CN117802142A - 一种生产SAMe的基因工程酵母菌株及其生产SAMe的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供过表达SAM2基因在提高基因工程菌株的SAMe产量中的应用，属于基因工程领域。所述SAM2基因包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其功能变体；所述基因工程菌株为表达SAMe的基因工程酵母菌株SHF01，保藏编号为CGMCC No.28946。所述基因工程酵母菌株通过在KH01双倍体酿酒酵母菌株上δ整合SAM2基因过表达SAM2，通过酿酒酵母菌SHF01G消抗获得。KH01发酵的SAMe产量为0.27g/L，SHF01G摇瓶发酵的SAMe产量为0.9g/L，SHF01摇瓶发酵的SAMe产量为0.83g/L，即δ整合SAM2基因后，SAMe摇瓶发酵产量提高将近3倍。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种生产SAMe的基因工程酵母菌株及其生产SAMe的方法。
背景技术
S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAMe)是一种重要的代谢中间体，存在于所有生物体内，并在各种生物反应中发挥关键作用。S-腺苷-L-甲硫氨酸是一种辅酶，参与甲基、硫基、氨丙基的转运，存在于所有的真核细胞中，是人体组织和体液中普遍存在的一种生理活性分子，主要适用于肝硬化前和肝硬化所致肝内胆汁淤积、妊娠期肝内胆汁淤积，能使各种原因导致的肝功能异常转为正常。自1952年意大利科学家首先分离出SAMe以来，用于将其治疗抑郁症、关节炎、肝功能紊乱等疾患；在美国，已经成为一种畅销的保健品。
S-腺苷-L-甲硫氨酸的生产方法主要有化学合成法、酶促合成法和微生物发酵法等。化学合成法制备SAMe主要有3条途径[1]：①利用5'-甲硫腺苷和DL-2-氨基-4-溴丁基酸化学合成消旋的SAMe，合成的SAMe有50％具有生物活性；②通过S-腺苷同型半胱氨酸(S-Adenosylhomocysteine，SAH)和甲基供体CH3I或(CH3)3S催化合成，反应底物SAH价格昂贵，而且产物中含有20％～30％没有生物活性的(R,S)-SAMe异构体；③以价格低廉的腺苷(Adenosine)为底物和亚硫酰氯进行反应制备5-(氯甲基)腺苷盐酸；以L-甲硫氨酸为底物在-30～-40℃的条件下生成L-同型半胱氨酸；以5-(氯甲基)腺苷盐酸盐和L-同型半胱氨酸为底物在70-80℃的条件下进行缩合反应得到S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)；以三甲基氧鎓四氟硼酸盐为甲基供体对SAH进行甲基化得到终产物SAMe。该法合成SAMe存在产率低、反应条件苛刻、反应产物异构体多、分离纯化困难以及环境污染等不足，现已很少使用。
酶促合成法是利用SAMe合成酶催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成SAMe，且SAMe合成酶有三磷酸酶活性，将三磷酸分解为焦磷酸和磷酸，该法具有明确的工艺，提取出的SAMe纯度高，但生产过程操作复杂，耗时长，成本高。
微生物发酵法可以利用廉价的生产原料，通过特定的微生物代谢合成SAMe，操作简单，成本较低，且生产速率快，易于扩大规模[2]。因此，发酵法生产SAMe受到越来越多的关注。微生物发酵法是20世纪60年代至今工业化生产SAMe的主要途径。一些微生物尤其是酵母属(Saccharomyces)的菌株，在含有L-甲硫氨酸的培养基中生长时，可以在细胞内积累较高浓度的SAMe。通过这些微生物的大规模发酵及提取精制，可获得有生物活性的SAMe。随着SAMe需求量不断提升，使用基因工程手段改造生产SAMe的研究也越来越多，目前亟需开发一种产量较高，操作简单，可应用于工业化生产的SAMe生产方法。
[1]牛卫宁,左晓佳,王丽衡等.S-腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展[J].化学与生物工程,2009,26(03):1-5.
[2]李美京,米哲言,王金浩等.微生物发酵法生产S-腺苷甲硫氨酸的研究进展[J].生物工程学报,2023,39(06):2248-2264.
