CN117778238A

CN117778238A - 一种约氏乳杆菌及其相关产品和应用

Info

Publication number: CN117778238A
Application number: CN202311658979.7A
Authority: CN
Inventors: 李光玉; 赵梦迪; 李悦垚; 张媛媛; 刘可园
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2023-12-05
Filing date: 2023-12-05
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明公开了一种约氏乳杆菌及其相关产品和应用，涉及微生物领域。本发明的提供的约氏乳杆菌GJ231的保藏编号为CCTCC NO:M 2023981，相对于其他约氏乳杆菌而言，GJ231能够耐酸、耐胆盐，在肠道中具有较高的存活率，对多种病原体具有较好的抑菌效果，可应用于防治由病原体引发的相关疾病；其次，GJ231的高温耐受能力较好，在喷涂制备宠物食品的过程中具有较高的存活率；再有，GJ231还具有较强的抗氧化能力，能够降低氧化应激导致的过氧化反应，可应用于抗衰老和抗氧化；此外，GJ231还拥有细菌素基因簇，可能用于产生细菌素，具有替代抗生素和食物保鲜的潜力。

Description

一种约氏乳杆菌及其相关产品和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种约氏乳杆菌及其相关产品和应用。

背景技术

约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii，L.johnsonii)分类于乳杆菌属(Lactobacillus)。研究表明，约氏乳杆菌可通过TLR1/2-STAT3信号通路激活肠道CD206+巨噬细胞，促进其分泌IL-10，从而缓解小鼠溃疡性结肠炎；约氏乳杆菌还可以保护心脏功能、抑制心肌损伤细胞因子和改善宿主肠道屏障完整性；口服约氏乳杆菌还能提高小鼠血液中的还原型谷胱甘肽水平，从而改善肝脏的线粒体形态和功能，减少肝脏脂质、改善***性的糖代谢。因此，约氏乳杆菌已经作为一种益生菌广泛的应用于人和动物的功能性产品中。

随着宠物消费的升级，宠物主开始关注科学养宠，对功能性产品的需求不断提升。益生菌作为一种无毒无残留且具有益生用的功能性补充剂在人和宠物食品中的应用越来越广泛，比如乳酸菌、双歧杆菌、酵母等在宠物食品中的应用。但是目前市场销售大多数的宠物益生菌产品并非宿主源，使用效果也良莠不齐。考虑宿主物种具有特异性，可能会排斥其他物种肠道的微生物。

目前，犬源约氏乳杆菌报道较少，市场上并没发现相关的产品。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种约氏乳杆菌及其相关产品和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种约氏乳杆菌，其名称为Lactobacillusjohnsonii GJ231，保藏号为CCTCC NO:M 2023981。

第二方面，本发明实施例提供了一种微生物制剂，其含有前述实施例所述的约氏乳杆菌。

第三方面，本发明实施例提供了一种约氏乳杆菌的发酵产物，其由前述实施例所述的约氏乳杆菌发酵培养获得。

第四方面，本发明实施例提供了一种产品，其包括前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂或前述实施例所述的发酵产物。

第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂或前述实施例所述的发酵产物在制备用于具有延缓衰老和/或抗氧化功能的产品中的应用。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂或前述实施例所述的发酵产物在非诊断治疗目的的抑制病原体或制备抑制所述病原体的产品或制备防治由所述病原体引发的相关疾病的产品中的应用。

第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂或前述实施例所述的发酵产物在制备细菌素或制备具有以下任意一种或多种功能的产品中的应用；(1)改善肝功能；(2)促进免疫器官发育；(3)促进肠道绒毛的生长；(4)防治胃肠道疾病。

第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述实施例所述的微生物制剂或前述实施例所述的发酵产物在制备宠物饲料中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、约氏乳杆菌GJ231耐酸，耐胆盐，耐人工肠液，具有很好的益生潜力，在肠道中存活率较高，有助于其持续发挥功效。

2、约氏乳杆菌GJ231的抑菌能力较好，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌具有较好的抑菌效果，可用于预防和治疗腹泻。

3、约氏乳杆菌GJ231抗氧化能力强，具有很高的DPPH、ABTS和超氧阴离子的自由基清除能力，可降低氧化应激导致的过氧化反应，可应用于宠物的抗衰老，延长其寿命。

4、灌服约氏乳杆菌GJ231对小鼠安全无不良影响，且可提高小鼠血清抗氧化能力(T-AOC和SOD含量)，降低MDA含量；改善肝功能(BUN含量显著降低)；促进免疫器官发育(脾器官指数显著提高)和绒毛长度。

5、约氏乳杆菌GJ231拥有细菌素基因簇，可用于生产细菌素，具有替代抗生素和食物保鲜的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为约氏乳杆菌GJ231菌落形态(A)及细胞形态(B)；

