLA-DR、CD7，极少数表达CD158e，不表达CD158a、CD158b、NKp30、CD159c、CD161、CD5为克隆性NK细胞。属于第1期NK肿瘤。此例标本存在CD56^-克隆性NK细胞，因此不能只选择CD56⁺CD3^-NK细胞，设门方法需要变化。

图3为一例CD5⁺NK肿瘤细胞检测结果。在CD45/SSC图中对淋巴细胞（淋），单核细胞（单），粒细胞（粒）及有核红细胞（红）进行设门并显示比例。利用CD56/CD3，对CD56^+/-CD3^-（NK1）NK细胞进行初步设门（NK1），同时对CD56⁺CD3⁺（NKT）细胞、CD56^-CD3⁺ （T）细胞设门设门。建立CD2/CD7和CD56/CD161图显示NK1门内细胞，选择CD2⁺CD7⁺，和CD56^+/-CD161⁺细胞对NK细胞进行进一步设门（NK）。建立CD56/CD16图显示NK门内细胞，对CD56^hiCD16^-早期（56^hi）NK和CD56^dim+CD16⁺晚期（56^d）NK细胞设门。建立一系列2维点图，均显示NK 门内细胞，分析不同抗原在早期和晚期NK细胞中的表达特点。图中显示56^hi早期NK细胞表型未见明显异常。但CD5⁺NK细胞在NK细胞中占55.54%，比例明显增高，对CD5⁺NK细胞设门，显示CD5⁺细胞表型为CD159c⁺CD158a⁺CD16^st+CD161⁺CD57⁺CD7^dim+穿孔素⁺颗粒酶B⁺，不表达CD94、NKp46、CD158b、CD158e、CD159a、CD8、HLA-DR，为克隆性NK细胞，分为第4期。

图4和图5为一例CD7^-NK肿瘤细胞检测结果。对淋巴细胞（淋），单核细胞（单），粒细胞（粒）及有核红细胞（红）、CD56^+/-CD3^-（NK1）、CD56⁺CD3⁺（NKT）细胞、CD56^-CD3⁺（T）细胞设门同前。建立CD94/NKp46和CD56/CD94图显示NK1门内细胞，选择CD94^+/dim+将CD94-细胞去除（NK）。建立CD5/CD7图显示NK门内细胞，可见绝大对数细胞不表达CD7（7-），只有极少数细胞表达CD7（7+），对2群细胞进行设门。建立一系列2维点图，均显示NK 门内细胞，分析其余抗原在CD7⁺和CD7^-2群细胞中的表达特点。图4显示CD7^-NK细胞表型，此群细胞CD159a⁺占90%，CD56从强到阴性，CD56^hi和NKp46比例增加，不表达CD16、CD161和穿孔素，计分6分，属于第一期NK肿瘤。图5显示CD7⁺NK细胞，此群细胞表达CD16、CD56^dim、CD94、穿孔素、颗粒酶B，全部标志表达均在参考范围，为正常NK细胞。

图6为一例CD56^-NK肿瘤细胞检测结果。对淋巴细胞（淋），单核细胞（单），粒细胞（粒）及有核红细胞（红）、CD56^+/-CD3^-（NK1）、CD56⁺CD3⁺（NKT）细胞、CD56^-CD3⁺（T）细胞设门同前。建立穿孔素/颗粒酶B及CD94/CD7图显示NK1门内细胞，选择穿孔素⁺和CD94⁺细胞对NK细胞精确设门（NK）。建立CD56/CD16图显示NK门内细胞，对CD56^hiCD16^-早期（56^hi）NK和CD56^dim+CD16⁺晚期（56^d）NK细胞设门，可见>90%细胞不表达CD56。建立一系列2维点图，均显示NK门内细胞，分析不同抗原在三群NK细胞中的表达特点。可见CD56^hiNK细胞抗原表达未见明显异常，为正常早期NK细胞。而CD56^d和CD56^-NK细胞抗原表达基本一致，此群细胞强表达穿孔素、颗粒酶B，表达CD7和CD16，弱表达CD94，不表达CD159a、CD159c、NKp46、CD158b、CD158e、CD159a，为晚期NK细胞，但CD56和CD158系列均阴性，为异常克隆性表现。归入第3期NK肿瘤。

图7为一例骨髓标本存在前体NK肿瘤细胞检测结果。图7中的A为本发明实施例1的抗体组合，图7中的B为利用中国专利CN202310744220.4筛查的结果，图7中的B证明存在CD5^-CD7⁺CD56⁺CD117^p+cCD3^-CD33^p+CD34^-异常幼稚细胞，是否为NK细胞不能确定。用本发明组合进一步检测（图7中的A），利用CD45/CD7（7⁺）、CD56/CD3（NK1）和SSC^lowNKp46⁺（NK）对此群细胞进行设门。此群细胞存在三亚群，分别为1.CD7⁺CD94^-CD56^-；2.CD7^st+CD94⁺CD56^st+；3.CD7^d+CD94⁺CD56^dim+CD16⁺。第1群细胞不表达CD94及其他NK相关标志，强表达CD117，不表达CD34和CD38，CD56从阴到弱阳，少数细胞表达CD33和MPO，似为NK祖细胞。第2群细胞，表达NK早期相关标志：CD159a，NKp46，少数细胞弱表达CD16，符合早期NK细胞。第3群细胞同时表达颗粒酶B，表型符合晚期NK细胞。CD117⁺细胞在NK中达到63%，比例明显增高，其中还包括更早期的NK祖细胞，为前体NK细胞。虽然在有核细胞中的比例为1.0%，但提示有出现急性NK细胞白血病的可能。