发明内容
本发明提供过表达SAM2基因在提高基因工程菌株的SAMe产量中的应用，属于基因工程领域。所述SAM2基因包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其功能变体；所述基因工程菌株为表达SAMe的基因工程酵母菌株SHF01，保藏编号为CGMCC No.28946。所述基因工程酵母菌株通过在KH01双倍体酿酒酵母菌株上δ整合SAM2基因过表达SAM2，通过酿酒酵母菌SHF01G消抗获得。KH01发酵的SAMe产量为0.27g/L，SHF01G摇瓶发酵的SAMe产量为0.9g/L，SHF01摇瓶发酵的SAMe产量为0.83g/L，即δ整合SAM2基因后，SAMe摇瓶发酵产量提高将近3倍。
本发明的技术方案包括：
一方面，本发明提供了过表达SAM2基因在提高基因工程菌株的SAMe产量中的应用。
具体地，所述SAM2基因包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其功能变体。
具体地，所述基因工程菌株为表达SAMe的基因工程菌株。
进一步具体地，所述基因工程菌株为表达SAMe的基因工程酵母菌株。
优选地，所述基因工程菌株为酿酒酵母菌SHF01G或酿酒酵母菌SHF01，所述酿酒酵母菌SHF01通过酿酒酵母菌SHF01G消抗获得。
进一步优选地，所述酿酒酵母菌SHF01于2023年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28946，分类命名为Saccharomyces cerevisiae。
又一方面，本发明提供了一种基因工程酵母菌株的构建方法，所述构建方法包括在表达SAMe的基因工程菌株中过表达SAM2基因。
具体地，所述SAM2基因包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其功能变体。
具体地，所述构建方法包括通过质粒转化过表达或δ整合过表达。
具体地，所述表达SAMe的基因工程菌株为表达SAMe的基因工程酵母菌株。
进一步具体地，所述基因工程菌株为酿酒酵母菌SHF01G或酿酒酵母菌SHF01。
进一步具体地，所述质粒转化过表达包括构建过表达SAM2基因的质粒，所述的质粒的骨架为含有大肠杆菌ori和Amp，以及酿酒酵母的TEF promotor、GPD promotor和KanMX组件的pHA180载体。
进一步具体地，所述通过δ整合过表达，包括构建过表达SAM2基因的δ整合片段，所述δ整合片段为SHF01G整合片段。
优选地，所述SHF01G整合片段通过扩增pHF85质粒构建得到。
进一步优选地，所述pHF85质粒通过将pHF85片段和带同源臂的SAM2片段通过无缝克隆方式重组到含有大肠杆菌ori和Amp，以及酿酒酵母的TEF promotor、GPD promotor和KanMX组件的pHA180载体上获得。
再进一步优选地，所述扩增所用引物为3delta-R和5delta-F；所述3delta-R具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，5delta-F具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
具体地，所述构建方法还包括抗性筛选和消除抗性，所述的抗性选自博来霉素、遗传霉素、嘌呤霉素、潮霉素B或诺尔斯菌素。
优选地，所述的抗性选自博来霉素、遗传霉素。
又一方面，本发明提供了上述构建方法构建的基因工程菌株。
具体地，所述基因工程菌株为基因工程酵母菌株。
进一步具体地，所述基因工程酵母菌株通过在双倍体酿酒酵母菌株上δ整合SAM2基因过表达SAM2。
优选地，所述基因工程酵母菌株为酿酒酵母菌SHF01G或酿酒酵母菌SHF01。
进一步优选地，所述消抗菌株为酿酒酵母菌SHF01于2023年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.28946，分类命名为Saccharomycescerevisiae。
优选地，所述双倍体酿酒酵母菌株为KH01。
进一步优选地，所述双倍体酿酒酵母菌株KH01菌株购买自烟台马利酵母有限公司，批号为YT201902260569。
又一方面，本发明提供了一种基因工程菌株，所述基因工程菌株为基因工程酵母菌株。
具体地，所述基因工程酵母菌株为酿酒酵母菌SHF01，所述酿酒酵母菌SHF01通过酿酒酵母菌SHF01G消抗获得。
具体地，所述构建方法还包括抗性筛选和消除抗性，所述的抗性选自博来霉素、遗传霉素、嘌呤霉素、潮霉素B或诺尔斯菌素。
优选地，所述的抗性选自博来霉素、遗传霉素。
优选地，所述酿酒酵母菌SHF01于2023年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28946，分类命名为Saccharomyces cerevisiae。
又一方面，本发明提供了上述基因工程菌株再在生产SAMe或制备含SAMe的产品中的应用。
具体地，所述应用包括在提高SAMe产量中的应用。
具体地，所述产品包括含SAMe的饲料、食品、保健品或药品中的应用。