图2为约氏乳杆菌GJ231进化树；

图3为约氏乳杆菌GJ231生长及产酸速率曲线；

图4为约氏乳杆菌GJ231对酸度的耐受性；

图5为约氏乳杆菌GJ231抑菌试验结果；其中，A为大肠杆菌，B为金黄色葡萄球菌，C为单核细胞增生李斯特菌，D为沙门氏菌，E为铜绿假单胞菌；a孔加GJ231菌悬液，b孔加GJ231上清液，c孔加GJ231菌体蛋白，d孔加MRS培养基(空白对照)；

图6为约氏乳杆菌GJ231溶血试验结果；

图7为饲喂GJ231小鼠器官指数的影响；其中，A～E分别为心脏指数，肝脏指数，脾脏指数，肾脏指数和胸腺指数；

图8为饲喂GJ231小鼠血清生化指标；其中，A～H分别为谷草转氨酶，谷丙转氨酶，尿素氮，丙二醛，总抗氧化能力，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶；

图9为饲喂GJ231小鼠空肠HE染色图；其中，A～B分别为对照组和灌服GJ231组；

图10为GJ231基因组circlize图；

图11为COG结果分类图；

图12为GO注释结果分类图；

图13为KEGG pathway结果分类图；

图14为GJ231细菌素的潜在基因簇；其中，A～C分别为GJ231菌株细菌素预测结构图，预测细菌素三级结构，GJ231菌株细菌素氨基酸序列与以报道细菌素序列对比。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一方面，本发明实施例提供了一种约氏乳杆菌，其名称为Lactobacillusjohnsonii GJ231，保藏号为CCTCC NO:M 2023981。

具体地，约氏乳杆菌GJ231于2023年6月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072。

约氏乳杆菌GJ231的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种微生物制剂，其含有前述实施例所述的约氏乳杆菌。

在一些实施例中，所述微生物制剂还可以包括其他益生菌。

另一方面，本发明实施例提供了一种约氏乳杆菌的发酵产物，其由前述实施例所述的约氏乳杆菌发酵培养获得。

在一些实施例中，对发酵培养约氏乳杆菌GJ231的培养基和培养条件没有特殊限制，可采用现有应用于约氏乳杆菌培养的培养基和培养条件。

在一些实施例中，培养基可以采用MRS培养基。

在一些实施例中，发酵培养的温度可以为20～40℃，具体可以为20、22、24、26、28、30、32、34、36、37、38、40℃中的任意一种或多种。培养时间可以为1～50h，具体可以为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50h中的任意一种或任意两种之间的范围。

另一方面，本发明实施例提供了一种产品，其包括前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂或前述实施例所述的发酵产物。

在一些实施例中，所述产品为食品、药品、饲料或保健品。

在一些实施例中，所述饲料包括宠物饲料。

另一方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂或实施例所述的发酵产物在制备用于具有延缓衰老和/或抗氧化功能的产品中的应用。

在一些实施例中，抗氧化功能具体可以包括：降低或避免由氧化应激导致的过氧化反应。

另一方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂或实施例所述的发酵产物在非诊断治疗目的的抑制病原体或制备抑制所述病原体的产品或制备防治由所述病原体引发的相关疾病的产品中的应用。

在一些实施例中，所述病原体包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌中的任意一种或多种。

在一些实施例中，所述防治包括：预防、治疗或辅助治疗中的任意一种或多种。

本文中的“治疗”包括减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。

对于癌症来说，“治疗”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长，繁殖，或转移，或以上的某些组合。对于肿瘤来说，“治疗”包括清除全部或部分的肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或以上的某些组合。

另一方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂或实施例所述的发酵产物在制备细菌素或制备具有以下任意一种或多种功能的产品中的应用；

(1)改善肝功能；

(2)促进免疫器官发育；

(3)促进肠道绒毛的生长；

(4)防治胃肠道疾病；

(5)食物保鲜。

在一些实施例中，所述免疫器官包括：脾(脾脏)。脾是重要的淋巴器官，位于腹腔的左上方(左季肋区胃底与膈之间)，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆，当局部受暴力打击易破裂出血。

在一些实施例中，所述胃肠道疾病包括：腹泻、胃炎、肠炎、结肠炎、阑尾炎、克罗恩病、消化性溃疡、胃癌和肠癌中的任意一种或多种；

在一些实施例中，所述消化性溃疡包括：食管溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡中的任意一种；