对于筛查残留白血病标志（LAIP）：在找到NK细胞的分化规律后，就比较容易鉴别，可依据肿瘤的分期判断表型异常，例如第1期肿瘤，出现CD56和CD7弱表达，CD159a克隆性表达，均可作为MRD检测的LAIP。对第2期肿瘤，出现CD159a和CD159c双克隆性表达，如同时存在CD161^dim，或CD7^dim或CD56^hi，是很好的检测MRD的LAIP。3~4期肿瘤主要依据CD158和CD159c或NKp30的克隆性，可能同时出现CD94^dim，颗粒酶B低表达，或表达CD5，可作为鉴别肿瘤性NK细胞的标志，是检测MRD的LAIP。

治疗靶点的筛查：通过全面的分析正常NK细胞及肿瘤性NK细胞的抗原表达特定，可以选择在肿瘤性NK细胞发生率较高的抗原如CD159a或CD159c及特异性高的抗原，如NKp46，作为候选靶点抗原，用于肿瘤的治疗。

对比例1

设计20种以上的抗体组合的难点在于，荧光素太多，是目前传统流式细胞术一倍多（8~10种），一半以上的荧光素是临床未使用过的。而每种荧光素的强度不同，光谱之间有干扰，需要选择合适的抗原进行配伍，使荧光素之间的干扰尽可能低。另外，使用的抗体需要从公司购买，而不同公司其抗体的质量不同，哪些抗体质量好，哪些抗体质量差，均需要验证。针对某个抗体不同公司可供选择的荧光素有限。而选择什么样的抗体进行组合也需要丰富的临床免疫分型的检验。这些均为设计20种以上抗体组合带来很大难度。本发明发抗体组合的研发也经历了几个阶段历，时1年多的时间才达到满意的结果，研发过程如下：

第一版抗体组合共20个抗体，相对于表1中的抗体组合不包括抗CD56、抗CD2和抗HLA-DR抗体，但包括NKp44-PE-CY7和CD4-APC-Fire810，且抗CD161抗体为BD公司的BV510。

在具体病例实施时，采用CD3^-CD16⁺，CD7+CD5^-，对NK细胞进行设门，经检测6例后发现CD16和CD7经常弱表达或阴性，这些抗体难以对NK细胞进行精确设门，故在第一版组合中加入CD56-PE-Fire700，为第二版抗体组合，共21个抗体。在连续检测11例后，发现CD161-BV510全部为阴性，与理论结果不同，又对多个公司的CD161抗体进行试用，最终选用贝克曼公司CD161，但因可供选择的荧光素有限，只有FITC、PE、PE-CY7，而在已经检测的11例标本中NKp44-PE-CY7均为阴性，故选择CD161-PE-CY7，将原NKp44剔除，为第三版组合，共20个抗体。在连续检测31例标本，对结果进行总结分析时，发现CD158b-PerCP-Cy5.5结果与常规10色结果有很大差异，经常规检测CD158b为克隆性表达，而本发明为阴性。在用正常标本进行反复验证后，认为第三版组合中CD158b-PerCP-Cy5.5与PE-Dazz1e594，PE-Cy5，PE-Fire700光谱间有很大干扰，影响CD158b的检测，必须进行调整。因CD158b可供选择抗体较少，CD7可供选择的荧光素抗体较多，故换成CD158b-FITC，原CD7-FITC换成BV480。同时在结果分析时发现NK肿瘤均不表达CD4，而HLA-DR在NK肿瘤时经常表达，故将CD4去除，原通道改为HLA-DR，并加入CD2-BV 510，以加强对NK细胞设门的能力。形成第4版即最终的抗体组合（表1）。上述抗体购自BD公司，Biolegend、cytek公司和贝克曼公司。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物，其特征在于，包括膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物；

2.根据权利要求1所述的抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物中的抗体为荧光素标记的抗体；

3.根据权利要求1或2所述的抗体组合物，其特征在于，所述膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物在检测时分别用于1个流式管中。

4.权利要求1~3任一项所述抗体组合物在制备NK细胞检测相关产品中的应用，所述NK细胞检测包括（1）~（6）中的一种或多种：

（1）对NK细胞进行肿瘤免疫分型；

（2）对NK细胞进行克隆性鉴定；

（3）对NK细胞的分化途径进行识别；

（4）对NK细胞进行分化分期；

（5）筛查MRD标志物；

（6）筛查NK肿瘤治疗靶点。

5.一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述抗体组合物；所述抗体组合物中的膜标记抗体组合物和胞内标记抗体组合物独立包装。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：红细胞溶解液、破膜剂和缓冲液PBS。

7.一种用于分析NK细胞分化分期及NK细胞肿瘤免疫分型的***，其特征在于，包括检测模块和分析模块；

所述检测模块用于通过流式细胞术检测待测样本的抗原表达水平，包括权利要求1~3任一项所述抗体组合物或权利要求5或6所述的试剂盒；

所述分析模块用于分析检测模块的检测结果。

8.权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7所述的***在制备NK肿瘤细胞检测相关产品中的应用，所述NK细胞检测包括（1）~（6）中的一种或多种：

（1）对NK细胞进行肿瘤免疫分型；

（2）对NK细胞进行克隆性鉴定；

（3）对NK细胞的分化途径进行识别；

（4）对NK细胞进行分化分期；

（5）筛查MRD标志物；

（6）筛查NK肿瘤治疗靶点。