又一方面，本发明提供了一种SAMe的生产方法，其特征在于，所述生产方法通过发酵权利要求上述的基因工程酵母菌株获得SAMe。
所述生产方法包括如下步骤：
(1)将基因工程酵母菌株接入培养基中进行培养，得到种子液；
(2)将步骤(1)制备得到的种子液转入发酵培养基中进行培养；
(3)补加L-Met，培养，得到含有SAMe的发酵液。
具体地，步骤(1)中所述的基因工程酵母菌株为SHF01菌株；
优选地，所述酿酒酵母菌SHF01于2023年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28946，分类命名为Saccharomyces cerevisiae。
具体地，步骤(1)中所述的培养基包括YPD培养基。
优选地，所述YPD培养基每升培养基中包括20g葡萄糖、10g酵母粉、20g大豆蛋白胨FP410，以无菌去离子水定容至1L，自然pH 6.5。
具体地，步骤(2)中所述的发酵培养基包括O培养基。
优选地，所述O培养基每升培养基中包括50g葡萄糖、5g酵母粉、10g蛋白胨、0.5g七水硫酸镁、2g磷酸氢二钾、4g磷酸二氢钾、1.5g L-甲硫氨酸，以无菌去离子水定容至1L。
具体地，所述的发酵过程中，还包括对上述的发酵培养基进行高压蒸汽灭菌步骤。
优选地，所述的灭菌温度为121℃，时间20-30min。
具体地，步骤(3)中所述的L-Met的浓度为0.75g/L。
优选地，步骤(3)中所述的发酵液中SAMe的检测方法为高效液相色谱法(HPLC)。
具体地，所述检测方法包括如下步骤：
取500μL发酵液，添加1mL的1.5mol/L高氯酸，于40℃水浴锅水浴30min，8000r/min离心10min，上清液用0.22μm的水相膜过滤后，用HPLC检测SAMe产量。
优选地，HPLC的参数如下：
采用Welch Ultimate Aq-C18色谱柱，4.6*250*5μm；
流动相A为：10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液，磷酸调pH至3.0；
流动相B为：乙腈；
流动相A：流动相B体积比为82：18；
柱温为30℃；
波长为254nm，进样量为5μL；
检测时间为11min；
利用紫外检测器检测波长254nm，初始流动相的流速为1.0mL/min，7min时流速升到1.2mL/min。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供过表达SAM2基因在提高基因工程菌株的SAMe产量中的应用，属于基因工程领域。所述SAM2基因包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其功能变体；所述基因工程菌株为表达SAMe的基因工程酵母菌株SHF01，保藏编号为CGMCC No.28946。
(2)KH01发酵的SAMe产量为0.27g/L，SHF01G摇瓶发酵的SAMe产量为0.9g/L，SHF01摇瓶发酵的SAMe产量为0.83g/L，即δ整合SAM2基因后，SAMe摇瓶发酵产量提高将近3倍。
保藏说明
菌株名称：酿酒酵母菌SHF01；
分类命名：酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae；
保藏编号：CGMCC No.28946；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏时间：2023年11月13日；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为HPLC测定SAMe的图谱。
图2为SAM2基因过表达。
图3为SHF01G发酵筛选。
图4为SHF01G消抗克隆筛选。
图5为SHF11G发酵筛选。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行说明，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明，以使本发明技术方案更易于理解掌握。下属实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明均可从商业途径获得。
本实施例中所用材料如下：
1、YPD培养基：每升培养基中含20g葡萄糖、10g酵母粉、20g大豆蛋白胨FP410，以无菌去离子水定容至1L，自然pH 6.5。
2、O培养基：每升培养基中含50g葡萄糖、5g酵母粉、10g蛋白胨、0.5g七水硫酸镁、2g磷酸氢二钾、4g磷酸二氢钾、1.5g L-甲硫氨酸，以无菌去离子水定容至1L。
3、G418遗传霉素：购买自翌圣生物，货号60220ES08。
4、Phleo腐草霉素：购买自翌圣生物，货号60217ES20。
实验方法1酿酒酵母基因操作方法
KH01感受态细胞的制备：
KH01菌株(购买自烟台马利酵母有限公司，批号为YT201902260569)，利用山梨醇法制备酵母电转化KH01感受态细胞。
1.1质粒的转化方法