在一些实施例中，所述防治包括：预防、治疗或辅助治疗中的任意一种或多种；

在一些实施例中，所述产品包括：药物、食品、饲料和保健品中的任意一种；

在一些实施例中，所述饲料包括宠物饲料。

此外，本发明实施例还提供了如前述实施例所述的约氏乳杆菌或前述任意实施例所述的微生物制剂或实施例所述的发酵产物在制备宠物饲料中的应用。

具体地，所述宠物饲料的类型包括动物性饲料、植物性饲料和饲料添加剂。动物性饲料来自动物及其屠宰后的副产品，包括畜禽的肉、内脏、血粉、肉骨粉、鱼粉、乳汁等。动物性饲料适口性好，易于消化，蛋白质和维生素含量较高。常见的犬动物性饲料有鱼、肉、蛋、奶等。植物性饲料种类繁多，价格低廉，是肉用犬或大型犬的补充饲料。其中，植物性饲料包括农作物成熟的籽实，如玉米、大米、大豆等；根茎类植物的根茎，如甘薯、马铃薯、木薯、胡萝卜菜等；瓜果类，如南瓜、西葫芦等；农副业加工产品，如米糠、糖渣、***等；青菜类等。这些饲料富含淀粉和糖类。饲料添加剂又称“辅加料”，给宠物喂食“辅加料”是为了给宠物补充某种微量成分。饲料添加剂的种类很多作用各异，最常见的是用于促进狗生长发育、防治疾病等。在一些实施例中，所述制备宠物饲料的步骤包括：在宠物基础饲料上喷涂约氏乳杆菌或微生物制剂。以喷涂的方式在宠物饲料中添加益生菌，能够使得饲料的内里和/或表面均匀分布高活性的益生菌，提高益生菌的存活率，降低运输过程益生菌脱离的损失率。

在一些实施例中，所述制备宠物饲料的步骤包括：在宠物基础饲料上喷涂约氏乳杆菌或微生物制剂。

对喷涂的具体工艺无特殊限制，可基于现有工艺进行实施。在一些实施例中，所述喷涂包括：高温喷涂或真空喷涂。所述高温可以为60～70℃，具体可以为60、62、64、66、68、70℃中的任意一种或任意两种之间的范围。约氏乳杆菌GJ231具有优异的高温耐受能力，其在50℃的存活率超过80％，60℃的存活率超过70％，70℃耐高温存活率超过60％，相对于其他菌株而言，其更能适用于以喷涂的方式添加于宠物食品中(较高的存活率)，在降低了宠物饲料的加工成本的情况下，提高了宠物饲料的功效。

在一些实施例中，所述宠物包括：犬科动物。

在一些实施例中，所述犬科动物包括：狗。相对于其他来源的约氏乳杆菌，约氏乳杆菌GJ231能更好的适用于犬科动物的胃肠道环境，能更好的定植和黏附到肠道细胞，发挥其益生功能。同时口服本源动物微生物不会引起因外来微生物导致的胃肠道紊乱。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1.犬源约氏乳杆菌分离鉴定

1.1分离用培养基

MRS培养基，具体成分如表1所示。

表1MRS培养基成分表g/L

pH 6.5±0.2，121℃高压灭菌15min。

1.2分离方法

(1)样品的采集与微生物分离：选择中国青岛即墨畜牧实验场的2只成年健康的雌性比格犬。通过无菌拭子采集直肠粪便，迅速放入含有生理盐水的50mL灭菌螺口具盖试管中。低温冷藏条件运输至青岛农业大学特种经济动物营养实验室，立即进行梯度稀释，每梯度三个平板，倾注法分离培养，于37℃倒置培养。

(2)分离纯化：取以上长有各种细菌的平板，选取不同菌落形态的乳酸菌单菌落，采用连续划线法进行分离纯化。重复3-4次，镜检，直至获得纯种。

(3)观察菌落特征，利用革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。

(4)按照北京索莱宝科技有限公司细菌基因组提取试剂盒(D1600)说明书提取细菌DNA，利用细菌通用引物：27F，1492R对所获得乳酸菌保守序列进行扩增并测序，引物合成及测序送检北京擎科生物科技有限公司完成，对16S rRNA序列进行同源性比对。16S rDNA的扩增体系如下，扩增体系的总体积为50μl。

ddH₂O	19μl
		DNA plate	2μl
Primer F	2μl
		Primer R	2μl
2xEs Taq MasterMix(含染料)	25μl

PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

1.3约氏乳杆菌的分离鉴定筛选

经形态学观察，显微镜检，酶学分析以及碳水化合物利用实验，结合16S rRNA测序比对，鉴定为约氏乳杆菌，命名为GJ231，16S rRNA基因序列如下所示。菌株培养20h后，菌落中间凸起，呈球形或卵圆形，表面光滑；兼性厌氧，革兰氏阳性，菌体呈短杆状，二端呈圆形。GJ231的菌落形态如图1中A所示，显微镜检形态如图1中B所示。

对GJ231的16S rRNA基因进行***发育分析，确定它们与约氏乳杆菌的亲缘关系密切。***发育树如图2所示。

(1)16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下(5’-3’)：

CTTAGACGGCTGACTCCTATAAAGGTTATCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAGACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATCCGCTTGCCTTCGCAGGTTCGCTTCTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCAGCGTCCCCGAAGGGAACACCTAATCTCTTAGGTTTGCACTGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCAACAGTTTCTGATGCAATTCTCCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTATTGAACCGCCTGCACTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTAAGTAATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCTTTCTTCACTACCAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCAAGAGTGATAGCAGAACCATCTTTCAAACTCTAGACATGCGTCTAGTGTTGTTATCCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCAGTCTCTTGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCTTGTATCTAGTTTCATTTAGTGCAAGCACTAAAATCATCTAGGCAAGCTCGCTCGACTGCAGTATAG。

(2)GJ231***发育树

见图2。

2.生长特性

2.1阳性对照菌株

选择犬科动物(蓝狐源)CCTCC NO.M ZJBF004约氏乳杆菌ZJBF004做阳性对照，发明申请(专利)号：CN201911265623.0。

2.2生理生化特性

取活化培养18h后的分离菌菌液，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌***鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行乳酸菌生理生化特性鉴定，糖发酵试验、V-P试验、甲基红(MR)试验、明胶试验等生化特性进行鉴定。

2.3生长性能及产酸性能测定

取活化培养18h后的分离菌菌液以3.0％的接种量接种于MRS培养基中，37℃恒温培养24h，对照组为未接菌种液的液体培养基。分别于0、1、2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、36、48h取样测定培养液OD₆₀₀nm吸光度值，分别于0、1、2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、36、48h取样测定pH。以时间为横坐标，以培养液的pH和OD₆₀₀nm吸光度值为纵坐标，绘制其生长曲线和产酸曲线。

2.4耐酸特性试验

取活化培养18h后的分离菌菌液以3.0％的接种量接种于初始pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的MRS液体培养基中，37℃恒培养。分别于0、3、6、9、12、18、24、30、36、42h测定其OD₆₀₀nm吸光度值，每组3个平行。测定完成后取3组平行试验结果计算平均值，根据计算结果绘制曲线。

2.5耐高温特性试验

取活化培养18h后的分离菌菌液，分别于50℃、60℃、70℃和80℃的水浴锅中处理5min，处理后立即放在冰盒中。取100μL培养液梯度稀释后涂布，用平板计数法计算活菌数，以0h的活菌数为对照计算存活率。

存活率

其中，T_initial1和T_treatmeft1分别是0min和5min存活细菌的数量(log CFU/mL)。

2.6胃肠道定植能力

2.6.1耐酸试验

取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，弃去上清液后，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，然后在无菌PBS缓冲液(pH 2.5)中重新悬浮。在37℃培养0和3h后，将10×连续稀释的培养物涂布于MRS琼脂平板上，然后在37℃下孵育24h，通过活菌落来评估分离菌株对酸的耐受性，重复3次试验。

存活率

其中，T_initial2和T_treatment2分别是在温育前(0h)以及在温育后(3h)存活细菌的数量(log CFU/mL)。

2.6.2耐胆盐试验

取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，弃去上清液后，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，重新悬浮在含有0.1％和0.3％(w/v)猪胆汁盐(Solarbio，China)的PBS缓冲液中。在37℃培养0、1h、4h和6h后，将10×连续稀释的培养物涂布于MRS琼脂平板上，然后在37℃下孵育24h，通过活菌菌落来评估分离菌株对胆盐的耐受性，重复3次试验。

存活率

其中，T_initial3和T_treatment3分别是在温育前(0h)以及在温育后(4h)存活细菌的数量(log CFU/mL)。

2.6.3人工胃肠液耐受性试验

人工胃液和人工肠液的配置参考2010年版《中国药典》。

取活化培养18h后的分离菌菌液，4℃，10000rpm离心10min，弃上清，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤两次，重悬于人工胃液中，于37℃，200rpm孵育1.5h。孵育后，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤细菌沉淀两次，4℃，10000rpm离心10min，然后重悬于人工肠液中，并在37℃，200rpm孵育3h。在人工胃液和肠液中孵育前后，通过平板计数稀释法计算细菌沉淀活力。重复3次试验。

存活率

其中，T_initial4和T_treatment4分别是在人工胃液或肠液中孵育之前以及在人工胃液或肠液中孵育后存活细菌的数量(log CFU/mL)。

2.6.4表面疏水性试验

采用细菌碳烃化合物黏着法(bacterium adhesion to hydrocarbons，BATH)，通过乳酸菌对碳烃化合物的亲和力来反应菌株表面的疏水性能。取活化培养18h后的分离菌菌液4℃,10000rpm离心10min，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤3次后，调节菌液OD₆₀₀吸光度值为0.25±0.05(A1)备用。然后，以1∶1的比例加入二甲苯和氯仿，涡旋振荡3min，于37℃孵育2h。最后，小心地吸取水相，测量OD₆₀₀吸光度值(A2)。重复3次试验。疏水率计算公式如下：