将0.5μg质粒加入制备得到的KH01感受态细胞中，混匀，加入2mm电击杯中，放置5-10min，电击转化，电击后迅速加入0.5mL YPD培养基，30℃复苏培养2h，从中取出120μL涂布于含有0.5g/L G418的YPD琼脂平板培养基中，30℃培养48h，得到转化子。
1.2整合片段的转化方法
将2-3μg整合片段加入制备得到的KH01感受态细胞中，混匀，加入2mm电击杯中，放置5-10min，电击转化，电击后迅速加入0.5mL YPD培养基，30℃复苏培养2h，从中取出120μL涂布于含有不同浓度G418(1g/L、2g/L、3g/L)的YPD琼脂平板培养基中，30℃培养48h，得到转化子。
实验方法2酿酒酵母菌摇瓶发酵生产SAMe方法
1、摇瓶发酵：
从含G418的YPD琼脂平板培养基上挑取单菌落，接种于含有4mL YPD培养基的试管中，置30℃摇床250rpm活化过夜；取培养20h后的种子400μL至20mL的O培养基(底物为L-Met)中，置30℃摇床250rpm，进行发酵培养；发酵培养24h时，补加0.5mL的0.75g/L L-Met(母液浓度为30g/L)继续发酵24h，得发酵液。
2、SAMe的提取：
取500μL发酵液，添加1mL的1.5mol/L高氯酸，于40℃水浴锅水浴30min，8000r/min离心10min，上清液用0.22μm的水相膜过滤后，用高效液相色谱(HPLC)检测SAMe产量，检测方法详见实验方法3。
实验方法3HPLC测定发酵液中的SAMe
HPLC参数如下：
采用Welch Ultimate Aq-C18色谱柱，4.6*250*5μm；
流动相A为：10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液，磷酸调pH至3.0；
流动相B为：乙腈；
流动相A：流动相B体积比为82：18；
柱温为30℃；
波长为254nm，进样量为5μL；
检测时间为11min；
利用紫外检测器检测波长254nm，初始流动相的流速为1.0mL/min，7min时流速升到1.2mL/min。
实验结果：
HPLC测定SAMe的图谱如图1所示，从图1中可以看出，SAMe的出峰时间为6-7分钟。
实施例1质粒过表达SAM2
1、以pHA180为模板，以引物对TEF-homL和TEF-homR进行PCR扩增，得到大小为5950bp的pHF82片段，所述引物对TEF-homL和TEF-homR序列见表1，所述pHA180具有如SEQID No.1所示的序列。
表1TEF-homL和TEF-homR序列信息
2、以BY4742酵母基因组为模板，以引物对SAM2-homL和SAM2-homR(序列表2)进行PCR扩增，得到大小为1202bp的带同源臂的SAM2片段，具有如SEQ ID No.2所示的序列。
表2SAM2-homL和SAM2-homR序列信息
3、将步骤1制备得到的pHF82片段和步骤2制备得到的带同源臂的SAM2片段，通过无缝克隆方式(GBclonart无缝克隆试剂盒，苏州神洲基因有限公司，货号GB2001)重组到含有大肠杆菌ori和Amp，以及酿酒酵母的TEF promotor、GPD promotor和KanMX组件的pHA180载体上，得到SAM2过表达质粒pHF82，命名为pHF82质粒。
4、将步骤3制备得到的pHF82质粒按照实验方法1中1.1所述的质粒的转化方法，转化至KH01感受态细胞中，得到转化子KH01/pHF82。
5、将步骤4中培养得到的转化子KH01/pHF82和KH01(对照组)参照实验方法2所述方法，进行摇瓶发酵和SAMe的提取，参照实验方法3所述的方法，用高效液相色谱(HPLC)检测SAMe产量。
测定结果见图2，KH01发酵的SAMe产量为0.26g/L，KH01/pHF82发酵的SAMe产量为0.37g/L，表明经过SAM2过表达后，SAMe产量提高。
实施例2SAM2基因的δ整合
考虑到游离质粒在酵母中表达不稳定，把优势基因SAM2整合到基因组上。
1、以pHA184为模板，以引物对TEF-homL和TEF-homR进行PCR扩增，得到大小为6390bp的pHF85片段，所述pHA184具有如SEQ ID No.3所示的序列。
2、以BY4742酵母基因组(购买自淼灵生物，货号T0081)为模板，以引物对SAM2-homL和SAM2-homR进行PCR扩增，得到大小为1202bp的带同源臂的SAM2片段，具有如SEQ IDNo.2所示的序列。
3、将以步骤1制备得到的pHF85片段和步骤2制备得到的带同源臂的SAM2片段，通过无缝克隆方式(GBclonart无缝克隆试剂盒，苏州神洲基因有限公司)重组到含有大肠杆菌ori和Amp，以及酿酒酵母的TEF promotor、GPD promotor和KanMX组件的pHA184载体上，得到SAM2整合质粒pHF85，命名为pHF85质粒。
4、将pHF85质粒为模板，以引物对3delta-R和5delta-F进行PCR扩增，得到大小为4836bp的SHF01G整合片段。
表3 3delta-R和5delta-F序列信息
| 引物 | 序列号 | 引物序列(5′→3′) |
| 3delta-R | SEQ ID No.8 | CTGAGAAATATGTGAATGTTGAGataattg |