疏水率CSH(％)＝(1-A2/A1)×100％(5)；

其中，A1和A2分别是孵育之前和之后的OD₆₀₀吸光度值。

2.6.5自凝聚力试验

取培养过夜18h的分离菌菌液，4℃，10000rpm离心10min，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤2次，然后重新悬浮于等体积的无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)中，测量OD600吸光度值(A3)，然后涡旋振荡10s，置于37℃，孵育2h，避免搅拌，仔细吸收上部，测量OD₆₀₀吸光度值(A4)，重复3次试验。自凝聚率计算公式如下：

自凝聚率Autoaggregationability(％)＝(1-A4/A3)×100％(6)；

其中，A3和A4分别是孵育8h之前和之后的OD₆₀₀吸光度值。

2.7抑菌试验

菌株的抑菌性能采用牛津杯琼脂扩散法进行测定，取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，获得无细胞上清液(CFS)。将无菌牛津杯放置在TSA琼脂平板上，TSA平板含有胰蛋白胨(15.0g/L)、大豆胨(5.0g/L)、氯化钠(5.0g/L)和琼脂(15.0g/L)，取200uL浓度为1×10⁷CFU/mL的致病菌(大肠杆菌ATCC25922；沙门氏菌ATCC14028；金黄色葡萄球菌ATCC25923；铜绿假单胞菌ATCC27853；单核细胞增生李斯特菌ATCC19115)涂布于TSA琼脂平板上，待菌液吸收完全后，每个孔接种200μL分离菌株的菌液，CFS，菌体蛋白和MRS液体培养基(阴性对照)，TSA平板于37℃恒温培养箱正置放置培养，24h后观察是否有抑菌圈形成，并精确量取抑菌圈直径。

2.8抗生素敏感性试验

菌株的抗生素敏感性采用纸片扩散法进行测定。根据评价益生菌安全性的建议并结合市场上常见的抗生素，取活化培养18h后的分离菌菌液，于4℃，10000rpm离心10min，用无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤2次后，然后在无菌中性PBS缓冲液(pH 7.0)中重悬以获得对数生长期的细菌溶液(0.5McFarland悬浮液)。取100uL分离菌株的McFarland悬浮液涂布于MRS琼脂平板上。最后，将抗生素纸片在15min内贴于MRS琼脂平板表面，将平板在37℃恒温培养24h，观察是否有抑菌圈形成，并用游标卡尺测定抑菌圈直径。

2.9自由基清除试验

2.9.1DPPH自由基清除试验

用索莱宝DPPH检测试剂盒来测定分离菌株的DPPH清除能力，按照说明书操作，简而言之，吸取100μL培养18h后的分离菌菌液加入900μL提取液，旋涡振荡混匀，室温10000rpm离心10min，取25μL上清液加入到975μL DPPH工作溶液中，涡旋混匀，室温避光静止30min。用酶标仪于515nm处记录吸光度。DPPH自由基清除率的计算公式如下：

其中：A_assay ¹为待测样品的吸光度；A_control ¹为分离菌株处理上清液和无水乙醇混合液的吸光度；A_blank ¹为提取液和工作液混合的吸光度。

2.9.2ABTS自由基清除试验

用索莱宝ABTS检测试剂盒来测定分离菌株的ABTS清除能力，按照说明书操作，简而言之，吸取100μL培养18h后的分离菌菌液加入900μL提取液，旋涡振荡混匀，室温10000rpm离心10min，取上清，置冰上待测。取50μL上清液加入到850μL ABTS工作液中，再加入100μL试剂四工作液，充分混匀，室温避光静置6min。用酶标仪测定405nm处的吸光度，同时做空白和对照。ABTS自由基清除率的计算公式如下：

其中：A_assay ²为待测样品的吸光度；A_control ²为空白管吸光度；A_blank ²对照管的吸光度。

2.9.3超氧阴离子自由基清除试验

用索莱宝超氧阴离子自由基清除检测试剂盒来测定分离菌株的超氧阴离子清除能力，按照说明书操作。在530nm处测定空白管和测定管的吸光值，分别记为A_空白和A_测定。计算公式如下：

超氧阴离子清除率(％)＝(A_空白-A_测定)/A_空白×100％(9)。

2.10安全性试验

2.10.1溶血试验

取活化培养18h后的分离菌菌液在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上划线，其中含有5.0％(w/v)的羊血(Oxoid,Germany)，将平板在37℃下培养48h，并检查血琼脂平板是否存在β-溶血(菌落周围的清晰区域)、α-溶血(菌落周围的绿色区域)或γ-溶血(菌落周围无区域)迹象。用金黄色葡萄球菌(ATCC25923)菌株作为阳性对照。

2.10.2小鼠安全性试验

为了进行体内安全性评价，将生长健康，体重接近的昆明系小白鼠40只随机分为2组，每组20只动物。对照组(CON)小鼠灌服0.2mL无菌生理盐水，而益生菌组(GJ231)的小鼠灌服0.2mL分离菌株1×10¹⁰CFU/mL。每3天测量一次体重和采食量，并记录小鼠的健康状况。持续28天后，将小鼠禁食12小时，然后用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉。腹主动脉采血收集血液，并通过离心(4000rpm，4℃，10min)收集血清以进行进一步分析。处死小鼠后，解剖观察两组小鼠的内脏器官，并收集心脏、肝脏、肾脏、脾脏和胸腺等器官并称重，器官系数计算为器官重量/体重×100。

采集小鼠空肠中段约1cm，用生理盐水轻轻漂洗肠道内容物后迅速将样本浸泡至4％多聚甲醛中进行组织固定24h。然后进行组织的修整和洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，然后在光学显微镜下观察染色切片。

2.11菌株全基因组测序

使用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行联合测序，使用Unicycler(版本：0.5.0，https://github.com/rrwick/Unicycler)进行组装。组装后的基因组由Prokka(版本：1.14.6，https://github.com/tseemann/prokka)软件进行编码基因预测。使用MinCED(Version：0.4.2)对基因组进行成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)进行预测。用COG、KEGG、UniProt和RefSeq BLAST+(版本：2.11.0+)对预测的基因序列进行分析，将预测的基因序列与这些功能数据库进行比较，得到基因功能注释结果。使用软件Hmmer(版本：3.3.2)基于Pfam和TIGERFAMs数据库进行功能注释，并使用R包，绘制基因组圈图。

2.12细菌素预测

采用BAGEL4(http://bagel4.molgenrug.nl/index.php)获取GJ231细菌素的氨基酸序列，利用Uniprot(https://www.uniprot.org/blast/)挖掘编码细菌素的功能基因，并用Structure Assessment(https://swissmodel.expasy.org/assess)进行可视化。

3.结果与分析

3.1生长特性

3.1.1生理生化特性

约氏乳杆菌GJ231部分生理生化特性如表2所示。约氏乳杆菌GJ231可利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、菊糖和半乳糖。

表2约氏乳杆菌GJ231生理生化特性

项目	结果	项目	结果
				七叶苷	-	***糖	-
纤维二糖	-	果糖	-
				麦芽糖	+	葡萄糖	+
甘露醇	-	鼠李糖	-
				水杨苷	-	L-鼠李糖	-
山梨醇	-	木糖	-
				蔗糖	+	MR试验	-
棉子糖	+	V-P试验	-
				菊糖	+	硝酸盐产气	-
半乳糖	+	硫化氢试验	-

备注：+为阳性反应；-为阴性反应。

3.1.2生长性能及产酸性能测定

如图3所示，约氏乳杆菌GJ231在0-3h生长缓慢，处于生长迟缓期，3-18h OD₆₀₀nm吸光度值迅速上升，处于生长对数期，18h后菌液吸光度趋于平稳，进入生长稳定期。菌液产酸pH曲线变化与生长曲线相一致，3h内pH下降缓慢；3h pH下降速率加快，18h后菌液pH变化趋于平缓，稳定在3.7左右。

3.1.3菌株耐酸性能

由图4可知，菌株GJ231在pH≤3.0时生长完全被抑制，随培养时间延长，OD₆₀₀nm吸光度值未见变化。在pH＝4.0时，菌株能缓慢生长，但OD₆₀₀nm吸光度值明显低于pH＝5.0、6.0、7.0时。在pH≥5.0时，菌株GJ231均能正常生长，但在到达稳定期时OD₆₀nm吸光度值存在一定差别，其中，OD值pH＝6.0>pH＝7.0>pH＝5.0，活菌数与OD₆₀₀nm吸光度值变化趋势相一致。

3.1.4菌株对高温耐受性

由表3可知，菌株GJ231在50℃的存活率超过80％，60℃的存活率超过70％，70℃存活率超过60％，说明约氏乳杆菌GJ231具有较好的耐高温能力，可以考虑直接喷涂(70℃)于宠物食品表面，直接发挥功效，降低加工成本。

表3约氏乳杆菌GJ231高温耐受性

备注：注：同行数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，含有相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

3.2菌株在胃肠道内的定植能力

3.2.1菌株对酸和胆盐耐受性

由表4可知，菌株GJ231对酸和胆盐具有较强的耐受性。接种于pH＝2.5的MRS液体培养基中3h后菌株的存活率为73.04％。接种于胆盐浓度为0.1％的MRS液体培养基中1h、4h和6h后菌株的存活率为98.60％、85.23％和73.52％；接种于胆盐浓度为0.3％的MRS液体培养基中1h、4h和6h后菌株的存活率为86.65％、72.82％和68.78％。与约氏乳杆菌ZJBF004相比，GJ231对0.3％胆盐6h存活率稍高。