| 5delta-F | SEQ ID No.9 | CTGTTGGAATAGAAATCAACTATCatctac |
5、将步骤4制备得到的SHF01G整合片段，按照实验方法1中1.2所述的整合片段的转化方法，转化至KH01感受态细胞中，得到不同浓度(1g/L、2g/L、3g/L)G418 YPD琼脂平板培养基培养得到的转化子SHF01G，即SHF01G重组菌株。
6、将步骤5制备得到的转化子SHF01G，参照实验方法2所述方法，进行摇瓶发酵和SAMe的提取，参照实验方法3所述的方法，用高效液相色谱(HPLC)检测SAMe产量。
测定结果见图3，KH01发酵的SAMe产量为0.27g/L，SHF01G重组菌株发酵的SAMe产量均显著提高，SAMe基因δ整合后筛选高产菌株，3g/L G418筛选出的菌株SAMe产量可达0.9g/L以上，与KH01相比提高将近3倍。
实施例3SHF01G消抗
1、将pSH65质粒转化至SHF01G重组菌株，操作方法如下：
将0.5μg pSH65质粒(购买自翌圣生物，货号P1352)加入至实施例2制备得到的KH01/SHF01G中，混匀，加入2mm电击杯中，放置5-10min，电击转化，电击后迅速加入0.5mLYPD培养基，30℃复苏培养2h，从中取出120μL涂布于含有15mg/L phleo的YPD琼脂平板培养基中，30℃培养48h，得到转化子。
2、转化子接种至2mL含2％半乳糖的YPG中(不加葡萄糖的YPD加160μL的半乳糖)，诱导培养2-3小时后，取出10μL菌液，加入990μL无菌水稀释100倍，从中取出120μL涂布于YPD琼脂平板培养基，30℃培养2-3天，选取单克隆，分别点于Phleo板和G418抗性板进行培养，选取两个抗性平板都不长的克隆，划线YPD纯化，得到正确消抗的菌株，命名为SHF01，保藏编号为CGMCC No.28946。
3、摇瓶发酵：将步骤2中培养得到的SHF01和未经消抗的SHF01G(对照组)参照实验方法2所述方法，进行摇瓶发酵和SAMe的提取，参照实验方法3所述的方法，用高效液相色谱(HPLC)检测SAMe产量。
结果见图4，SHF01G发酵的SAMe产量为0.85g/L，SHF01发酵的SAMe产量为0.83g/L，SHF01G消抗后SAMe产量没有下降。
实施例4SAM2基因δ整合酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 1C)感受态细胞
实施例4与实施例2的区别仅在于：步骤5和步骤6不同：
步骤5：将步骤4制备得到的SHF01G整合片段，按照实验方法1中1.2所述的整合片段的转化方法，转化至Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 1C感受态细胞中，于1、2、3g/LG418 YPD琼脂平板培养基培养得到的转化子SHF11G，发酵筛选所有克隆。
步骤6：将步骤5制备得到的转化子SHF11G，参照实验方法2所述方法，进行摇瓶发酵和SAMe的提取，参照实验方法3所述的方法，用高效液相色谱(HPLC)检测SAMe产量。
测定结果见图5，Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 1C发酵的SAMe产量为0.15g/L，SHF11G发酵的SAMe产量为0.5g/L，可见SHF11G发酵SAMe产量有提高，无论单倍体酵母还是双倍体酵母δ整合SAM2基因都是能提高SAMe的产量。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。
Claims (10)
1.过表达SAM2基因在提高基因工程菌株的SAMe产量中的应用，其特征在于，所述SAM2基因包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其功能变体；所述基因工程菌株为表达SAMe的基因工程菌株；所述基因工程菌株优选为表达SAMe的基因工程酵母菌株。
2.一种基因工程酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括在表达SAMe的基因工程菌株中过表达SAM2基因，所述的SAM2基因包括如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其功能变体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括通过质粒转化过表达或δ整合过表达；所述表达SAMe的基因工程菌株为表达SAMe的基因工程酵母菌株。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述质粒转化过表达包括构建过表达SAM2基因的质粒，所述的质粒的骨架为含有大肠杆菌ori和Amp，以及酿酒酵母的TEFpromotor、GPD promotor和KanMX组件的pHA180载体；所述δ整合过表达包括构建过表达SAM2基因的δ整合片段，所述δ整合片段为SHF01G整合片段。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括抗性筛选和消除抗性，所述的抗性选自博来霉素、遗传霉素、嘌呤霉素、潮霉素B或诺尔斯菌素。