表4约氏乳杆菌GJ231在酸和不同胆盐浓度中的存活率

项目	培养时间/h	GJ231存活率/％	ZJBF004存活率/％
				pH 2.5	3	73.04±1.61	-
0.1％胆盐	1	98.60±2.36	-
				0.1％胆盐	4	85.23±0.65	-
0.1％胆盐	6	73.52±0.80	-
				0.3％胆盐	1	86.65±0.39	-
0.3％胆盐	4	72.82±5.13	-
				0.3％胆盐	6	68.78±2.06	65.39

3.2.2菌株对人工胃肠液耐受性

由表5可知，约氏乳杆菌GJ231在人工胃肠液中具有很强的存活能力。接种于人工胃液1.5h后菌株的存活率为60.45％；接种于人工肠液3h后菌株的存活率为97.03％，人工肠胃液共同消化4.5h后，存活率为59.07％。其中，人工胃液存活率低于约氏乳杆菌ZJBF004，但人工肠液存活率高于约氏乳杆菌ZJBF004。

表5约氏乳杆菌GJ231在人工胃肠液中的存活率

3.3菌株表面疏水性及自凝聚性能

细菌根据表面疏水性定义标准，一般设定CSH％>50％为高度疏水，CSH％介于20％和50％为中度疏水，CSH％<20％为非疏水。自凝聚能力一般分为：低(16％-35％)，中等(35％-50％)和高(50％以上)三类。由表6可知，约氏乳杆菌GJ231表面疏水性和自凝聚率均高于约氏乳杆菌ZJBF004，说明GJ231可较好的黏附定植在胃肠道，这对益生菌持续发挥功能性改善宿主健康至关重要。

表6约氏乳杆菌GJ231表面疏水率及自凝聚率

3.4菌株的抑菌性能

图5和表7结果显示，该菌株对沙门氏菌的抑菌圈直径大于20mm，对金黄色葡萄球菌的直径大于18mm，对单核细胞增生李斯特菌的抑菌圈直径16-18mm，对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈直径14-16mm，且菌悬液和上清液抑菌效果相似，因此猜想可能是其代谢产物(有机酸、细菌素、胞外多糖等)产生的抑菌作用。与约氏乳杆菌ZJBF004相比，GJ231对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌效果更好，但对金黄色葡萄球菌抑菌效果低于约氏乳杆菌ZJBF004。

表7约氏乳杆菌GJ231抑菌试验结果

3.5菌株的抗生素敏感性

药敏片直径为6mm，故设抑菌圈直径大于7mm的为具有抑菌性，小于等于7mm视为无抑菌性。由表8可知，菌株GJ231对各种常见抗生素的敏感性不同。对米诺环素、头孢哌酮和氯霉素的敏感性强，抑菌圈直径大于23mm，对哌拉西林、头孢唑林和头孢呋辛中度敏感，抑菌圈直径大于15mm，对庆大霉素和四环素抑菌圈直径在7-14mm之间，对其抗生素则不敏感。

表8约氏乳杆菌GJ231抗生素敏感性

注：+++：23-30mm；++：15-22mm；+：7-14mm；-：没有抑菌圈。

3.6菌株自由基清除能力

由表9可知，约氏乳杆菌GJ231对DPPH、ABTS和超氧阴离子自由基清除率分别是68.23％、90.80％和86.07％，其中GJ231的DPPH自由基清除率显著高于约氏乳杆菌ZJBF004，说明GJ231对自由基清除能力更高。

表9约氏乳杆菌GJ231自由基清除率

项目	GJ231自由基清除率/％	ZJBF004自由基清除率/％
			DPPH	68.23±0.64	31.1
ABTS	90.80±1.89	-
			超氧阴离子	86.07±0.79	-

3.7安全性试验结果

3.7.1溶血试验结果

以金黄色葡萄球菌作阳性对照(图6上)，可见明显β-溶血(菌落周围的清晰区域)，但GJ231为不溶血(菌落周围无区域，图6下)，初步说明约氏乳杆菌GJ231安全无致病性，可进行体内试验进一步验证其益生特性。

3.7.2小鼠试验结果

小鼠试验阶段临床观察所有小鼠精神状况良好，均能正常采食及饮水，粪便未见异常，试验期间未有试验小鼠死亡。试验结束后剖检观察其内脏均未见异常病理组织学变化及细菌易位，说明菌株针对小鼠临床应用无毒副作用。

本实施例还验证了GJ231如何影响小鼠的器官系数。如图7所示，CK组与益生菌组小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏脏器重均无显著性差异。这表明菌株GJ231对动物生长发育无不良影响，是安全的，无毒副作用；益生菌组小鼠的胸腺重量显著高于对照组，说明灌服GJ231促进了小鼠免疫器官的发育。

图8展示了添加GJ231的小鼠的血清生化指标的影响。与对照组小鼠相比，益生菌组小鼠血清BUN和MDA含量显著降低，T-AOC和SOD含量显著提高。CK组与益生菌组小鼠血清AST、ALT、CAT和GSH-PX含量均无显著性差异。

本实施例还验证了饲喂GJ231对小鼠肠道形态的影响。如图9所示，益生菌组小鼠空肠绒毛长度更长，表明饲喂GJ231不仅对小鼠肠道发育与肠道健康无不良影响，还能促进小鼠空肠绒毛的长度，提高对营养物质的消化吸收。

3.8菌株全基因组测序结果

为了了解益生菌的特性并探索GJ231的益生潜力，进行了全基因组测序。图10中显示了GJ231的完整环状基因组图谱的结果。通过过滤接头、短片段及低质量数据后，组装后得到的完整基因组大小为1.763M。

GJ231基因组含有三条环，一条环状染色体(Bacteria|ctg_1)、一个环状未分类(Bacteria|ctg_2)和一个环状质粒(Bacteria|ctg_3)，G+C含量分别为34.70％、34.32％和35.73％，属于中等大小的基因组，这些细菌通常具有很强的代谢性、耐受性和适应性。菌株GJ231基因组的COG、GO和KEGG结果如图11-13所示。COG注释结果显示，GJ231主要富集的有碳水化合物运输和新陈代谢(Carbohydrate transport and metabolism)、翻译(Transcription)、核糖体结构和生物发生(Translation,ribosomal structure andbiogenesis)和仅一般功能预测(General function prediction only)。GO注释结果显示，生物过程(biological process)富集前三的分别是翻译、磷酸烯醇式丙酮酸依赖的蔗糖磷酸转移酶***和碳水化合物代谢过程；细胞成分(cellular component)富集前三的分别是等离子体膜、膜的积分分量和细胞质；分子功能(molecular function)富集前三的分别是ATP结合、DNA结合和金属离子结合。KEGG注释到前4条信号通路有：全局和总览图(Globaland overview maps，284)、碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism，120)、跨膜运输(Membrane transport，98)和翻译(Translation，80)。

3.9细菌素预测及比对

许多共生细菌能产生称为细菌素的抗菌小分子，可抑制/清除特定的靶细菌，影响菌群组成。因此，细菌素作为潜在的微生物组编辑工具，引起了越来越多的关注。GJ231全基因组分析也预测到了两个细菌素(Gassericin T and Gassericin E)，细菌素基因簇示意如图14中A。主要氨基酸序列和蛋白质三维结构如图14中B～C。从GJ231分离的细菌素在宠物食品中存在许多潜在的用途，包括替代抗生素和食品保存，因为细菌素的热稳定性和宽pH范围可以为产品提供适当的保质期。此外，它们的广谱活性有助于对抗腐败微生物和病原体。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种约氏乳杆菌，其特征在于，其名称为Lactobacillus johnsonii GJ231，保藏号为CCTCC NO:M 2023981。

2.一种微生物制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的约氏乳杆菌。

3.一种约氏乳杆菌的发酵产物，其特征在于，其由权利要求1所述的约氏乳杆菌发酵培养获得。

4.一种产品，其特征在于，其包括权利要求1所述的约氏乳杆菌或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3所述的发酵产物；

可选地，所述产品为食品、药品、饲料或保健品；

可选地，所述饲料包括宠物饲料。

5.如权利要求1所述的约氏乳杆菌或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3所述的发酵产物在制备用于具有延缓衰老和/或抗氧化功能的产品中的应用。

6.如权利要求1所述的约氏乳杆菌或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3所述的发酵产物在非诊断治疗目的的抑制病原体或制备抑制所述病原体的产品或制备防治由所述病原体引发的相关疾病的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病原体包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和单核细胞增生李斯特菌中的任意一种或多种；

可选地，所述防治包括：预防、治疗或辅助治疗中的任意一种或多种。

8.如权利要求1所述的约氏乳杆菌或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3所述的发酵产物在制备细菌素或制备具有以下任意一种或多种功能的产品中的应用；

(1)改善肝功能；

(2)促进免疫器官发育；

(3)促进肠道绒毛的生长；

(4)防治胃肠道疾病；

(5)食物保鲜。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述免疫器官包括：脾；

可选地，所述胃肠道疾病包括：腹泻、胃炎、肠炎、结肠炎、阑尾炎、克罗恩病、消化性溃疡、胃癌和肠癌中的任意一种或多种；

可选地，所述消化性溃疡包括：食管溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡中的任意一种；

可选地，所述防治包括：预防、治疗或辅助治疗中的任意一种或多种；

可选地，所述产品包括：药物、食品、饲料和保健品中的任意一种；

可选地，所述饲料包括宠物饲料。

10.如权利要求1所述的约氏乳杆菌或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3所述的发酵产物在制备宠物饲料中的应用；

可选地，所述制备宠物饲料的步骤包括：在宠物基础饲料上喷涂约氏乳杆菌或微生物制剂；

可选地，所述宠物包括：犬科动物；

可选地，所述犬科动物包括：狗。