6.通过权利要求2-5任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌株。
7.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为基因工程酵母菌株，所述基因工程酵母菌株为δ整合了SAM2基因的酿酒酵母菌SHF01，保藏编号为CGMCC No.28946。
8.权利要求6或7所述的基因工程菌株在生产SAMe或制备含SAMe的产品中的应用。
9.一种SAMe的生产方法，其特征在于，所述生产方法通过发酵权利要求6或7中所述的基因工程菌株获得SAMe。
10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括如下步骤：
(1)将基因工程菌株接入培养基中进行培养，得到种子液；
(2)将步骤(1)制备得到的种子液转入发酵培养基中进行培养；
(3)补加L-Met，培养，得到含有SAMe的发酵液。
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410161691.7A Pending CN117802142A (zh) | 2024-02-05 | 2024-02-05 | 一种生产SAMe的基因工程酵母菌株及其生产SAMe的方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN117802142A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1385537A (zh) * | 2002-06-14 | 2002-12-18 | 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 | 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 |
| CN103087934A (zh) * | 2012-01-16 | 2013-05-08 | 浙江工商大学 | 高产s-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法 |
| CN103382496A (zh) * | 2012-05-03 | 2013-11-06 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
| CN103993055A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-08-20 | 浙江工业大学 | 一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法 |
| CN114574377A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-06-03 | 江南大学 | 一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用 |
-
2024
- 2024-02-05 CN CN202410161691.7A patent/CN117802142A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1385537A (zh) * | 2002-06-14 | 2002-12-18 | 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 | 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 |
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| CN103382496A (zh) * | 2012-05-03 | 2013-11-06 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种制备s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
| CN103993055A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-08-20 | 浙江工业大学 | 一种生物合成腺苷蛋氨酸的方法 |
| CN114574377A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-06-03 | 江南大学 | 一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用 |
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